В качестве наиболее доступной части ЦНС позвоночных является нейральная сетчатка (NR) превосходная система для анализа ключевых аспектов нейрогенеза, тем более, что архитектура сетчатки и лежащие в основе механизмы развития сетчатки сильно консервативны у позвоночных. NR позвоночных содержит 7 основных типов клеток (6 типов нейронов и один тип глиальных клеток), которые распределены по трем ядерным слоям, разделенными двумя сетевидными слоями (Livesey and Cepko, 2001). Фоторецепторы (колбочки и палочки) составляют большую часть наружного ядерного слоя [outer nuclear layer (ONL)], где они превращают входящие протоны в химический сигнал. Клетки ретинальных ганглиев (RGCs) занимают наиболее внутренний ядерный слой [ganglion cell layer (GCL)] и являются нейронами, аксоны которых выходят из глаза, проецируются в ретинотопическим образом (сохраняя топографическую карту) в головной мозг: в зрительный tectum у амфибий, рыб и кур и в superior colliculus у млекопитающих. Остальные 4 типа клеток [биполярные, гоизонтальные и амакринные клетки, а также клетки Muller glia (MGs)] формируют внутренний ядерный слой (INL), который располагается между ONL и GCL, хотя определенная подгруппа, т.наз. смещенные амакринные клетки обнаруживаются в GCL. Биполярные клетки контактируют с фоторецепторами и RGCs, передавая информацию от одного слоя к др. Горизонтальные клетки обращены лицом к наружному плексиформному слою и контактируют с клетками фоторецепторов, тогда как амакринные клетки обращены лицом к внутреннему плексиформному слою и контактируют с RGCs. Оба типа клеток интегрируют и очищают зрительные сигналы с сетчатки. Горизонтальные клетки участвуют в усилении контраста, тогда как амакринные клетки вносят вклад в предварительные вычисления зрительных стимулов посредством обратной связи между ганглиями и биполярными клетками. Клетки MGs единственный не нейрональный тип клеток в NR пз и играют поддерживающую роль во время гомеостаза. Они могут также повторно вступать в клеточный цикл после повреждений (Dyer and Cepko, 2000). Они также, как полагают, оперируют в зрительных волокнах, обеспечивая передачу фотонов к фоторецепторам (Franze et al., 2007).

Хотя имеются только 7 основных типов клеток в сетчатке, существует действительно значительное разнообразие внутри каждого типа нейронов. Напр., a подгруппа RGCs, как было установлено, чтобы осуществлять циркадный ритм у млекопитающих, использует melanopsin в качестве фоторецептора (Freedman et al., 1999). Морфологическое разнообразие подтипов значительное среди ингибирующих клеток. Существует более 28 различных типов горизонтальных клеток и множество типов амакринных клеток и необходимы как внутренние, так и наружные сигналы, чтобы генерировать соотв. количества каждого подтипа (Jusuf et al., 2012; Jusuf et al., 2011).

Заметим, все эти типы клеток генерируются из популяции клеток предшественников сетчатки (RPCs) в течение6 узкого временного промежутка. Как же инициируется нейрогенез? Зарождаются разного типа клетки в определенной последовательности каков механизм гарантии сбалансированного распределения клеточных типов? Происходи ли каждый тип клеток из предетерминированного унипотентного предшественника или существуют мультипотентные RPCs общие для всех?

The early neural retina and apicobasal polarity

Перед нейрогенезом NR состоит из пула пролиферирующих RPCs, которые образуют нейроэпителий с псевдослоями, а котором каждая RPC контактирует как с апикальной, так и базальной ламиной. Крупномасштабный скрининг мутаций, вызывающих дефекты развития сетчатки, преимущественно у рыб, привел к идентификации факторов, участвующих в становлении и поддержании апикально-базальной (A-B) полярности (Malicki, 2004), включая Par, Crumbs и Scribble комплексы. Нарушение A-B полярности во время раннего эмбриогенеза у разных животных моделей влияет на пролиферацию и организацию в сетчатке RPC (Herder et al., 2013; Wei and Malicki, 2002), а мутации в генах A-B полярности ассоциируют с различными ретинопатиями у людей (Richard et al., 2006).

Одним из ключевых проявлений A-B полярности RPCs является процесс, известный как interkinetic nuclear migration (IKNM) (Baye and Link, 2008). В разных нейроэпителиях, пролиферирующие клетки преимущественно делятся на апикальной поверхности. Полагают. что клетки (и в особенности их ядра) подвергаются стереотипическим миграциям в ходе клеточного цикла: в направлении базального домена во время G1, и базально расположенные ядра д. проходить S фазу и затем перемещаться апикально в G2, чтобы поделиться ещё раз (Baye and Link, 2008). Однако, это мнение резко изменилось, когда техника получения 4D изображений позволила проследить динамику IKNM в сетчатке рыб (Baye and Link, 2007; Norden et al., 2009). Эти анализы показали, что за исключением быстрой миграции на апикальную сторону непосредственно пред митозом, ядра проходят клеточный циклов любом месте вдоль A-B оси. Ассоциированные с микротрубочками двигательные белки контролируют движения ядер вдоль A-B оси, хотя быстрая миграция к апикальной стороне в основном обеспечивается активностью актомиозина (Del Bene et al., 2008; Norden et al., 2009; Xie et al., 2007; Yu et al., 2011).

IKNM , как полагают, является механизмом для балансировки нейрогенных и пролиферативных сигналов, воздействующих на RPCs (Del Bene et al., 2008; Murciano et al., 2002). Передача сигналов Notch, известный регулятор нейрогенеза, активируется асимметрично вдоль A-B оси. Предупреждение ядра от осуществления апикальной миграции, так что предшественники подвергаются меньшему воздействию апикальной передачи сигналов Notch, приводит к преждевременному выходу из клеточного цикла и к дифференцировке, это нарушает нормальное распределение клеточных типов (Del Bene et al., 2008). Напротив, расширение апикального домена RPCs увеличивает время воздействия передачи сигналов Notch и предупреждает нейрогенез (Clark et al., 2012).

How is neurogenesis initiated and coordinated?

В определенный момент развития RPCs начинают дифференцироваться Эксперименты на рыбах и курах показали, что передача сигналов fibroblast growth factor (FGF) (особенно FGF8 и FGF3, экспрессирующихся по вентральной срединной линии) необходима для инициального переключения нейрогенеза в сетчатке (Martinez-Morales et al., 2005), она запускает дифференцировку RGCs как специфицированного первого типа клеток. Нейрогенез, будучи запущенным с помощью FGFs, далее вызывает дифференцировку и в конечном итоге распространяет её на всю сетчатку. Sonic hedgehog (Shh), секретируемый дифференцированными RGCs, участвует в распространении волны дифференцировки у рыбок данио (Neumann and Nuesslein-Volhard, 2000). Однако, поскольку нейрогенез и образование слоёв клеток осуществляется и в отсутствие RGCs (Kay et al., 2001), то рассматривается альтернативная модель. Факторы вне сетчатки (такие как Shh и FGF) могут влиять на внутренне присущие клетками решения RPCs выйти из клеточного цикла (Kay et al., 2005). Передача сигналов FGF участвует также в запуске нейрогенеза в сетчатке мышей (Cai et al., 2010), но роль Shh в нейрогенезе сетчатки млекопитающих всё ещё неясна.

У всех проанализированных позвоночных генерация нейрональных и не нейрональных клеточных типов сетчатки следует стереотипичному порядку возникновения (Cepko et al., 1996; Livesey and Cepko, 2001). RGCs генерируются первыми, тогда как биполярные клетки и MGs зарождаются последними. Эти исследования привели к т. наз. 'модели компетентности' (Cepko et al., 1996), согласно которой RPCs проходят через последовательные состояния компетентности в фиксированной временной последовательности. В каждом состоянии они или могут генерировать определенный дифференцированный тип клеток или переходят к следующей стадии с ещё более ограниченным потенциалом. Недавние клональные исследования на рыбах показали, что порядок зарождения индивидуальных RPCs, хотя и обнаруживает склонность, но не строго детерминирован, как ожидалось согласно модели (He et al., 2012). Сходные эксперименты проводятся и на др. видах животных и необходим дальнейший анализ для определения, существует ли строгий порядок гистогенеза, наблюдаемый для всего органа, и всё ли ещё верен на уровне индивидуального клона.

Potency of retinal progenitors

Модель компетентности показывает, что RPCs проходят через серию состояний компетентности, при которых генерируются разные нейроны. Но это верно для всех RPCs, а являются ли индивидуальные RPCs унипотентными или мультипотентными? Этот вопрос был адресован ко многим животным моделям, используя разные экспериментальные подходы. Во всех случаях, целью было мечение одиночных RPC и анализ постмитотического потомства, генерируемого ими. использовалась техника от клональной вирусной инфекции у грызунов и кур (Fekete et al., 1994; Turner et al., 1990) и микроинъекций краски/энзимов/ДНК в одиночные Xenopus RPCs (Holt et al., 1988; Wetts and Fraser, 1988; Wong and Rapaport, 2009) до современных рекомбинантных подходов у рыб с использованием флюоресцентных белков, которые меняют свой цвет и позволяют отслеживать весь процесс in vivo (He et al., 2012). Каждое исследование описывает повторяющийся сценарий: индивидуальные RPCs могут генерировать два или более постмитотических типа клеток, т.е. являются мультипотентными. Интересно, что разные RPCs внутри одной и той же сетчатки могут и в самом деле генерируют клоны, отличающиеся по количеству клеток и составу типов клеток in vivo (He et al., 2012; Holt et al., 1988; Turner et al., 1990; Wetts and Fraser, 1988) и in vitro (Gomes et al., 2011). Закодированы ли описанные отличия генетически (детерминистически) или являются стохастически принимаемыми in situ всё ещё открытый вопрос, хотя стохастическая модель, по-видимому, лучше соответствует наблюдаемому поведению.

У анамниот и в меньшей степени также у птиц, сетчатка постоянно растет во время постэмбриональных стадий. У рыб существует пожизненная генерация всех типов нейральных клеток, которые происходят из ретинальных стволовых клеток (RSCs) на периферии NR - области, известной как ciliary marginal zone (CMZ) (Perron and Harris, 2000). Поскольку ниша нейральных стволовых клеток, CMZ, была тщательно охарактеризована в последние декады (Centanin et al., 2011; Perron and Harris, 2000; Raymond et al., 2006). Отметим описываемая гетерогенность потенциала ранних эмбриональных RPCs изменяется драматически в CMZ. Даже одиночная нейральная стволовая клетка в CMZ, в отличие от индивидуальных RPCs, продуцирует все основные типы нейронов сетчатки и MGs (Centanin et al., 2011).

Присутствие активной CMZ у низших позвоночных поощрило исследователей изучить гомологичные структуры у млекопитающих. Отсутствующие на периферии сетчатки мыши, пролиферативные предшественники обнаруживаются, когда активность пути Shh -хорошо известного регулятора CMZ у рыб, амфибий и кур - усиливается (Moshiri and Reh, 2004). Восстановление CMZ-подобной структуры у млекопитающих при слабых нарушениях ключевого сигнального пути, подтверждает гипотезу прогрессивной потери активных RSCs в ходе эволюции позвоночных и иллюстрирует, как знания, приобретенные на анамниотах могут быть транслированы в область RSC млекопитающих.

Retinal regeneration

Помимо RSCs в CMZ, имеется и др. группа пролиферирующих клеток сетчатки у постэмбриональных рыб, лягушек и кур: MGs. MGs распределена по всей дифференцированной сетчатке и, по крайней мере, у рыб продуцирует новые палочковидные фоторецепторы в условиях гомеостаза (Bernardos et al., 2007; Johns and Fernald, 1981). Они могут также реагировать на повреждения, чтобы генерировать др. типы ретинальных нейронов (Bernardos et al., 2007; Fimbel et al., 2007;Ramachandran et al., 2012). Их регенеративный потенциал в сетчатке рыб и кур делает MGs привлекательной мишенью для лечения ретинопатий у млекопитающих. Хотя MGs не реагируют спонтанно после повреждения сетчатки у млекопитающих, они могут быть индуцированы, чтобы сделать это путем активации образцов, таких как добавление коктейлей из ростовых факторов (Lamba et al., 2008) в подходах, сходных с теми, что используются для активации радиальной глии в головном мозге грызунов.

Пигментные клетки в цилиарном теле [pigmented ciliary margin (PCM)] грызунов считаются альтернативным источником RSCs благодаря своей способности формировать нейросферы и экспрессировать маркеры нейронов сетчатки in vitro (Tropepe et al., 2000). Однако, всё ещё спорно, представляют ли собой PCM клетки настоящие RSCs или являются дифференцированными пигментными клетками, которые могут пролиферировать при определенных культуральных условиях (Cicero et al., 2009).

У мышей белее эффективный способ достижения регенерации нейронов сетчатки, таких как палочковидные фоторецепторы, при этом в конечном итоге восстанавливается зрение, это трансплантации донорских клеток. Донорские клетки, которые могут быть использованы находятся в пределах от предшественников фоторецепторов у новорожденных мышей (MacLaren et al., 2006; Pearson et al., 2012) до предшественников, происходящих in vitro из эмбриональных стволовых клеток (ESCs) мышей (Gonzalez-Cordero et al., 2013) или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (iPSCs) (Lamba et al., 2009). Более того, исследователи пытаются формировать целиком 3D оптический бокал in vitro (Eiraku et al., 2011; Nakano et al., 2012) из ESCs. Ретиногенез в чашке может быть использован для получения информации о молекулярных аспектах и для визуализации динамических свойств развития сетчатки человека in vitro. Сетчатка, генерируемая из iPSCs, происходящих от человека, может обеспечить лучшее понимание болезней и используется для идентификации персонализованной терапии.

Perspectives

NR, как экспериментально чрезвычайно доступная часть ЦНС позвоночных, является органом, выбираемым для изучения ключевых аспектов нейрогенеза и исследования, осуществляемые на сетчатке вносят существенный вклад в наше понимание нейрогенеза позвоночных. Быстрая разработка новых инструментов безусловно позволит решить множество открытых вопросов. Нас интересует, как устанавливается собственно A-B полярность в RPCs во время ранних стадий ретиногенеза, но пока неизвестно действительно ли и как одни и те же факторы влияют на удивительную A-B морфологическую асимметрию среди взрослых ретинальных нейронов. Индуцибельные средства могут быть использованы, чтобы нарушить A-B полярность сразу после начала нейрогенеза и может быть отслежен весь процесс аксоногенеза, расслоения и ретинальных взаимных соединений во всем органе или in vivo или в 3D органоидах, растущих в культуре. Получение изображений вживую в комбинации со специфичными для типов клеток флюоресцентными репортерами прокладывают путь к пониманию детерминирует ли положение внутри сетчатки судьбу вновь зарождающихся нейронов или напротив, предетерминированная судьбы нейронов специфицирует их позицию внутри сетчатки, которую новорожденные клетки занимают.

Как указывалось выше, мы всё ещё далеки от полного понимания потенциала дифференцировки индивидуальных RPCs и как это может контролироваться изнутри или снаружи. Длиной в жизнь нейрогенез в сетчатке анамниот открывает дополнительное поле за пределами онтогенетического нейрогенеза и значительно больше мы знаем о регуляции постэмбрионального нейрогенеза при гомеостатических и регенеративных условиях. Это особенно важно, т.к. рост и регенерация не только имеют отношение к пониманию базовых принципов нейрогенеза, но и имеют критическое значение для регенеративной терапии. Удивительно, что присутствие функциональной CMZ у низших позвоночных тесно коррелирует с её высокой эффективностью в регенерации всех типов клеток сетчатки после повреждения; возможна ли эффективная регенерация у видов, лишенных CMZ, предстоит определить. Мы начинаем транслировать наше понимание онтогенетического и регенеративного нейрогенеза в подходы для регенерации клеток и ткани сетчатки.

Retinal neurogenesis Lazaro Centanin and Joachim Wittbrodt 2014 Development 141, 241-244.

Retinal neurogenesis
Lazaro Centanin and Joachim Wittbrodt
2014 Development 141, 241-244.