Сфинголипиды являются биоактивными липидами, которые были описаны как сигнальные и регуляторные молекулы (Figure 1; Hannun and Bell, 1989). Сфинголипиды, такие как церамид и сфингомиелин, в основном концентрируются в цитоплазматических мембранах, где они в основном ассоциируют с микродоменами мембран, наз. липидными плотиками (Parton and del Pozo, 2013).

Figure 1. Schematic representation of the structure of major sphingolipids Sphingolipids are characterised as amphipathic molecules, composed of a sphingoid backbone, represented by the amino alcohol sphingosine, which can be converted to ceramide by the attachment of a fatty acid to carbon 2 by an amide bond. Ceramide and sphingosine can be converted to S1P or sphingomyelin by the addition of a phosphate group or phosphocholine to carbon 1, respectively.

Многочисленные исследования связывают сфинголипиды с разными биологическими процессами, связанными с эмбриональными стволовыми клетками, включая помощь в выживании клеток в ходе пролиферации, регуляцию экспрессии генов, связанных с плюрипотентностью, дифференцировкой, воспалением, апоптозом, регуляцией клеточного цикла, клеточной полярности и миграции (Inniss and Moore, 2006; Wendler and Rivkees, 2006; Avery et al., 2008; Bieberich, 2011). Также наблюдается, что сфинголипиды выполняют роль в сердечно-сосудистом развитии, индуцируя созревание эмбриональной сосудистой системы мыши и меняя морфологию сердца у эмбрионов рыбок данио и мыши (Kupperman et al., 2000; Kono et al., 2004; Wendler and Rivkees, 2006). Кроме того, сфинголипиды могут ассоциировать с передачей сигналов реактивными видами кислорода (ROS) (Maceyka et al., 2007). Имеющиеся доказательства подтверждают, что баланс между церамидами и sphingosine-1-phosphate (S1P) непосредственно связан с реакцией на оксидативные стрессы (Maceyka et al., 2007). Нарушение оксидативного гомеостаза способствует продукции избыточных количеств ROS, которые окисляют биологические молекулы, меняя их структурные свойства и влияя на их роль во многих клеточных процессах (Ufer and Wang, 2011).

Во время эмбрионального развития баланс redox важен для кардиального развития и это связано с ремоделированием, сократимостью и дифференцировкой сердечной ткани (Ufer et al., 2010; Santos et al., 2011). Однако, доказательства показывают, что избыточное образование ROS вредно для сердечной функции, поскольку это связано с пороками сердца и сердечно-сосудистыми заболеваниями (Das and Vasudevan, 2007; Ku and Dulskien, 2008; Ribas et al., 2011; Thompson and Al-Hasan, 2012; De Marchi et al., 2013).

Oxidative stress and antioxidant mechanisms during embryonic development

Накопление избыточных количеств ROS может способствовать оксидативным стрессам, особенно во время эмбриогенеза (Ufer and Wang, 2011). Эмбрионы млекопитающих высоко чувствительны к альтерациям в гомеостазе redox; неустойчивость в гомеостазе redox способствует задержке развития, уродствам органов или даже эмбриональной летальности (Guerin et al., 2001; Ufer and Wang, 2011). В этом смысле необходимы антиокислительные механизмы, чтобы обеспечить гомеостаз redox во внутриклеточной среде и защитить эмбрион от оксидативных повреждений (Guerin et al., 2001; Harvey et al., 2002; Ufer et al., 2010; Ufer and Wang, 2011).

Антиоксидантные механизмы могут быть классифицированы как не ферментативные и ферментативные (Ufer and Wang, 2011); однако, активность антиоксидантных энзимов значительно ниже во время эмбриогенеза, чем у взрослых (Ufer et al., 2010; Ufer and Wang, 2011). Короче, эти антиоксидантные энзимы включают каталазу (CAT), глютатион пероксидазу (GPX), глютатион редуктазу, тиоредоксин (TRX) редуктазу и супероксид дисмутазу (SOD; Guerin et al., 2001; Ufer and Wang, 2011).

Во время эмбрионального развития делеции или дефицит активности этих энзимов ассоциирован с сенсибилизацией к клеточным стрессам, как это происходит при дефиците GPX1, который приводит к апоптозу (Ufer and Wang, 2011). Напротив, апоптоз, как было установлено, приводит к эмбриональной гибели, как в случае GPX4-дефицитных мышей (Ufer and Wang, 2011). Однако, MnSOD нокаут нарушает функцию митохондрий, а исследования показывают, что новорожденные мыши MnSOD -/- погибают вскоре после рождения (Li et al., 1995). Кроме того, MnSOD нокаутные мыши обнаруживают дилятационную кардиомиопатию, с увеличенным диаметром полости левого желудочка, уменьшенной толщиной стенки и фиброзом эндокарда (Li et al., 1995). Более того, TRX действует, защищая преимплантационный эмбрион от оксидативного стресса, а нокаут TRX является летальным во время этого периода, что ассоциировано со снижением пролиферации и увеличением апоптоза (Kobayashi-Miura et al., 2007). Мыши с дефицитом TRX2-редуктазы в кардиальной ткани обнаруживают дилятационную кардиомиопатию и застойную сердечную недостаточность, погибают вскоре после рождения (Kobayashi-Miura et al., 2007). Наконец, CAT-дефицитные мыши обнаруживают нормальное развитие, хотя дефицит в ткани CAT замедляет метаболизм H₂ O2 (Ho et al., 2004).

Не ферментативная защита включает мочевую кислоту, аскорбиновую кислоту, tocopherol и glutathione (GSH), hypotaurine и taurine (Guerin et al.,2001; Ufer and Wang, 2011). Биосинтез GSH происходит во время созревания ооцитов, где он необходим для поддержания мейотического веретена и защиты эмбриона от ROS повреждений после стадии бластоциста, тогда как ингибирование синтеза GSH вызывает повреждения ДНК (Guerin et al., 2001; Ufer and Wang, 2011). В противоположность негативному эффекту продукции избыточных количеств ROS, низкие и промежуточные уровни ROS важны для обеспечения нейрональной дифференцировки, формирования пальцев и хода стадии бластоциста (Dennery, 2007). У бластоциста продукция ROS регулирует запрограммированную клеточную гибель и ROS взрывообразно индуцируют лизис zona pellucida, делая возможной имплантацию бластоциста в стенку матки (zona hatching; Ufer and Wang, 2011). Кроме того, ROS участвуют в апоптозе ооцитов и в стимуляции пост-овуляторного старения (Ufer and Wang, 2011).

Исследования показали, что метаболиты сфинголипидов регулируют redox гомеостаз посредством NADPH оксидазы, NOS, антиоксидантных энзимов и митохондриальной целостности (Fern? ndez-Checa, 2003; Won and Singh, 2006). Т.о., ROS может действовать как вторичная мессенджер молекула, тогда как метаболиты сфинголипидов регулируют роль ROS как сигнальной молекулы.

The influence of sphingolipids on cardiac development

Оборот сфинголипидов регулируется пространственно-временным способом и способен сформировать сотни структур со многими потенциальными комбинациями, которые могут быть прикреплены к sphingoid основанию (Figure 2; Futerman and Hannun, 2004).

Figure 2. Representation of the sphingolipid metabolic pathway in eukaryotic cells Sphingolipid biosynthesis starts with Ser and P-CoA condensation catalysed by SPT, forming 3-KDS, which is reduced to DhSph by the 3KSR and N-acylated by the DhCS, generating DhCer. In the next step, DES converts DhCer to a various chain-length Cer. SMSr or CGT can convert Cer to CPE or GalCer, respectively. Cer requires CERT and endocytic vesicles to be transported to the luminal side of the Golgi apparatus. Furthermore, Cer may be converted to SM by SMS activity, which transfers phosphocholine from phosphatidylcholine to Cer. Alternatively, Cer can be phosphorylated by CERK to form Cer1P or catalysed by GCS to form glucosylceramide and the more complex Gsl. SM, Gsl and Cer are transported to the plasma membrane, where the concentration of SM and Cer is modulated by the activity of SMS and SMase, which hydrolyse SM to Cer. In addition, Sph is formed by the deacylation of Cer by CDase and is reversed by CS. SPHK phosphorylates Sph to form S1P. ABC transporters mediate the export of S1P. Once in the extracellular milieu, S1P can elicit intracellular actions through S1PR1-5. S1P production is negatively regulated through a reversible conversion that is induced by SPP1 and extracellular LPP. Alternatively, it is irreversibly degraded by SPL, forming HD and PE. 3-KDS, 3-ketodihydrosphingosine; 3KSR, 3-ketosphinganine reductase; ABCt, ABC transporter; C1PP, ceramide-1-phosphate phosphatase; CDase, ceramidase; Cer, ceramide; Cer1P, ceramide-1-phosphate; CERK, ceramide kinase; CERT, ceramide transporter; CGT, ceramide galactosyltransferase; CPE, ceramide phosphoethanolamine; DES, dihydroceramide desaturase; DhCer, dihydroceramide; DhCS, dihydro(ceramide) synthases; DhSph, dihydrosphingosine; GalCer, galactosylceramide; Gsl, glycosphingolipids; GCS, glucosylceramide synthase; HD, hexadecenal; LPP, lipid phosphate phosphatase; P-CoA, palmitoyl-CoA; PE, phosphoethanolamine; S1P, sphingosine-1-phosphate; S1PR(1-5), S1P membrane receptors; S1PP, S1P phosphatase; Ser, serine; SM, sphingomyelin; SMS, sphingomyelin synthase; SMSr, sphingomyelin synthase related protein; Sph, sphingosine; SPHK, S1P kinase; SPL, S1P lyase; SPT, serine palmitoyl transferase.

Недавно потребность в сфинголипидах обнаружена для детерминации судеб клеток у взрослых, в предшественниках и эмбриональных стволовых клетках (Kleger et al., 2011). Кроме того, сфинголипиды, как было установлено, влияют на сердечно-сосудистые ткани путем модуляции дифференцировки и развития мезодермы (Kleger et al., 2011).

Во время эмбрионального развития сердце является первым органом, формируемым посредством множественных ступеней с использованием одновременно дифференцировки и морфогенеза (Yamagishi et al., 2009; Norden and Kispert, 2012). Структурная и функциональная сложность зрелого сердца является результатом онтогенетических процессов, которые приводят к образованию трубки, петли сердца, образованию кардиальных перегородок и развитию клапанов (Yamagishi et al., 2009; Norden and Kispert, 2012). Нарушения в этих процессах могут вносить вклад во врожденные болезни сердца (Wendler and Rivkees, 2006).

У эмбрионов мыши первая ступень кардиогенеза происходит во время дня эмбриогенеза 6-7 (E6-7), когда клетки кардиальных предшественников из первичной полоски мигрируют, чтобы сформировать два билатеральных региона в передней латеральной пластинке мезодермы и конвергировать их, чтобы сформировать кардиальный серп по срединной линии эмбриона (Yamagishi et al., 2009; Norden and Kispert, 2012). Исследования на рыбках данио (Danio rerio) продемонстрировали, что клетки, мутантные по гомологу S1P membrane receptor 2 (S1PR2) млекопитающих, кодируемому геном mil, формируют два латерально расположенных сердца, известных как cardia bifida (Matsui et al., 2007). Cardia bifida возникает из-за снижения миграционной способности клеток кардиальных предшественников благодаря неуместным взаимодействиям между клетками и фибронектином; эти неуместные взаимодействия предупреждают от миграции клеток кардиальных предшественников из их билатеральных позиций в направлении срединной линии, где обычно происходит слияние их в сердце (Matsui et al., 2007). S1PR2 является членом семейства S1P мембранных рецепторов, состоящих из S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 и S1PR5. S1PR2 также принадлежит к семейству G protein-coupled рецепторов (Takuwa et al., 2008; Schwalm et al., 2013). Эти рецепторы активируются с помощью S1P во внеклеточной среде и действуют, запуская определенные пути внутриклеточной передачи сигналов (Takuwa et al., 2008; Schwalm et al., 2013). Кроме того, нокдаун у рыбок данио транскрипта S1PR1 приводит к перикардиальному отёку и сосудистым дефектам, включая неправильное образование петли сердца и медленные сердцебиения (Mendelson et al., 2013).

В ходе развития сердца петлеобразное сердце подвергается серии процессов ремоделирования, чтобы создать эндокардиальные подушки (EC) в тракте оттока и атриовентрикулярном (AV) канале, которые являются предшественниками кардиальных клапанов (напр., aortic, pulmonic, митрального и трехстворчатых клапанов; Person et al., 2005). EC формируются в результате пролиферации эндокардиальных клеток, которые подвергаются эпителиально-мезенхимному переходу (EMT), и они прогрессивно мигрируют в кардиальный гель до тех пор, пока противоположные концы не придут в контакт и не начнут сливаться (Person et al., 2005; Ray and Niswander, 2012).

Ранние исследования показали, что эмбрионы мышей, обработанные экзогенным S1P обнаруживают нарушения кардиальной морфологии на ст. E7.5 и аномальное развитие EC на ст. E9.5 (Wendler and Rivkees, 2006). Более того, экспланты AV канала от эмбрионов мыши E9.5, обработанных разными концентрациями экзогенного S1P, обнаруживают ингибирование клеточных выростов, но не обнаруживают изменений в сердцебиениях после 24 ч (Wendler and Rivkees, 2006). Однако, мышиные эмбрионы, обработанные N, N-dimethyl-sphingosine (DMS), не избирательным ингибитором двух основных белков, которые фосфорилируют sphingosine, чтобы сформировать S1P, sphingosine kinases 1 и 2 (SPHK1 and SPHK2), обнаруживают снижение сердцебиений после 24 ч и клеточную гибель в эксплантах AV канала (Wendler and Rivkees, 2006). Кроме того, воздействия экзогенных S1P или DMS блокируют EMT в эксплантах AV канала, предупреждая клетки от принятия фибробластного фенотипа, включая образование филоподий или ламеллиподий, выпячиваний, необходимых для EMT (Wendler and Rivkees, 2006; Yilmaz and Christofori, 2009). Несмотря на это, совместная обработка эксплантов AV канала низкими количествами S1P (0.5 µ M) и DMS (2.5 µ M) восстанавливает EMT (Wendler and Rivkees, 2006). Следовательно, эти эксперименты демонстрируют, что разные механизмы, ответственные за развитие EC чувствительны к альтерациям уровней S1P (Wendler and Rivkees, 2006).

Более того, ERM семейство (ezrin, radixin и moesin) цитоскелетных белков участвует в эффективности EMT (Haynes et al.,2011). Белки семейства ERM были также описаны как мишени для сфинголипидов. Сфинголипиды действуют, активируя или деактивируя ERM белки, чтобы модулировать цитоскелет и клеточное поведение (Adada et al., 2013). Это семейство белков взаимодействует с актином цитоскелета в клеточном кортексе и регулирует клеточную морфологию и выпячивания из клеточной мембраны (lamellipodia and filopodia), клеточную пролиферацию, адгезию, миграцию и инвазию (Adada et al., 2013). ERM белки, модулируемые с помощью фосфорилирования, которое способствует их активации за счет конформационных изменений; S1P, как было установлено, стимулирует гиперфосфорилирование ezrin, тогда как церамид оказывает противоположный эффект, способствуя дефосфорилированию ezrin (Adada et al., 2013).

Кроме того, потеря Cert, ER-to-Golgi транспортного белка для церамида, является летальной, поскольку нокаутные Cert мыши погибают на ст. E11.5 и обнаруживают аномалии сердца, такие как набухание, истончение и прозрачность стенки тракта оттока и всего сердца (Wang et al., 2009). Они обнаруживают также скопление крови и более слабые сокращения желудочков по сравнению с эмбриональным сердцем дикого типа (Wang et al., 2009). Кардиальная ткань экспрессирует S1PR1, S1PR2 и S1PR3, которые участвуют в сигнальной трансдукции посредством Gi, Gq и G12/13 белков (Kawabori et al., 2013; Takuwa et al., 2013). Следовательно, S1PR1, S1PR2 и S1PR3 действуют путем координации созревания сосудистой сети (Kono et al., 2004). Исследования показали, что потеря S1pr1 приводит к эмбриональной летальности на ст. E12.5-E14.5 из-за тяжелых кровоизлияний (Kono et al., 2004). Напротив, S1pr2 -/- или S1pr3 -/- не обнаруживают аномалий, указывая на возможную кооперацию или избыточность роли S1PR2 и S1PR3 в отношении S1PR1 (Kono et al., 2004). В соответствии с этими результатами S1PR1 является важным для генеза сосудов, т.к. способствует взаимодействию эндотелиальных клеток и гладкомышечных клеток, необходимому для ремоделирования сосудов и стабилизации сосудистой сети (Kono et al., 2004).

Т.о., сердечно-сосудистое развитие является чувствительным к альтерациям в метаболизме сфинголипидов, которые в основном затрагивают ремоделирование цитоскелета, способствуя нарушению клеточной миграции, кардиальных сокращений и EMT.

ROS as a signalling molecule and its interaction with sphingolipids

Ранее было показано, что увеличении уровней ROS, при одновременном снижении антиоксидантной активности связано с генерацией сфинголипидов, таких как sphingosine, S1P и церамид, и со стимуляцией оборота сфинголипидов (Figure 3; Nikolova-Karakashian and Reid, 2011). Напр., митохондриальный церамид может взаимодействовать с цитохромом c, способствуя смещению цитохрома c из митохондриальной мембраны, приводя к снижению митохондриального трансмембранного потенциала (Δ ψ m) и к снижению потребления кислорода (Figure 3; Nikolova-Karakashian and Reid, 2011).

Figure 3. Schematic summarising the connection between sphingolipids and ROS Low/moderate ROS levels associated to the presence of antioxidants in the cell leads to the activation of SPHK, inducing S1P synthesis and promoting cell survival. However, an increase in ROS production and SMase activation, results in ceramide accumulation, which leads to cell apoptosis. Increased ceramide levels also are able to impair the mitochondrial functions. Mitochondrion is represented with its electron transport chain composed of the protein complexes (I-V) in the inner mitochondrial membrane. The impairment of complex III and complex IV by sphingosine-derived lipids and ceramide analogues are associated with ROS generation, while H2O2 is produced from by MnSOD in the matrix. In addition, ceramide results in cytochrome c displacement, reduced mitochondrial transmembrane potential (?? m) and oxygen consumptions. Furthermore, sphingolipids can interact with phosphatidylglycerol (e.g., cardiolipin, phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine) to alter the hydrophobicity of the mitochondrial membrane. Additionally, ceramide generation is able to regulate NAPDH oxidase activity. Ang II activates AT1R, triggering a signalling cascade involving the induction of p47phox phosphorylation through c-Src, which precedes PLD and PKC activation. The activation of c-Src leads to EGFR transactivation, stimulating PI3K and Rac. In turn, Rac is able to stimulate NOX functions. In this sense, activation of NADPH oxidase and increased levels of ceramide can stimulate a lipid raft-redox signalling platforms, which are able to generate , H2O2, ONOO? production and reduce NO bioavailability. Likewise, ROS can stimulate caveolin phosphorylation by Src, Fyn and Abl, triggering intracellular signalling associated to caveolae. Abl, proto-oncogene tyrosine kinase; ANT, adenine nucleotide translocase; Antiox, antioxidant molecules; AT1R, Angiotensin II type 1 receptor; Cer, ceramide; Complex I, NADH dehydrogenase; Complex II, succinate dehydrogenase; Complex III, cytochrome c reductase; Complex IV, cytochrome c oxidase; Complex V, ATP synthase; CytC, cytochrome c; Fyn, proto-oncogene tyrosine kinase; IMS, intermembrane space; Matrix, mitochondrial matrix; MIM, mitochondrial inner membrane; MOM, mitochondrial outer membrane; NOX, NADPH oxidase; p22, NADPH oxidase complex subunit; p47, NADPH oxidase complex subunit; p67, NADPH oxidase complex subunit; PDG, Phosphatidylglycerol; PI3K, phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase; PKC, protein kinase C; PLD, phospholipase D; Rac, Rho family of GTPase; SM, sphingomyelin; Sph-derived, sphingosine-derived lipids; SPHK, S1P kinase; Src, proto-oncogene tyrosine kinase.

Церамид действует как центральная молекула, необходимая для образования комплексов сфинголипидов, и он также является компонентом митохондриальных внутренней и внешней мембран (Nikolova-Karakashian and Reid, 2011; Kogot-Levin and Saada, 2013). Кроме того, ceramide synthase 2 (CS-2), sphingomyelinase (SMase) и ceramidase, как известно, присутствуют в митохондриях; интересно, что образование церамида может происходить в митохондриальном матриксе и наружной митохондриальной мембране (Figure 2; Nikolova-Karakashian and Reid, 2011; Novgorodov et al., 2011; Kogot-Levin and Saada, 2013). Наблюдалось, что нокаут Cert способствует накоплению церамида в митохондриях, указывая, что CERT ассоциирован с митохондриальным церамидом (Nikolova-Karakashian and Reid, 2011; Kogot-Levin and Saada, 2013).

Более того, аналоги церамида, которые могут действовать на изолированные митохондрии, способствуют увеличению продукции ROS, ингибируя комплекс III и стимулируя продукцию H₂ O₂ при высоких концентрациях церамида, тогда как NO стимулируется при низких концентрациях церамида (Figure 3; Nikolova-Karakashian and Reid, 2011; Trounce et al., 2013). Однако механизмы, с помощью которых сфинголипиды действуют на транспортеры электронов, не полностью изучены. Предполагается, что эти липиды способны влиять на сборку и стабильность митохондриального комплекса (Siddique et al., 2013). According to Siddique et al. (2013), устранение Des1 (dihydroceramide desaturase) снижению уровней комплекса IV. Кроме того, устранение CS-2 повышает уровни C16-ceramide и dihydrosphingosine, приводя к хроническому оксидативному стрессу путем образования ROS путем модуляции активности комплекса IV (Zigdon et al., 2013). Более того, sphingosine и происходящие из sphingosine липиды, galactosylsphingosine и glucosylsphingosine способны ингибировать активность комплекса IV, ассоциированного с phosphatidylcholine (Figure 3; Igisu et al., 1988).

Липиды, такие как phosphatidylglycerols cardiolipins, phosphatidylcholine и phosphatidylethanolamine важны собственно для функционирования митохондриальной респираторной цепи и оксидативного фосфорилирования, которые необходимы для поддержания структурной целостности и каталитической активности комплексов I, III и IV (Figure 3; Sharpley et al., 2006; Kogot-Levin and Saada, 2013). Более того, сфинголипиды могут изменять гидрофобность митохондриальных мембран и возможно взаимодействуют с необходимыми липидами, чтобы поддерживать устойчивое состояние активности комплексов митохондриальной респираторной цепи (Igisu et al., 1988; Kogot-Levin and Saada, 2013). Кроме того, церамид может действовать как аллостерический эффектор благодаря связыванию с индивидуальными комплексами, модифицируя из нормальную активность и воздействуя на сборку или стабильность комплексов (Figure 3; Kogot-Levin and Saada, 2013). Cardiolipin также играет существенную роль в организации митохондриальных промежуточных мембран и пространств между гребешками, которые помогают контролировать образование липидно/белковых комплексов и закрепляющих киназ, таких как creatine kinase (CK) и nucleoside diphosphate kinase (Schlattner et al., 2009). Дисфункция митохондрий и избыточная продукция ROS могут нарушать энергетическое состояние клеток и проницаемость митохондрий путем инактивации CK (Schlattner et al., 2006). В сердечной ткани митохондриальная CK играет важную роль в поддержании энергетического гомеостаза сердца (Schlattner et al., 2006). В этом смысле снижение активности или инактивация CK может разрушить постоянную смену энергии и гомеостаз Ca²⁺, оба приводят к снижению энергетических резервов и контрактильной дисфункции (Schlattner et al., 2006).

Некоторые исследования были предприняты, чтобы понять корреляцию оксидантного окружения и продукции церамида (Levy et al., 2006; Won and Singh, 2006; Nikolova-Karakashian and Reid, 2011). Большинство хорошо известных механизмов связано с генерацией церамида в оксидантных условиях посредством SMases, энзимов, обладающих высокой чувствительностью к оксидативным стрессам, и чья активность ингибируется присутствием GSH (Figure 3; Levy et al., 2006; Won and Singh, 2006; Nikolova-Karakashian and Reid, 2011). Когда уровни GSH снижены, то neutral sphingomyelinase 2 (nSMase2) активируется, способствуя накоплению церамида и апоптозу клеток (Levy et al., 2006; Won and Singh, 2006; Castillo et al., 2007). Воздействие H₂ O₂ активирует nSMase2, тогда как воздействие ONOO^- активирует acid sphingomyelinase (aSMase), вызывая генерацию церамида. Однако эти эффекты не обнаруживаются в условиях с низкими уровнями ROS (Figure 3; Castillo et al., 2007).

Интересно, что умеренные уровни ROS активность SPHK, это приводит к повышению внутриклеточного S1P снижению уровней церамида и способствует выживанию клеток (Pchejetski et al., 2007; Van Brocklyn and Williams, 2012). Однако избыточная продукция ROS приводит к снижению S1P за счет деградации SPHK, это способствует генерации церамида и клеточному апоптозу (Pchejetski et al., 2007; Van Brocklyn and Williams, 2012). Напротив, антиоксидант N-acetyl-cysteine способен блокировать деградацию SPHK, чтобы поддерживать уровни S1P и способствовать выживанию клеток (Maceyka et al., 2007; Pchejetski et al., 2007). Кроме того, митохондриальный S1P взаимодействует с PHB2, белком, связанным с биогенезом и функцией митохондрий (Strub et al., 2011). Взаимодействие между S1P and PHB2 способствует сборке комплекса IV, показывая, что митохондриальный S1P может быть важен для поддержания активности пути оксидативного фосфорилирования (Strub et al., 2011).

В дополнение к роли сфинголипидов с митохондриях они также ассоциированы с ROS в микродоменах мембран, наз. липидными плотиками. Эти липидные плотики обогащены кластерами сфинголипидов, гликосфинголипидов, холестерола и белков, они создают сигнальную платформу, способную привлекать или агрегировать различные рецепторы, такие как TNFα рецепторы, которые индуцируют генерацию церамида (Won and Singh, 2006; Catalgol and Kartal Ozer,2010). Однако церамид участвует в активации NADPH оксидазы, которая агрегирует с липидными микродоменами, формируя lipid raft-redox сигнальные платформы, способные продуцировать H₂ O₂ и ONOO^- в ответ на разные стимулы (Won and Singh, 2006; Catalgol and Kartal Ozer, 2010). В сердечно-сосудистой системе экспрессируются разные изоформы NADPH оксидазы (NOX1, NOX2, NOX4 и NOX5) (Brandes et al., 2010). Точнее говоря сердечно-сосудистые гомологи NOX1 и NOX2 высвобождаются, тогда как NOX5 способна формировать и о^- ₂ и H₂ O₂ (Brandes et al., 2010). С др. стороны, NOX4 неспособен продуцировать О^- ₂ и продуцирует только H₂ O₂ (Brandes et al., 2010). Angiotensin II (Ang II) важным активатором NADPH оксидаз посредством G protein-сцепленного рецептора Ang II type 1 receptor (AT1R) в сосудистых гладкомышечных клетках (Figure 3; Cai et al., 2003; Ushio-Fukai and Alexander, 2006). Этот рецептор индуцирует p47phox фосфорилирование, которому предшествует индукция c-Src, phospholipase D (PLD) и protein kinase C (PKC; Cai et al., 2003; Ushio-Fukai and Alexander, 2006). Индукция c-Src стимулирует транс-активацию epidermal growth factor response (EGFR) белка, что приводит к активации phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) и Rac (Figure 3; Cai et al., 2003). Затем, Rac транслоцируется в клеточную мембрану, стимулируя и поддерживая функции NOX (Figure 3; Cai et al., 2003). В этом смысле, AT1R с caveolin для транслокации части AT1R в обогащённые кавеолином липидные платформы, что важно для передачи сигналов AT1R (Figure 3; Ushio-Fukai and Alexander, 2006).

Caveolin является мембранным белком, составляющим домен мембран кавеол; кавеолы являются липидными плотиками, участвующими в разных сигнальных путях, таких как эндоцитоз, регуляция липидов, организация цитоплазматической мембраны, сигнальная трансдукция и передача сигналов кальция (Parton and del Pozo, 2013).

Более того, NO является молекулой, защищающей сосуды, продуцируемой с помощью endothelial NO synthase (eNOS), которая нуждается в кофакторе BH4 и L-arginine для своей димеризации (Forstermann and Munzel, 2006). Однако, производное NADPH оксидазы О^- ₂ реагирует с NO, способствуя образованию ONOO^- в эндотелиальных клетках и ограничивая биодоступность NO (Figure 3; Cai et al., 2003; F?rstermann and M?nzel, 2006; Brandes et al., 2010). Кроме того, образование сосудистых ROS может потенциально увеличивать не связанные eNOS, которые превращаются в способствующие окислению молекулы, способствующие продукции больших количеств О^- ₂ и дальнейшему снижению биоактивного NO (Cai et al., 2003; F?rstermann and M?nzel, 2006; Brandes et al., 2010).

образом, ROS может стимулировать tyrosine kinases Src, Fyn и Abl фосфорилированию caveolin по tyrosine 14, приводя к активации его сигнальных мишеней и это фосфорилирование важно для внутриклеточной передачи сигналов внутри кавеол (Li et al., 1996; Catalgol and Kartal Ozer,2010). В этих микродоменах, sphingomyelin взаимодействует с холестеролом, чтобы определить переход между жидкой и упорядоченной или гель-подобной фазой цитоплазматической мембраны (Catalgol and Kartal Ozer, 2010). Однако наблюдается, что экзогенный церамид способствует вытеснению холестерола из липидных плотиков, модифицируя белковый состав и структуру липидных платформ (Megha and London, 2004). Следовательно, возможно, что индуцированное ROS накопление церамида изменяет композицию липидных плотиков и нарушает сигнальную трансдукцию через липидные платформы.

Interplay between ROS and sphingolipids in the heart

Изучение эмбрионов кур продемонстрировало, что тракт оттока у эмбрионов более чувствителен к оксидативным стрессам, чем вентрикулярный или атриальный миокард и значительно более чувствителен, чем постнатальные или зрелые кардиомиоциты после воздействия наномолярными концентрациями H₂ O₂ и зависимым от времени экспозиции способом (Fisher, 2007). Интересно, что H₂ O₂ способствует увеличению активности caspase 3 в мезенхиме подушек тракта оттока, тогда как миокард тракта оттока обнаруживает индуцированные оксидантами повреждения (Fisher, 2007). Более того, высокие уровни ROS вызывают аберрантный апоптоз, ассоциированный с повреждениями ДНК и митохондрий, приводящий к патологическому ремоделированию и аномалиям сердца (Takimoto and Kass, 2007). Напротив, апоптоз может также быть ассоциированным с морфологическими событиями в кардиомиоцитах тракта оттока, где он обеспечивает ротацию и укорочение тракта оттока во время перехода от одиночной к двойной циркуляции (Watanabe et al., 2001). Эта стадия ремоделирования тракта оттока необходима для соотв. васкулогенеза и образования зрелых вентрикуло-артериальных соединений (Watanabe et al., 2001).

Помимо ремоделирования сердца, ROS индуцирует кардиальную гипертрофию путем стимулирования разных сигнальных путей, включая активацию Src, Ras GTPase, PKC, Ask-1, MAPKs и JNK белков (Takimoto and Kass, 2007). Следовательно, избыточная продукция ROS может быть связана с патологическим ремоделированием сердца, гипертрофией, фиброзом и контрактильной дисфункцией. Влияние ROS на контрактильную дисфункцию связано с модификациями важных белков из процессов, связанных с возбуждением и сокращением. В этом смысле, ROS супрессирует L-type кальциевые каналы и sarcoplasmic reticulum Ca2+-pump ATPase (SERCA), затрагивающие транспорт Ca²⁺ через сарколемму (Zima and Blatter, 2006; Takimoto and Kass, 2007).

Redox регуляция также может модифицировать активность Na⁺ -H⁺ обменников, Na⁺ -K⁺ ATPase и oxidate thiol (SH) групп в белках канала, таких как SERCA (Zima and Blatter, 2006). Сходным образом, sphingosine и sphingomyelin могут редуцировать внутриклеточные концентрации Ca²⁺, тогда как церамид и S1P оказывают противоположный эффект, способствуя увеличению свободного внутриклеточного Ca²⁺ в кардиомиоцитах у взрослых и новорожденных крыс (Alewijnse et al., 2004). Более того, острое увеличение церамида или S1P может увеличивать цитозольную концентрацию Ca²⁺, способствуя усилению контрактильной функции в изолированных миоцитов из желудочков крыс и в культивируемых интерстициальных клетках клапанов свиньи, соотв. (Relling et al., 2003; Witt et al., 2012). Гипоксия у матери вызывает генерацию ROS и воспалительный стресс в сердце плода из-за повышенных уровней NOS, nitrotyrosine, способствующих воспалению цитокинов (напр., IL-6, TNFα), хитшокового белка 70 (HSP70) и matrix metalloproteinases (Thompson and Al-Hasan, 2012). Воздействие на эмбрионов гипоксии вовремя пренатальной фазы вызывает низкую кардиальную эффективность, ограниченный рост сердца, измененную деятельность сердца и пониженную экспрессию PKCε в сердце плодов и взрослых крыс (Thompson and Al-Hasan, 2012). Кроме того, PKCε выполняет важную роль в защите сердца и участвует в дифференцировке кардиальных предшественников (Galli et al., 2013). Однако новорожденные крысы, подвергнутые воздействию hyperoxic условий, обнаруживают повышенную продукцию ROS и, следовательно, повышенное систолическое давление крови и дисфункцию сосудов у взрослых (Thompson and Al-Hasan, 2012). Более того, активация nSMase действует как самая ранняя реакция на redox стресс, генерируемая с помощью hypoxia-reoxygenation, которые способствуют накоплению церамида в кардиомиоцитах (Nikolova-Karakashian and Reid, 2011). Интересно, что SPHK1 активируется в ответ на гипоксические условия за счет активации HIF1α и HIF2α способствуя повышению уровней S1P и стимуляции миграции эндотелиальных клеток и внося тем самым вклад в ангиогенез и ремоделирование ткани (Schwalm et al., 2008). Однако в кардиомиоцитах новорожденных крыс ишемия, наступающая после повреждения реперфузии, способствует прогрессивному накоплению церамида, индукции апоптоза в миокардиальных клетках путём индукции TNF и Fas лиганда (Bielawska et al., 1997). Такое увеличение церамида может быть обусловлено с помощью продукции ROS вовремя реперфузии, как только кровоток восстанавливается в миокарде, приводя к генерации ROS и ассоциированной патологии ischaemia/reperfusion (Braunersreuther and Jaquet, 2012).

Др. важная роль ROS и сфинголипидов связана с миграцией кардиального нервного гребня. Клетки нервного гребня происходят из нейроэктодермы и подвергаются EMT, мигрируя в разные места эмбриона и внося вклад в развитие различных органов, включая сердце (Morgan et al., 2008). Следовательно, миграция клеток кардиального нервного гребня важна для собственно образования перегородки тракта оттока, это приводит к образованию аорты, легочного ствола и артерий аортальной дуги (Morgan et al., 2008).

Наблюдается, что клетки кардиального нервного гребня чрезвычайно чувствительны к ROS, поскольку эти клетки обладают низкими уровнями SOD и CAT (Roest et al., 2007). ROS индуцированные с помощью гипергликемии, способны способствовать миграции клеток кардиального нервного гребня, дефектам тракта оттока, тяжелым аномалиям и апоптозу аортальной дуги (Roest et al., 2007; Morgan et al., 2008). Кроме того, микотоксин fumonisin потенциально воздействует на клетки нервного гребня (Marasas et al., 2004). Fumonisin, как известно, ингибирует ceramide synthase (CS), чтобы модифицировать клеточную пролиферацию, увеличить экспрессию цитокина (напр., TNFα) и способствовать накоплению свободных sphingoid оснований, таких как sphinganine и sphingosine (He et al., 2001; Marasas et al., 2004). Fumonisin может ингибировать митохондриальный комплекс I, приводя к деполяризации митохондриальной мембраны; fumonisin также нарушает передачу сигналов кальция и способствует продукции ROS (Domijan and Abramov, 2011). Кроме того, ингибирование синтеза церамида приводит к нарушению синтеза sphingomyelin и glycosphingolipid, приводя к разрушению цитоплазматических мембран, это также влияет на активность мембранных транспортеров фолатов (FRs; Marasas et al., 2004; Sabharanjak and Mayor, 2004).

Фолат важен для эмбрионального развития, включая развитие сердечно-сосудистой системы (Tang et al., 2004). Более того, фолат является кофактором для разнообразных клеточных реакций, включая синтез аминокислот и нуклеотидов, и фолат также участвует в one-carbon реакциях (Sabharanjak and Mayor, 2004; Tang et al., 2004). Недостаточность фолата увеличивает уровни homocysteine, перокисление липидов и продукцию ROS (ассоциирует с дисфункцией цитохром c оксидазы), нарушает активность антиоксидантных энзимов и способствует деполяризации мембраны (Chang et al., 2007).

Отметим, что FRs являются glycosylphosphatidylinositol-закрепленными белками, которые стабилизируются за счет своей ассоциации с кавеолами, где фолат и FR интернализуются с помощью зависимого от липидных плотиков эндоцитоза (Sabharanjak and Mayor, 2004). Адекватное распределение холестерола и сфинголипидов является критическим для морфогенеза сердца; аномальный транспорт фолата приводит к уменьшению пролиферации кардиомиоцитов и увеличению клеточного апоптоза, которые и вносят вклад в дефекты сердца (Tang et al., 2004). Кроме того, аномальный метаболизм сфинголипидов, и продукция ROS приводят к снижению экспрессии гена Pax3 в клетках кардиального нервного гребня (Roest et al., 2007; Morgan et al., 2008). Pax3 кодирует белок, экспрессирующийся в нервной трубке, нервном гребне и сомитах, и он важен для миграции клеток кардиального нервного гребня и пролиферации предшественников нервного гребня (Tang et al., 2004). Снижение экспрессии Pax3 ассоциирует с дефектами развития сердца, включая прерывание аорты, двойной выход из правого желудочка, аномальная функция миокарда и персистенция truncus arteriosus (Roest et al., 2007; Morgan et al., 2008).

Более того, ингибирование Rho GTPases в кардиальном развитии мыши вызывает тяжелые дефекты в морфогенезе сердца на ст. E9.5, такие как слабая трабекуляция, перикардиальные излияния, бедность ткани клетками, а также нарушение петлеобразования сердца и созревания желудочков (Wei et al., 2002). Кроме того, отсутствие Rho GTPases подавляет образование EC и bulboventricular борозды, региона, который демаркирует ось будущей межжелудочковой перегородки (Wei et al., 2002). Однако, S1P может также влиять на активацию передачи сигналов Rho GTPase посредством S1PR1, S1PR2 и S1PR3, и активация Rho GTPase связана с ремоделированием сердца (Takuwa et al., 2008). Т.о., S1P обеспечивает активацию Rac и Rho или ингибирование Rho-зависимого ингибирования Rac зависимым от субтипа рецептора способом (Takuwa et al., 2008). Эти мембранные рецепторы, купированы с G белками, которые регулируют разные нижестоящие сигналы с помощью Gi, G12/13 и Gq (Takuwa et al., 2008). Сходным образом, Rho активируется в сердце с помощью G12/13 белков посредством и S1PR2, и S1PR3 (Takuwa et al., 2008). Rac активируется с помощью S1PR1 и S1PR3-обеспечиваемой активности Gi, тогда как S1PR2 ингибирует активность Rac (Takuwa et al., 2008). Активация Rac и Rho может быть также связана с повышенными уровнями ROS (Takuwa et al., 2010). Т.о., аномальный метаболизм сфинголипидов, и продукция ROS могут быть ассоциированы с нарушениями нижестоящей передачи сигналов к мишеням, важным для кардиального морфогенеза.

Cardiovascular diseases related to ROS action and sphingolipids

Врожденные пороки сердца (CHDs) состоят из структурных аномалий сердца и кровеносных сосудов, которые обнаруживают распространение 0.8%, 0.69% и 0.93% у живых рожденных в США, Европе и Азии соотв. (Go et al., 2014). Среди наиболее частых проявлений CHDs встречаются дефекты межжелудочковой и межатриальной перегородки, сопровождаемые patent ductus arteriosus и стенозом клапанов легочного ствола (Go et al., 2014).

Некоторые болезни у взрослых ассоциированы с разными стрессовыми условиями внутри матки, которые возникают во время эмбрионального развития, Кардиальные аномалии, ассоциированные с изменениями в плацентно-материнском интерфейсе, где внешнесредовые факторы и материнские болезни играют существенную роль в эмбриональном развитии. Эти факторы, способные увеличивать риск CHD, такие как сахарный диабет, фенилкетонурия, ожирение и факторы образа жизни, такие как курение и использование алкоголя (Das and Vasudevan, 2007; Ku and Dulskien, 2008; Ribas et al.,2011; Thompson and Al-Hasan, 2012; De Marchi et al., 2013). Удивительно, исследования выявили корреляцию материнской тучности с повышенным риском эмбриональных CHD (Mills et al., 2010). Авт. продемонстрировали, что ожирение увеличивает шансы развития дефектов межпредсердных перегородок, стеноза аорты и лёгочного ствола, тетрады Фалло и синдром гипоплазии левого сердца (Mills et al., 2010). Др. сравнительное исследование касалось статуса оксидативных стрессов у 30 детей рожденных здоровыми матерями одного возраста и у 43 детей с разными типами CHD (Pirinccioglu et al., 2012). Было установлено, что CHD группа представлена пониженной антиоксидантной активностью и позитивными биомаркерами повреждений от ROS, такими как повышенные уровни белка carbonyl, маркера оксидативных повреждений белка и malondialdehyde (MDA), маркера перикисного окисления липидов (Pirinccioglu et al., 2012).

Доказательства также подтвердили курение сигарет как фактор дисфункции эндотелия и пороков сердца, т.к. это связано с избыточной продукцией ROS и подавлением VEGF-индуцированной клеточной миграции (Michaud et al., 2006). VEGF является важным модулятором кардиального развития, действующего на морфогенез AVC и EMT (Enciso et al., 2003). Кроме того, VEGFA коррелирует диабетической эмбриопатией, затрагивающей миграцию эндотелиальных клеток, трансформацию и инвазию, и способствует дефектам в EC (Enciso et al., 2003).

Более того, передача сигналов сфинголипидов и ROS широко участвует в возникновении эндотелиальной дисфункции и прогрессировании сосудистых или системных болезней, таких как атеросклероз, диабет и гипертензия (Won and Singh, 2006; Zhang et al., 2006; Catalgol and Kartal Ozer, 2010).

Снижение NADPH оксидаз это основной источник ROS в сосудистой ткани и контроля гомеостаза эндотелиальной функции (Griendling and Harrison, 2001; Zhang et al., 2006). Однако её аномальная активность связана с эндотелиальным патогенезом и факторами риска атеросклероза (Griendling and Harrison, 2001; Zhang et al., 2006). Кроме того, в одном сообщении продемонстрировано, что рецепторы гибели и апоптические факторы, такие как TNFα Fas лиганд и endostatin, стимулируют образование кластеров липидных плотиков и рекрутируют NOX2, p47phox и Rac в эти структуры (Zhang et al., 2006). Т.о., это рекрутирование и образование кластеров липидных платформ способствуют активации и агрегации NADPH оксидазы в эндотелиальных клетках коронарных артерий, продуцируя ROS и устанавливая redox сигнальную платформу (Zhang et al.,2006). Образование кластеров, обогащенных церамидом липидных плотиков в ответ на некоторые факторы увеличивает продукцию ROS, это может приводить к окислению липопротеинов низкой плотности, активации SMase и накоплению церамида, достигающих кульминации при сосудистых заболеваниях, таких как атеросклероз (Catalgol and Kartal Ozer, 2010). NADPH oxidase-произведенные ROS являются модуляторами передачи сигналов и ассоциируют с гипертензией, гипертрофией, процессами ремоделирования и воспалением (Brandes et al., 2010). Несмотря на это, NOX4, являющаяся основной изоформой NADPH оксидазы, экспрессируется в недифференцированных эмбриональных стволовых клетках, дифференцированных эмбриоидных тельцах и неонатальных кардиомиоцитах (Li et al., 2006). В отличие от др. NAPDH оксидаз, которые обычно ассоциируют с сердечно-сосудистой патологией, NOX4-производные ROS обусловливают активацию MEF2C посредством p38 MAPK, приводя к дифференцировке кардиомиоцитов (Li et al., 2006).

Сердечно-сосудистые изоформы eNOS и нейрональная NO synthase (nNOS) постоянно экспрессируются, а их разобщение ассоциирует с различными патологиями, такими как дилятационная кардиомиопатия, атеросклероз, дисфункция эндотелия, гипертензия и ишемические реперфузионные повреждения (Roe and Ren, 2012). Вариации в кардиальной ткани уровней NO, вызываемые выключением NOS, вызывают разные эффекты на функцию и контрактильность сердца как следствие снижения биодоступности NO (Roe and Ren, 2012). В этом смысле высокие уровни NO способствуют s-nitrosylation Ca²⁺ регуляторных белков и активации растворимой guanyl cyclase, которая приводит к накоплению внутриклеточного cGMP, тогда как низкие уровни NO стимулируют активность adenylyl cyclase, увеличивая внутриклеточные уровни cAMP и Ca²⁺ (Roe and Ren, 2012). Кроме того, снижение биодоступности NO во время сердечно-сосудистого развития может быть ассоциировано с повышенным апоптозом кардиомиоцитов, а также с нарушением разных биологических процессов, таких как EMT, миграция клеток, происходящих из эпикарда, и пролиферация клеток в AV подушках (Liu and Feng, 2012). Сходным образом, дефицит eNOS связан с сердечной недостаточностью, врожденными дефектами перегородок и ассоциирует в 85% с величиной гибели в первые 7 дней постнатальной жизни мышей (Liu and Feng, 2012). В сосудистых эндотелиальных клетках S1P активирует eNOS посредством S1P мембранных рецепторов Akt-зависимым способом (Igarashi et al., 2001). Тем не менее, эндотелиальные клетки, инкубированные с экзогенными церамидами, обнаруживают усиление активности eNOS (Li et al., 2002). Церамид также способствует повышению продукции ROS и снижению биодоступности NO, благоприятствуя атерогенезу (Li et al., 2002).

Трансгенные мыши, преобразованные, чтобы способствовать избыточной экспрессии SPHK1, обнаруживают S1PR₃ -зависимый кардиальный фиброз, связанный с дегенерацией кардиомиоцитов (Takuwa et al., 2010). S1PR3 способствует увеличению уровней ROS и активации TGFβ, Rac1 и RhoA малых GTPases (Takuwa et al., 2010). Эти белки вовлечены в кардиальный фиброз и являются вышестоящими регуляторами продукции ROS (Takuwa et al., 2010). Кроме того, избыточная экспрессия SPHK1 приводит к повышенным уровням окисидативных повреждений ДНК, как показывают 8-hydroxydeoxyguanosine и MDA, маркеры пероксидации липидов и тканевые оксидативные стрессы, соотв. (Takuwa et al., 2010).

Во взрослом сердце увеличение уровней церамида за счет активации de novo путей ассоциирует с патофизиологическими событиями и дисфункцией сердца (Lee et al., 2012; Park and Goldberg, 2012). Кардиомиоциты, лишенные субъединицы Sptlc2 из serine palmitoyltransferase, обнаруживают дефицит в составе липидов сердца, который приводит к дисфункции сердца (Lee et al., 2012). Тем не менее, нарушение биосинтеза сфинголипидов с помощью дисфункции serine palmitoyltransferase связано с увеличением кардиальной контрактильностии снижением экспрессии апоптических генов, предупреждающих токсичность, связанную с избытком церамида (Lee et al., 2012; Park and Goldberg,2012).

Conclusions

The role of sphingolipids as modulators of redox equilibrium and heart development is poorly understood. Although studies have shown that sphingolipids such as ceramide play an important role in modulating ROS production, the molecular mechanisms underlying this interplay are still elusive. Nevertheless, it is clear that these molecules are able to impact cell fate, as ROS is able to reduce S1P synthesis and promote ceramide accumulation.

It is also clear that sphingolipids, primarily S1P and ceramide, are deeply connected to multiple heart abnormalities and CHD. However, the understanding of this sphingolipid rheostat during differentiation, migration, contractility and remodelling of cardiac tissue is an arduous task, as it is difficult to address the pleiotropic effects of these lipids and the extent of their influence on biological processes. Nonetheless, they have arisen as crucial mediators of heart development and should be taken into consideration when trying to understand the pathologies associated with cardiogenesis.

The importance of sphingolipids and reactive oxygen species in cardiovascular development Joice de Faria Poloni, Henrique Chapola, Bruno C?sar Feltes and Diego Bonatto* Biology of the Cell Volume 106, Issue 6, pages 167-181, June 2014

The importance of sphingolipids and reactive oxygen species in cardiovascular development
Joice de Faria Poloni, Henrique Chapola, Bruno C?sar Feltes and Diego Bonatto*
Biology of the Cell Volume 106, Issue 6, pages 167-181, June 2014