Посещений: 
РАЗВИТИЕ СЕТЧАТКИ И ХРУСТАЛИКА
Роль фактора Pax6
|
|
Stage-dependent requirement of neuroretinal Pax6 for lens and retina development Lucie Klimova and
Zbynek Kozmik
Development 141, 1292-1302. 2014 |
The physical contact of optic vesicle with head surface ectoderm is an initial event triggering eye morphogenesis. This interaction leads to lens specification followed by coordinated invagination of the lens placode and optic vesicle, resulting in formation of the lens, retina and retinal pigmented epithelium. Although the role of Pax6 in early lens development has been well documented, its role in optic vesicle neuroepithelium and early retinal progenitors is poorly understood. Here we show that conditional inactivation of Pax6at distinct time points of mouse neuroretina development has a different impact on early eye morphogenesis. When Pax6 is eliminated in the retina at E10.5 using an mRx-Cretransgene, after a sufficient contact between the optic vesicle and surface ectoderm has occurred, the lens develops normally but the pool of retinal progenitor cells gradually fails to expand. Furthermore, a normal differentiation program is not initiated, leading to almost complete disappearance of the retina after birth. By contrast, when Pax6 was inactivated at the onset of contact between the optic vesicle and surface ectoderm in Pax6Sey/floxembryos, expression of lens-specific genes was not initiated and neither the lens nor the retina formed. Our data show that Pax6 in the optic vesicle is important not only for proper retina development, but also for lens formation in a non-cell-autonomous manner.
Рисунки к статье
|
Собственно развитие глаза зависит от скоординированного образования двух основных тканей глаза: сетчатки и хрусталика. Развитие глаза позвоночных начинается с инвагинации зрительного пузырька optic vesicle (OV) в направлении компетентной давать хрусталик поверхностной эктодермы головы surface ectoderm (SE). Как только OV приходит в контакт с SE, возникает серия реципрокных индуктивных сигналов вызывающая образование хрусталиковой плакоды (LP), а последующая инвагинация LP и OV ведет к образованию двухслойного оптического бокала optic cup (OC), с пигментным эпителием сетчатки (RPE), окружающим сетчатку (rev. Fuhrmann, 2010;Chow and Lang, 2001; Ogino et al., 2012). Генетические исследования выявили многочисленные транскрипционные факторы и сигнальные пути, взаимодействующие в сложной сети, контролирующей раннее развитие глаз (rev. Fuhrmann, 2010; Chow and Lang, 2001; Ogino et al., 2012; Xie and Cvekl, 2011). Среди сигнальных путей, пути BMP (Furuta and Hogan, 1998;Rajagopal et al., 2009; Sj?dal et al., 2007; Wawersik et al., 1999) и FGF (Faber et al., 2001; Garcia et al., 2011; Gotoh et al., 2004; Pan et al., 2006) являются важными для индукции и скоординированного перехода OV-к-OC, поскольку тяжелые дефекты глаз ассоциируют с их инактивацией.
К моменту образования LP дорсальная область OV специфицируется в сетчатку и заполняется митотически активными клетками предшественниками сетчатки (RPCs) (Fuhrmann, 2010;Levine and Green, 2004). Исследования по отслеживанию клонов показали, что RPCs являются мультипотентными, с одиночными клетками предшественниками, компетентными давать все ретинальный нейроны и типы глиальных клеток (Holt et al., 1988; Turner and Cepko, 1987; Turner et al., 1990). Определяющим свойством RPCs является совместная экспрессия транскрипционных факторов Rx (Rax), Pax6, Lhx2, Six3/Six6, Chx10 (Vsx2) и Hes1, которые экспрессируются перед активацией нейрогенной программы и вносят вклад в пролиферативный и ретиногенный потенциал RPCs (Burmeister et al., 1996;Grindley et al., 1995; Jean et al., 1999; Li et al., 2002; Liu et al., 2010; Marquardt et al., 2001; Mathers et al., 1997; Oliver et al., 1995; Porter et al., 1997; Tomita et al., 1996;Walther and Gruss, 1991). В определенной последовательности появления RPCs дифференцируются в несколько типов ретинальных клеток: клетки ретинальных ганглиев, горизонтальные клетки и фоторецепторы колбочки дифференцируются первыми, затем следуют амакринные клетки и палочковидные фоторецепторы, биполярные клетки и, наконец, клетки Мюллеровой глии (Young, 1985). По ходу ретиногенеза RPCs подвергаются действию меняющейся среды из внешних сигналов (Cepko, 1999). Это в кооперации с внутренне присущими факторами, представленными транскрипционными факторами, наиболее выраженные из них, это basic helix-loop-helix (bHLH) и гомеодоменовый класс, регулирует пролиферацию предшественников и действует, чтобы направлять развитие в определенные типы клеток (Brown et al., 1998; Cepko, 1999; Hatakeyama and Kageyama, 2004;Inoue et al., 2002; Lillien, 1995; Morrow et al., 1999; Perron and Harris, 2000; Tomita et al., 1996).
К моменту дифференцировки нейронов, субпопуляция предшественников подвергается переходу от пролиферативной стадии к стадии клонального ограничения нейронов, после чего они выходят из клеточного цикла и выбирают или нейрональную или глиальную судьбу. Соответственно, необходим собственно баланс между выходом из клеточного цикла и повторным вступлением для гарантии своевременной генерации всех типов клеток сетчатки (rev. Agathocleous and Harris, 2009). В фазе клеточного цикла G1 сигналы способствующие росту и подавляющие рост предопределяют, будут ли клетки предшественники выходить или повторно вступать в клеточный цикл. В сетчатке млекопитающих KIP белки p57Kip2 (Cdkn1c) и p27Kip1 (Cdkn1b) и cyclin D1 участвуют в непосредственной регуляции пролиферативного потенциала предшественников (Das et al., 2009; Dyer and Cepko, 2000; Dyer and Cepko, 2001;Geng et al., 2001; Levine et al., 2000; Levine and Green, 2004), способствуя или выходу из клеточного цикла или продолжению. Наблюдение, что некоторые нейрогенные факторы способствуют как детерминации нейрональной судьбы, так и выходу из клеточного цикла указывает на то, что процесс спецификации типов клеток и выход из клеточного цикла тесно связаны (Farah et al., 2000; Ochocinska and Hitchcock, 2009). Однако, механизм, которые контролирует этот комплекс событий остается в основном неизвестным.
Транскрипционный фактор с доменом paired и гомеодоменом Pax6 играет жизненно важную роль в развитии глаз позвоночных и беспозвоночных (Kozmik, 2005). Поскольку Pax6-дефицитные ( Pax6-/-) мыши лишены глаз (Hill et al., 1991; Hogan et al., 1986), при этом развитие глаз останавливается на стадии OV, поэтому много внимания было уделено выяснению функции Pax6 в развитии индивидуальных глазных структур (rev. Shaham et al., 2012). Pax6 экспрессируется, начиная с ранних стадий формирования глаз в SE и OV, и позднее в развивающихся хрусталиках, RPE и во всех митотически активных RPCs сетчатки (Walther and Gruss, 1991). Условное устранение Pax6 выявило автономную потребность в нем для развития хрусталика (Ashery-Padan et al., 2000; Shaham et al., 2009), также как и для более позднего ретинального нейрогенеза (Marquardt et al., 2001; Oron-Karni et al., 2008). Несмотря на это автономная роль Pax6 в предшественниках из OV и вновь сформированного OC остается нерешенной. Мы использовали Cre-loxP систему для условной инактивации Pax6 специфически в предназначенных стать сетчаткой глазных предшественников.
DISCUSSION
В нашем исследовании мы сфокусировались на функции Pax6 в глазных предшественниках, предназначенных стать сетчаткой, т.е. в OV и раннем OC. Современная модель предполагает, что проспективной сетчаткой экспрессируемый Pax6 безразличен для развития хрусталика и OC (Fujiwara et al., 1994). Кроме того, известно, что на стадии нейрогенеза потеря Pax6 приводит к исключительной генерации амакринных промежуточных нейронов, указывая на необходимость Pax6 для мультипотентности клеток предшественников (Marquardt et al., 2001). Мы показали, что в проспективной сетчатке Pax6 необходим для трех критических процессов: индукции хрусталика, размножения ранних предшественников сетчатки и для инициации программы дифференцировки сетчатки.
The role of Pax6 in proliferation of early retinal progenitors
Хотя, как было установлено, Pax6 участвует в пролиферации нейральных предшественников, реакция на потерю Pax6, по-видимому, зависит от онтогенетического контекста. Pax6-/- мутанты обнаруживают повышенные количества ранних кортикальных предшественников в S фазе (Estivill-Torrus et al., 2002; G?tz et al., 1998; Warren et al., 1999), но наблюдается снижение пролиферации в диэнцефалоне и глазном рудименте (Philips et al., 2005; Warren and Price, 1997). Условная инактивация Pax6 в RPCs на периферии OC на ст. E12 приводит к обеднению клетками, сопровождаемому снижением пропорции клеток в S фазе (Marquardt et al., 2001; Oron-Karni et al., 2008), это указывает на способствующий пролиферации эффект Pax6 в RPCs. Молекулярный механизм, как Pax6 регулирует пролиферацию клеток, остается неизвестным. Одна из возможностей заключается в том, что он регулирует экспрессию или функцию общих компонентов аппарата клеточного цикла или непосредственно с помощью Pax6 или косвенно с помощью его некоторых мишеней (Cvekl et al., 1999; Estivill-Torrus et al., 2002; Farah et al., 2000; Holm et al., 2007; Ochocinska and Hitchcock, 2009). Здесь мы показали, что после инактивации Pax6 ингибитор циклин-зависимой киназы p57Kip2 обнаруживает аномально накопление. Этот процесс сопровождается неспособностью RPC повторно вступать в S фазу и подавлением cyclin D1. Хотя cyclin D1 обычно экспрессируется делящимися RPCs, способствуя ходу клеточного цикла, его экспрессия быстро подавляется в появляющихся постмитотических клетках (Barton and Levine, 2008;Das et al., 2009; Dyer and Cepko, 2001). Напротив, экспрессия p57Kip2 увеличивается в небольшом субнаборе RPCs между E14.5 и E17.5 , когда они выходят из клеточного цикла (Dyer and Cepko, 2000). Исследования по потере и избыточной функции, проведенные в сетчатке мышей продемонстрировали, что p57Kip2 необходим и достаточен для индукции выхода из клеточного цикла (Dyer and Cepko, 2000). Т.о., способствующий пролиферации эффект Pax6 в сетчатке может быть обусловлен, по крайней мере, частично ингибированием преждевременного выхода из клеточного цикла посредством регуляции уровней белка p57Kip2. Мы также наблюдали усиление активности мРНК p57Kip2, негативный контроль, по-видимому, осуществляется на транскрипционном уровне. Механизм, с помощью которого p57Kip2 обусловливает выход из клеточного цикла в дефицитных по Pax6 RPCs, может заключаться в блокировании фосфорилирования ретинобластомного белка (rev. Sherr and Roberts, 1995).
Стоит отметить, что перед выходом из клеточного цикла Pax6-дефицитных RPCs независимый от p57Kip2/cyclin D1 механизм регулирует скорость пролиферации. Продолжительность клеточного цикла в популяции Pax6-дефицитных RPC существенно увеличена по сравнению с популяцией дикого типа RPC на ст. E11.5 и E13. В противоположность Pax6-дефицитным кортикальным предшественникам, обнаруживающим удлинение S фазы (Estivill-Torrus et al., 2002), суммарное время увеличивалось за счет G1, G2 и M фаз в Pax6-дефицитных RPCs, указывая на функцию Pax6 в этих фазах клеточного цикла.
The role of Pax6 in differentiation into multiple retinal cell types
Как только OV начинает инвагинировать, чтобы сформировать OC, возникает популяция RPCs. Предыдущие исследования показали, что некоторые характеристики предшественников сетчатки сохраняются и в задержанном OV рудименте зародышевой линии эмбрионов Pax6-/- (B?umer et al., 2003; Bernier et al., 2001). Линия mRx-Cre делает возможной инактивацию Pax6 точно в то время, когда устанавливается популяция RPC, и перед инициацией программы дифференцировки (на ст. E10). Наш анализ показал, что Pax6 абсолютно необходим для генерации всех типов клеток сетчатки, т.к. не обнаруживается признаков генеральной дифференцировки нейронов после инактивации Pax6, это подчеркивает специфическую роль Pax6 в поддержании мультипотентности RPC. может быть объяснено способностью Pax6 активировать экспрессию способствующих нейрогенезу bHLH факторов, включая Atoh7, Mash1, Math3, Ngn2 и Neurod1 (Hatakeyama and Kageyama, 2004; Marquardt et al., 2001; Oron-Karni et al., 2008; Riesenberg et al., 2009) (this study).
Наше наблюдение, что Pax6 обязателен для дифференцировки нейронов в сетчатке кажется противоречащим предыдущим исследованиям. Marquardt с коллегами (Marquardt et al., 2001) показали, что инактивация Pax6 на стадии OC с помощью α-Cre приводит к генерации исключительно амакринных промежуточных нейронов. Дальнейший детальный анализ выявил две популяцииf RPCs, которые по-разному отвечают на потерю Pax6: в то время как предшественники, расположенные более центрально в OC, принимают судьбу амакринных клеток, клетки, расположенные по периферии активируют экспрессию Crx (Oron-Karni et al., 2008). Тем не менее, наши данные показывают, что Pax6 также обязателен для продукции амакринных клеток, поскольку Neurod1, Math3, Atoh7 и др. специфичные для амакринных клеток факторы не экспрессируются в отсутствие Pax6. Эти отличия могут быть приписаны времени инактивации Pax6. Когда используется mRx-Cre, то Pax6 полностью элиминируется перед инициацией программы дифференцировки (E10) (this study); при α-Cre (Marquardt et al., 2001; Oron-Karni et al., 2008), Pax6 элиминируется на 2 дня позднее (E12) (Riesenberg et al., 2009) (our observation). На ст. E12 программа дифференцировки уже инициирована, т.к. некоторые факторы, способствующие нейрогенезу, включая, Neurod1 и Atoh7, экспрессируются (rev. Hatakeyama and Kageyama, 2004). Возникновение амакринных клеток, скорее всего, является результатом двухфазной инактивации Pax6 с помощью α-Cre в отношении начала нейрогенеза. Так как предшественники, расположенные в центральной части OC, дифференцируются раньше, то присутствие двух популяций RPCs в OC у α-Cre/Pax6 fl/fl условных мутантов, с популяцией амакринных клеток, расположенной более центрально, скорее всего, отражает разную степень нейрональной дифференцировки вдоль оси от центра к периферии (Oron-Karni et al., 2008).
The role of Pax6 in the lens-inductive ability of the OV
У Pax6-/- эмбрионов развитие глаз останавливается на стадии OV и ни хрусталик, ни OC не образуются (Grindley et al., 1995; Hill et al., 1991; Hogan et al., 1986). Поскольку Pax6 экспрессируется в SE и OV (Walther and Gruss, 1991), то неясно, какой компонент является источником дефекта. Некоторые исследования показывают, что поверхностная эктодерма, экспрессирующая Pax6 может быть ответственной за дефект (Collinson et al., 2000; Fujiwara et al., 1994; Grindley et al., 1995;Quinn et al., 1996), это привело к всеобщему принятию мнения, что активность Pax6 в OV в общем не нужна для образования хрусталика (rev. Ashery-Padan and Gruss, 2001; Lang, 2004; Mathers and Jamrich, 2000; Ogino and Yasuda, 2000). Однако это заключение не было проверено генетически. Эксперименты, в которых anti-Pax6 morpholinos были электропортированы в OV эмбрионов кур, показали, что экспрессируемый OV Pax6 может играть существенную роль в формировании сетчатки и хрусталика (Canto-Soler and Adler, 2006). Условная инактивация Pax6 в SE показала, что экспрессируемый SE Pax6 автономно необходим для хрусталиковых предшественников и хрусталиков, но не для образования сетчатки (Ashery-Padan et al., 2000). Здесь мы предоставили доказательство, что ранняя экспрессия Pax6 в OV необходима для развития обоих тканевых компонентов: клеточно автономно для развития OC/сетчатки и клеточно неавтономно для образования хрусталика. У OV Pax6 мутантов развитие глаза останавливается на ст. OV способом морфологически напоминающим фенотип Pax6-/- (Sey) мутантов. Т.о., у Pax6-/- эмбрионов дефект образования глаза, по-видимому, связан с функцией Pax6 как в OV, так и SE (this study) (Canto-Soler and Adler, 2006), что находится в резком контрасте с современным превалирующим мнением (Ashery-Padan and Gruss, 2001; Ogino and Yasuda, 2000). Интересно, что Pax6 необходим для образования хрусталика только до перехода от OV к OC. Как только начинает появляться хрусталиковая ямка из хрусталиковой плакоды, развитие хрусталика больше не зависит от экспрессируемого OC Pax6. Это согласуется с идеей, что развитие хрусталика становится независимым от OV/OC, когда хрусталик достигает определенной стадии развития (Adler and Canto-Soler, 2007; Lang, 2004).
Как Pax6 регулирует способность OV индуцировать образование хрусталика остается неизвестным. Было продемонстрировано, что образование хрусталика зависит от отложения молекул внеклеточного матрикса между хрусталиковой плакодой и OV, и что этот процесс зависит от экспрессии Pax6 (Huang et al., 2011). Имеется прекрасное доказательство, что передача сигналов от OV важна для активации специфичной для хрусталика экспрессии в SE и для последующего образования хрусталика (Faber et al., 2001; Furuta and Hogan, 1998; Kamachi et al., 1998; Wawersik et al., 1999; Yun et al., 2009). Мы оказались неспособны определить заметные изменения в компонентах сигнальных путей BMP, FGF и Wnt/β-catenin. Остается возможность, что причинные изменения у Pax6Sey/fl/mRx-Cre временные и слишком незначительные, чтобы быть определены в нашем анализе. Альтернативно, дополнительные, пока ещё не установленные сигналы могут участвовать в индукции хрусталика. Идентификация дальнейших молекул, действующих ниже Pax6 в OV, может помочь открытию молекулярных деталей в этом процессе.
|