Клеточное старение было первоначально идентифицировано как состояние "постоянного" ареста клеточного цикла в результате ограничения репликативной способности нормальных диплоидных фибробластов человека (HDFs) в культуре (наз. репликативным старением) (Hayflick 1965; Shay and Wright 2000). Затем репликативное старение было ассоциировано с укорочением или дисфункцией теломер, разные клеточные stressors, как было установлено, также вызывают сходный фенотип. Т.о., в общем старение может быть описано как состояние стабильного ареста клеточного цикла в ответ на разнообразные стрессы (Campisi and d'Adda di Fagagna 2007; Collado et al. 2007; Kuilman et al. 2010). Недавно однако, это довольно приблизительное описание было существенно пересмотрено, благодаря углублению нашего понимания его клеточно неавтономных активностей, которые обеспечиваются с помощью senescence-associated secretory phenotype (SASP). Клеточно неавтономные активности старения позволяют понять функциональное значение стареющих клеток в патофизиологии, особенно в разнообразных ролях в опухолевых микроусловиях, и позволяют предположить, что они могут вносить вклад в снижение функции органа при старении. Т.о., старение не является исключительным состоянием, в скорее гетерогенным фенотипом, управляемым разнообразными сигналами, приводящими к разным результатам. Помимо SASP старение ассоциирует с др. эффекторными механизмами, усложняя фенотип. Это мнение согласуется с идеей, что в противоположность апоптической программе старение является собирательным фенотипом из множественных эффекторных программ, формирующих функциональную сеть старения (Young et al. 2013). Более того, недавние исследования выявили "не патологическую" роль старения во время эмбрионального развития. Старение, а , скорее всего, апоптоз, вносит вклад в формирование эмбрионального паттерна (Mu?oz-Esp?n et al. 2013; Storer et al. 2013). Кроме того, ERVWE1-слияние клеток, необходимое для образования плацентарного синцитиотрофобласта, вызывает старение, хотя точную роль этого старения в развитии и функции плаценты ещё предстоит выяснить (Chuprin et al. 2013). Эти исследования подкрепляют концепцию разнообразия фенотипов старения и подтверждают, что старение может быть более широко распространенным феноменом, чем это казалось ранее.

Ряд маркеров старения был охарактеризован в прототипической HDF системе, но многие из этих находок были оценены на др. клетках и в системах in vivo (Table 1). Эти маркеры часто ассоциированы с эффекторными механизмами. Напр., некоторые маркеры ДНК damage response (DDR) (d'Adda di Fagagna 2008) и компоненты SASP (Kuilman and Peeper 2009; Copp? et al. 2010) используются в качестве in vitro и in vivo маркеров старения. Даже активность senescence-associated β-galactosidase (SA-β-Gal) de facto характерный признак старения (Dimri et al. 1995), может отражать повышенную активность аутофагии, по крайней мере, в некоторых случаях (Gerland et al. 2003; Narita et al. 2011). Поскольку эффекторные механизмы старения не обязательно специфичны для старения или присутствуют при всех формах старения, интерпретация маркеров старения д. быть контекст-зависимой; более важно, множественные маркеры необходимо рассматривать в комбинации. Вполне возможно, что разные комбинации эффекторов и маркеров являются результатом различий в "качестве" фенотипа. Такой "спектр" старения согласуется с недавней идеей активно поддерживаемого состояния "глубокого" или "позднего" старения, которое, по-видимому, ассоциировано со специфическими (дополнительными) маркерами и эффекторами старения (Passos et al. 2010; De Cecco et al. 2013; Ivanov et al. 2013). Недавняя детальная характеристика SASP, где паракринная трансмиссия старения соседним клеткам снижалась во время серии переносов, также предоставляет доказательство качественной изменчивости фенотипа старения (Acosta et al. 2013). Здесь мы суммирует механизмы эффекторов и рассматриваем некоторые ключевые компоненты коллективного механизма старения (Fig. 1).

Table 1. Selected list of senescence markers

DDR

Старение может быть вызвано разными стимулами, а активация DDR путей используется в индукции и поддержании старения во многих случаях. DDR состоит из восприятия повреждений ДНК, амплификации активностей вышестоящих киназ ATM и ATR, сигнальной трансдукции через нижестоящие киназы CHK2 и CHK1 и эффекторных белков, таких как p53 и CDC25 (d'Adda di Fagagna 2008). Устойчивые DDR в особенности те, что представляются с помощью telomere dysfunction-induced foci (TIF) (Takai et al. 2003; Herbig et al. 2006) и ДНК сегментов с альтерациями хроматина, поддерживающими старение (ДНК-SCAR) (Rodier et al. 2011), оказываются связанными с поддержанием старения прежде всего за счет активации p53 (Rodier et al. 2009; Fumagalli et al. 2012).

Было показано, что киназы DDR активируется во время репликативного старения, ассоциированное с постепенным укорочением теломер (Harley et al. 1990), а ингибирование пар ATM/ATR или CHK2/CHK1 задерживает начало репликативного старения (d'Adda di Fagagna et al. 2003; Herbig et al. 2004). Теломеры являются нуклеопротеиновыми комплексами, составленными из специализированных тандемных повторяющихся последовательностей (5'-TTAGGG-3')? и связаны с мультибелковным комплексом, наз. "shelterin" (Palm and de Lange 2008). Теломеры расположены на конце каждой хромосомы, защищают концы ДНК от ряда энзимов, участвующих в метаболизме ДНК. Каждый конец теломеры состоит из одной нити и она может образовать кольцо к началу, образуя t-петлю и проникая между теломерной dsДНК, чтобы сформировать структуру D-петли (Palm and de Lange 2008). Было показано, что из пристанища (shelterin) белок TRF2 защищает хромосомные концы (van Steensel et al. 1998), а также ограничивает репарацию ДНК, когда повреждения возникают внутри теломер (Fumagalli et al. 2012).

Хотя точный порог длины теломеры или количество нефункциональных теломер в клетке, в которой запускается старение всё ещё неясно (d'Adda di Fagagna 2008), современная структурная модель описывает три состояния теломер: закрытое состояние (сформирована t-петля), промежуточное состояние и вскрытое состояние (Cesare and Karlseder 2012). В этой модели, укорочение теломер подвергает воздействию концы хромосом, которые становятся субстратом для DDR, тем самым запускается клеточное старение (промежуточное состояние). Дальнейшее укорочение теломер (открытое состояние) ведет к потере TRF2, приводящее к слиянию между хромосомами или внутри хромосомы и к состоянию наз. "кризисом", которое связано с заметным увеличением геномной нестабильности и клеточной гибели. DDR на незащищенных теломерах может стать видимым с помощью DDR маркерных белков, таких как 53BP1 и γ-H2AX (H2AX фосфорилированный по Ser139) (d'Adda di Fagagna et al. 2003; Takai et al. 2003; Herbig et al. 2004). В промежуточном состоянии, однако, DDR-позитивные теломеры сохраняют TRF2, ингибирующий слияние концов хромосом и репарацию ДНК. Т.о., это состояние может быть результатом сохранения DDR. Кроме того, TRF2-зависимая супрессия репарации ДНК внутри теломер может вызывать передачу сигналов DDR от повреждения, ассоциированного с теломерой, возникающего по причине, иной, чем укорочение теломеры (Karlseder et al. 2002; Fumagalli et al. 2012). Если повреждения ДНК распространяются по всему геному (напр., при γ-облучении), то повреждения внутри теломер оказываются неизлечимыми и тем самым стабилизируются (Fumagalli et al. 2012; Hewitt et al. 2012; Suram et al. 2012). Недавнее изучение показало, что повреждение определенного нетеломерного сайта также может персистировать, давая образование ДНК-SCAR (Rodier et al. 2011). Механизмы супрессии репарации повреждений ДНК в нетеломерных сайтах остаются неизвестными.

В дополнение к репликативному истощению и агентам, вызывающим повреждения ДНК, DDR, как было установлено, является критическим эффектором oncogene-induced senescence (OIS) (d'Adda di Fagagna 2008). Сильная активация некоторых онкогенов (таких как Ras или Raf) парадоксально вызывает старение (Serrano et al. 1997) и этот процесс, по-видимому, зависит от теломер (Jones et al. 2000). Первоначальная реакция нормальных клеток на постоянные онкогенные стимулы является типичной гиперпролиферацией, которая происходит, чтобы в "чувствительных" клетках запустить фенотип старения (Lin et al. 1998). Показано, что один механизм для связи между инициальной митотической реакцией и индукцией старения - это с S- фазрй ассоциированная DDR: онкогенный стресс управляет источниками повышенной репликации ДНК, приводя к накоплению промежуточных образований неполной репликации, приводя к повреждениям ДНК и активации DDR киназ (ATM, ATR, CHK2 и CHK1) (Bartkova et al. 2006; Di Micco et al. 2006; Mallette et al. 2007). Эти исследования также показали, что в зависимости от типа онкогенов или клеток экспериментальная инактивация ключевых DDR факторов может ингибировать OIS. Более того, в соответствии с находкой, что повреждения теломерной ДНК нерепарируемые, сообщалось, что OIS также связан с персистенцией DDR на теломерах (Suram et al. 2012).

Т.о. DDR, по-видимому, является механизмом, лежащим в основе старения, запускаемым различными стимулами. Конечно, DDR-независимое старение также описано при некоторых экспериментальных условиях, когда p16, p38MAPK или ATR активированы постоянно или опухолевый супрессор Pten полностью потерян (Toledo et al. 2008; Rodier et al. 2009; Alimonti et al. 2010; Freund et al. 2011). Кроме того, два недавних исследования идентифицировали "запрограммированное" клеточное старение, которое вносит вклад в ремоделирование ткани во время эмбрионального развития млекопитающих во множественных регионах (Mu?oz-Esp?n et al. 2013; Storer et al. 2013). Они показали, что это онтогенетическое старение обычно обнаруживает некоторые общие маркеры с OIS (включая SA-β-Gal, p21, p15 и метки гетерохроматина) , но не с DDR. Усиление активности p21 (главной мишени для p53) является критическим для этого фенотипа, но в соответствии с отсутствием DDR, активация p21 не зависит от p53. Интересно, что поскольку онтогенетическое старение обнаруживает также усиление активности некоторых компонентов SASP, главные мишени для DDR (see below), такие как IL6 и IL8, по-видимому, не обнаруживают усиления (Storer et al. 2013). Т.о., эти исследования предоставили физиологические контексты для DDR-независимого старения.

SASP

Ключевой вклад альтераций секретома в старческий фенотип уже давно известен. Ранние исследования показали, что поздние пассажи фибробластов человека или фибробластов, полученных от субъектов с синдромом преждевременного старения, продуцируют секреторные белки, включая plasminogen activator inhibitor type-1 (PAI-1), который позднее становится функциональным маркером старения (Murano et al. 1991;Goldstein et al. 1994; Kortlever et al. 2006).

Секретом стареющих клеток сложный, состоит из ряда цитокинов, хемокинов и протеаз среди прочего (Campisi 2005; Kuilman and Peeper 2009). Этот SASP или senescence messaging secretome (SMS) (Kuilman and Peeper 2009) отражает клеточно неавтономную функциональность стареющих клеток и может поддерживать их роль in vivo в патофизиологии старения и зависимых от возраста нарушений. Однако границы функций, описанные для членов SASP, чрезвычайно разнообразны и включают как аутокринную, так и паракиную передачу сигналов, эффекты, способствующие и супрессирующие опухоли, и про- и противо-воспалительные сигналы.

Regulation of the SASP

Контроль секретома в стареющих клетках осуществляется на многих уровнях, от транскрипционной регуляции до аутокринных петель обратной связи, но сохранение DDR, по-видимому, является критическим для регуляции SASP (Coppe' et al. 2010). Стареющие клетки, индуцированные или генотоксическими стрессами, репликативным истощением или онкогенными стрессами, секретируют мириады факторов, связанных с воспалением, пролиферацией и модуляцией внеклеточного матрикса (ECM) (Acosta et al. 2008; Kuilman et al. 2008; Rodier et al. 2009).

Потеря ataxia telangiectasia-mutated (ATM) или др. факторов, реагирующих на повреждения ДНК (таких как NBS1 и CHK2) приводит к снижению некоторых SASP факторов, таких как IL6 и IL8, центральных компонентов SASP, во время не только DDR-индуцированного старения, но и также OIS (Rodier et al. 2009). OIS также обеспечивается с помощью DDR (Bartkova et al. 2006; Di Micco et al. 2006; Mallette et al. 2007). Кроме того, экспрессия CDK ингибиторов p16 или p21 приводит к индукции старения без использования DDR; такой фенотип старения лишен способствующих воспалению SASP (Rodier et al. 2009). Т.о., использование SASP в основном зависит от персистенции DDR, связанной со стимулами старения (Coppе et al. 2010). Интересно, что Coppе et al. (2008) показали, что потеря p53 из HDFs скорее усиливает персистирующую DDR и секрецию IL6 secretion, играющих ключевую роль в про-туморогенных паракринных активностях SASP (see below). Поэтому они предложили интересную концепцию, что p53 действует как "клеточно неавтономный опухолевый супрессор." Эта идея была подкреплена недавним исследованием химически индуцируемой hepatocellular carcinoma (HCC) у мышей, у которых p53-обусловленный SASP в hepatic stellate cells (HSCs) супрессирует развитие HCC частично за счет запуска активации противо-опухолевых M1 макрофагов (Lujambio et al. 2013).

Многие компоненты SASP усиливают свою активность на транскрипционном уровне (Shelton et al. 1999; Kuilman et al. 2008), а два транскрипционных фактора , NF-κB and C/EBPβ, как было установлено, усиливают свою активность, активируют и соединяются с хроматином во время OIS и кооперативно регулируют воспалительные компоненты SASP (Acosta et al. 2008; Kuilman et al. 2008; Chien et al. 2011; Jing et al. 2011). Используя транскриптомный подход, Kuilman et al. (2008) показали, что истощение IL6, которое они подтвердили с помощью прямой транскрипционной мишени C/EBPβ, приводит к коллапсу воспалительной SASP сети и старение не происходит. Недавно было показано, что передача сигналов IL1 является вышестоящим эффектором для NF-κB и C/EBPβ , а значит и для индукции IL6 и IL8 (Orjalo et al. 2009; Hubackova et al. 2012;Acosta et al. 2013). Интересно, что Acosta et al. (2013) идентифицировали inflammasomes, многомолекулярные комплексы врожденного иммунитета, в качестве критического регулятора этого процесса. Аналогично апоптосомам, котоые активируют caspase-9 и последующий каскад классического пути апоптоза, inflammasomes активируют caspase-1 (первоначально известно как конвертирующий энзим для IL1), которая необходима для инициации и амплификации передачи сигналов IL1 (Strowig et al. 2012; Hoare and Narita 2013). Кроме того, недавнее исследование показало, что IL1 (и TGFβ, др. компонент SASP) может обеспечивать старение путем активации оксидативных стрессов и повреждений ДНК, предоставляя др. уровень позитивной петли обратной связи (Hubackova et al. 2012; Acosta et al. 2013). Эти исследования коллективно подтверждают, что воспалительные SASP составляют сложную иерархическую сеть, которая использует мощную амплификацию сигнала.

Functions of the SASP

Имеются разнообразные нижестоящие эффекты SASP которые зависят от контекста и ситуации клеток, получающих сигналы. Эти эффекты включают protumorigenesis (паракринные), иммуномодуляцию (паракринные), усиление старения (паракринные и аутокринные) и модуляцию тканевых микроусловий (паракринные) (Hoare and Narita 2013). Помимо функции клеточно-автономной опухолевой супрессии старения, которая подкрепляется с помощью SASP посредством аутокринной петли обратной связи, отмечены парадоксальные способствующие туморогенезу эффекты SASP (Coppе et al. 2010). Было показано, что секретируемые белки от стареющих HDFs способствуют пролиферации и злокачественной трансформации предраковых эпителиальных клеток (Krtolica et al. 2001; Bavik et al. 2006). Напр., эти паракринные эффекты способствуют эпителиально-мезенхимному переходу и инвазии, васкуляризации опухолей и аномальной морфологии тканей, которые обеспечиваются с помощью цитокинов, способствующих воспалению, IL6 и IL8, VEGF и metalloprotease MMP3 (Parrinello et al. 2005; Copp? et al. 2006,2008; Kuilman et al. 2008). Интересно, что паракринная способствующая туморогенезу активность SASP, по-видимому, имеет более существенное значение для клеток, которые уже начали движение в направлении злокачественной трансформации.

Как затем SASP затрагивает нормальные клетки? В работах групп Peeper и Gil groups (Acosta et al. 2008; Kuilman et al. 2008) показано, что IL6 и IL8, ключевые компоненты, ' подкрепляют" старение скорее, чем "распространяют" фенотипы старения на здоровые соседние клетки. Эта потребность в некоторой детерминированности клеток-мишеней в направлении или злокачественной трансформации или старения может объяснить до некоторой степени плейотропные функции этих цитокинов. Однако, недавние исследования показали, что некоторые SASP факторы, включая IL1β, могут индуцировать старение в нормальных клетках. Т.о., старение может переноситься на нетрансформированные соседние клетки посредством паракринной активности SASP (Hubackova et al. 2012; Acosta et al. 2013). IL1β д. быть расщеплен и модифицирован активированной с помощью inflammasome caspase-1,и поэтому инфламасомы участвуют в локальном распространении не только воспаления, но и также старения в тканевых микроусловиях. Интересно, что распространение паракринного старения, по-видимому, находится под контролем, поскольку передаваемость (transmissibility) SASP убывает во время серийных трансмиссий старения (Acosta et al. 2013). Значение inflammasome-IL1β сигнала как вышестоящего эффектора старения, также наблюдалось при HSC старении у мышей. Это может быть вызывано за счет ожирением связанной продукции кишечными микробами метаболита желчной кислоты deoxycholic acid (DCA), хотя в этом случае паракринный эффект HSC SASP, по-видимому, является туморогенным для гепатоцитов в присутствии канцерогена DMBA (Yoshimoto et al. 2013).

Паракринные эффекты SASP провоцируют также противоопухолевый иммунитет (Serrano 2011;Hoenicke and Zender 2012). Апоптические клетки физиологически быстро элиминируются посредством фагоцитоза, чтобы устранить вредное некротическое воспаление. Xue et al. (2007) впервые показали, что стареющие клетки также могут элиминироваться in vivo. Они использовали H-ras-управляемую мышиную модель рака печени, в которой эндогенный уровень p53 может быть модулирован за счет индуцибельных RNAi. Они показали, что реактивация пути p53 приводит к регрессии ras-управляемых опухолей. Поразительно, они не установили признаков апоптоза, а вместо этого индукцию старения; SASP вызывает инфильтрацию клеток natural killer (NK) и др. прирожденные клетки эффекторы, чтобы элиминировать опухолевые клетки. Недавно, используя сходную модель, Iannello et al. (2013) показали, что рекрутирование NK клеток в опухоли, в которых был реактивирован p53, нуждается в chemokine CCL2 и то элиминация этих опухолевых клеток с помощью NK клеток зависит от присутствия на поверхности NK рецептора NKG2D, как известно, участвующего в противоопухолевом иммунитете. Однако, оба исследования использовали реципиентных мышей, лишенных реакции зрелых T-лимфоцитов. В контекстах, где все компоненты иммунной системы оставались интактными, было продемонстрировано, что специфичные к антигену CD4⁺ реакции T-лимфоцитов против активированных онкогенов являются критическими для избавления от стареющих клеток (Kang et al. 2011b). "Senescence surveillance" с помощью врожденных и адаптивных иммунных реакций, запускаемых с помощью паракринной передачи сигналов SASP, далее были продемонстрированы в нескольких иных модельных системах (Krizhanovsky et al. 2008; Acosta et al. 2013;Lujambio et al. 2013).

Интересно, было установлено, что незлокачественные клетки, включая инфильтрируемые иммунные клетки, получившие ранние неопластические повреждения, обнаруживали фокальную активацию p16 (Burd et al. 2013). Данные подтверждают, что паракринные активности из SASP не только рекрутируют иммунные клетки, но и также передают старение на них. Однако, исследователи полагают. что возможно не исключена вероятность, что иммунные клетки становятся старыми где-то, а затем преимущественно рекрутируются в возникающий неопластический регион (Burd et al. 2013). Во всяком случае, специфические роли программ старения в этих иммунных клетках нуждаются в дальнейшей оценке.

Помимо межклеточных коммуникаций, недавние доказательства также связывают старение с целостностью архитектуры ткани. Хроническое токсическое повреждение печни у мышей приводит к развитию печеночного фиброза, который напоминает хронические повреждения печени человека. В ответ на повреждения печени HSCs первоначально активируются, пролиферируют и развивают способствующий фиброзу секретом. Эти мыши обнаруживают накопление стареющих клеток, которые преимущественно происходят из HSCs (Krizhanovsky et al. 2008). Однако, когда активированные HSCs впоследствии становятся старыми, то профибротический секретом переключается на более типичный SASP-подобный секретом, содержащий как способствующие воспалению цитокины, так и энзимы, деградирующие матрикс; это в целом воспринимается как "fibrolytic," т.е. ограничивающий фиброз печени. У мышей, лишенных p53, HSCs неспособны подвергаться старению, продолжают пролиферировать и секретируют профибротические факторы, приводя к расширенному фиброзу печени. Более того, старение активирует HSCs и в конечном итоге приводит к элиминации с помощью надзора за старением (senescence surveillance), с помощью NK клеток (Krizhanovsky et al. 2008) или макрофагов (Lujambio et al. 2013). Т.о., соотв. время индукции старения и последующей с иммунитетом связанной очистки от HSCs, по-видимому, существенно для физиологического процесса репарации ткани печени.

Как запускается старение в HSCs, остается неизвестным. Однако недавнее исследование показало интересное взаимодействие между поврежденными гепатоцитами и активированными HSCs: экспрессия белка внеклеточного матрикса CCN1 усиливается и секретируется гепатоцитами после повреждения печени; CCN1 запускает старение в HSCs посредством связывания α6β1 integrin, рецептора для CCN1 (Kim et al. 2013). В более раннем исследовании той же группы было установлено, что CCN1 играет также важную роль в заживлении ран кожи, где CCN1 запускает старение локальных миофибробластов. Подобно старению HSCs в поврежденной печени, CCN1-индуцированные состарившиеся миофибробласты ограничивают чрезмерные степени фиброза (Jun and Lau 2010). Уровень CCN1 также, по-видимому, повышается и в др. связанных со старением тканях, таких как доброкачественная гиперплазия простаты (BPH) (Castro et al. 2003; Sakamoto et al. 2004). Было бы интересно узнать, является ли вовлечение CCN1 в старение и репарацию ткани более генерализованным, особенно к контексте опухолевых микроусловий.

Эти отличающиеся эффекты SASP не являются взаимно исключающими и внутри данных микроусловий комплекс межклеточных и клетка-ECM коммуникаций посредством набора SASP компонентов вызывает разные эффекты с зависимости от типа клеток и клеточных условий. Понимание и манипуляции с сетью эффектов такой сложной сигнальной сети как SASP, по-видимому, очень затруднительно, но расширяет наши возможности по модулированию нарушений, связанных со старением. Кроме того, недавнее исследование лаб. Schmitt (Dоrr et al. 2013) предоставило информацию о др. аспекте SASP, не связанном с его нижестоящими эффектами, а скорее с процессом синтеза белка, который провоцирует стресс эндоплазматического ретикулёма (ER).

Nucleus, chromatin, and gene regulation

Ядерный фенотип и паттерн генной экспрессии серьезно отклоняются во время старения, при этом подавляются гены клеточного цикла, усиливают свою активность гены-маркеры старения и наблюдаются ассоциированные со старением альтерации секретома (Shelton et al. 1999). Т.о., возможно, что старение связано с некоторыми уникальными механизмами регуляции генов. Напр., p16, функциональный биомаркер старения, негативно регулируется с помощью триметилирования гистона H3 Lys 27 (H3K27me3) и локализующие его белки из группы polycomb (Jacobs et al. 1999), этому противодействует JMJD3, деметилаза H3K27 (Agger et al. 2009;Barradas et al. 2009).

Др. пример регуляции генов, связанных со старением, показан в недавнем исследовании Chicas et al. (2010). Гены клеточного цикла в целом репрессируются, когда клетки арестовываются; т.о., их репрессия не является специфичной для старения. Среди семейства ретинобластомных белков (Rb, p107 и 30), вклад Rb в репрессию субнабора генов клеточного цикла (а именно, генов, участвующих в репликации ДНК) является уникальным для старения, тогда как все члены семейства Rb обнаруживают перекрывающуюся активность в репрессии этих генов во время покоя (Chicas et al. 2010). Это исследование предоставляет возможное объяснение, почему из семейства Rb сам Rb почти исключительно мутирует при раке, подчеркивая опухоль супрессирующую роль Rb, и при старении. Предложены некоторые механизмы для участия Rb's в регуляции генов, связанных со старением. Напр., опухолевый супрессор promyelocytic leukemia (PML), компонент PML ядерных телец (PML NBs, также известных как promyelocytic oncogenic domains [PODs]), является маркером старения: во время старения PML усиливает свою активность, увеличиваются размер и количество PML NBs (Table 1), и PML вносит вклад в старение посредством регуляции статуса p53 и Rb (Ferbeyre et al. 2000; Pearson et al. 2000; Bischof et al. 2002, 2005). Vernier et al. (2011) недавно показали, что Rb-E2F комплексы рекрутируются на PML NBs, где heterochromatin protein 1 (HP1) (Zhang et al. 2005) и Rb фосфатаза PP1α (protein phosphatase 1α) также находятся во время старения. Они показали, что избыточная экспрессия PML репрессирует некоторые мишени для E2F, чьи промоторы приспособлены для E2F, а также PML; поэтому исследователи предположили, что PML NBs являются местами зарождения (nucleation) гетерохроматина на E2F мишенях (Vernier et al. 2011). Было также показано, что Rb участвует в замалчивании E2F генов-мишеней во время старения, благодаря своей физической ассоциации с AGO2 (ключевым компонентом RNA-induced silencing complex [RISC]) и микроРНК (напр., let-7) (Benhamed et al. 2012).

Старение также часто ассоциирует с глобальными изменениями структуры хроматина и измененной экспрессией белков, затрагивающих структуры хроматина (Adams 2007). Напр., после индукции старения в HDFs, senescence-associated heterochromatic foci (SAHFs) становятся легко различимыми как отдельные DAPI-плотные фокусы, образование которых обычно зависит от пути Rb (Narita et al. 2003). Кроме того, субнабор генов, репрессируемых в стареющих клетках, обнаруживает увеличение репрессивных гистоновых меток в генных регионах (Narita et al. 2003; Di Micco et al. 2011; Sadaie et al. 2013). Эти исследования подтверждают некоторые корреляции между альтерациями в глобальной структуре хроматина и генной экспрессии, но как структура хроматина высокого порядка влияет на экспрессию специфических генов, остается неизвестным.

SAHFs

SAHFs первоначально были описаны при OIS и в меньшей степени при репликативном и вызванном повреждениями ДНК старении HDFs (Narita et al. 2003). SAHFs обогащены репрессивными эпигенетическими маркерами, такими как метилированная H3K9, HP1 и macroH2A, тогда как эухроматиновые метки исключены из SAHFs (Narita et al. 2003; Zhang et al. 2005). Серия исследований из лаб. Adams (Zhang et al. 2005, 2007;Ye et al. 2007a,b) показали, что в качестве раннего события старения необходима транслокация HIRA гистонового шаперонового комплекса на PML NBs для образования SAHF. Они также установили, что перемещение HIRA на PML тельца управляется с помощью подавления канонического сигнального пути Wnt (Ye et al. 2007a). SAHFs характеризуются также изменениями архитектурных белков хроматина, включая накопление HMGA белков и потерю линкерного гистона H1 (Funayama et al. 2006; Narita et al. 2006). Т.о., ряд факторов функционально или физически участвует в этом процессе.

Было предположено, что SAHFs состоят из индивидуальных хромосом (Funayama et al. 2006; Zhang et al. 2007), и что каждый фокус обладает многослойной структурой, которая состоит из H3K9me3 конституитивной гетерохроматиновой сердцевины, окружённой слоем H3K27me3 факультативного гетерохроматина (Chandra et al. 2012). Поразительно, наш геномный анализ этих двух репрессивных гистоновых меток показал, что структура SAHF возникает благодаря пространственной перестройке предсуществующего маркированного репрессивными метками хроматина.

Как глобальная структура старческого хроматина влияет на экспрессию индивидуальных генов? Можно предположить, что такой процесс, который четко отделен от конституитивного гетерохроматина, факультативного гетерохроматина и активного эухроматина в особые слои, будет создавать условия, при которых не только репрессия генов, но и также активация генов, смогут быть очень эффективно скоординированы и подкреплены (Chandra and Narita 2013). Т.о., возможно, что "локальные" модификации генного хроматина могут регулироваться отдельно, а альтерации "глобальной" структуры хроматина облегчают экспрессию генов в зависимости от состояния их хроматина и/или позиции. Di Micco et al. (2011) показали, что SAHF-подобные структуры могут сохраняться, когда обход OIS достигается с помощью истощения p53 или ATM. Следовательно, SAHF-подобные структуры могут также обеспечивать контекст-зависимые нижестоящие эффекты, очень сходные с SASP, которые также могут оставаться активными, когда стареющие клетки возобновляют пролиферацию за счет истощения p53 на фоне с низким содержанием p16 (Coppе et al. 2008). Di Micco et al. (2011) показали также, что SAHFs сдерживают DDR, подтверждая, что роль SAHFs не ограничена регуляцией генов.

Lamin B1

Ядерная пластинка, волокнистая структура под внутренней ядерной мембраной, участвует в интеграции ядерной структуры, хроматина и экспрессии генов. Ядерная ламина соматических клеток содержит два основных белка: A-type и B-type ламины (Dechat et al. 2010). Lamin B1 (LMNB1), как было установлено, специфически подавляется во время старения в HDFs (Shimi et al. 2011). Затем несколько исследований подтвердили уменьшение LMNB1 в разных типах стареющих клеток (Barascu et al. 2012; Freund et al. 2012;Dreesen et al. 2013; Sadaie et al. 2013; Shah et al. 2013). Однако функциональная взаимосвязь между изменениями в уровне LMNB1и старческими фенотипами, всё ещё неясна.

Степень, с которой старческий фенотип затрагивается модуляцией уровней LMNB1 варьирует от исследования к исследованию. Однако, RNAi-обеспечиваемое истощение LMNB1, по-видимому, ассоциирует со снижением клеточной пролиферации в разной степени у большинства (Shimi et al. 2011; Dreesen et al. 2013; Sadaie et al. 2013; Shah et al. 2013). Shimi et al. (2011) показали, что истощение LMNB1 достаточно, чтобы индуцировать старение посредством модуляции продукции reactive oxygen species (ROS). Парадоксально, они установили, что истощение LMNB1 приводит к уменьшению ROS p53-зависимым образом. Сходным образом, Barascu et al. (2012) показали, что увеличенные уровни LMNB1 ассоциируют с усилением активности ROS и старением. В целом, ROS, как полагают, является причиной клеточных повреждений и , как было установлено, ROS увеличиваются во время старения. Более того, высокие уровни экзогенных оксидативных стрессов могут вызывать старение (Passos et al. 2007). Однако растут доказательства, подтверждающие, что умеренные уровни ROS могут также вносить вклад в клеточную пролиферацию и жизнеспособность (Sena and Chandel 2012). Т.о., альтерации LMNB1 могут вносить вклад в тонкую настройку уровней ROS.

Shah et al. (2013) также показали индукцию старения с помощью истощения LMNB1 в HDFs. Они установили крупномасштабные домены хроматина, обогащенные H3K4me3 и H3K27me3 (наз. "mesas") и истощенные по H3K27me3 (наз. "canyons") в стареющих HDFs; они были скоррелированы с экспрессией ключевых генов, ассоциированных со старением. Интересно, что истощение по LMNB1 запускает эти mesas и canyons. Мы также наблюдали снижениеLMNB1 в стареющих HDFs и меланоцитах (Sadaie et al. 2013). Интересно, что, несмотря на глобальное снижение LMNB1, мы наблюдали перераспределение LMNB1 по геному; LMNB1 были преимущественно редуцированы в регионах, обогащенных H3K9me3 скорее, чем по H3K27me3, но имелись небольшие регионы (лишь 2% генома), где накапливался LMNB1. Гены внутри этих регионов с повышенным содержанием LMNB1, включали некоторые гены клеточного цикла, стремились быть репрессированными во время старения, при этом увеличивался H3K27me3 в телах генов. Кроме того, мы установили корреляцию между снижением LMNB1 (частично в регионах H3K9me3) и пространственным перемещением околоядерного гетерохроматина (обогащенного H3K9me3) и образованием SAHF. Эти исследования подтвердили, что альтерации LMNB1 могут также вносить вклад в старение посредством регуляции генов в некоторых специфических регионах.

По сравнению с истощением LMNB1, фенотипы, индуцированные с помощью эктопических LMNB1 были более гетерогенными в разных исследованиях: избыточная экспрессия LMNB1 или задерживает (Shimi et al. 2011) или усиливает старение (Barascu et al. 2012; Dreesen et al. 2013) или оказывает минимальный эффект на пролиферацию (Sadaie et al. 2013). Точные причины, лежащие в основе этих различий, неясны. Помимо упомянутой выше двойной роли ROS в пролиферации в зависимости от их уровней, тонкий баланс между LMNB1 и LMNA также может дифференциально вызывать нарушения в зависимости от системы (Hutchison 2012; Dreesen et al. 2013). Важно отметить, что, ассоциированные со старением, комплексы региональных альтераций геномного связывания LMNB1, зависящие от локального состояния хроматина, могут быть замаскированы за счет индуцированных глобальных уровней LMNB1.

Other chromatin alterations associated with senescence

Поскольку SAHFs охарактеризованы микроскопически, De Cecco et al.(2013) недавно идентифицировали др. тип альтераций хроматина, ассоциированных со старением, используя биохимический подход: formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE), метод геномного картирования открытых регионов хроматина. Они показали, в репликативном старении HDFs, общаяя конденсация хроматина происходит в эухроматических регионах, за исключением нескольких специфических генов. С др. стороны, повторяющиеся последовательности хроматина, включая основные классы ретротранспозонов, а также перицентромерные регионы, которые сильно сконденсированы в нормальных клетках, обнаруживают тенденцию оставаться открытыми в стареющих клетках. Деконденсация этих гетерохроматиновых регионов связана с экспрессией мобильных элементов (таких как LINE1 элементы), а их транспозиция происходит, особенно в поздние временные точки после индукции старения. Они также продемонстрировали деконденсацию околоцентромерного гетерохроматина у поздних стареющих клеток.

Ivanov et al. (2013) недавно показали потери хроматина во время старения. Они установили, что редукция LMNB1 и потеря целостности ядерной оболочки в стареющих клетках ассоциированы с появлением cytoplasmic chromatin fragments (CCFs). Имеется целенаправленная аутофагия для деградации, приводящая к снижению содержания гистонов. Снижение общего содержания гистонов наблюдалось и в глубоких (или "зрелых") частях невусов (nevi), модели in vivo OIS (Ivanov et al. 2013). Т.о., подобно перераспределению относительной конденсации хроматина, упомянутому выше, CCFs также появляются и в более поздних событиях во время старения. Физиологическое значение этих альтераций хроматина, ассоциированных с поздним и глубоким старением, ещё предстоит выяснить, или они может быть рассмотрены как "дегенеративные" альтерации, как предполагают исследователи (De Cecco et al. 2013; Ivanov et al. 2013).

Senescence and changes in cellular metabolism

Старение сегодня определяется по отсутствию прогресса клеточного цикла или пролиферации. Однако стареющие клетки часто увеличены, указывая на то, что они сохраняют способность к "гипертрофии". Т.о., по-видимому, отсутствует связь между клеточной пролиферацией и ростом во время старения. Кроме того, функциональные активности стареющих клеток вместе с en masse секрецией белков также подтверждают, что стареющие клетки метаболически чрезвычайно активны. Это было подтверждено недавним исследованием, которые измеряли различные аспекты метаболизма во время старения (Fig. 2).

Protein degradation pathways

Макроаутофагия (обозначаемая как аутофагия в данном обзоре ) является эволюционно законсервированным катаболическим процессом, использующим изоляцию цитоплазматических органелл и макромолекул за счет состоящих из двух мембран аутофагосом и их массовой деградации при слиянии с лизосомами (формирующим аутолизосомы) (Mizushima and Komatsu 2011). Аутофагия это куча неспецифических механизмов деградации цитоплазмы. Некоторый уровень специфичности грузов, направляемых на деградацию, управляется с помощью рецепторов аутофагии, включая p62 (также известен как sequestosome-1), NBR1 и Nix (Johansen and Lamark 2011). Основной уровень аутофагии играет важную роль для качественного контроля гомеостаза макромолекул и энергии, но он может быть также индуцирован в ответ на различные цитотоксические стрессы (Hoare et al. 2011). Увеличиваются данные, указывающие на существенную ассоциацию между старением и аутофагией в разных клеточных системах (Gerland et al. 2003; Gamerdinger et al. 2009;Sasaki et al. 2010; Capparelli et al. 2012; D?rr et al. 2013). Некоторые исследования касались функционального значения аутофагии при старении, где её роль, по-видимому, варьирует в зависимости от клеточного типа и пусковых механизмов старения (Patschan et al. 2007; Young et al. 2009; Leidal et al. 2012; Mosieniak et al. 2012; Singh et al. 2012; D?rr et al. 2013). Gamerdinger et al. (2009) показали постепенный сдвиг в пути деградации для полиубиквитинированных белков от протеосомного пути до аутофагии во время репликативного старения в HDFs. Др. исследования также предполагают значение др. функции аутофагии как механизма выживания, предоставляющего некоторый баланс между старением и гибелью клеток после начала клеточного стресса (Patschan et al. 2007). В самом деле, некоторые исследования показали, что ингибирование аутофагии облегчает старение (Kang et al. 2011a; Wang et al. 2012), но это может быть обусловлено частично потерей защитной роли аутофагии в клетке, это способствует эффекторам старения при некоторых стрессовых условиях, когда клетки не склонны к апоптозу.

Мы недавно показали, что аутофагия активируется во время динамичной фазы OIS в HDFs, это сопровождается согласованным усилением активности генов, участвующих в аутофагии и биогенезе лизосом (Young et al. 2009). Кинетика этих изменений в генной экспрессии была сходной с таковой для компонентов SASP, подразумевая некоторый уровень корреляции между аутофагией и SASP. В самом деле, ингибирование аутофагии супрессирует продукцию IL6 и IL8 и задерживает наступление старения. Наши данные подтвердили функциональную связь между двумя эффекторными программами, аутофагии и SASP, участвующих в старении, хотя мы не исключаем более непосредственную функциональную связь аутофагии с OIS. Как действует аутофагия, множество белков процесса деградации и SASP, которые представляют процесс массивного синтеза белков, действуют вместе? Ряд исследований показал, что mTOR, основной регулятор белкового синтеза, также положительно регулирует старение в разных системах (Demidenko et al. 2009; Blagosklonny 2012; Kolesnichenko et al. 2012; Pospelova et al. 2012;Garbers et al. 2013). Мы недавно показали, что субклеточная локализация аутофагии и mTOR могут играть ключевую роль в одновременной активации анаболических и катаболических процессов во время старения (Narita et al. 2011). mTOR является чувствительной к питательным веществам киназой, которая способоствует глобально трансляции белков и биогенезу рибосом и ингибирует комплекс ULK1, который инициирует формирование аутофагосом (Mizushima and Komatsu 2011). С др. стороны, было показано, что стимуляция аминокислотами запускает поставку mTOR на поверхность лизосом, где mTOR активируется Rag GTPase-зависимым способом (Sancak et al. 2008, 2010; Bar-Peled and Sabatini 2012). Т.о., mTOR ингибирует инициальную ступень аутофагии, тогда как последняя стадия аутофагии (аутолизосомы) может облегчать активацию mTOR. Интересно, что OIS ассоцирует с накоплением компартментов аутолизосом, где Rag GTPase-зависимая секвестрация mTOR коррелирует с повышенным образованием аутофаголизосом, а также с продукцией цитокинов (Narita et al. 2011). Хотя и не подтверждено, действительно ли актуальная киназная активность mTOR локализуется совместно с аутолизосомами во время старения, пространственная близость аутолизосом и mTOR (Tor autophagy spatial coupling compartment [TASCC]) может представлять собой механизм для одновременной активации белков деградации и "локального белкового синтеза" в определенных контекстах. Кластеры лизосом были также ассоциированы со старением в разных контекстах (Gerland et al. 2003; D?rr et al. 2013).

В дополнение к аутофагии, имеется второй основной путь деградации белка - протеосомный - также имеющий функциональное значение для фенотипа. Недавно было показано, что аберрантная передача сигналов Ras/ERK приводит к senescence-associated protein degradation (SAPD), мишенями которой являются белки, необходимые для хода клеточного цикла, клеточной миграции, митохондриальных функций, метаболизма РНК и передачи клеточных сигналов (Desch?nes-Simard et al. 2013). Инактивация индивидуальных мишеней SAPD достаточна для индукции старения. Т.о., помимо аутофагической "повальной" деградации, "избирательная" протеосомная деградация белков также играет важную роль в старении.

Дальнейшее доказательство связывает быстрый оборот белка и продукцию секреторных белков во время старения. В модели старения, вызываемой химиотерапией, продукция SASP ассоциировала с повышенными энергетическими потребностями, ER стрессом, реакцией в виде неупакованных белков и повышенной активностью аутофагии (D?rr et al. 2013). исследователи предположили, что чрезвычайно активный SASP подавляет клеточную способность синтеза и преобразования секреторных белков, приводя тем самым к proteotoxic стрессу, который может быть ослаблен одновременной активацией аутофагии зависимым от энергии способом. Данные также подтвердили, что увеличение потребления кислорода (и тем самым вообще-то продукцию АТФ) во время старения является зависимым от аутофагии. Т.о., therapy-induced senescent (TIS) клетки являются наиболее чувствительными к прерыванию поступления экзогенной энергии или к аутофагии, чем нормальные клетки или несекреторные стареющие клетки. Это исследование предоставило дополнительную точку зрения функционального взаимоотношения между анаболическими и катаболическими процессами, которые одновременно активируются во время старения. Это указывает на то, что SASP и энергия необходимы для их продукции, обеспечивая потенциальный механизм очистки стареющих клеток независимо от нижестоящих функций каждого из секретируемых белков.

Mitochondria metabolism

Помимо активного метаболизма белков, описанного выше, недавние сообщения показали, что митохондриальный оксидативный метаболизм усиливается в стареющих клетках, подтверждая метаболические потребности этих клеток (D?rr et al. 2013; Kaplon et al. 2013). Совместное исследование групп Peeper и Gottlieb (Kaplon et al. 2013) недавно определяло метаболический профиль стареющих HDFs, вызываемых онкогеном BRAFV600E. Оно показало, что pyruvate dehydrogenase (PDH) играет ключевую роль в OIS. Пируват является последним продуктом гликолиза, а PDH превращает пируват в acetyl-CoA, который вступает в TCA цикл клеточного дыхания. Т.о., PDH располагается в месте соединения между гликолизом (анаэробной реакцией в цитоплазме) и циклом TCA (аэробной реакцией внутри митохондрий). Активность PDH тонко настраивается с помощью двух энзимов, PDH kinases (PDKs) и PDH phosphatases (PDPs), которые ингибируют и активируют PDH, соотв. Во время OIS, вызываемого с помощью BRAFV600E, PDH активируется посредством супрессии PDK1 и индукции PDP2, приводя к повышенной активности цикла TCA и сопутствующему потреблению кислорода. Сходное увеличение активности PDHи потребление кислорода наблюдается во время RasG12V-индуцированного старения, хотя в этом контексте уровни PDK1 и PDP2, по-видимому, не изменены. Активация PDH не просто следствие OIS, поскольку активации PDH с помощью истощения PDK1 достаточна для индукции старения в HDFs, как и эктопическая экспрессия PDK1 для OIS. Интересно, что активация PDH, по-видимому, токсическое событие даже в BRAFV600E-управляемых клетках меланомы, которые уже обошли OIS, указывая тем самым, что ось PDK1-PDP2-PDH не только критическая для супрессии опухоли, но и также потенциальная мишень для лечения опухолей.

C др. стороны, имеется связь между старением и дисфункцией митохондриального метаболизма (Passos et al. 2007). Необычайно, было показано, что клеточные уровни АТФ снижаются посредством митохондриальной дисфункции при OIS в HDFs (Moiseeva et al. 2009). Кроме того, при репликативном старении HDFs, описано частичное разобщение оксидативного фосфорилирования в митохондриях; т.о., даже если потребление кислорода увеличивается, продукция АТФ может быть не эффективной (H?tter et al. 2004). Хотя группы Peeper и Gottlieb (Kaplon et al. 2013) не сообщили об действительных уровнях продукции АТФ в OIS клетках, др. недавнее исследование D?rr et al. (2013) показало увеличение продукции АТФ в TIS лимфомах и OIS HDFs. Они показали, что скорость гликолиза, как и потребления кислорода увеличивается в этих условиях и что усиленная продукция энергии является критической для жизнеспособности стареющих клеток. Причины кажущегося расхождения между ранними и недавними исследованиями способности митохондрий в продукции энергии, неясны. Изменения метаболических профилей в ответ на онкогенные или генотоксические стрессы могут быть очень чувствительны к интенсивности и/или продолжительности такого стресса. Т.о., легкие отличия в экспериментальных системах могут затрагивать одномоментные срезы профилей. Во всяком случае, все исследования в общем определяли усиление активности ROS, которые оказались сопричастны в качестве критического посредника старения (Lee et al. 1999; Lu and Finkel 2008; Moiseeva et al. 2009).

Как гиперактивный цикл TCA и продукция энергии вносят вклад в старение? Возможно, что увеличение ROS облегчает этот процесс. Кроме того, как полагают, D?rr et al. (2013) повышение продукции энергии клетками, по-видимому, является стратегией для обслуживания энергетических потребностей эффекторов старения, включая SASP и аутофагию. Более того, гликолиз (анаэробный процесс) и цикл TCA (аэробный процесс) благоприятствуют синтезу биомассы и генерации энергии, соотв., а их баланс является критическим для клеточной пролиферации. Гиперактивный цикл TCA не только усиливает продукцию ROS, но и также нарушает синтез биомассы (необходимый для пролиферации клеток), такой как продукция липидов, нуклеотидов и аминокислот (Vander Heiden et al. 2009). Кроме того, рассматривая недавние доказательства, что метаболиты, происходящие из цикла TCA, такие как succinate, fumarate и α-ketoglutarate, оказывают выраженные эффекты на регуляцию транскрипции (Kaelin and McKnight 2013), также время предположить, что эти метаболиты или сдвиг в их балансе могут влиять на фенотип посредством их клеточных эффектов.

Недавнее исследование Jiang et al. (2013) показало, что нарушения malic enzymes (MEs), ассоциированные с циклом TCA, модулируют старение. MEs важны для продукции NADPH, который необходим для синтеза биомассы, напр., продукции липидов. Они показали, что MEs являются репрессируемыми мишенями для p53 и что истощение MEs реципрокно активирует p53, индуцируя тем самым p53-зависимое старение в HDFs, тогда как их эктопическая экспрессия задерживает репликативное старение. Хотя последствия истощения ME, по-видимому, зависят от типа клеток (Jiang et al. 2013), возможно, что истощение MEs переводит метаболизм malate на продукцию NADH, который является главными донором цепочки транспорта электронов, которая управляет продукцией АТФ в митохондриях. Кроме того, NADPH является восстановителем (reducing agent); т.о., истощение MEs должно также усиливать оксидативные стрессы. В самом деле, Jiang et al. (2013) обнаруживают повышенную продукцию ROS после нокдауна MEs (ME2 в частности) в HDFs. Было бы интересно узнать, связаны ли функционально гиперактивное митохондриальное дыхание и реципрокная регуляция p53 и ME (Fig. 2).

Senescence stability

Старение ранее определяли такими терминами, как "постоянный арест" или "необратимый выход из клеточного цикла." Однако часто задаваемый вопрос относительно старения: "действительно ли старение необратимо?" В культуре, покоящиеся клетки могут быстро возобновлять свой клеточный цикл после устранения ингибирующих эффектов, таких как низкий уровень сыворотки или контактное ингибирование; стареющие клетки являются устойчивыми к подобным воздействиям (Seshadri and Campisi 1989, 1990; Serrano et al. 1997). Отсутствие реакции на стимуляцию факторами роста в особенности подкрепляет стабильность ареста OIS клеток, где передача сигналов от стимулов ростовых факторов нижестоящим мишеням постоянно активна. Это верно и in vivo? напр., в меланоцитных невусах, которые части обладают онкогенными мутациями BRAFV600E.

Однако попытки строго исследования стабильности старения показали, что стабильность ареста клеточного цикла также варьирует в зависимости от клеточного контекста. Было показано, что репликативное старение в BJ кожных фибробластах может быть обращено после истощения p53 (Beaus?jour et al. 2003). Это согласуется с мнением, что персистирующий DDR вносит вклад в поддержание фенотипа старения прежде всего посредством пути p53 (d'Adda di Fagagna 2008). По сравнению со стареющими BJ клетками, которые обнаруживают тенденцию относительно низкой экспрессии p16, попытки обратить старение в WI38 легочных эмбриональных фибробластах, в которых p16-Rb путь интактен, оказались безуспешными (Beaus?jour et al. 2003). Интересно, что вообще-то обусловленные отличающейся активностью пути p16-Rb, WI38 клетки также оказались более SAHF-компетентными. Как упоминалось ранее, формирование SAHF в основном зависит от пути p16-Rb, но не от пути p53 в OIS HDFs (Narita et al. 2003). Если обсуждение выше корректно, что SAHF-подобная сегрегация хроматина, обусловленная его эпигенетическими маркерами, ассоциирует с эффективным поддержанием профиля генной экспрессии (для конституитивно экспрессируемых и репрессированных), SAHFs, , по крайней мере, частично может вносить вклад в устойчивость старения к удалению персистирующего p53 сигнала.

Др признак стабильности старения - это арест, происходящий из области репрограммирования клеток. В 2009, 6 исследований показали, что пути p53 и INK4A активируются во время генерации induced pluripotent stem (iPS) клеток с использованием классических 4-х факторов OCT4, SOX2, KLF4 и c-MYC (или трех факторов без c-MYC). Итак, они установили, что старение может быть барьером для репрограммирования при генерации iPS клеток из фибробластов (Banito et al. 2009; Hong et al. 2009; Kawamura et al. 2009; Li et al. 2009; Mari?n et al. 2009; Utikal et al. 2009). Недавно, однако, iPS клетки были успешно сгенерированы из HDFs с репликативным старением со скоростью, сравнимой с таковой у их пролиферирующих аналогов (Lapasset et al. 2011). Для этого были добавлены два др. ключевых регулятора характеристик эмбриональных стволовых клеток, NANOG и LIN28, к 4-м классическим; следовательно, стареющие клетки может быть репрограммированы при оптимальных условиях. Интересно, что исследователям потребовалось, чтобы по время репрограммирования стареющих клеток, исчезновение SAHFs предшествовало восстановлению пролиферации, подтверждая роль SAHFs в поддержании ареста старения.

Senescence in vivo

OIS интенсивно исследовался в культуральных системах, с тех пор, как оно впервые было описано в деталях (Serrano et al. 1997). В 2005, серия исследований идентифицировала OIS и родственный ему фенотип, потерю опухолевого репрессора, вызванную старением (напр., с помощью PTEN loss-induced cellular senescence [PICS]) (Alimonti et al. 2010) при некоторых предраковых повреждениях у мышей и человека (Braig et al. 2005; Chen et al. 2005;Collado et al. 2005; Lazzerini Denchi et al. 2005; Michaloglou et al. 2005), подкрепляя роль старения в супрессии опухолей (Narita and Lowe 2005). Однако как иллюстрируют разнообразные активности SASP, роль влияния старения на туморогенез нуждается в тщательной оценке, исходя из суммарного воздействия на опухолевые микроусловия в целом. Воздействие стареющих клеток на микроусловия было показано в контексте повреждения и репарации ткани (see "Functions of the SASP") (Krizhanovsky et al. 2008; Jun and Lau 2010; Kim et al. 2013).

Репликативное старение, прототипический фенотипа, использует "время"; поэтому оно часто обозначается как "клеточное старение." Неудивительно, что старение давно подозревается как играющее роль в старении организма и снижении функции органов с возрастом (Rudolph et al. 2000; Cristofalo et al. 2004). В самом деле, маркеры старения, включая SA-β-Gal, DDR, дисфункцию теломер и p16, были обнаружены в различных тканях старых индивидов (Dimri et al. 1995; Krishnamurthy et al. 2004;Herbig et al. 2006; Jeyapalan et al. 2007; Flores et al. 2008) и в зависимых от возраста болезнях органов у млекопитающих (Minamino et al. 2002; Price et al. 2002). Такое зависимое от возраста усиление активности p16 было также подтверждено с использованием мышиных моделей с p16 репортером (Yamakoshi et al. 2009; Burd et al. 2013). Но играет ли клеточное старение (senescence) причинную роль в старении организма(aging)? Серия исследований проведена в 2006 касательно этого важного вопроса (Janzen et al. 2006; Krishnamurthy et al. 2006; Molofsky et al. 2006). Они показали, что p16 повышает свою активность в тканевых компартментах стволовых клеток и клеток предшественников, таких как гематопоэтические стволовые клетки (HSCs), клетки панкреатических островков и нервные стволовые клетки зависимым от возраста способом и тем самым ограничивает их регенеративную способность. p16 является CDK inhibitor (CDKI) и поэтому ингибирует ход клеточного цикла. По сравнению с др. CDKIs, он очень специфичен для старения и возможно является одним из лучших "функциональных" биомаркеров старения. В самом деле, они показали, что генетическое устранеие p16 восстанавливает регенеративную способность в тих тканевых стволовых клетках и клетках предшественниках до некоторой степени. Эти исследования подтверждают причинную роль клеточного старения для старения организма, по крайней мере, на уровне органов.

Соотв. , Baker et al. (2008) показали, что дефицит p16 ослабляет фенотип старения организма в ряде тканей, когда p16 активируется у BubR1 гипоморфных прогероидных мышей. Вместо того, чтобы задерживать клеточное старение путем истощения p16, та же самая группа использовала др. стратегию элиминации p16-позитивных стареющих клеток. Они создали элегантную мышиную модель, в которой p16-позитивные стареющие клетки были индуцибельными и убивались избирательно (Baker et al. 2011). У тех же самых прогероидных мышей устранение в течение всей жизни или только в поздний период жизни p16-экспрессирующих стареющий клеток задерживало наступление связанных с возрастом фенотипов в тканях, чувствительных к p16. Конечно, Baker et al. (2008, 2011) показали, что в противовес случаям устранения p16, которые ускоряли развитие опухолей лёгких на гипоморфном BubR1 фоне, устранение p16-экспрессирующих стареющих клеток не приводило к очевидным побочным эффектам. Т.о., удаление стареющих клеток представляет собой перспективный подход для терапии старения. Однако в то же время эти исследования также показывают существование p16-независимых ассоциированных с возрастом фенотипов, по крайней мере, в BubR1 гипоморфных прогероидных моделях.

Благотворный эффект элиминации p16-экспрессирующих стареющих клеток неким образом напоминает фенотип super-Arf/p53 (s-Arf/p53) мышей, которые обладают обычным образом регулируемыми одиночными дополнительными дозами генов Arf и p53 (Matheu et al. 2007). Средняя продолжительность жизни s-Arf/p53 мышей достоверно длиннее, чем контрольных мышей дикого типа, хотя максимальные продолжительности жизни сходны. Такой эффект предотвращения старения при добавочных Arf/p53, по-видимому, не зависит от их эффектов по супрессии опухолей. Точный механизм этого эффекта против старения полностью неясен. Как полагают исследователи, некоторые гены мишени для p53 при физиологических условиях обладают глобальным анти-оксидантным эффектом, который помогает частично ослаблять старение (Matheu et al. 2007). Можно предположить, что добавочные дозы этих опухолевых супрессоров могут вноситьь вклад в эффективность очистки от стареющих клеток.

Concluding remarks

Recent advances in our understanding of senescence suggest that what once was thought to be an endpoint of stress response has a functional relevance in various pathophysiological contexts, including aging and age-associated diseases, inflammation, and tissue repair. In addition, identification and characterization of senescence effector programs such as the DDR, the mTOR/autophagy signal network, the protein secretory program, and epigenetic gene regulation, which are shared with other physiological contexts, have been promoting interdisciplinary approaches to tackle this complex phenotype. A challenge is to understand senescence as a high-order network of these different pathways and molecules. The diversity in the quality of the phenotype according to the combination of the effector mechanisms and biomarkers may seem to make the definition of senescence obscure. Unfortunately, there is no such thing as a "senescence score." The recent approach using "high content analysis" to study senescence might improve our skill for diagnosing senescence, at least in vitro (Acosta et al. 2013). Further understanding of the "senescence network" will be required to obtain more systematic and quantitative tools for senescence diagnosis. Such advances in understanding senescence would also extend our opportunity to modulate this complex phenotype in various pathophysiological contexts.

The SETD8/PR-Set7 Methyltransferase Functions as a Barrier to Prevent Senescence-Associated Metabolic Remodeling.
Hiroshi Tanaka, Shin-ichiro Takebayashi, Akihisa Sakamoto, Tomoka Igata, Yuko Nakatsu, Noriko Saitoh, Shinjiro Hino, Mitsuyoshi Nakao.
Cell Reports, 2017; 18 (9): 2148 DOI: 10.1016/j.celrep.2017.02.021

Фермент, блокирующий клеточное старение, и его механизмы были открыты коллективом из Kumamoto University в Японии. Они установили, что снижение энзима SETD8, который регулирует пролиферацию клеток и функцию генов, приводит к раннему проявлению признаков старения.

Многие типы клеток тела в конечном итоге прекращают свою пролиферацию, т.к. их способность делиться уменьшается. Это, т. наз. клеточное старение и является важным фактором, связанным с процессом старения и продолжительностью жизни. Хотя существуют различные этиологии клеточного старения, механизм всё ещё недостаточно понятен. В частности, вызываемое стрессами клеточное старение происходит, когда геномная ДНК повреждена физическими факторами, такими как радиация или с помощью химических соединений, воздействующих на ДНК. Кроме того, когда клетки превращаются в канцерогенные, то происходит клеточное старение, чтобы предупредить начало возникновения рака. К сожалению, увеличение возраста облегчает это становление болезни, так что важным является собственно контроль этой специфической клеточной функции.

Стареющие клетки гипертрофируются и приобретают уплощенную морфологию и теряют свою пролиферативную способность. В последние годы было установлено, что стареющие клетки секретируют разнообразные белки, которые иногда способствуют хроническому воспалению, а также развитию рака, действуя на окружающие клетки. Поскольку стареющие клетки более активны, чем предполагалось, то клеточное старение рассматривается как причина феномена старения всего тела. Напр., сообщалось, что конгда стареющие клетки старых мышей удаляли, то супрессировалось старение всего тела. Др. словами, если мы сможем устранять клеточное старение, то можно контролировать старение всего тела.

Исследователи из Kumamoto University изучали механизмы клеточного старения с точки зрения эпигенетики, области исследований изменений экспрессии генов с помощью молекулярных модификаций. Они просеивали факторы, связанные со старением клеток культивируемых фибробластов человека (cells in connective tissue which aid in cell proliferation, differentiation, and repair), используя разные подходы. Они установили, что фермент SETD8 метилтрансфераза, которые добавляет метилирование гистона H4 по лизину 20 (H4K20), регулирует признаки старения генов.

Нормальные клетки прекращают пролиферацию после многократных делений (репликативное старение), и когда онкогены активируются для индукции рака, то возникает старение, чтобы предупредить это (онкогеном индуцируемое старение). В последнем случае SETD8 был описан, как регулируюзий клеточную пролиферацию и функцию генов посредством монометилирования H4K20, но его связь с клеточным старением оставалась неизвестной. Однако, было установлено, что SETD8 заметно снижен в стареющих клетках. Когда они осуществили эксперименты по нокдауну гена (использовав RNA interference), чтобы супрессировать функцию SETD8 в фибробластах, то клеточное старение возникало с типичными признаками. Более того, используя лекарство, подавляющее активность фермента SETD8, появлялись сходные стареющие клетки. Др. словами, SETD8 играет роль в предупреждении клеточного старения.

Исследователи затем осуществили затем сложный анализ экспрессии всех генов в стареющих клетках со сниженным уровнем SETD8. Результаты показали, что присутствует экспрессия генов, участвующих в клеточном старении, особенно генов для рибосомальных белков и рибосомальных РНК, ответственных за синтез клеточных белков, и генов, белки которых ингибируют пролиферацию клеток. Это показало, что потеря SETD8 усиливает синтез белков и арест роста стареющих клеток посредством регуляции генов.

Стареющие клетки нуждаются в больших количествах энергии для поддержания клеточных функций, таких как синтез и секреция белка. Исследователи прежде сообщали, что продукция энергии в митохондриях заметно увеличена в стареющих клетках (Takebayashi et al. Aging Cell, 2015). Теперь исследователи установили, что активация митохондрий активируется с помощью SETD8, а микроскопические наблюдения подтвердили, что ядрышко и митохондрии оказались удивительно развиты в истощенных по SETD8 клетках. Следовательно, старение клеток и соотв. их метаболические активности ускоряются при снижении SETD8.

Cellular senescence and its effector programs Rafik Salama, Mahito Sadaie, Matthew Hoare and Masashi Narita Genes & Dev. 2014. 28: 99-114

Cellular senescence and its effector programs
Rafik Salama, Mahito Sadaie, Matthew Hoare and Masashi Narita
Genes & Dev. 2014. 28: 99-114