Слюнные железы - это органы, связанные с ротовой полостью, они продуцируют слюну, важную жидкость для нормальной речи, вкуса, жевания, глотания и переваривания. Имеются три основных слюнных железы: подчелюстная слюнная железа (SMG), которая продуцирует большую часть секрета слюны, подъязычная слюнная железа и околоушная железа; все они сообщаются с ротовой полостью посредством независимых экскреторных протоков. Кроме того, минорные слюнные железы располагаются по всей слизистой рта и языка и имеют короткие разветвляющиеся трубочки.
Функция слюнных желез может быть нарушена при многих болезнях и состояниях, такие как побочные эффекты радиационной терапии при раке головы и шеи. Альтерации слюнных желез могут приводить к xerostomia ('синдром сухого рта'), которая вызывает дискомфорт у пациентов, снижает качество их жизни (Bouma et al., 2003; Vissink et al., 2010). Поэтому существует интерес к разработке стратегии регенерации слюнных желез (Lombaert et al., 2008), к иннервации слюнных желез (Knox et al., 2013) и путям передачи сигналов, управляющих морфогенезом слюнных желез (Jaskoll et al., 2004a; 2004b; Dang et al., 2009; Rebustini and Hoffman, 2009; Patel et al., 2011).
Слюнные железы млекопитающих образуются во время эмбрионального развития в процессе морфогенеза ветвления, который играет критическую роль в развитии и многих др. родственных органов, включая лёгкие, почки и молочные железы (Tucker, 2007). Этот процесс осуществляется за счет расщепления и удлинения сферических эпителиальных структур, называемых концевыми утолщениями, которые проникают в окружающую мезенхиму. Развитие мышиных SMG впервые становится видимым как утолщение эпителия рядом с языком примерно на ст. E11.5 (день эмбриогенеза 11.5, pre-bud стадия). Эпителий инвагинирует и формирует эпителиальный слюнной зачаток (bud), связанный с поверхностью рта с помощью примитивного главного протока на ст. E12.5. На ст. E13.5, эпителий образует несколько ответвлений приблизительно с 4-5 утолщениями (buds) (pseudoglandular stage). На ст. E15.5, большинство протоков, которые первоначально содержат твердое заполнение из эпителиальных клеток, формируют просвет за счет апоптоза клеток, расположенных в центре (canalicular stage). На ст. E17.5, ответвления образуют экскреторные протоки и терминальные утолщения (buds) превращаются в секреторные ацинусы (terminal bud stage). Развитие слюнных желез грызунов продолжается и после рождения, а финальная дифференцировка ацинусов и зернистых трубочек завершается на ст. полового созревания (Gresik, 1994; Tucker, 2007).
Слюнные железы сегодня активно исследуются (Ogawa et al., 2013; Liu and Wang, 2014). Многочисленные исследования показали, что морфогенез ветвления слюнных желез нуждается в постоянном взаимодействии и общении между эпителием и мезенхимными клетками слюнных желез (Rebustini and Hoffman 2009; Knosp et al., 2012). В дополнение к эпителиально-мезенхимным взаимодействиям, взаимодействия эпителия с аксонами также необходимы для развития слюнных желез, поскольку парасимпатическая иннервация происходит параллельно с ростом слюнных желез (Coughlin, 1975). Более того, как морфогенез ветвления слюнных желез, так и количество cytokeratin5+ (CK5+) клеток предшественников в слюнном эпителии драматически снижаются, когда удаляется парасимпатический ганглий (PSG) (Knox et al., 2010). Следовательно, парасимпатическая иннервация критически влияет на рост и развитие слюнных желез (Proctor and Carpenter, 2007).
Expression of DLK1, DLK2 and N1ICD during salivary gland development
Пути передачи сигналов, такие как sonic hedgehog (Shh) (Jaskoll et al., 2004b), Wnt (Hai et al., 2010) и FGF/FGFR (Knosp et al., 2012) существенны для органогенеза SMG. NOTCH является ещё одним важным путем, чья функция исследована в линиях клеток слюнных желез человека (HSG) (Dang et al. 2009). Однако, его роль и механизмы действия во время органогенеза слюнных желез пока неясны. NOTCH белки являются трансмембранными рецепторами, из которых у млекопитающих имеются 4 разных члена и 5 NOTCH лигандов: JAGGED 1/2 и DLL 1/3/4 (Katsube and Sakamoto, 2005; Blanpain et al., 2006). Каждый из них принадлежит к семейству белков с epidermal growth factor (EGF)-подобными повторами. Взаимодействия со своими лигандами инициируют каскад протеолитических расщеплений NOTCH рецепторов с помощью внеклеточных маталлопротеиназ и мембранных gamma-секретаз. Это расщепление дает NOTCH intracellular domain (NICD), который транслоцируется в ядро, где он может регулировать экспрессию генов путем соединения и активации транскрипционного фактора CSL/RBP-J/CBF-1. Некоторые из нижестоящих генов мишеней активируются с помощью NICD-CSL/RBP-J/CBF-1 комплекса, среди них семейство Hairy enhancer of split (Hes) (Blanpain et al., 2006).
DLK1 (Delta-like 1, также наз. Pref1) является трансмембранным и секретируемым белком, относящимся к семейству, содержащему EGF-подобные повторы. Было продемонстрировано, что как мембранный, так и секретируемый DLK1 белки действуют как негативные регуляторы передачи сигналов NOTCH посредством взаимодействия с EGF-подобными повторами (Baladr?n et al., 2005). В дополнение к полной длине Pref1A, альтернативный сплайсинг дает др. три основные короткие формы, Pref1B, 1C и 1D. Протеолитическое расщепление Pref1A и 1B может в свою очередь давать две растворимые формы: крупная в 50 kDa форма и в 24-25 kDa малая форма. Только связанные с мембраной формы и крупные растворимые формы обладают биологической активностью (Mei et al., 2002; Wang et al., 2006). Зрелый Pref1A человека обладает 85% идентичных аминокислотных последовательностей с гомологами мыши и крысы.
DLK1 обладает разнообразными биологическими функциями. Постоянная экспрессия DLK1 в преадипоцитах блокирует их дифференцировку в зрелые адипоциты (Smas et al., 1994; Smas and Sul, 1996). DLK1 регулирует также дифференцировку скелетных стволовых клеток, тимоцитов и клеток надпочечников и среди прочего ингибирует секрецию гормона роста в клетках гипофиза GH3 (Ansell et al., 2007). Совсем недавние исследования установили, что DLK1 является потенциирующим фактором адипогенеза в мезенхимных C3H10T1/2 клетках. Эти белковые функции, поскольку ингибитор передачи сигналов NOTCH в этих клетках, подтверждает, что подавляющие и усиливающие эффекты DLK1 на адипогенез зависят от общего уровня передачи сигналов NOTCH (Nueda et al., 2007a). У эмбрионов мыши DLK1 заметно экспрессируется во время развития разных органов, включая лежащий в их основе морфогенез ветвления, таких как поджелудочная железа, лёгкие и SMG (Yevtodiyenko and Schmidt, 2006).
Более того, новый ген, Dlk2, кодирует белок, чьи структурные свойства действительно идентичны таковым у DLK1 (Nueda et al., 2007b). Было продемонстрировано, что и DLK1 и DLK2 действуют как ингибирующие неканонические белковые лиганды для NOTCH1 рецептора, которые модулируют активности др. др. и передачу сигналов NOTCH в преадипоцитах и эмбриональных фибробластах мыши (Sanchez-Solana et al., 2011).
Мы анализировали пространственное и временное распределение DLK1 и DLK2 во время развития SMG мыши регуляцию, осуществляемую с помощью sDLK1, действуя посредством пути передачи сигналов NOTCH на морфогенез ветвления и иннервацию SMG.
Discussion
Мы предоставили доказательства, что и DLK1 и DLK2 присутствуют во время развития SMG, от инициальной до терминальной стадии морфогенеза. Интересно, что паттерн экспрессии DLK1 был полностью отличен от такового DLK2. Так, DLK1 обнаруживает строгую экспрессию в мезенхиме и миоэпителиальных клетках, тогда как он слабо экспрессируется в клетках ацинарного эпителия и отсутствует в протоках. Напротив, DLK2 в основном экспрессируется в эпителиальном компартменте, особенно в протоках. Хотя DLK1 ранее был обнаружен в эмбриональных тканях и в частности в SMG, эти исследования были ограничены днем E16.5 (canalicular-terminal bud stage) (Yevtodiyenko and Schmidt, 2006). Кроме того, это первое сообщение о паттерне экспрессии DLK2 в развитии SMGs. Более того, известно, что DLK1 поддерживает клетки в пролиферативном состоянии и является негативным регулятором появляющихся стволовых клеток и клеток предшественников в таких процессах как адипогенез, нейрогенез или гематопоэз (Al Haj Zen and Maddedu, 2012; Ferron et al., 2012; Mirshekar-Syahkal et al., 2012). В этом контексте мы задались вопросом, может ли воздействие DLK белка в органотипических культурах влиять на инициацию, рост и ветвление эпителия при формировании SMGs.
Мы установили, что DLK1 и DLK2 действуют как ингибиторные неканонические лиганды для NOTCH1 в клетках HSG, подобно тому, как это было показано ранее для др. систем (Nueda et al., 2007b; Sanchez Solana et al., 2011). Роль сигнального пути NOTCH во время развития SMG пока понятна не до конца. Мы использовали только очищенный, растворимый DLK1 белок в наших экспериментах из-за того факта, что внеклеточный домен DLK1 был описан как активный белок, тогда как пока ничего не известно о о существовании растворимой формы DLK2. Мы четко показали, что добавление sDLK1 белка в культуру SMGs оказывает негативный эффект на морфогенез ветвления и рост SMG, подобно тому, как это происходит после добавления фармакологического ингибитора пути NOTCH, DAPT. Тот факт, что экспрессия N1ICD снижена в SMGs, обработанных sDLK1 четко указывает на негативную регуляцию пути передачи сигналов NOTCH с помощью sDLK1 во время морфогенеза SMGs и образования веточек.
В работе мы также установили, что нарушение ветвления за счет ингибирования NOTCH коррелирует со снижением иннервации эпителиальных конечных утолщений SMGs. Хорошо известно, что парасимпатическая иннервация происходит параллельно с ростом слюнных желез. Во время ранней плодной стадии парасимпатический ганглиогенез и иннервация происходят вместе с развитием эпителия SMG (Coughlin, 1975; Knox et al., 2010, Knox et al., 2013). Морыогенез эпителия SMG нуждается в PSG иннервации, активности ацетилхолиновых и эндотелиальных мускариновых рецепторов (Knox et al., 2010). Давно известно, что NOTCH оказывает выраженные эффекты на ветвление нейронов (Berezovska et al., 1999; Sestan et al., 1999; Redmond et al., 2000). Недавние эксперименты показали, что ветвление дендритов вновь сгенерированных нейронов модулируется in vivo дозово-зависимым способом, базирующимся на расщеплении NOTCH рецептора (Breunig et al., 2007). Кроме того, NOTCH1 необходим для поддержания стволовых клеток и клеток предшественников гиппокампа взрослых и что важно, он играет критическую роль в качестве регулятора нейрогенеза и глиогенеза в ЦНС и периферической нервной системе (Taylor et al., 2007, Ables et al., 2010, 2011). Более того, передача сигналов NOTCH необходима для генерации Шванновских клеток во время эмбрионального развития мыши (Woodhoo et al.,2009), это может влиять на удлинение аксонов подчелюстных PSG нейронов.
Поскольку механизмы, с помощью которых sDLK1 и DAPT ингибирую SMG иннервацию, всё ещё полностью неизвестны, наши результаты демонстрируют, что ингибирование пути передачи сигналов NOTCH вызывает прекращение морфогенеза ветвления слюнных желез и воздействует драматически на рост аксонов PSG, это приводит к заметному снижению CK5+ клеток предшественников эпителия слюнных желез. Эта корреляция между иннервацией и CK5+ SMG эпителиальными предшественниками согласуется с предыдущим сообщением, которое описало, что парасимпатическая иннервация поддерживает популяцию эпителиальных CK5+ клеток предшественников во время развития SMGs (Knox et al., 2010).
Относительно DLK1, это также первое сообщение, которое показало, как избыточное присутствие этого белка во время развития SMG может приводить к устранению морфогенеза ветвления и иннервации. Согласно нашим результатам, эти события зависят от действия sDLK1 на путь передачи сигналов NOTCH. Более того, ингибирующий эффект DLK1 и DAPT на аксональный рост PSG нейронов может быть частично восстановлен с помощью холинергической стимуляции с помощью CCh; однако, морфогенез ветвления не восстанавливается полностью, когда SMGs обрабатываются одновременно с sDLK1 или DAPT и CCh. Это демонстрирует, что факторы, же играют роль в нарушениях развития SMG, индуцируемых прекращением передачи сигналов NOTCH. Мы полагаем, что снижение морфогенеза ветвления эпителия, вызываемое подавлением передачи сигналов NOTCH с помощью sDLK1 или DAPT может базироваться на его эффекте на возникновение расщеплений концевых утолщений, поскольку пролиферация клеток остается неизменной. Фактически, возникновение эпителиальных расщеплений, как было установлено, возникает независимо от клеточной пролиферации (Nakanishi et al., 1987), но этот вопрос всё ещё остается не проясненным до конца. Др. потенциальное объяснение заключается в обширном апоптозе эпителиальных клеток, возникающим вследствие ингибирования NOTCH в SMG. Этот апоптоз может быть предупрежден вновь сформированными CK5+ эпителиальными предшественниками, чтобы достичь полного созревания после генерации, даже в условиях восстановленной иннервации с помощью CCh. Итак, наши данные подтверждают, что DLK белки регулируют морфогенез SMGs и рост PSG нейронов посредством ингибирования пути передачи сигналов NOTCH.
