Контроль выбора клетками судеб является наиболее крайней формой регуляции генов. Гены, приспособленные к функционированию с определенном типе клеток, могут противодействовать функции клеток др. типа, так что природа использует разнообразные регуляторные механизмы, чтобы гарантировать стабильные паттерны активации и репрессии генов. У прокариот самоподдерживающиеся регуляторные сети транскрипционных факторов, связанные с ДНК, могут быть достаточны, чтобы регулировать активацию и репрессию генов (Ptashne 2011). У эукариот ~200-пн. (bp) сегменты генома обернуты почти дважды октамерами из 4-х основных гистонов, чтобы сформировать нуклеосомы, обеспечивая стерическое ограничение соединению транскрипционных факторов с ДНК (Kornberg and Lorch 1999). Пионерские транскрипционные факторы обладают специальными свойствами, т.к. они способны преодолеть подобные ограничения, это позволяет факторам задействовать закрытый хроматин, который недоступен для др. типов транскрипционных факторов (Fig. 1). Однако, дальнейшая упаковка высшего порядка нуклеосом в гетерохроматин может закрыть доступ к ДНК полностью, предоставляя дополнительный барьер для изменения судьбы клеток (Fig. 1).

Figure 1. Initial targeting of closed chromatin by pioneer factors. The DNA-binding domain of pioneer factors allows the protein to recognize its target site on nucleosomal DNA. The initial targeting of nucleosomal DNA by pioneer factors occurs in closed, silent chromatin that lacks nuclease hypersensitivity and consistent histone modifications or other prior marks. This allows the pioneer factor to initiate reprogramming of silent genes that may be inappropriate to express in a given cell, enabling cell type conversion. Many transcription factors (nonpioneers) cannot initially target such genes but can do so coordinately with, or after, pioneer factors bind. However, certain heterochromatic regions of the genome, such as where H3K9me2 or H3K9me3 marks are deposited, are refractory to pioneer factor binding. Continuing research on how pioneer factors can target nucleosomal sites and how heterochromatic impediments can be broken down will inform ways to enhance our ability to control cell fates for biomedical purposes. >

Who's on first?

Какие транскрипционные факторы первыми достигают онтогенетически замалчиваемых генов и инициируют их экспрессию, чтобы способствовать изменению клеточных судеб? Генетические исследования сами по себе не могут ответить, как транскрипционный фактор может оказаться необходимым или достаточным, чтобы запустить регуляторное изменение, это безусловно зависит от предыдущего связывания др. факторов в клетке. Поскольку иерархические механизмы, с помощью которых транскрипционные факторы задействуют сайты мишени в хроматине, предоставляют информацию о путях модулирования этого процесса и, следовательно, о контроле выбора судьбы.

В разных контекстах, где были тестированы группы транскрипционных факторов в отношении их способности менять судьбу клетки, субнабор факторов постоянно обнаруживает наивысший эффект на превращения клеток. Биохимические и геномные исследования показали, что такие факторы могут рассматриваться как "пионеры" благодаря действительно их способности задействовать сайты мишени ДНК в закрытом хроматине перед очевидным задействованием, открытием или модификацией сайта др. факторами (Box 1). Связывание нуклеосом с помощью пионерских факторов делает возможным координацию или последующее связывание др. транскрипционными факторами, кофакторами и хроматин-модифицирующими и ремоделирующими энзимами, с кульминацией по активации генов, характерных для новой судьбы (Fig. 2). Главным моментом является то, что активность по связыванию с нуклеосомами пионерских факторов позволяет им инициировать регуляторные события в определенных местах хроматина, которые не были запрограммированы на экспрессию, т.к. обычно это онтогенетически замалчиваемые гены.

Box 1. Features of pioneer transcription factors

Engage their target sites in closed (nuclease-resistant), silent chromatin prior to gene activity.

Increase accessibility of a target site that makes other proteins (e.g., transcription factors, chromatin remodelers, chromatin modifiers, histone variants, and repressors) accessible to the site.

Play a primary role in cell programming and reprogramming and establish the competence for cell fate changes. How to predict/validate pioneer factors

Observe the chromatin state of target sites for a transcription factor before and after the factor is expressed in a cell. Pioneer factors can target sites that are closed (nuclease-resistant; e.g., with ATAC-seq and DNase-seq) or shown to be nucleosomal (MNase-Seq) prior to binding and often result in chromatin opening upon binding. Merely correlating open chromatin at sites where a transcription factor is already bound does not predict pioneer factors.

Analyze direct binding between a transcription factor and a reconstituted mononucleosome or a nucleosomal array in vitro (e.g., with electrophoretic mobility shift assays, DNase I footprinting, and sequential transcription factor and core histone ChIP).

Analyze the effect of a transcription factor binding on DNA accessibility at the target sites in vitro (reconstituted nucleosomal array with a transcription factor) or in vivo (ectopic expression or deletion of a transcription factor).

Figure 2. Initial targeting of pioneer factor and subsequent events. (A) Pioneer transcription factors can target sites with high intrinsic nucleosome occupancy. (B) Pioneer factors initially engage nucleosomal target sites, which enable other factors (transcription factors, chromatin modifiers, and remodelers) to access the target sites. (C) Other transcription factor (TF)-binding and chromatin modifications could stabilize pioneer factor binding to the target sites.

мы начали рассматривать последние исследования по геномному картированию состояния хроматина перед и после задействования транскрипционного фактора в контексте развития и репрограммирования клеток, которые предоставляют доказательства, что пионерские факторы обладают специальными хроматин-связывающими свойствами, характерными для их пионерской функции.

Pioneer factors in zygotic genome activation

Материнские факторы с ооцитах запускают активацию зиготического генома, это наиболее драматическое событие репрограммирования в эмбриогенезе (Tadros and Lipshitz 2009). Материнский транскрипционный фактор Zelda (Zld; zinc finger early Drosophila activator) играет первичную роль в начале активации зиготического генома у эмбрионов Drosophila (Liang et al. 2008; Nien et al. 2011). Zld белок присутствует в ядрах существенно раньше, чем др. ключевые материнские транскрипционные факторы, такие как Bicoid (Bcd) и Dorsal (Dl) белки, и соединяется с регуляторными регионами генов перед активацией зиготического генома (Harrison et al. 2011; Nien et al. 2011). Присоединение Zld повышает доступность ДНК и облегчает присоединение др. транскрипционных факторов, включая Bcd и Dl, чтобы найти энхансеры (Foo et al. 2014; Xu et al. 2014). Более того, дифференциальная доступность к ДНК устанавливается с помощью разных уровней Zld связывающих пороговых наборов, отвечающих на градиент Dl: Наиболее открытые энхансеры активируются даже когда концентрация Dl низкая, но лишь немногие открытые энхансеры активируются только тогда, когда концентрация Dl высокая (Foo et al. 2014). В то время как in vitro исследования по связыванию нуклеосом всё же сообщают по всем критериям in vivo Zld, по-видимому, функционирует как пионерский фактор для активации зиготического генома.

Хотя гомологи Zld не были описаны помимо насекомых, у рыбок данио, Nanog, Pou5f3 (первоначально наз. Pou2 и Pou5f1; член класса V семейства POU, также, как и у млекопитающих Oct3/4), и функционально перекрывающаяся группа SoxB1 транскрипционных факторов (Sox2, Sox3, Sox19a и Sox19b) высоко обогащены и соединяются со своими мишенями перед активацией зиготического генома. Они также играют первичную роль в начале активации зиготического генома (Lee et al. 2013; Leichsenring et al. 2013). У мыши материнские факторы Oct3/4 и Sox2 также являются первичными регуляторами активации зиготического генома (Foygel et al. 2008; Pan and Schultz 2011). Хотя факторы, которые активируют зиготический геном могут задействовать свои сайты мишени в хроматине, который предварительно не программирован, они могут вызывать локальные изменения в хроматине и могут позволить последующую экспрессию генов, что и является характерным признаком пионерских транскрипционных факторов (Table 1).

Table 1. Predicted/validated pioneer transcription factors

Pioneer factors in cell reprogramming

Репрограммирование окончательно дифференцированных клеток впервые продемонстрировано с помощью переноса ядер соматических клеток в энуклеированный ооцит (Gurdon 1962), показавший, что факторы в цитоплазме ооцита могут репрограммировать соматические ядра в плюрипотентное состояние. Путем скрининга разнообразных факторов, которые обычно экспрессируются в плюрипотентных стволовых клетках (PSCs), но не в фибробластах, в отношении их способности превращать фибробласты в плюрипотентные клетки, транскрипционные факторы Oct3/4, Sox2, Klf4 и c-Myc (O, S, K, M), как было установлено, запускают эндогенную бы репрограммировать фибробласты в индуцированные PSCs (iPSCs) (Takahashi and Yamanaka 2006). Хотя были описаны альтернативные наборы транскрипционных факторов для репрогаммирования в iPSC (e.g., Buganim et al. 2014), большинство исследований включало Oct3/4 и/или Sox2 (Yu et al. 2007; Feng et al. 2009; Han et al. 2010; Gao et al. 2013). Как набор этих факторов первым взаимодействует со своими сайтами мишенями, чтобы инициировать репрограммирование? Инициальные события связывания OSKM в фибробластах человека показывают их предпочтительную оккупацию promoter-distal (т.e., enhancer) сайтов мишеней (Soufi et al. 2012). Большинство инициальных событий связывания происходит в генах, которые выявляют репрограммирование к плюрипотентности, а также в генах, которые способствуют апоптозу во время ранних стадий репрограммирования iPSC. Много больше инициальных связывающих событий отличаются от определенного паттерна связывания в эмбриональных стволовых клетках (ES) или iPSCs, которые сохраняют плюрипотентность (Soufi et al. 2012). Т.о., инициальное связывание или сканирование генома является совершенно разнородным вовремя репрограммирования соматических клеток в плюрипотентные, а последующая реорганизация факторов генома д. происходить, чтобы установить финальное плюрипотентное состояние (Hochedlinger and Plath 2009).

Из этих факторов Oct3/4, Sox2 и Klf4 действуют как пионерские транскрипционные факторы, поэтому они м. получать доступ к закрытому хроматину, независимо связываются они вместе или в отдельности (Fig. 1; Table 1; Soufi et al. 2012). "Закрытый хроматин" в этом контекста означает отсутствие гиперчувствительности к DNase и отсутствие соотв. паттерна гистоновых модификаций. Напротив, c-Myc в отдельности предпочитает соединяться с сайтами "открытого хроматина", которые являются DNase-hypersensitive и содержат активирующие гистоновые модификации (Soufi et al. 2012). Однако, c-Myc может соединяться с сайтами закрытого хроматина вместе с др. факторами (Soufi et al. 2012). Эти находки иллюстрируют, как группа факторов, каждый из которых необходим для эффективного превращения в плюрипотентность, м. существенно отличаться в отношении того, что они являются пионерскими факторами. Кроме того, пионерские факторы могут непосредственно позволять не пионерским соединяться с сайтами закрытого хроматина. Точные механизмы, с помощью которых происходит такое облегчение, ещё предстоит определить, но следует учитывать взаимодействия между пионерскими факторами и нуклеосомами, которые позволяют др. факторам связываться, прямые взаимодействия между самими факторами и/или рекрутирование кофакторов или ремодельеров нуклеосом, которые в свою очередь будут менять локальный ландшафт хроматина, чтобы облегчить связывание вторичных факторов (Fig. 2).

Исследования по отслеживанию одиночных молекул на живых клетках подтвердили, что вовремя репрограммирования iPSC, Sox2 соединяется сначала с ДНК мишенью, затем связывает Oct3/4, чтобы стабилизировать трехчастный комплекс (Chen et al. 2014). Эти результаты на живых клетках не согласуются с ChIP-seq (chromatin immunoprecipitation [ChIP] в комбинации с глубоким секвенированием) данными, где большинство инициальных событий связывания Oct3/4- и Sox2 были обнаружены независимым один от др. (Soufi et al. 2012). Исследования ChIP-seq с нативными OSKM белками были осуществлены в определенных условиях, когда продолжительное культивирование клеток, индуцированных с помощью OSKM приводит к превращению их в iPSC. Напротив, исследования одиночных молекул нуждаются безусловно в более высокой эктопической экспрессии HALO-нагруженных факторов, которые ковалентно связывают флуоресцентный лиганд в экспериментах с коротким периодом роста. Это д. быть исследование одиночной молекулы, где выявляется зависимое от состояния хроматина связывание факторов, чтобы задействовать чувствительные к DNase, явно свободные сайты ДНК в ядре, которые представлены немногими событиями в исследовании ChIP-seq. Мы нуждаемся в прямых исследованиях по связыванию нуклеосом и хроматина, чтобы понять в точности, как OSKM факторы механистически и последовательно воздействуют на хроматин, чтобы инициировать драматическое репрограммирование к плюрипотентности. Поэтому Pou5f3 и Sox2 факторы могут выполнять пионерскую функцию во время активации зиготического генома (see above), подчеркивая специальные способности этих факторов.

Pioneer factors in direct cell conversion (transdifferentiation)

Непосредственное превращение клеток (трансдифференцировка) с помощью индивидуальных транскрипционных факторов, было продемонстрировано впервые, когда было установлено, что MyoD индуцирует специфичные для мышц свойства, если эктопически экспрессируется в фибробластах (Davis et al. 1987). Однако экзогенный MyoD в энтодермальных и эктодермальных клетках неспособен индуцировать полное фенотипическое переключение (Weintraub et al. 1989; Schаfer et al. 1990). Более поздние исследования выявили, что MyoD индуцирует myogenin посредством кооперации с фактором Pbx, который постоянно связан с сайтами мишенями для MyoD в фибробластах перед экспрессией MyoD (Berkes et al. 2004). Имеется множество др. примеров прямого превращения клеток внутри одного и того же зародышевого листка: комбинация PU.1 и C/EBPα превращает фибробласты в макрофаг-подобные клетки (Feng et al. 2008), а GATA4, MEF2C, TBX5, Hand2 и NKX2.5 превращают фибробласты в кардиомиоцит-подобные клетки (Ieda et al. 2010; Addis et al. 2013).

Первые доказательства эффективности трансдифференцировки между разными зародышевыми листками получены при генерации функциональных глютаматергических нейронов (индуцибельных нейронов [iNs]) из фибробластов с помощью трех транскрипционных факторов Ascl1, Brn2 и Myt1l (Vierbuchen et al. 2010). Из этих факторов, Ascl1 играет центральную роль в инициации трансдифференцировки, поскольку Ascl1 сам по себе достаточен, чтобы индуцировать незрелые iN клетки, а Brn2 и Myt1l нет. Вскоре после этого были сгенерированы из фибробластов допаминергические и моторные нейроны с использованием разных наборов транскрипционных факторов, но оба набора включали Ascl1 (Caiazzo et al. 2011; Son et al. 2011). Недавно, Wernig с колл. (Wapinski et al. 2013) выявили иерархический механизм, управляющий ранней стадией трансдифференцировки в iNs: Ascl1 действует как пионерский транскрипционный фактор, чтобы соединиться с закрытым хроматином и рекрутировать Brn2 на сайты мишени для Ascl1 (Table 1), а Brn2 в первую очередь необходим для поздних стадий трансдифференцировки, участвуя в созревании iN. эксперименты показали, что даже когда факторы одновременно избыточно экспрессируются, они функционируют иерархическим образом, как описано выше для Oct3/4, Sox2, Klf4 и c-Myc. Ascl1 действует первым в становлении компетентности к нейрональному клону, это сопровождается др. транскрипционными факторов, чтобы специфицировать нейрональные подтипы. Подобно не пионерскому c-Myc, белок Ascl1 относится к basic helix-loop-helix (bHLH) семейству транскрипционных факторов, чья стержневая структура, как полагают, соединяется с обеими сторонами ДНК спирали (Bertrand et al. 2002). Однако в отличие от c-Myc, Ascl1, по-видимому, обладает свойствами пионерского фактора. Важно определить, как разные члены класса bHLH, обладающие различиями по тому, как они контактируют с ДНК, могут или нет действовать как пионерские факторы. Более того, Ascl1 характеризуется как фактор "on-target" в отношении большинства из своих первыми связываемых сайтов, когда эктопически экспрессируется в фибробластах, соответствующих сайтам, которые остаются связанными, когда клетки окончательно дифференцируются в нейроны (Wapinski et al. 2013). Это контрастирует с Oct3/4, Sox2, и Klf4, инициально связанных с геномом фибробластов, где, как указывалось выше, многие из инициальных событий связывания не соответствуют тем, что наблюдаются после полного превращения в iPSCs (Soufi et al. 2012). Это может отражать прирожденные отличия в том, как Ascl1 в противоположность Oct3/4, Sox2 и Klf4 первоначально распознает свой сайты мишени в хроматине.

Альтернативно, могут существовать врождённые отличия в общей структуре хроматина плюрипотентных клеток, которые проходят множественные фазы, чтобы воспроизвести путем репрограммирования iPSCs, тогда как прямое превращение среди дифференцированных клеток может не использовать драматическое общее изменение хроматина. Напр., восстановление флюоресценции после экспериментов фотообесцвечивания (photobleaching) подтвердило хроматин плюрипотентных клеток более "hyperdynamic", чем хроматин соматических клеток, это делает возможным более быстрый обмен компонентами хроматина, чем в дифференцированных клетках (Meshorer et al. 2006). Т.о., глобальные изменения в структуре хроматина могут быть необходимы для репрограммирования в iPSCs, и возможно клетки могут проходить через разные стадии с разными паттернами связывания на каждой стадии.

Др. примером трансдифференцировки между зародышевыми листками является индукция гепатоцит-подобных клеток из фибробластов (iHep) за счет экспрессии экзогенных или forkhead box protein A1 (FoxA1), FoxA2, FoxA3 с HNF4a (Sekiya and Suzuki 2011) или экзогенной экспрессии FoxA3, GATA4 и HNF1a в комбинации с инактивацией гена опухолевого супрессора p19Arf (Huang et al. 2011). Эти факторы были открыты в пулах из многих транскрипционных факторов, участвующих в развитии печени; общим компонентом был FoxA. Однако по сравнению с первичными гепатоцитами, iHeps обнаруживают достоверные отличия в экспрессии генов и неспособны полностью восстановить печеночную функцию в трансплантационной модели (Huang et al. 2011; Sekiya and Suzuki 2011). CellNet анализ, который является биоинформационным инструментом для оценки точности клеточного превращения, неожиданно выявил, что iHeps, индуцированные с помощью FoxA и HNF4a представляют предшественники кишечной энтодермы больше, чем зрелые гепатоциты (Morris et al. 2014). Они также показали, что iHeps способны приживаться как в мышиной печени, так и толстом кишечнике, которые являются альтернативными судьбами энтодермы кишки (Bort et al. 2006). Очевидно, что пионерский транскрипционный фактор FoxA и кофакторы наделяют компетентностью дифференцироваться в клон энтодермы кишки из фибробластов (Table 1), и необходимы дополнительные клон-детерминирующие факторы для получения зрелых гепатоцитов. Эта модель согласуется с оригинальным описанием FoxA, как наделяющего компетентностью эмбриональной энтодермы (Gualdi et al. 1996).

CellNet анализ далее выявил, большинство событий трансдифференцировки неспособно погасить программы экспрессии стартующего типа клеток и тем самым ослабляется полнота превращения клеточного типа (Cahan et al. 2014). Следовательно, важно знать, как иерархическую регуляторную сеть, необходимую для активации желаемого типа клеток и способы ослабления оригинальной регуляторной программы генов. Эта последняя область, по-видимому, является главным пробелом в области превращения клеточных типов. В соответствии с этим было бы важно знать, повторно устанавливать тканеспецифические гетерохроматиновые блоки, резистентные к связыванию пионерского фактора и служащие помехой репрограммированию клеток (Soufi et al. 2012).

Pioneer factors in cell programming during development

Не удивительно, что транскрипционные факторы, которые обладают сильным эффектом на репрограммирование клеток и трансдифференцировку, как было установлено, играют центральную роль в эмбриональном развитии. FoxA1 и FoxA2 экспрессируются в энтодерме передней кишки и необходимы для приобретения компетентности к развитию печени (Gualdi et al. 1996; Lee et al. 2005). GATA4 и GATA6 экспрессируются в энтодерме передней кишки и необходимы для раннего развития печени (Holtzinger and Evans 2005; Zhao et al. 2005; Watt et al. 2007). Специфичный для печени энхансер ген albumin (Alb1) содержит 6 сайтов для связывания транскрипционных факторов (McPherson et al. 1993). Из них только сайты связывания FoxA и GATA заняты в начале развития энтодермы кишки, при этом ген Alb1 ещё не экспрессируется (Gualdi et al. 1996; Bossard and Zaret 1998; Xu et al. 2012). После спецификации печени все сайты связывания заняты и ген Alb1 становится активным. Т.о., FoxA и GATA факторы действуют как пионерские для спецификации печени путем задействования хроматина в мультипотентных предшественниках и помощи в наделении компетентностью к печеночной судьбе (Table 1). Во время дифференцировки ES клеток в энтодерму in vitro, некоторые сайты связывания FoxA2 предварительно заняты H2A.Z, а связывание FoxA2 с сайтами во время индукции энтодермы приводят к истощению нуклеосом и активации генов (Li et al. 2012a).

Иерархическое связывание, при котором пионерские факторы присоединяются первыми, не является уникальным для развития печени. При развитии гипофизарных melanotrope, инициальная экспрессия Pax7, paired гомеодоменового транскрипционного фактора, немного опережает др. melanotrope транскрипционные факторы, такие как Tpit (Budry et al. 2012). Budry et al. (2012) экспрессировали экзогенный Pax7 в линии гипофизарных corticotrope клеток, в которой Tpit экспрессируется, а Pax7 нет. Связывание экзогенного Pax7 увеличивает доступность хроматина и индуцирует de novo рекрутирование Tpit в сайт связывания Pax7. Pax7 связан с ДНК с одним из или обоими мотивами для белкового paired домена и его гомеодомена. Интересно, что связывание Pax7 с обоими мотивами делает хроматин более доступным, чем каждый из мотивов в отдельности. Хотя прирожденный механизм неизвестен, Pax7 открывает структуру хроматина посредством соединения с составными мотивами и наделяет компетентностью развития melanotrope (Table 1; Drouin 2014).

PU.1, как известно, играет критическую роль в миелоидном и лимфоидном развитии, и его экспрессия предшествует экспрессии др. клон-детерминирующих транскрипционных факторов (Carotta et al. 2010). Связывание PU.1 вызывает локальное ремоделирование нуклеосом вследствие отложения активной гистоновой модификации H3K4me1 (Heinz et al. 2010). PU.1 также задействует др. клон-детерминирующие транскрипционные факторы (Heinz et al. 2010) и способствует общему истощению нуклеосом (Barozzi et al. 2014). Кроме того, связывание PU.1 вносит вклад в endotoxin-индуцированную активацию транскрипции в макрофагах (Ghisletti et al. 2010). PU.1 соединяется с существенной фракцией endotoxin-индуцибельных энхансеров перед тем, как стимуляция endotoxin будет удерживать энхансеры доступными. Экспрессия экзогенного PU.1 в фибробластах также индуцирует доступность хроматина в de novo PU.1-связывающих сайтах в индуцибельных энхансерах. PU.1 использует гидратацию, чтобы распознавать ДНК мишени и формировать долго живущие комплексы по сравнению с др. Ets факторами, которые используют электростатические взаимодействия (Wang et al. 2014). Мы полагаем, что базирующееся на гидратации распознавание наделяет PU.1 необходимой адаптацией, чтобы связывать нуклеосомную ДНК. Хотя необходимы более механистические исследования, чтобы понять, как PU.1 осуществляет свою функцию, PU.1 может действовать как пионерский фактор для обеспечения доступности мишеней для энхансеров во время миелоидного и лимфоидного развития (Table 1). Итак, эти исследования показали, что пионерский фактор осуществляет связывание до детерминации клона и может использовать ступень открытого хроматина для становления компетентности к активации генов.

Обширные компьютерный анализ изменений в расщеплениях с помощью DNase по геному во время дифференцировки in vitro ES клеток в мезодерму, энтодерму, препанкреатическую и кишечную энтодерму (Sherwood et al. 2014). Sherwood et al. (2014) разработали элегантный метод protein interaction quantitation (PIQ), который предсказывает связывание транскрипционного фактора, базируясь на DNase footprinting и прирожденных мотивах связывания. PIQ анализ геномных корреляций между связывающими факторами и степенью локальной доступности хроматина может тем самым предсказывать пионерские транскрипционные факторы.

Однако, PIQ не предсказал FoxA как пионерский фактор. По Sherwood et al. (2014) это возможно из-за того, что FoxA может рекрутировать корепрессоры, создающие закрытый хроматин (Sekiya and Zaret 2007); такие события связывания с помощью FoxA не были обнаружены, поскольку они не были предсказаны, как вызывающие гиперчувствительность, необходимую для PIQ, чтобы идентифицировать пионерскую активность. Кроме того, метод PIQ предсказывает только 50% факторов, действительно связывающих сайты, выявляемых с помощью ChIP-seq.

Несмотря на эти проблемы интересно, что Sherwood et al. (2014) открыли, что субнабор пионерских факторов, выявляемых с помощью PIQ, вызывает открытие хроматина преимущественно на стороне их nonpalindromic ДНК-связывающего мотива. Итак, группа факторов ведет себя асимметрично, что удивительно, и подтверждает направленность специфических механизмов, открываемых с учетом "нижестоящих" событий, сопровождающих связывание пионерских факторов.

После завершения развития имеется много примеров, когда предварительное связывание с помощью FoxA факторов делает возможным последующее связывание с помощью рецепторов гормонов и др. ДНК-связывающих белков (Gao et al. 2003; Carroll et al. 2005; Zhang et al. 2005; Li et al. 2009, 2012b; Pihlajamaa et al. 2014), т.к. ранее было открыто это в деталях (Zaret and Carroll 2011). Циркадные часы млекопитающих, управляемые с помощью CLOCK и BMAL1 транскрипционных факторов, ритмически соединяющихся с нуклеосомными сайтами мишенями, способствуют инкорпорации гистонового варианта H2A.Z, и делают возможным последующее связывание др. транскрипционных факторов (Menet et al. 2014). Т.о., часы млекопитающих, по-видимому, используют пионерские факторы, чтобы активировать гены в специфическое время суточного цикла.

the basis for pioneer activity: nucleosome binding and chromatin opening

Каковы молекулярные механизмы, лежащие в основе пионерской функции? Семейство FoxA транскрипционных факторов были исследовано механистически в глубину с помощью биохимического анализа на мононуклеосомном, динуклеосомном и нуклеосомном массивном субстратах in vitro сочетано с in vivo footprinting (Table 1; Cirillo et al. 2002; Zaret and Carroll 2011). Очищенный FoxA белок может соединяться со своими сайтами мишенями на нуклеосомной ДНК, открывать локальный домен компактизованного хроматина и стабилизировать позицию нуклеосом (McPherson et al. 1996; Shim et al. 1998; Cirillo et al. 2002). Открытие хроматина с помощью FoxA in vitro не нуждается в АТФ или зависимых от АТФ ремодельерах (Cirillo et al. 2002). Так, ДНК-связывающий домен FoxA напоминает таковой линкерного гистона и соединяется с одной стороной спирали ДНК вдоль длинной оси ДНК, это приводит к тому, что др. сторона ДНК связывает стержневые гистоны (Clark et al. 1993; Ramakrishnan et al. 1993; Cirillo et al. 1998). Т.о., FoxA пионерский фактор структурно приспособлен распознавать эти сайты мишени ДНК на нуклеосоме. Также C-терминальный домен FoxA может соединяться непосредственно с белками стержневых гистонов и необходим для открытия хроматина (Cirillo et al. 2002). Необходимы прямые исследования связывания нуклеосом для др. пионерских факторов, чтобы определить, как разные ДНК-связывающие домены могут быть адаптированы к поверхности нуклеосом и как др. домены белков могут взаимодействовать непосредственно со стержневыми гистонами, вообще-то дестабилизируя их. Кроме того, необходимо понять, как пионерские факторы могут задействовать хроматин-модифицирующие энзимы, чтобы расширять "открытость" локального домена хроматина, помогая активировать энхансеры или промотор.

Nucleosomes at enhancers: a collaborator for pioneer factors

У высших эукариот экспрессия генов регулируется с помощью скоординированного действия промоторов, которые детерминируют точку старта генной транскрипции и один или более дистальных энхансеров, которые модулируют активность промотора (Levine et al. 2014). Эти регуляторные последовательности появляются в контексте нуклеосом, что обеспечивает состояние репрессивной базы для экспрессии генов (Struhl 1999; Wang et al. 2011). Расположение нуклеосом может определяться множественными факторами: последовательностями ДНК, транскрипционными факторами, хроматин ремоделирующими энзимами и транскрипционным аппаратом (machinery) (Struhl and Segal 2013). ДНК последовательность может благоприятствовать или нет образованию нуклеосом. Напр., последовательность с poly (dA: dT) треками, как было установлено, дестабилизирует нуклеосомы (Anderson and Widom 2001), тогда как последовательность с высоким содержанием GC или с ~10-bp периодичностью AA или TT динуклеотиды способствуют образованию нуклеосом (Ioshikhes et al. 2006; Segal et al. 2006; Tillo and Hughes 2009). У высших эукариот последовательность ДНК на промоторах, энхансерах и сайтах связывания транскрипционных факторов в целом обеспечивает высокое прирожденное присутствие нуклеосом (Tillo et al. 2010; Gaffney et al. 2012). Однако в разрез предсказанию о высоком присутствии нуклеосом, геномное картирование обычно обнаруживает, что нуклеосомы истощены на активных промоторах (Schones et al. 2008; Valouev et al. 2011; Teif et al. 2012). Исследования доступности ДНК далее показали, что промоторы имеют тенденцию быть открытыми повсеместно среди многих типов клеток (Thurman et al. 2012), подтверждая, что обычно экспрессируемые транс-факторы удерживают промоторы доступными. Однако энхансеры стремятся стать открытыми тканеспецифическим способом (Thurman et al. 2012).

Как действуют сайты хроматина энхансеров, чтобы стать доступными тканеспецифическим образом снова прирожденная склонность подлежащей ДНК к высокому содержанию нуклеосом? Хотя большинство транскрипционных факторов не может достичь нуклеосомную ДНК сами по себе, пионерские транскрипционные факторы (напр., FoxA) могут соединяться с нуклеосомной ДНК и рекрутировать др. факторы для связи (Cirillo et al. 2002). В соответствии с этим транскрипционные факторы p53 и PU.1 и прогестероновый рецептор, который обычно оперирует с FoxA1 (Clarke and Graham 2012), предпочтительно находят свои мотивы для связывания среди последовательностей с прирожденно высоким присутствием нуклеосом скорее, чем среди мотивов с высоким сродством, но низким прирожденным присутствием нуклеосом (Lidor Nili et al. 2010; Ballare et al. 2013; Barozzi et al. 2014). Т.о., в противоположность догме, что нуклеосомы д. быть прирожденно репрессивными в отношении генной активности и д. быть удалены для соединения факторов, пионерские транскрипционные факторы позитивно используют свойство высокого присутствия нуклеосом на энхансерах в качестве мишени для функционального связывания (Fig. 2A).

Принимая во внимание, что пионерские факторы могут связывать свои мишени на нуклеосомной ДНК, к чему неспособны др. факторы, мы полагаем, что энхансеры пользуются клеточными и тканевыми качественными особенностями, а нуклеосомы действуют как фильтр, чтобы предупредить связывание не пионерских факторов, которые предпочитают свободную ДНК и д. во всем остальном искажать сеть клеточных характеристик. Согласно этой логике, если последовательность мишень становится стабильно свободной от нуклеосом, то нуклеосомы не смогут более служить в качестве такого фильтра. Необходимы дальнейшие исследования стабильности нуклеосом в энхансерах высших эукариот для решения этой проблемы.

Facilitators and impediments for pioneer factor binding in vivo

Исследования по широкому картированию генома показали, что все транскрипционные факторы, включая пионерские факторы, соединяются только с субнабором из своих предполагаемых связываемых мотивов в геноме и обнаруживают отличающиеся паттерны связывания в разных типах клеток. Так, на примере анализа принадлежности видна пригодность вычислительного инструмента MultiGPS по сравнению с набором данных ChIP-seq (Mahony et al. 2014). Наблюдения Mahony et al. (2014) привели к гипотезе, что (1) пионерские факторы могут инициировать обнаружение региона, а затем задействовать др. факторы, чтобы стабилизировать связывание пионерских факторов, (2) позитивные признаки хроматина могут обеспечить пионерским факторам связывание и (3) репрессивные свойства хроматина могут предупреждать связывание пионерских факторов.

Nucleosome-mediated cooperativity between transcription factors

Соединение множественных транскрипционных факторов, способных функционировать в комбинации, является наследуемым в отношении регуляции эукариотических генов, особенно для контроля клеточной специфичности (Yamamoto 1985; Carey 1998). Как описывалось ране, события трансдифференцировки обычно требуют набора транскрипционных факторов. В развитии печени пионерские факторы FoxA и GATAs первоначально занимают специфический для печени энхансер (Gualdi et al. 1996). В развитии макрофагов и B-клеток, PU.1 действует как пионерский транскрипционный фактор, но нуждается в определенном наборе клон-детерминирующих транскрипционных факторов, чтобы усилить связывание PU.1 с сайтом мишенью и заложить активные гистоновые модификации (Heinz et al. 2010). Более того, при инициации репрограммирования в iPSC, Oct3/4, Sox2 и Klf4 действуют как пионерские факторы, а c-Myc облегчает связывание Oct3/4, Sox2 и Klf4 (Soufi et al. 2012). Эти результаты подтверждают, что пионерские транскрипционные факторы могут соединяться скоординировано с др. факторами. Мы полагаем, что прирожденные свойства распознавания нуклеосом пионерскими факторами могут также обеспечивать скоординированное соединение с др. факторами. И эти прирожденные свойства распознавания нуклеосом пионерскими факторами позволяют им сканировать закрытый хроматин на присутствие потенциальных сайтов связывания и затем рекрутировать др. факторы, которые д. в свою очередь стабилизировать связывание пионерских факторов с хроматином (Fig. 2).

Большинство широко распространенных кооперативных соединений, как известно, базируются на межбелковых взаимодействиях между транскрипционными факторами. Однако нуклеосомная структура ДНК делает возможной кооперативное соединение без таких межбелковых взаимодействий, т.е. нуклеосомами обеспечиваемая кооперация между транскрипционными факторами может быть достигнута за счет их одновременной конкуренции с гистонами за подлежащую ДНК (Adams and Workman 1995; Chavez and Beato 1997; Vashee et al. 1998; Miller and Widom 2003; Mirny 2010; Moyle-Heyrman et al. 2011). Такую кооперативность обычно можно наблюдать, когда множественные (напр., 4 из 5) события связывания транскрипционных факторов могут происходить внутри одной или половинки нуклеосомы. Напротив, пионерские факторы сами по себе могут распознавать нуклеосомные сайты мишени и затем рекрутировать др. транскрипционные факторы. Такое рекрутирование д. стабилизировать связывание пионерских и не пионерских факторов, чтобы обеспечить специфичный для типа клеток паттерн связывания. В присутствии или отсутствии такой стабилизации повышенная способность пионерских факторов взаимодействовать с нуклеосомной ДНК создает преимущества для кооперативных механизмов, чтобы облегчить соединение множественных транскрипционных факторов с закрытым хроматином замалчиваемых генов.

Positive chromatin features for pioneer factor binding

Действуют ли пионерские транскрипционные факторы позитивно, используя модификации хроматина, чтобы усилить своё взаимодействие с определенными сайтами мишенями? Данные здесь разнородны. Во-первых, недавние исследования показали, что ~40% генома млекопитающих и Droshophila лишены характерных гистоновых модификаций и рассматриваются как имеющие состояние "low signal" (Kharchenko et al. 2011; Ho et al. 2014). Т.о., кроме существования нуклеосом крупные фракции хроматина, по-видимому, являются нейтральными не маркированными, являются ли они активными или репрессивными. В соответствии с этими наблюдениями, человеческие Oct3/4, Sox2 и Klf4 при инициальном репрограммировании соединяются с геномными сайтами, которые не богаты в среднем гистоновыми модификациями (Soufi et al. 2012), а связывание PU.1 не зависит от H3K4me1, но сопровождается отложением H3K4me1 (Ghisletti et al. 2010; Heinz et al. 2010).

Два независимых исследования показали, что отложение активных гистоновых модификаций (H3K4me2, H3K4me1 и H3K9ac) следует или происходит одновременно со связыванием FoxA, но не перед связыванием FoxA во время дифференцировки, индуцируемой ретиноевой кислотой в плюрипотентных ES или P19 клетках эмбриональной карциномы (Taube et al. 2010; Serandour et al. 2011). Однако, др. исследование показало, что уменьшение H3K4me1 и H3K4me2 ослабляет связывание FoxA в линии клеток рака груди MCF7 (Lupien et al. 2008). Итак, очевидно, что активные гистоновые модификации могут усиливать связывание пионерских транскрипционных факторов с хроматином, но не обязательны для инициального использования этих факторов. Также гипометилирование ДНК необязательно для соединения FoxA (Serandour et al. 2011). В терминах гистоновых вариантов сайты связывания FoxA2 могут быть предварительно заняты H2A.Z во время дифференцировки клеток ES в энтодерму и клетки печеночных предшественников, но эти предварительно занятые сайты составляют лишь часть (16%) от всех сайтов, связывающих FoxA2 (Li et al. 2012a). С этой точки зрения наиболее совместимым свойством хроматина, обеспечивающими присоединение пионерских транскрипционных факторов, является высокая прирожденная оккупация нуклосомами (Fig. 2).

Repressive chromatin features for pioneer factor binding

Являются ли эти свойства хроматина теми, что препятствуют связыванию пионерских факторов с нефункциональными или альтернативными клональными сайтами? При сравнении между линиями клеток MCF7 рака груди и LNCaP рака простаты, FoxA1 соединяется по-разному с более, чем половиной их сайтов мишеней (Lupien et al. 2008). Это специфичное для типов клеток связывание обратным образом коррелирует с репрессивными гистоновыми модификациями H3K9me2. Более того, гетерохроматиновые домены megabase шкалы, заполненные H3K9me3 в фибробластах, содержат гены, необходимые для репрограммирования клеток в плюрипотентные клетки, но устойчивы к инициальному связыванию с помощью OSKM вовремя репрограммирования (Fig. 1; Soufi et al. 2012). Уменьшение откладки H3K9me3 делает возможным присоединение Oct3/4 и Sox2 к этим доменам и усиливает репрограммирование. Поразительно, разные гены, которые функционируют позднее в процессе репрограммирования, осуществляют репрограммирование, протекающее более детерминировано в клеточной популяции, маркируя гетерохроматиновые домены, которые резистентны к инициальному связыванию OSKM (Buganim et al. 2012). Очевидно, что H3K9me3 гетерохроматиновые домены представляют барьер для перехода из стохастической фазы в детерминистическую фазу репрограммирования. Хотя, H3K9me2 и H3K9me3 домены, по-видимому, блокируют связывание пионерских факторов.

Гетерохроматиновые блоки связывания пионерских факторов могут служить способом клеткам сохранять стабильной свою судьбу. Мы полагаем, что причина, почему трансдифференцировка обычно неспособна выключать инициальную генетическую программу, может быть связана с неспособностью перенастраивать гетерохроматиновые домены на новый тип клетки (Cahan et al. 2014). Понимание, как гетерохроматиновые регионы устанавливаются и поддерживаются, предоставит информацию об усилении клеточных превращений и поможет объяснить изменения в клеточных судьбах при болезнях, таких как рак (Cruickshanks et al. 2013).

Pioneer factors as bookmarking factors in mitosis

Пионерские транскрипционные факторы играют важную роль в клеточной памяти во время митотического роста. Во время митозов хромосомы заметно конденсируются, РНК полимераза исключается из хроматина, и транскрипция затухает. Недавние исследования по отлавливанию хромосомных конформаций показали, что трехмерное разбиение геномных доменов в интерфазе почти полностью теряется во время митоза (Naumova et al. 2013). Во время выхода из митоза такие домены воссоздаются вновь, снова появляется РНК полимераза в хроматине и весь геном становится транскрипционно активным способом, которые в точности воспроизводит состояние клеток перед репликацией (Egli et al. 2008). Хотя большинство транскрипционных факторов и RNA polymerase II отделяются от митотического хроматина, субнабор транскрипционных факторов сохраняется, первоначально он был назван как "bookmarking" факторы (Martinez-Balbas et al. 1995; Michelotti et al. 1997; Zaidi et al. 2010). С момента их открытия они были оценены как факторы закладки, сохраняемые при митозе, которые стали относить к пионерским транскрипционным факторам, включая GATA1 и FoxA1 (Table 1; Kadauke et al. 2012; Caravaca et al. 2013). Исследования связывания по всему геному GATA1 и FoxA1 при митозе показали, что только минимум их сайтов связывания в интерфазе сохраняется в митотическом хроматине (Kadauke et al. 2012; Caravaca et al. 2013). Интересно, что сохраняемые при митозе сайты связывания GATA1 и FoxA1 не связаны с определенными гистоновыми модификациями. Наблюдалась одна корреляция, что сохраняемые при митозе сайты FoxA1 это те, для которых предсказано высокое содержание внутренне присущих нуклеосом (Caravaca et al. 2013). Это согласуется в выше приведенным обсуждением о том, как прогнозируемое содержание нуклеосом оказывается выдающимся свойством геномных регуляторных последовательностей и подчеркивает значение связывания с нуклеосомами пионерских факторов для митотических закладок.

Отметим, что гены, ассоциированные со связыванием GATA1 и FoxA1 при митозе были среди первых, реактивируемых после выхода из митоза (Kadauke et al. 2012; Caravaca et al. 2013). Тщательные эксперименты с разрушением GATA1 специфически в митозах показали окончательно, что сохранение в митозе является критическим для своевременной реактивации генов после выхода из митоза (Kadauke et al. 2012). Все из известных bookmarking и пионерских факторов участвуют в репрограммировании клеток во время развития, приводя к предположению, что механизм реактивации генов во время выхода из митоза воспроизводит частично иерархический процесс, с помощью которого разные типы клеток специфицируются в первую очередь (Zaret 2014).

Pioneer factors in disease progression

Поскольку пионерские транскрипционные факторы столь заметно влияют на репрограммирование клеток, их неправильная регуляция д. оказывать тяжелые эффекты на здоровье человека. Sox2 не экспрессируется в нормальном эпидермисе, но активируется в раковых стволовых клеток мыши и человека в плоскоклеточной карциноме кожи (Boumahdi et al. 2014). Следовательно, Sox2 участвует в инициальной стадии возникновения опухолей и их поддержании. У человека при плоскоклеточной карциноме пищевода и легких хромосомные сегменты, содержащие Sox2, часто генетически амплифицированы (Bass et al. 2009). Т.о., эктопическая экспрессия Sox2 или более высокие уровни её экспрессии д. активировать ранее замалчиваемые программы, чтобы наделить компетентностью к онкогенезу, вообще-то аналогично клеточному репрограммированию. Более того, FoxA и GATA факторы участвуют в разнообразных зависимых от гормонов раковых опухолях, таких как estrogen receptor-позитивный рак груди и androgen receptor-позитивный рак простаты (Zaret and Carroll 2011; Jozwik and Carroll 2012). При раке груди экспрессия FoxA1 является важным предзнаменованием жизнеспособности раковых пациентов (Badve et al. 2007). Т.о., пионерские транскрипционные факторы могут быть потенциальными биомаркерами и мишенями для лекарств при лечении рака.

Pioneer factors and the future of cellular reprogramming

Как видно из приведенного выше обсуждения пионерские факторы благодаря своей способности распознавать последовательности мишени ДНК в нуклеосомах в условиях, при которых этого не могут др. факторы. Такое связывание может быть стабилизировано координированным действием др. белков и обычно сопровождается изменениями в структуре локального хроматина, делая тем самым возможными последующие события, необходимые для регуляции генов. Способность находить молчащие гены в закрытом хроматине делает пионерские факторы особенно пригодными для клеточного репрограммирования, почти также как они участвуют в естественном клеточном репрограммировании в развитии. Остаются всё ещё важные вопросы (Box 2).

Box 2. Important issues to be addressed

What is the influence of predicted high nucleosome occupancy and nucleosome position on defining the subset of target sites to which pioneer factors will bind in a cell?

What are the structural features of DNA-binding domains that allow certain factors to have pioneer activity?

How do domains outside of the DNA-binding domain affect pioneer activity and subsequent chromatin-opening events?

How does a better understanding of the mechanism of pioneer factor interaction with nucleosomes or chromatin inform how to generate transcription factors with enhanced cellular reprogramming activity?

How do chromatin features (e.g., H3K9me3 domains) impede pioneer factor binding?

How are heterochromatic domains established or broken down in order to impede or enhance pioneer factor binding?

Несмотря на их способность соединяться специальными нуклеосомами, как пионерские факторы распознают только субнабор своих сайтов мишеней в нативном хроматине? Вообще-то субнабор сайтов, которые обнаруживаются пионерскими факторами, участвуют в сборке позиционированных нуклеосом в определенном типе клеток, которые готовы к связыванию пионеров. Более детальное картирование позиций нуклеосом в клетках вместе с тем, как они могут или нет обнаруживаться с помощью транскрипционных факторов, д. предоставить информацию.

Почему разные структуры доменов связывания ДНК способствуют или противодействуют активности пионеров? Этот вопрос, скорее всего, следует адресовать детальным биохимическим исследованиям, сравнивающим, как разные пионерские и не пионерские факторы соединяются (или нет) с очищенными, определенными нуклеосомами. Имеются ли предпочтительные варианты мотивов для обнаружения сайтов закрытого хроматина в геноме в противовес открытым сайтам и как работает способность адаптироваться доменов связывания ДНК к нуклеосомной ДНК в связи со способностью связывания нуклеосом? Это можно было бы смоделировать на нуклеосомных субстратах in vitro и использовать информацию для модификации домена связывания ДНК, чтобы усилить его исходную способность находить нуклеосомную ДНК, усиливая тем самым клеточное репрограммирование. Эта стратегия осуществима, поскольку транскрипционные факторы, которые используются для осуществления клеточного репрограммирования, по-видимому, необходимы только для инициальной активации соотв. клеточной сети. После инициации экзогенные репрограммирующие факторы могут быть потушены, поскольку возникают новые сети само-поддержания и завершается смена судьбы в отсутствие инициальных репрограммирующих факторов (Takahashi and Yamanaka 2006).

Как могут домены пионерских белков вне доменов связывания ДНК влиять на архитектуру и стабильность нуклеосом? Др. белковые домены д. взаимодействовать со стержневыми гистонами, чтобы стабилизировать связывание нуклеосом. Более того, предстоит определить, могут ли пионерские факторы "щекотать" нуклеосомы способом, который дестабилизирует стержневые гистоны или изменения в конформации нуклеосом способом, который модулирует, чтобы могли присоединиться др. факторы. Кроме того, было бы важно осуществить тщательное биохимическое исследование на полинуклеосомных матрицах, так чтобы белковые домены, которые влияют на укладку высокого порядка локального хроматина могли быть оценены (Cirillo et al. 2002). Очевидно, такие домены открытого хроматина д. быть переданы др. факторам и усиливать их регуляторную функцию.

Как в точности сильно компактизуется гетерохроматин исключая доступ пионерским факторам? Понимание, как тканеспецифические гетерохроматиновые домены создаются и могут быть разрушены д. предоставить информацию о способах усиления клеточного репрограммирования. Предполагается, что окончательное установление новой клеточной судьбы после репрограммирования д. использовать перестройку гетерохроматиновых доменов, поэтому, скорее всего, что преходящие скорее, чем перманентные методы уменьшения гетерохроматина в начале клеточного репрограммирования будут наиболее пригодны.

Сегодня возможно использование малых молекул для обнаружения модификаций хроматина, которые сразу же глобально затрагивают большинство клеток сети. Мы ожидаем, что понимание механизмов, с помощью которых пионерские факторы находят специфические сайты в геноме, инициируя регуляторные события, и поддерживая их в ходе митоза и в др. контекстах, предоставит более специфические способы модулирования клеточных сетей, которые контролируют клеточные судьбы и действуют в норме и при болезнях.

Pioneer transcription factors in cell reprogramming Makiko Iwafuchi-Doi and Kenneth S. Zaret doi:10.1101/gad.253443.114 Genes & Dev. 2014. 28: 2679-2692

Pioneer transcription factors in cell reprogramming
Makiko Iwafuchi-Doi and Kenneth S. Zaret
doi:10.1101/gad.253443.114 Genes & Dev. 2014. 28: 2679-2692