Посещений:
ТРАНС-ГОЛЬДЖИ-СЕТЬ

Сортировка и транспорт секретируемых белков

Secretory cargo sorting at the trans-Golgi network
Christine Kienzle, Julia von Blume
Trends in Cell Biol. Volume 24, Issue 10, October 2014, Pages 584-593

Sorting of proteins for secretion from cells is crucial for normal physiology and the regulation of key cellular events. Although the sorting of lysosomal hydrolases at the trans-Golgi network (TGN) for delivery to pre-lysosomes is well characterized, the corresponding mechanism by which secreted proteins are sorted for plasma-membrane delivery remains poorly understood. Recent discoveries have revealed a novel sorting mechanism that requires the linkage between the cytoplasmic actin cytoskeleton to the membrane-anchored Ca2+ ATPase, SPCA1 (secretory pathway calcium ATPase 1), and the luminal 45 kDa Ca2+-binding protein, Cab45, for successful sorting of a subset of proteins at the TGN. We review progress in understanding these processes.


Protein secretion at a glance


Секреция белков является важной для межклеточных коммуникаций и для установления и поддержания целостности ткани. Секретируемые белки включают сигнальные молекулы, такие как гормоны, цитокины и хемокины, а также внеклеточные матричные белки, такие как коллагены, которые предоставляют структурную и биохимическую поддержку, окружающую клетки, и играют основную роль в клеточной адгезии, межклеточных коммуникациях и дифференцировке. Дефекты в высвобождении этих белков лежат в основе нарушений, включая аутоиммунные заболевания [1], рак [2], нейрологические болезни [3], диабет [4] и скелетные дисплазии [5]. Большинство исследований сфокусировано на нижестоящих свойствах этих белков, но мало известно о механизме контроля их экспорта из аппарата Гольджи.
Большинство секретируемых белков содержат сигнальную последовательность, которая направляет их в эндоплазматический ретикулум (ER) во время синтеза [6]. Здесь они транслоцируются в просвет ER и своевременно укладываются, перемещаются в покрытые coat protein complex II (COPII) пузырьки, чтобы проникнуть в аппарат Гольджи. После прохождения через мембраны Гольджи белки сортируются в TGN для транспорта их в соотв. клеточные компартменты или для секреции с помощью специфических транспортеров 7-9. В зависимости от типа клеток, эти места предназначения включают апикальную и базолатеральную поверхность клетки, ранниеЪсортинг эндосомы, поздние эндосомы, рециклинг эндосомы, гранулы хранения секрета, предшествующие компартменты Гольджи и ER 10 and 11 (Figure 1), указывающие, что каждое предназначение, по крайней мере, может использовать определенный тип пузырьков [12].

Figure 1. Protein trafficking and sorting in the secretory pathway. Proteins containing a signal sequence are translocated across the endoplasmic reticulum (ER) membrane. After folding in the ER, proteins have two fates: either they become ER-resident proteins or leave the ER in coat protein complex II (COPII)-coated vesicles towards the Golgi apparatus via the ER Golgi intermediate compartment (ERGIC). After traversing the cis and medial Golgi compartments, proteins enter the trans-Golgi network (TGN), an important sorting station. Here proteins have to be sorted and packaged into transport carriers to reach their final destinations. Numerous TGN exit routes have been described: proteins packaged into clathrin-coated vesicles are transported to the endosomes, whereas constitutively secreted cargo or transmembrane proteins are transported towards the apical or basolateral plasma membrane. In specialized cells, proteins leave the TGN to be stored in secretory storage granules. These granules fuse with the plasma membrane primarily in response to an extracellular stimulus. Retrieval of ER proteins is carried out by COPI vesicles.

TGN organization and cargo export


TGN генерирует огромное количество разных носителей, которые приспособлены для переноса грузов в разные клеточные компартменты и на разные клеточные поверхности для секреции. В самом деле пузырьки, идентифицированные, как отпочковавшиеся от TGN являются пузырьками, покрытыми клатрином, перемещающимися в направлении пре-лизосом [12], как пузырьки, предназначенные для доменов апикальной и базолатеральной мембраны в поляризованных и не поляризованных клетках [13] и как секреторные гранулы [14]. Важно понять, как распределены эти молекулы и связаны с организацией TGN.
Структура и размер TGN варьирует межу разными типами клеток [15]. В большинстве клеток TGN представлена сетью трубочек, которые возникают из последних двух транс цистерн [10]. В противоположность экспорту из ER, который происходит из стабильных экспортных доменов, называемых места выхода из ER [16], экспорт из TGN, по-видимому, более сложный. Высоковольтная электронная микроскопия в комбинации с компьютерной осевой томографией выявила существование разных доменов TGN [17], названных 'exit domains', которые состоят из варьирующих типов везикулярных и тубулярных носителей, обогащенных грузом и аппаратами почкования, но лишены белков, характерных для Гольджи [18]. В самом деле, clathrin-покрытые пузырьки, способствующие транспорту mannose-6-phosphate receptors (MPR) в эндосомы выглядят как испускаемые из последней цистерны TGN и происходящих из него трубочек. Более того, в нормальных эпителиальных клетках почек крыс (NRK) предпоследние две цистерны декорированы 'кружево образной' оболочкой, которая, как полагают, представляет собой экспортный домен для отправки пузырьков на поверхность клеток 17 and 19. В частности, эпителиальные клетки, которые выстилают поверхность органов обнаруживают поляризованное распределение белков и липидов на своей апикальной и базолатеральной клеточной поверхности. Интересно, что такое поляризованной разделение также происходит в неполяризованных клетках 20 and 21, указывая, что задействованы сходные пути в обоих типах клеток.
Получение наглядного представления о носителях, предназначенных для переноса на клеточную поверхность в живых клетках выявило структуры разных и гетерогенных размеров и форм 22 and 23. Однако оставалось неясным, избыточно экспрессируемые грузовые белки, используемые для детекции этих структур, действительно ли влияют на наблюдаемые структуры. Новый класс транспортных носителей идентифицирован недавно CARTS (carriers from the trans-Golgi to the cell surface), он привносит новое понимание состава носителей [24]. CARTS транспортируют PAUF (pancreatic adenocarcinoma upregulated factor) and LysC (lysozyme C), но не collagen I и vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G), из Гольджи на клеточную поверхность (Figure 2). Эта находка предоставляет четкое доказательство, грузовые молекулы сортируются и выходят из определенных доменов TGN, создаваемых с помощью уникального микроокружения из белков и липидов, к которым определенные молекулы груза обнаруживают избирательное сродство. Эти домены состоят из липидов, таких как phosphoinositides, sphingolipids и cholesterol [25], и/или декорированы определенными оболочками, прикреплениями и GTPases, необходимыми для сортировки грузов и генерации пузырьков [18]. Образование этих доменов экспорта, скорее всего, высоко динамично и может зависеть притока груза. Более того, некоторые из этих доменов могут быть использованы экспортные переносчики [10].

Figure 2. Sorting of secretory proteins at the TGN is poorly understood. There are two well-described sorting principles at the TGN. This is the (A) receptor-mediated sorting of lysosomal hydrolases via M6P (Mannose-6-Phosphate) and the M6P receptor (M6PR) to the lysosome via endosomes, in clathrin-coated vesicles. Another class of soluble proteins is sorted via sortilin and clathrin to endosomes, eventually arriving to lysosomes. A specific signal in these proteins is recognized by sortilin, thereby permitting their sorting. Another process is the sorting of proteins destined to secretory storage granules (B). These molecules aggregate in the presence of low pH and Ca2+ in the TGN and these aggregates condense and mature from immature storage granules (ISG) into mature storage granules (MSG). CARTS transport Lysozyme C and PAUF to the cell surface (C). How other soluble secretory proteins destined to the apical and basolateral cell surface are sorted remains poorly understood (D).

Хотя считается, что существует множество классов пузырьков, происходящих из TGN, задачей исследователей является идентификация маркеров этих пузырьков, что позволит их охарактеризовать и возможно очистить. Более того, необходимо установить, существуют ли разные домены для разных классов секретируемых белков.

TGN sorting of soluble proteins


TGN отвечает за сортировку секретируемого, а также трансмембранного груза или белков, прикрепленных к мембранам, напр., с помощью glycosyl phosphatidyl inositol (GPI) якорей. На сегодня предложены несколько моделей того, как трансмембранные белки сортируются в TGN (Box 1), для получения деталей рекомендуем прекрасные обзоры и исследовательские статьи 13, 26-28. Здесь же мы сфокусируемся на сортировке секреторных белков.

Box 1. Principles of sorting of transmembrane proteins at the TGN

  • During transmembrane protein sorting, adaptor proteins (APs) are recruited to the TGN membrane by Arf GTPases. APs then recognize sorting signals in the cytosolic domains of transmembrane proteins. At the TGN, for instance AP-1 attaches clathrin to the membrane and recruits accessory proteins that regulate vesicle formation [86]. In polarized cells it was shown that the clathrin adaptor protein 1-A (AP-1A), which is ubiquitously expressed [87], localizes to phosphatidyl inositol 4-phosphate (PI4P) and Arf-1 enriched TGN domains 88 and 89, as well as to early endosomes, and is required for endosomal targeting. Proteins that travel to the basolateral cell surface in an AP-1B-dependent manner 87 and 90first move from the TGN into recycling endosomes in a Rab13-dependent manner before they are transported to the basolateral membrane 91 and 92. However, it was also suggested that AP-1A and AP1-B localize indistinguishably to the TGN and recycling endosomes, and only differ in their selectivity/affinity for particular cargo motifs [93]. Indeed, endosomal and some basolateral-directed proteins contain tyrosine-based residues (NPXY or YXX? motifs) and domains that contain two leucine residues [(DE)XXL(LI)] or DXXLL consensus motifs that bind to AP-1 94 and 95. It has also been suggested that AP-1 together with the Arf-related protein Arfrp1/Arl-3 is required for the export of the planar cell polarity signaling molecule Vangl2 from the TGN to the plasma membrane through a YYXXF motif [96]. Another adaptor protein at the TGN is AP-4, which binds the [YX(FYL)(FL)E] motif. In contrast to other APs, AP-4 does not assemble clathrin coats but seems to be required for the sorting of a subset of neuronal cargoes [28].
  • The sorting of proteins destined to the apical cell surface was suggested to occur in lipid raft domains, which are dynamic, nanometer-sized, sterol/sphingolipid-enriched lipid-protein assemblies [97] that can be induced to form stable lipid platforms at the TGN [98]. In addition, the length and the asymmetric amino acid composition of integral membrane proteins, and consequently the lipid bilayer thickness, determine the Golgi retention of transmembrane proteins [99].
  • In yeast, the exomer, a coat protein complex, is required for the transport of chitin synthase Chs3p and Fus1p from the late Golgi membrane to the plasma membrane 100 and 101. However, there are no known orthologs of exomer in higher eukaryotes.




    • Sorting by selective aggregation


    Профессиональные секреторные клетки, такие как нейроэндокринные клетки, синтезируют и преобразуют пептидные гормоны, которые хранятся в секреторных накопительных гранулах. Эти гранулы сливаются с плазматической мембраной и высвобождают своё содержимое во внеклеточное пространство в ответ на внеклеточные стимулы [14]. Сортировка этих регулируемых грузов в TGN стала главной в исследованиях последних 30 лет 29-32.
    Разнообразные белки, предназначенные для сортировка в секреторные накопительные гранулы формируют крупные комплексы и агрегаты внутри просвета TGN; низкий pH (~6.4) этого компартмента способствует образованию таких кластеров, которые сегрегируют от др. растворимых белков в TGN. Т. наз. immature secretory granules (ISG) отпочковываются от TGN и превращаются в зрелые секреторные гранулы (MSG), которые содержат белковую плотную сердцевину (Figure 2). Неправильно отсортированные не гранулярные белки постепенно погружаются в пузырьки, покрытые клатрином, это в конечном счете приводит к правильному попаданию белкового груза в MSGs [33]. Способность регулируемого секреторного груза, такого как granins, формировать агрегаты часто является врожденным свойством их белковых структур. Напр., они содержат многочисленные кислые аминокислоты, которые управляют образованием кластеров в присутствии millimolar Ca2+ и слегка кислого pH в TGN [34]. Эти комплексы granin взаимодействуют непосредственно или косвенно с просветными мембранными доменами, богатыми холестеролом и сфинголипидами в TGN. Такое взаимодействие обеспечивает движущими силами для индукции отпочкования от TGN мембран, чтобы сформировать ISGs [35].
    Было предположено, что сортировка в направлении апикальной поверхности базируется на агрегации N-сцепленных и O-сцепленных glycans из белков и липидов. Эти агрегаты затем связывают лектины, такие как galectin-3, которые действуют как сортирующие рецепторы и направляют гликопротеины в апикальные транспортные пузырьки [36].

    Receptor-mediated luminal protein sorting at the TGN


    Сортировка белков в секреторные накопительные гранулы, как полагают, также происходит способом, зависимым от сортировки рецепторов. Было предположено, что carboxypeptidase E (CPE) [37] сортируется в секреторные накопительные гранулы путем взаимодействия с коротким α -спиральным доменом в мембране гранул [32]. "Закрепленные" на мембране CPE, как полагают, взаимодействуют с несколькими грузовыми белками, включая proenkephalin, proinsulin, proopiomelanocortin (POMC) [38] и brain-derived neurotrophic factor (proBDNF) [39] для поставки в секреторные накопительные гранулы. Было также установлено, что secretogranin III (SGIII) взаимодействует с мембранными доменами, богатыми холестеролом, в TGN и соединяется с chromogranin A (CgA) и др. прогормонами и вместе с CPE облегчает хранение в зрелых гранулах 40 and 41. Однако, роль CPE в качестве рецептора грузов для proinsulin и POMC поставлена под вопрос, поскольку proinsulin и POMC целенаправленно и корректно доставляются в секреторные накопительные гранулы у fat/fat мышей, которые обладают мутацией в гене Cpe/CPE, вызывающем эндокринные нарушения [42].
    Сортировка лизосомных гидролаз хорошо известна. Этот класс белков состоит приблизительно из 50 кислых гидролаз, включая glycosidases, proteases, lipases, nucleases, phosphatases и sulfatases, которые сортируются в TGN для транспорта в пре-лизосомы [43]. Олигосахаридные цепочки лизосомных гидролаз приобретают терминальные mannose-6-phosphate (M6P) остатки, когда они проходят через комплекс Гольджи [44]. Эти M6P тэги соединяются с MPRs, которые содержат цитозольные сортинг-мотивы для упаковки в транспортные пузырьки. В частности, MPRs содержат 'acidic cluster dileucine (AC-LL) signals', которые распознаются с помощью GGA (Golgi-localizing, γ -adaptin ear domain homology, ARF-binding protein) адаптерных белков. После связывания AC-LL сигнала, GGA адаптерные белки рекрутируют клатрин из цитоплазмы и собирается клатриновая оболочка на TGN [45]. После формирования оболочки пузырек отшнуровывается от TGN и сливается с эндосомными промежуточными образованиями [46], где низкий внутренний pH (pH 5.5) запускает диссоциацию лизосомных энзимов от MPRs (Figure 2). После высвобождения груза, MPRs транспортируются обратно в TGN, где они могут вступать в новый цикл [47].
    Дрожжевые клетки используют удаленный ортолог MPR, наз. MRL1 (mannose-6-phosphate receptor-like 1). Хотя этот белок необходим для транспорта некоторых кислых гидролаз в вакуоли, вряд ли он действует путем взаимодействия с M6P [48]. В противовес сортировке лизосомными гидролазами у млекопитающих большинство дрожжевых кислых гидролаз сортируется с помощью альтернативного механизма. Carboxypeptidase Y (CPY) сортируется в поздние Гольджи с помощью vacuolar protein sorting 10 (Vps10) грузового рецептора [49]. Vps10 является типа I однопроходным трансмембранным белком, которые соединяется с CPY путем сортировки мотива, состоящего из 4-х аминокислот, QRPL [50]; Vps10 транспортирует CPY в pre-vacuolar, эндосомный компартмент посредством пузырьков, покрытых клатрином. В эндосомах CPY отделяется от Vps10, который затем отправляется обратно в поздний Гольджи. CPY далее преобразуется в эндосомах и перемещается в вакуоль, где он и пребывает в своей зрелой форме [51].
    Клетки млекопитающих также сортируют белки в лизосомы независимым от MPR образом. Пациенты с болезнью inclusion cell (I cell) неспособны добавлять M6P к олигосахаридным цепочкам лизосомных энзимов, поскольку N-acetylglucosamine (GlcNac)-1 фосфотрансфераза, необходимая для модификации M6P мутантна, хотя субнабор лизосомных гидролаз транспортируется в лизосомы в клетках от таких пациентов [52]. Этот процесс, по-видимому, сходен с транспортом CPY у дрожжей, подтверждая, что др. рецепторы ответственны за сортировку лизосомных гидролаз в клетках млекопитающих. В самом деле, рецепторы гидролаз sphingolipid activator proteins (SAP) cathepsin D и H, по-видимому, базируются на 5, по крайней мере, Vps10 домен-содержащих белках: sortilin, SorCS1, SorCS2, SorCS3 и SorLA [53]. Из них, sortilin специфически обеспечивает транспорт из TGN в эндосомы (Figure 2).
    Более того, sortilin, как было установлено, регулирует сортировку белков из TGN в специализированные секреторные пузырьки, наз., mucocysts. У простейшей Tetrahymena thermophile установлено, что биосинтез mucocyst зависит от двух процессов сортировки в TGN. Один класс белков, наз. Grl (granule lattice) подвергается агрегации, тогда как вторая группа белков, наз. Grt-1p (granule tip) и Igr-1p (induced upon granule regeneration) не подвергается, и они сортируются посредством рецепторами обусловленного процесса, при этом sortilin выступает как рецептор [54]. Это наблюдение подтверждает, что биогенез mucocyst и биогенез лизосом могут базироваться на сходных механизмах (machineries).
    Кроме упомянутых выше рецепторов недавние доказательства также подтвердили роль в качестве переносчиков белков, транспортирующих Wnt (from 'Wingless/int') белки. Wnts являются семейством секретируемых белков, которые действуют как морфогены, чтобы активировать разнообразные пути, необходимые для основных онтогенетических процессов, также, как и поддержания гомеостаза взрослых тканей [55]. Хотя механизм секреции Wnt плохо изучен, известно, что он нуждается в белке переносчике Wnt в Wntless (Wls) для их транспорта на клеточную поверхность [56]. Предполагается, что Wls действует как рецептор сортировки для Wnt в TGN, поскольку первые исследования показали, что нагруженный эпитопом Wls располагается в Гольджи, TGN, эндосомах и плазматической мембране [56]. Интересно, что исследования с использованием антител для детекции эндогенных не меченных Wls показали, что существенный пул Wls располагается в ER, где он palmitoylated с помощью porcupine. Palmitoylated Wnts могут быть загружены непосредственно на Wls и перенесены из ER на плазматическую мембрану [57]. В этом отношении интересно также отметить, что в эпителиальных клетках Wls вместе с Wnt3a отсортировываются из TGN на базолатеральную поверхность способом, зависимым от activator protein 1 (AP-1) и clathrin [58]. Следовательно, вполне возможно, что Wls действует как рецептор сортировки в ER и TGN. Механизм действия Wls в качестве рецептора сортировки в двух разных компартментах предстоит ещё определить.

    ADF/cofilin-, actin-, Ca2+- and Cab45-dependent cargo sorting


    Геномный скрининг выявил потребность в обслуживающем актин белке twinstar для обеспечения секреции signal sequence-bearing horseradish peroxidase (ss-HRP) клетками Drosophila S2 [59]. Дальнейшее исследование процесса показало, что twinstar и его ортологи у дрожжей (Cof1) и в клетках млекопитающих (ADF и cofilin 1), облегчают сортировку субкласса грузовых молекул в TGN. Это наблюдение стало неожиданным, поскольку twinstar и его ортологи являются цитозольными белками, ассоциация которых с TGN неизвестна. Последующее исследование с использованием локализованного в TGN сенсора Ca2+ показало, что ADF/cofilin временно локализуется в мембранах TGN и регулирует приток Ca2+ в TGN путем взаимодействия с SPCA1 [60]. Секреторные белки, сортируемые зависимым от ADF/cofilin-, actin- и SPCA1 способом, включают Ca2+ -связывающие белки, такие как сartilage oligomeric protein (COMP), matrix glia protein (MGP), thrombospondin3 (TSP3), и белки, которые не связывают Ca2+, такие как металлопротеиназный ингибитор TIMP1 (tissue inhibitor of metalloprotease 1) и LysC 61 and 62. Процесс, по-видимому, консервативен, поскольку Cof1 и Pmr1 (plasma membrane ATPase related), дрожжевые ортологи SPCA1, необходимы для сортировки грузов из субнабора секретируемых белков из поздних Гольджи [63], а мутации в Pmr1 влияют на сортировку CPY и на созревание феромона в мембранах Гольджи [64]. Эти находки подтверждают новый, консервативный механизм сортировки секретируемых грузов в TGN.
    SPCA1 является трансмембранным белком, располагающимся в TGN, кодируемым геном ATP2C1 (ATPase, Ca2+ transporting, type 2C, member 1), который накачивает Ca2+, также, как и Mn2+, в просвет TGN зависимым от АТФ способом [65]. Потеря одной копии гена ATP2C1 вызывает болезнь Hailey-Hailey (пузырчатка), аутосомно доминантное нарушение кожи, характеризующееся супрабазальным акантолизисом кератиноцитов [66]. Мышиные нулевые мутанты Atp2c1 погибают после 10.5 дня беременности из-за нарушений закрытия нервной трубки. Ультраструктура этих эмбрионов обнаруживает аберрантную морфологию аппарата Гольджи с расширенными и немногочисленными цистернами, а также с увеличенными пузырьками [67]. SPCA1 необходим также для дифференцировки нейронов. В линии клеток нейробластомы N2a мышей и в нейронах гиппокампа, истощенных по SPCA1, поляризованный перенос прерван, приводя к нарушению дифференцировки нейронов, а также генерации функциональных нейритов [68]. Более того, SPCA1 RNA interference (RNAi) нарушает доставку amyloid precursor protein (APP) и транспорт пуринергического рецептора P2X7 [69]. Итак, эти исследования показали, что SPCA1 необходим для транспорта физиологически важных белков.
    Концентрация Ca2+ в аппарате Гольджи гетерогенна и как полагают существует градиент Ca2+ вдоль секреторного пути от ER к TGN [70]. Использование TGN-специфического сенсора Ca2+ показало, что содержание Ca2+ в просвете низкое и целиком зависит от активности SPCA1 по доставке Ca2+ 69 and 70. Тем не менее, как может актин и ADF/cofilin влиять на активность как насоса SPCA1 и каким образом Ca2+ в просвете обеспечивает сортировку белков? Актиновый цитоскелет, как известно, организует ассоциированные с мембранами белки в определенные функциональные домены на плазматической мембране [71]. Его прикрепление к мембране может влиять на разделение фаз первоначально гомогенных липидов в мембране и стабилизировать домены фазового разделения [72]. Следовательно, актин и ADF/cofilin должны действовать сходным образом в TGN. Одна из возможностей заключается в том, что ADF/cofilin и актин могут концентрировать молекулы SPCA1 в сортирующие домены и тем самым формировать кластеры, необходимые для локального накопления Ca2+ внутри TGN. Впоследствии грузы, которые обладают высоким сродством к Ca2+, д. секвестрироваться в домены сортировки, это д. сопровождаться отделением доменов (путем разделения мембраны), чтобы обеспечивать транспортными переносчиками грузы для транспорта на клеточную поверхность [60]. Показано, что SPCA1 накапливается в доменах мембран, богатых холестеролом, а истощение холестерола приводит к 50% снижению накачивающей активности [73]. Сбор SPCA1 в доменах, богатых холестеролом, стабилизируемый актином в TGN, может быть важным для его регуляции.
    Возможно также, что актиновый цитоскелет непосредственно регулирует функцию насоса посредством дифференциального связывания мономеров и олигомеров в противовес филаментам. В согласии с этим механизмом состояние полимеризации актина может модулировать транспорт ионов. Альтернативно, взаимодействие насос-актин может косвенно влиять на функцию насоса. Аналогично, доставка cofilin 1 и actin в ближайшее окружение SPCA1 может влиять на локальное ионное цитоплазматическое окружение, поскольку связывание cofilin 1 с филаментами связано с высвобождением ионов [74], благодаря открытию специфических сайтов 'ригидности' вдоль филамент [75]. Увеличение ионов в цитоплазме д. активировать транспорт ионов в TGN, для помощи в сортировке грузов.
    Как может Ca2+ в просвете TGN облегчать сортировку грузов? Интересно, что клетки, которые истощены по ADF/cofilin или SPCA1 не только неправильно сортируют секретируемые белки, но и также высвобождают растворимый располагающийся в Гольджи белок, Cab45 60 and 61. Lodish с колл. идентифицировали Cab45 в 1996 [76] как располагающийся в Гольджи белок с 6 EF hand (from 'glutamate/phenylalanine') доменами, каждый из которых соединяется с Ca2+. Локализация Cab45 чувствительна к уровням Ca2+ внутри Гольджи, поскольку нарушение концентрации Ca2+ после воздействия ionophore приводит к секреции Cab45 из клеток [62]. Cab45 сам по себе может быть необходим для зависимого от SPCA1 притока Ca2+ в TGN, поскольку предварительные исследования подтвердили, что он может локализоваться совместно с SPCA1 в определенном TGN-позитивном регионе (C.K. and J.v.B., unpublished). Следовательно, возможно, что Cab45 модулирует активность насоса внутренне посредством механизма обратной связи. Эта гипотеза нуждается в проверке с помощью нацеленных на TGN сенсоров Ca2+ и с помощью сверх-разрешающей микроскопии, чтобы определить ограничивается ли приток Ca2+ Cab45/SPCA1-позитивным доменом. Итак, важно определить, как цитозольный комплекс cofilin 1 и actin общается с Cab45 в просвете.
    Более того, Cab45 связывает несколько секреторных белков, включая LysC и COMP, и тем самым, по-видимому, облегчает секрецию этих белков [62]. Cab45 может действовать как рецептор растворимых грузов, который нуждается в тонкой настройке передачи сигналов просветного Ca2+, чтобы секвестрировать или высвобождать молекулы груза на транспортные переносчики или в отдельный домен TGN. Было показано, что располагающиеся в ER Ca2+ -связывающие белки, такие как GRP78 (78 kDa glucose-regulated protein, также известен как binding immunoglobulin protein, BiP) быстро секретируются из клеток, когда в ER снижаются уровни Ca2+ [77], подтверждая, что уровни Ca2+ нарушают сегрегацию располагающихся в ER белков от секреторных белков, приводя к транспорту грузовых молекул на ложные цели в мембране [78].
    Сходная система может существовать в аппарате Гольджи. Cab45 может быть Ca2+ -связывающим белком, который собирает секретируемые белки на Ca2+ -белковом матриксе, который образуется, когда SPCA1 накачивает Ca2+ в просвет TGN, секвестрируя тем самым грузовые молекулы в специфический домен и отделяя их от др. секреторных белков и располагающихся в Гольджи. Таким путем экспорт груза д. происходить из домена в регионы, где матрикс Ca2+ -белок неспособен поддерживать Ca2+. Пока неясно, как и почему груз отделяется от Cab45 на мембранах Гольджи, необходима дальнейшая проверка.
    Итак, актиновые филаменты и cofilin 1 соединяются с SPCA1 в TGN (Figure 3A), приводя к активации насоса, запуская тем самым приток Ca2+ в специфический домен в TGN. Это временное, локальное увеличение Ca2+ привлекает Cab45, который обладает высоким сродством к Ca2+ и поэтому удерживается внутри TGN, чтобы связывать секреторные белки и отделять их от др. белкового содержимого TGN (Figure 3B). Последующее отделение комплекса Cab45-груз происходит или после снижения Ca2+ или за счет сигнала, такого как фосфорилирование (Figure 3C), приводя к отделению груза для сортировки по определенным классам транспортных переносчиков. В самом деле, серин/треониновая киназа Fam20C (из 'family with sequence similarity 20') была недавно идентифицирована как 'Golgi casein kinase', которая фосфорилирует белки, которые несут специфические S-X-E/pS сайты, по мере трафика через аппарат Гольджи [79]. Fam20C фосфорилирует белки, необходимые для биоминерализации и многие др. секреторные белки, содержащие субстратную последовательность [79]. Однако существование и функция этих модификаций остаются неуловимыми. Возможно, что фосфорилирование играет главную роль во взаимодействии и диссоциации груз-Cab45.

    Figure 3. A novel sorting pathway independent of a 'classical sorting receptor'. (A) When cofilin 1 is inactive and does not localize to the TGN, actin filaments do not connect to SPCA1 and the pump has a low Ca2+-pumping activity. (B) As soon as cofilin 1 is activated, it binds to SPCA1 and actin filaments are recruited to the trans-Golgi network (TGN), consequently activating the pump by an unknown mechanism and inducing an influx of Ca2+ ions into a specific domain of the TGN. Luminal Ca2+ binds to Cab45 (45 kDa Ca2+-binding protein), and this probably induces a conformational change that allows Cab45 binding to secreted proteins. Binding is proposed to segregate these proteins from other proteins present in the TGN. (C) To be packaged into a transport carrier, the secreted proteins must dissociate from Cab45. How this occurs is not known, but could involve a post-translational modification such as phosphorylation. How Cab45 is retained in the TGN without accompanying cargo into nascent transport vesicles remains unknown.

    Concluding remarks


    Several studies indicate that constitutive secretion involves bulk transport through the secretory pathway unless the protein contains a positive sorting signal for diversion to lysosomes or secretory storage granules80 and 81. Therefore, it was postulated that secretory proteins are not actively sorted and their packaging into vesicles at the TGN occurs by default [82]. In the past three decades enormous strides have been made in identifying the sorting signals and molecular requirements of different TGN exit pathways. Protein segregation is now established as playing an essential role in sorting proteins into secretory storage granules[30], and signals have been identified that are responsible for the sorting of acid hydrolases to pre-lysosomes[83]. However, recent screens have uncovered unexpected roles for actin, cofilin 1, and calcium signals for the process by which proteins are constitutively secreted from cells (Figure 2). Furthermore, a recent study provided evidence that secretory proteins are actively sorted at the TGN and that constitutive cargo use distinct carriers for transport to the cell surface.
    How are secreted proteins sorted? The simplest concept invokes a ligand-receptor interaction where a sorting signal on the cargo binds to a receptor in the TGN. In the early Golgi, the KDEL receptor recognizes the KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) sequence of escaped, ER-resident proteins and returns them to the ER in COPI-coated vesicles (Figure 1) 84 and 85. However, a receptor for secreted proteins at the TGN has not been identified. Therefore, sorting of secreted proteins may utilize an alternative mechanism. For particular secretory cargoes, sorted independently of a classical receptor [60], sorting depends on a transient influx of Ca2+ into the TGN lumen. This increase in luminal Ca2+ is induced by the binding of actin and cofilin 1 to SPCA1 on the cytosolic face of the TGN, and it facilitates the association of the secretory proteins with the Golgi-resident protein, Cab45. Cab45 might act as a 'soluble receptor' [62] to segregate a subset of secretory proteins. The process appears to be conserved in evolution because twinstar was identified in Drosophila, and mammalian cells and yeast require the same components (actin, cofilin, Pmr1, Ca2+) for sorting of soluble proteins. However, a yeast ortholog of Cab45 is currently unknown. Much remains to be learned regarding this sorting process, and future studies should be directed at answering the remaining outstanding questions ( Box 2).

    Box 2. Outstanding questions
  • How do cofilin 1 and actin mechanistically activate the pump? Localized recruitment of actin filaments via cofilin 1 may retain the pump in distinct TGN domains in which the pump is active. Alternatively, the pump activation could rely on oligomerization of the protein, which has been shown for several P-type ATPases such as the Na+/K+ ATPase [102] and the H+ ATPase [103]. The oligomerization status may be supported by the actin cytoskeleton that stabilizes a membrane microdomain.
  • How can Cab45 sort proteins into a vesicle without also being secreted? If Cab45 binds to secreted proteins, they will need to dissociate from Cab45 before packaging into a transport carrier. This process could be mediated by a decrease in local Ca2+ levels or by a post-translational modification such as phosphorylation. Future work is needed to clarify these essential events, which are crucial for protein sorting at the TGN. It will be necessary to identify novel major players in the pathway by pull-down analysis and mass spectrometry. The process and the role of each player should be characterized in vitro with purified proteins. In addition, dynamic imaging techniques and super-resolution microscopy will be necessary to elucidate the action of actin in modulating SPCA1 in vivo.
  • Previous work demonstrated that sorting of secretory proteins at the TGN occurs actively. The actin/cofilin 1/SPCA1/Ca2+/Cab45-dependent process may only be among many other sorting activities that occur at the TGN. Future studies should focus on identifying new sorting components and purifying and characterizing TGN to cell surface transport carriers that transport secretory proteins. Novel gene-editing techniques in mammalian cells such as CRISPR/Cas9 [104] coupled to high-throughput screening will allow us to genetically identify more proteins required for sorting and transport of secretory proteins at the TGN. In addition, reconstitution of the components in vitroand super-resolution microscopy will be necessary to elucidate the action of the sorting components at the TGN.