Посещений:
СПИНАЛЬНЫЕ ДВИГАТЕЛЬНЫЕ НЕЙРОНЫ

Дифференцировка

How to make spinal motor neurons
Brandi N. Davis-Dusenbery, Luis A. Williams, Joseph R. Klim and Kevin Eggan
2014 Development 141, 491-501.

All muscle movements, including breathing, walking, and fine motor skills rely on the function of the spinal motor neuron to transmit signals from the brain to individual muscle groups. Loss of spinal motor neuron function underlies several neurological disorders for which treatment has been hampered by the inability to obtain sufficient quantities of primary motor neurons to perform mechanistic studies or drug screens. Progress towards overcoming this challenge has been achieved through the synthesis of developmental biology paradigms and advances in stem cell and reprogramming technology, which allow the production of motor neurons in vitro. In this Primer, we discuss how the logic of spinal motor neuron development has been applied to allow generation of motor neurons either from pluripotent stem cells by directed differentiation and transcriptional programming, or from somatic cells by direct lineage conversion. Finally, we discuss methods to evaluate the molecular and functional properties of motor neurons generated through each of these techniques.


Рисунки к статье

В своем дневнике, Jean-Dominique Bauby жаловался 'Other than my eye, two things are not paralyzed, my imagination and my memory' (Bauby, 1998). Такое тяжелое состояние, связанное с переживаниями, наблюдается при синдроме locked-in, при котором головной мозг остается относительно интактным, но терминальные нейроны, соединяющиеся со всеми мышцами, за исключением глазных, оказываются нефункциональными. Как результат, locked-in индивиды обладают единственной способностью воспринимать зрительные стимулы и думать о том, чего они не могут воплотить.
Два определяемые широко типы нейронов осуществляют связь между головным мозгом и мускулатурой: верхние или cortical spinal motor neurons (CSMNs) и нижние спинальные двигательные нейроны. Как подразумевают их названия, клеточные тела CSMNs располагаются в коре и передают двигательную информацию вниз по длинным аксонам в спинной мозг. Спинальные двигательные нейроны воспринимают эту информацию и посредством аксонов, которые проецируются из спинного мозга к мускулатуре, приводят в действие сокращения посредством специализированных синапсов, neuromuscular junction (NMJ).
Серьёзные повреждения нисходящих аксонов спинного мозга после физических повреждений или инсульта могут приводить к полному параличу. Хотя локальные повреждения периферических нервов к двигательным моторным нейронам могут вызывать только частичный паралич, состояния, такие как amyotrophic lateral sclerosis (ALS) и spinal muscular atrophy (SMA) могут вызывать более глобальную дегенерацию двигательных нейронов и приводить к состоянию locked-in (Box 1).

Box 1. Motor neuron degeneration in disease

Motor neuron diseases (MNDs) result from the progressive degeneration and death of motor neurons (MNs). The two most studied MNDs are the childhood genetic disease spinal muscular atrophy (SMA) and the adult-onset neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) (Burghes and Beattie, 2009; Ling et al., 2013). Both diseases involve neuromuscular dysfunction progressively leading to fatal paralysis. SMA is an autosomal-recessive disease characterized by the selective loss of spinal MNs. The vast majority of SMA cases are caused by mutations in the ubiquitously expressed survival of motor neuron-1 (SMN1) gene. These mutations lead to the severe reduction in SMN levels, which is thought to affect small nuclear ribonucleoprotein biogenesis, as well as RNA transport in neurons (Burghes and Beattie, 2009). A growing collection of evidence indicates that therapeutics capable of elevating SMN levels could be effective in treating SMA (Passini and Cheng, 2011). Still, precisely how a deficiency in SMN, a ubiquitously expressed protein, causes selective loss of MNs remains unclear.
In contrast to SMA, ALS affects both the cortical and spinal MNs. Approximately 10% of ALS cases are classified as familial, leaving the majority of ALS cases to be considered sporadic in origin. Several themes are emerging in the molecular pathologies of ALS (reviewed by Ling et al., 2013). These include dysfunctions in RNA processing and protein homeostasis as well as endoplasmic reticulum stress and problems in axonal transport. Interestingly, in SMA and ALS distinct subtypes of lower MNs are thought to be initially vulnerable to degeneration (Kanning et al., 2010). Thus, studying diverse populations of MNs in vitro could illuminate differential responses and guide the development of new therapeutics.


Как же развиваются терминальные двигательные дуги (circuitry) , это инспирировало многочисленные исследования, что сделало спинальные двигательные нейроны наиболее изученными типами нейронов. Желание защитить и в конечном итоге регенерировать двигательные связи в контексте болезней двигательных нервов и повреждений спинного мозга мотивировало попытки использования стволовых клеток и технологий репрограммирования, чтобы продуцировать двигательные нейроны для использования в поступательных движениях, включая моделирование данных состояний.
Мы хотим впервые рассмотреть процессы и события, которые контролируют спецификацию и дифференцировку спинальных двигательных нейронов во время эмбриогенеза. Затем мы обсудим, как возникающее понимание развития двигательных нейронов приводит к методам для направленной дифференцировки мышиных и человеческих pluripotent stem cells (PSCs) в двигательные нейроны. Сравнительно недавние усилия получать двигательные нейроны непосредственно из фибробластов за счет вынужденной экспрессии транскрипционных факторов, важных для характеристики двигательных нейронов также были предприняты. Наконец мы рассмотрим методы для оценки эквивалентности происходящих in vitro двигательных нейронов с их настоящими аналогами. Мы сфокусируем наше внимание исключительно на спинальных двигательных нейронах (обозначаемых просто MNs) и отправляем читателей, интересующихся развитием перепрограммированием CSMN к недавним публикациям (Shoemaker and Arlotta,

MN development


Десятилетия эмбриологических исследований и генетического анализа на модельных организмах выявили молекулярные основы нейральной индукции, а также дальнейшей дифференцировки и спецификации MNs во время развития. В начале 20th столетия, работа Spemann и Mangold's на эмбрионах амфибий показала, что сигналы, исходящие от дорсальной губы бластопора, теперь наз. Spemann-Mangold 'организатором', необходимы для индукции нейральной судьбы во время гаструляции (Hamburger, 1988). Дальнейшие исследования продемонстрировали, что скорее, чем предоставление позитивных сигналов для индукции судьбы нервных клеток, организатор является источником факторов, которые ингибируют передачу сигналов bone morphogenetic protein (BMP), включая Chordin, Follistatin и Noggin (De Robertis, 2006). Хотя потребность в ингибировании передачи сигналов BMP законсервирована у высших организмов, дополнительные индуктивные сигналы, включая fibroblast growth factors (FGFs), epidermal growth factors (EGFs) и Wnts были идентифицированы (Stern, 2005) (Fig. 1A).
После их инициальной генерации, клетки нервной трубки специфицируются вдоль как ростро-каудальной, так и дорсо-вентральной оси. Градиенты сигнальных молекул вдоль каждой оси предоставляют дорожную карту для проведения дифференцировки возникающих типов нейронов в каждом регионе. Домены предшественников специфицируются первыми и затем делаются более утонченными благодаря кооперативному действию внешних сигналов и нижестоящих транскрипционных факторов (Jessell, 2000; Alaynick et al., 2011). Вдоль ростро-каудальной оси нервная трубка специфицируется на крупные компоненты ЦНС, включая головной мозг, средний мозг, задний мозг и спинной мозг (Fig. 1A). Хотя множественные сигналы, как полагают, вносят вклад в каудализацию нейронов в спинном мозге, главным среди них является ретиноевая кислота retinoic acid (RA). В раннем развитии RA продуцируется благодаря активности retinaldehyde dehydrogenase 2 (RALDH-2; также известен, как ALDH1A2), испускаемой каудальной параксиальной мезодермой, и является критической для первоначального разграничения нейронов заднего и спинного мозга от тех, что в переднем и среднем мозге (Maden, 2007) (Fig. 1A).

Specification of MN fate


Вдоль дорсо-вентральной оси нервной трубки клетки предшественников подразделяются на пять доменов вентральных предшественников, наз. p0, p1, p2, pMN и p3, в свою очередь дают подтипы промежуточных нейронов V0-3 и двигательных нейронов (Fig. 1B). Градиент sonic hedgehog (Shh), секретируемый хордой и клетками вентральной пластинки нервной трубки, предоставляет вентральную топографическую информацию путем регуляции экспрессии гомеодоменовых (HD) и basic helix-loop-helix (bHLH) транскрипционных факторов (Alaynick et al., 2011). Транскрипционные факторы, стоящие ниже Shh, могут быть грубо подразделены на два класса, базируясь на их регуляции в ответ на передачу сигналов Shh. Белки класса II, включая Nkx6.1, Olig2 и Nkx2.2, активируются с помощью Shh и в свою очередь репрессируют экспрессию белков класса I, включая Pax6, Irx3, Dbx1 и Dbx2 (Briscoe et al., 2000; Jessell, 2000; Alaynick et al., 2011) (Fig. 1B).
Перекрестно-репрессивная активность между классом II и классом I белков открывает возможность консолидации качественных особенностей предшественников, а также генерации острых границ между соседними доменами (Briscoe et al., 2000). Напр., граница между p3 и pMN прочерчивается с помощью активности Pax6 и Nkx2.2. В самом деле у эмбрионов мыши мутация Pax6 вызывает дорсальное расширение границы экспрессии Nkx2.2 (Ericson et al., 1997). Сходным образом, дорсальная граница между pMN и p2 определяется с помощью взаимных репрессивных активностей Irx3 и Olig2, тогда как вентральная граница определяется экспрессией Ngn3 (Neurog3) (Novitch et al., 2001; Sugimori et al., 2007). Предшественники MN также экспрессируют HD транскрипционные факторы Nkx6.1 и Nkx6.2, которые действуют, чтобы репрессировать др. домены предшественников (Briscoe et al., 2000) (Fig. 1B). Экспрессия Olig2 в pMN домене способствует экспрессии Ngn2, который важен для выхода из клеточного цикла, а также для индукции терминальных MN транскрипционных факторов, включая Hb9 (Mnx1), Isl1, Isl2 и Lhx3 (Novitch et al., 2001). Недавно дополнительные молекулярные механизмы, включая пути микроРНК, как было установлено, регулируют границы между некоторыми доменами предшественников (Chen et al., 2011).

MN subtype specification


Хотя все MNs происходят из одиночного домена вентральных предшественников, дальнейшая спецификация MNs делает возможным скоординированное перемещение сотен разных мышечных групп. MNs могут быть далее расклассифицированы на основании их анатомических и функциональных свойств (Box 2). Позиционные качественные особенности MNs вдоль ростро-каудальной оси определяются координированным действием многих сигнальных молекул. Высокие уровнеи RA способствуют приобретению ростральных (напр. шейных и плечевых) качественных особенностей, тогда как активности FGFs и Gdf11 дают более каудальные (напр. торакальные и поясничные) MNs (Liu et al., 2001). Скомбинированные сигналы от RA, FGFs, Wnts и TGFβ членов семейств интегрируются, прежде всего, с помощью Hox транскрипционных факторов, чтобы специфицировать качественные особенности MN ростро-каудальных подтипов (Dasen and Jessell, 2009). Мышиные и человеческие Hox гены выстраиваются в 4 хромосомных кластера (HoxA, HoxB, HoxC и HoxD), каждый из которых обладает субнабором из 13 Hox генов паралогов (Hox1-Hox13). Внутри каждого кластера паттерн экспрессии Hox генов пространственно и во времени колинеарен с их хромосомной организацией, так что Hox1 гены экспрессируются в ростральном регионе организма, а Hox13 гены экспрессируются каудально (Pearson et al., 2005). В соответствии с их консервативной ролью в формировании паттерна тела, экспрессия Hox генов внутри спинного мозга детерминирует качественные особенности MN в столбах и избирательную мышечную иннервацию, при этом Hox4-8 гены экспрессируются на плечевом уровне, гены Hox8 и Hox9 на торакальном уровне, а Hox10 и Hox11 в поясничной области (Dasen et al., 2005; Dasen and Jessell, 2009) (Fig. 1C). Дальнейшая спецификация индивидуальных подтипов MN осуществляется с помощью тонкой настройки экспрессии паттерна Hox белков как в пространстве, так и во времени (Philippidou and Dasen, 2013). kar2

Box 2. Subclassification of MNs

Spinal MNs can be classified based on both anatomical and functional properties. Anatomically, MNs are divided into five major MN columnar identities: the phrenic motor column (PMC), lateral motor column (LMC), preganglionic column (PGC), hypaxial motor column (HMC) and median motor column (MMC) (Dasen and Jessell, 2009; Kanning et al., 2010; Philippidou and Dasen, 2013). MNs of each column reside in stereotypical regions along both the rostro-caudal and dorso-ventral axes. The MNs of the LMC can be further subdivided into MNs projecting either ventrally or dorsally within the limb, designated as medial (LMCm) or lateral (LMCl) groups, respectively. MN columnar pools can be further organized according to their innervation of particular muscle group targets.
The MNs of each pool can be further classified based on functional properties. These are defined by the type of muscle fiber innervated and are associated with morphological differences between MN classes. Individual muscles are composed of a mixture of fiber types, which can be grouped into two major categories: extrafusal and intrafusal. Whereas intrafusal fibers modulate the sensitivity of muscle to stretch, extrafusal fibers are primarily responsible for skeletal movement. Extrafusal muscle fibers can be further classified into fast twitch fatigable (FF, Type IIb/x), fast twitch fatigue resistant (FR, Type IIa) and slow twitch (S, Type I). α-MNs innervate these three extrafusal fiber types, whereas γ-MNs innervate intrafusal fibers. Both types of fibers can also be innervated by β-MNs (not shown). In addition to differences in the type of muscle fiber innervated, MN classes exhibit morphological differences with α-FF MNs typically representing the largest neurons and γ- and β-MNs being smaller (Kanning et al., 2010).


Экспериментальные манипуляции с Hox кодом у эмбрионов кур и мышей могут изменить субтип и характер проекций MN (Tiret et al., 1998; Wahba et al., 2001; Vermot et al., 2005;Wu et al., 2008; Misra et al., 2009; Jung et al., 2010; Philippidou et al., 2012; Lacombe et al., 2013). В качестве особенно наглядного примера мутация Hoxc9 у мышей вызывает потерю MNs торакального preganglionic column (PGC) и hypaxial motor column (HMC) и увеличение домена плечевого lateral motor column (LMC) (Jung et al., 2010). ChIP-Seq анализ Hoxc9 выявил, что этот белок непосредственно соединяется с многочисленными регионами внутри разнообразных Hox локусов, а его нарушение изменяет экспрессию многих Hox генов, подтверждая, что Hoxc9 может представлять собой ведущий регулятор качественных особенностей подтипов MN (Jung et al., 2010).
Способность разных Hox генов играть такую важную роль в детерминации качественных особенностей MN вообще-то является неожиданной, принимая во внимание, что гомеодомены Hox генов в основном законсервированы между паралогами. Однако накапливаются доказательства, что дальнейшая специфичность функции Hox может обеспечиваться за счет дополнительных факторов, включая нижестоящие эффекторы, такие как Forkhead box (Fox) белок P1 и HD белок Nkx6.1 (Philippidou and Dasen, 2013). FoxP1 экспрессируется на высоком уровне в LMC MNs, а эмбрионы FoxP1-/- мышей обнаруживают нарушения качественных характеристик MN в столбе и отклонения в расположении тел клеток MN и в проекции аксонов (Dasen et al., 2008; Rousso et al., 2008).
Многочисленные работы описывают молекулярные основы спецификации MN во время развития, это позволяет воспроизвести эти сигналы in vitro для генерации ex vivo MNs. Волнующим следствием этого прогресса является то, что он делает возможным получение достаточных количеств MNs, происходящих в контролируемых условиях, чтобы исследовать далее детальный механизм развития и спецификации MN. Напр., Mazzoni с коллегами осуществили серию исследований по иммунопреципитации хроматина во время дифференцировки MN in vitro, чтобы исследовать молекулярные детали регуляции экспрессии Hox генов (Mazzoni et al., 2013b). Авт. установили, что добавление RA во время дифференцировки MN приводит к рекрутированию рецепторов RA на домен хроматина Hox1-5 , это сопровождается быстрым удалением по всему домену H3K27me3 и приобретением качественных особенностей шейных MN. Более того, Cdx2, транскрипционный фактор, индуцируемый с помощью Wnt и FGF, контролирует очистку от H3K27me3 из доменов хроматина Hox1-9, приводя к спецификации плечевых или торакальных MN (Mazzoni et al., 2013b). Т.о., ранние модификации хроматина с помощью паттерн-формирующих факторов вносят вклад в спецификацию ростро-каудальных характеристик MNs. Этого типа механистические, геномные исследования конечно невозможны с ограниченными количествами и смешанными популяциями клеток, которые могут быть выделены из ранних эмбрионов. Продолжающаяся интеграция находок онтогенетических исследований модельных организмов и происходящих из in vitro MNs позволят расширить понимание спецификации MN и улучшить стратегии воспроизведения развития MN in vitro.

Directed differentiation of PSCs into MNs


PSCs, или эмбриональные стволовые клетки (ESCs), происходящие из предимплантационных бластоцистов (Evans and Kaufman, 1981; Thomson et al., 1998), или индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs), полученные c помощью репрограммирования соматических клеток c помощью определенных транскрипционных факторов (Takahashi and Yamanaka, 2006; Takahashi et al., 2007), характеризуются своей способностью пролиферировать неопределенное время в культуре, сохраняя свой онтогенетический потенциал, дифференцироваться в производные трех эмбриональных зародышевых слоев. За счет увеличения знаний онтогенетических путей, обеспечивающих нейральную индукцию и дальнейшую спецификацию MNs, биологи стволовых клеток разработали множественные подходы для управления дифференцировкой PSCs мышей и животных в MNs (Wichterle et al., 2002; Li et al., 2005; Singh Roy et al., 2005; Di Giorgio et al., 2007; Chambers et al., 2009; Hu and Zhang, 2009; Karumbayaram et al., 2009; Boulting et al., 2011; Patani et al., 2011; Amoroso et al., 2013). MNs, получаемые c помощью этих методов,как было установлено, обладают многочисленными характеристиками настоящих (bona fide) MNs, включая характерные электрофизиологические реакции, способность формировать функциональные NMJs и способность включаться в развивающийся спинной мозг. Также in vivo эмбриональное развитие спинальных MNs может быть прервано на определенных стадиях, также как и спецификация in vitro MNs из PSCs. В частности, ступени нейральной индукции, сопровождаемые формированием каудального и вентрального паттерна, все они соотв. образом осуществляются для MNs.

Neural induction


В отсутствии факторов, которые способствуют плюрипотентности, таких как leukemia inhibitory factor (LIF) и FGF, клетки PSCs спонтанно дифференцируются в разные клоны и теряют способность к самообновлению или генерации химерных мышей (Evans, 2011). Хотя спонтанная дифференцировка представляет собой препятствие для поддержания плюрипотентности, она может быть использована для получения дифференцированных типов клеток. Спонтанная дифференцировка во многие клоны включая нейроны может быть усилена путем индукции PSCs в условиях non-adherent культивирования, чтобы сформировать многоклеточные агрегаты, обозначаемые embryoid bodies (EBs) (Odorico et al., 2001). Однако эффективность нейральной индукции с использованием этих спонтанных подходов низкая с существенной гетерогенностью клеток внутри EBs, это препятствует дальнейшим механистическим исследованиям (Bain et al., 1995). Предложены множественные стратегии для улучшения продукции нейральных предшественников и клеток с фенотипами нейронов из дифференцирующихся популяций PSC. Эти подходы включают обработку культивируемых EB c помощью RA (Bain et al., 1995), слипчивое совместное культивирование PSCs с PA6 или MS-5 линиями стромальных питающих клеток (Kawasaki et al., 2000; Lee et al., 2007), длительное размножение nestin+ пролиферирующих клеток в определенной среде, содержащей митогены, такие как FGF2 и EGF (Okabe et al., 1996; Reubinoff et al., 2001; Joannides et al., 2007), отбор клонов, используя генетические репортеры (Li et al., 1998), и селективное ферментативное переваривание или ручной отбор структур розеток, подобных нервной трубке (Zhang et al., 2001; Hu and Zhang, 2009).
Недавно было продемонстрировано, что одновременное ингибирование сигнальных путей TGFβ/Activin/Nodal и BMP, благодаря использованию или малых молекул антагонистов или рекомбинантных ингибиторов, можно индуцировать быстрое и очень эффективное (более 80%) превращение в нейроны человеческих PSCs (Smith et al., 2008; Chambers et al., 2009; Zhou et al., 2010;Chambers et al., 2012) (Fig. 2A). Как и в случае процессов, которые происходят во время раннего развития, ингибирование путей TGFβ и BMP , как полагают, способствует дифференцировке PSCs в нейрональный клон преимущественно за счет ингибирования самообновления,, а также блокирования дифференцировки в направлении альтернативных клонов (Chambers et al., 2009). Некоторые др. пути, использующие EGFs, FGFs и Wnts, как полагают, регулируют нейрональную дифференцировку стволовых клеток мыши и человека. В частности, FGF2, как было установлено, способствует индукции и жизнеспособности нейральных предшественников (Streit et al., 2000; Wilson et al., 2000;Joannides et al., 2007). Следовательно, усиление передачи сигналов FGF2 во время нейральной индукции фазы дифференцировки может увеличивать количество нейральных предшественников, тогда как её ингибирование на последующей стадии способствует их переходу в дифференцированные нейроны (Joannides et al., 2007; Chambers et al., 2012). Fig. 2.

Caudal and ventral patterning


Вследствие нейральной индукции PSCs, клетки нейральных предшественников могут формировать паттерн с соответствии с онтогенетическими принципами. Воздействие RA способствует возникновению каудальных характеристик (спинного мозга), тогда как добавление или рекомбинантного Shh или малых молекул агонистов пути передачи сигналов Shh, таких как smoothened agonist (SAG) или purmorphamine (PUR), способствует вентрализации (Wichterle et al., 2002) (Fig. 2A). Исследования временных параметров показали, что дифференцировка in vitro осуществляется с той же самой временной регуляцией транскрипционных факторов, как это происходит in vivo, при этом Sox1+ нейральные предшественники дают Olig2+ предшественников MN, которые затем, в свою очередь, начинают экспрессировать Hb9 и Isl1 (Fig. 2B) (Wichterle et al., 2002). У мышей Hb9+ MNs начинают появляться 3-5 дней спустя после добавления паттерн-формирующих факторов (Wichterle et al., 2002; Di Giorgio et al., 2007). Время дифференцировки MN из PSCs человека более протяженное и это может в зависимости от использованного специфического протокола потребовать дополнительные 2-4 недели после нейральной индукции до появления электрофизиологической активности, HB9+ISL1+ нейронов (Chambers et al., 2009; Hu and Zhang, 2009; Boulting et al., 2011; Amoroso et al., 2013).
В противоположность хорошо изученным онтогенетическим механизмам, которые делают возможной спецификацию общую для MNs, как индивидуальные подтипы MN генерируются in vivo изучено в меньшей степени. Несмотря на это некоторые группы достигли прогресса в манипуляциях с подтипами MN, полученных c помощью направленной дифференцировки. В то время как в раннем развитии RA способствует приобретению качественных особенностей спинным мозгом, продолжающееся воздействие RA устанавливает ростральные качественные характеристики MN (Maden, 2007;Jessell, 2000). В контексте дифференцировки ESC мыши, протоколы, которые включают обработку клеток c помощью RA, обычно дают в результате MNs с шейными характеристиками, что подтверждается экспрессией Hoxc4 и Hoxa5 и отсутствием экспрессии Foxp1 или Hox8-11 (Peljto et al., 2010). Хотя дифференцировка MN обычно менее эффективна в отсутствие RA, исследованияя на мышах и человеке показали, что или передача эндогенных сигналов Wnt и FGF или подавление каскада передачи сигналов BMP/Activin/Nodal делают возможной генерацию MNs с каудальными позиционными характеристиками (Patani et al., 2009; Peljto et al., 2010; Patani et al., 2011). Более того, в контексте дифференцировки MN человека, Amoroso с коллегами недавно сообщили об изменениях в пропорции MNs, экспрессирующих характерны для median motor column (MMC) маркер LHX3 или для LMC маркер FOXP, когда передача сигналов SHH активирована посредством комбинации SAG и PUR вместо рекомбинантного SHH (Amoroso et al., 2013). Эта тонкая чувствительность дифференцирующихся MNs к изменениям в экспериментальном протоколе подчеркивает необходимость постоянной оценки протоколов дифференцировки MN и также открывает новый путь для оптимизации дальнейшей спецификации подтипов MN.

Transcriptional programming of PSCs into MNs


Ранние методы дифференцировки MN из PSCs человека были довольно неэффективны и нуждались в продолжительном периоде времени (40-60 дней) прежде чем возникающие в результате клетки приобретали электрофизиологические характеристики зрелых MNs. Чтобы повысить эффективность и уменьшить продолжительность этого процесса, Hester с коллегами связали направленную дифференцировку с подходами по программированию транскрипции (Fig. 2A) (Hester et al., 2011). После индукции нейральных предшественников из SCs человека, c помощью аденовирусов доставляли LHX3, ISL1 и NGN2 (NEUROG2) (обозначаемые как LIN факторы) в комбинации с экзогенной RA и передачей сигналов SHH , способны быстро и эффективно (более 60-70%) приобретать фенотипы зрелых MN , включая электрофизиологические свойства в течение 11 дней (Hester et al., 2011).
Дополнительная информация о транскрипционном программировании PSCs в MNs была получена при использовании мышиных ESCs генетически преобразованными, чтобы экспрессировать LIN факторы в ответ на doxycycline. В течение 24 ч активации LIN, эти клетки приобретали широко распространенные изменения генной экспрессии, при этом индукция MN маркеров Hb9 и холин ацетилтрансферазы (ChAT) происходила в течение двух дней (Mazzoni et al., 2013a). В отличие системы человека добавление паттерн-формирующих факторов не было необходимо для генерации MN; однако, сравнение с MNs, дифференцированными из ESCs мыши в условиях передачи сигналов RA и Shh показало, что активность ретиноидов влияет на экспрессию генов, контролирующих рострально-каудальные качественные характеристики (Mazzoni et al., 2013a).
Комбинированный подход направленной дифференцировки и транскрипционного программирования может позволить возникновение большого разнообразия типов MN, специфицированных in vitro. Напр., в то время как внесение Lhx3, Isl1 и Ngn2 в ESCs мыши приводило к появлению MNs со спинальными характеристиками, замещение Lhx3 на Phox2a давало MNs с краниальными характеристиками (Mazzoni et al., 2013a). Дальнейшее доказательство, что можно манипулировать точным исходом стратегий транскрипционного программирования получены в наблюдениях, что титрация относительных пропорций Lhx3 и Isl1 может влиять на спецификацию MNs в противовес V2 промежуточным нейронам. In vivo, Lhx3 и Isl1 образуют комплекс с nuclear LIM interactor protein NLI (Ldb1) , чтобы специфицировать MNs, тогда как в отсутствие Isl1, Lhx3, в комплексе с NLI, специфицирует V2 промежуточные нейроны (Thaler et al., 2002). В соответствии с этим молекулярным механизмом, эквимолярные количества Lhx3 и Isl1 способствуют генерации MN из ESCs мышей, тогда как избыток экспрессии Lhx3 дает V2 промежуточные нейроны. Использование Isl1-Lhx3 слитого белка также должно усиливать сдвиг дифференцировки клеток в направлении MNs (Lee et al., 2012). Т.к. механизм, который приводит к кооперативному действию транскрипционных факторов во время спецификации MN ещё предстоит определить, было бы интересно определить, могут ли использоваться сходные слитые белки для приобретения клетками судьбы более специфически и эффективно.

Direct lineage conversion of somatic cells into MNs


Недавний успех использования определенных факторов для репрограммирования соматических клеток в плюрипотентные, вместе с более ранними исследованиями, выявившими способность одного фактора, MyoD (Myod1), превращать фибробласты в мышечные клетки, привело многих исследователей к изучению дальнейшей способности клон-специфичных транскрипционных факторов индуцировать превращение специфичных типов клеток из неродственных соматических клеток (rev. Graf, 2011). С помощью сходного подхода, использованного для идентификации факторов репрограммирования iPSC , Vierbuchen с коллегами продемонстрировали, что набор из трех специфичных для нейрального клона транскрипционных факторов, обозначенных как BAM факторы [Brn2 (Pou3f2), Ascl1 и Myt1l] был достаточен для прямого превращения мышиных фибробластов в индуцированные induced neuronal (iN) клетки. Получение профиля генной экспрессии и электрофизиологические записи показали, что эти iN клетки обладают свойствами общими возбуждающим нейронам (Vierbuchen et al., 2010;Marro et al., 2011). После этого первого сообщения, микроРНК и дополнительные пронейрональные факторы, включая NeuroD1,как было установлено, кооперируют с или замещают факторы BAM во время превращения фибробластов человека в iNs (Ambasudhan et al., 2011; Pang et al., 2011; Yoo et al., 2011).
Критическим вопросом при использовании iN подхода является установление в точности подтипа нейрона. Наша группа продемонстрировала, что экспрессия BAM факторов в комбинации с 4 транскрипционными факторами (Lhx3, Isl1, Ngn2 и Hb9) достаточна для превращения фибробластов мыши в клетки с MN фенотипом, наз. induced MNs или iMNs (Son et al., 2011) (Fig. 2A). iMNs были идентифицированы на базе экспрессии трансгенного репортера Hb9::GFP и обладали молекулярными и функциональными свойствами MNs, происходящих от эмбрионов, включая профиль генной экспрессии и электрофизиологическую активность, образование нервно-мышечных соединений м способность интегрироваться в развивающийся спинной мозг эмбрионов кур. Интересно, что это исследование выявило, что после внесения MN факторов, фибробласты в отличие от PSCs, не проходят через промежуточное состояние нейральных предшественников nestin+ прежде чем стать iMNs (Son et al., 2011). Сходным образом, в случае iN клеток, фибробласты человека могут быть превращены в клетки с MN фенотипом при добавлении NeuroD1 к iMN котейлю из 7 факторов (Son et al., 2011). Недавно было показано, что прямое превращение клона может быть осуществлено и in vivo. Напр., кардиомиоциты, генерируемые за счет прямой консерсии из кардиальных фибробластов могут улучшать сердечно-сосудистую функцию у мышей (Song et al., 2012). Было бы интересно определить, может ли сходный подход быть приспособлен к нервной системе, чтобы репарировать повреждения и/или обращать вспять нейродегенеративные заболевания.

Evaluation of MNs produced in vitro


Хотя базовые принципы спецификации MN установлены, многие группы сообщают о различиях во времени и эффективности дифференцировки, а также в качественных особенностях возникающих в результате из PSC или из соматических клеток MNs. Эта изменчивость может возникать из-за очевидных различий в протоколах, таких как комбинация, концентрация и время дополнения специфических факторов роста, также как из-за менее очевидных различий, таких как плотность клеток или точный состав среды, используемый для культивирования клеток вследствие спецификации. Касательно степени, с которой минорные модификации в протоколах изменяют качественные особенности возникающих в результате MNs, то она умножается, поскольку большинство групп базируется на экспрессии трансгенных репортеров или небольших группах канонических генов маркеров, которые могли бы сообщить о незначительных специфических отличиях подтипов MN. Принимая во внимание потенциальное воздействие этих модификаций на подчиненные исследования, такие как in vitro моделирование болезней, связанных с нарушениями MN, продолжаются попытки тщательного изучения эффектов от изменения протоколов дифференцировки и стандартизации методов и анализа во многих лаб.
MNs могут быть оценены в соответствии с 4 первичными характеристиками, которые предоставляют информацию об эквивалентности полученных in vitro MNs c bona fide клетками: (1) нейрональная морфология и экспрессия характерных MN генов маркеров, (2) характерная электрофизиологическая активность и реакция на стимулы, (3) образование функциональных нейромышечных соединений и (4) внесение их в спинной мозг in vivo (Fig. 3).

Morphology and marker analyses


При культивировании в изоляции MNs обнаруживают однополярную морфологию с единичным аксоном, отходящим от тела, от которого отходят и одиночные дендриты. Хотя в плотных культурах отличить аксон от окружающих дендритов затруднительно, это осуществимо с помощью иммуноокрашивания на microtubule associated protein 2 (Map2), который маркирует проксимальные дендриты (Fig. 3A). Дополнительное иммуноокрашивание цитоскелетных белков нейронов, таких как β-III tubulin (Tuj1; Tubb3), также как и оценка состояния фосфорилирования нейрофиламент с использованием SMI антител делают возможной полную оценку сложной морфологии нейронов типичной для MNs.
Критическая ступень в направлении разработки методов генерации специфических типов in vitro это выбор соотв. специфичных для типа клеток маркеров, которые позволяют идентификацию дифференцированных типов клеток в отсутствие анатомической информации предоставляемой in vivo. Подобно всем остальным нейронам, MNs являются постмитотическими, свойство, которое детерминируется отсутствием инкорпорации bromodeoxyuridine (BrdU) в клеточную ДНК или отсутствием иммунореактивности белков клеточной пролиферации, таких как Ki67 (Mki67). MNs могут быть далее отличены от др. нейронов, исходя из экспрессии канонических транскрипционных факторов идентичности MN, включая Isl1 и Hb9, также как и маркеров более зрелого и холинергического MN фенотипа, таких как биосинтетический энзим ChAT и vesicular acetylcholine neurotransmitter transporter (vAChT) (Wichterle et al., 2002; Soundararajan et al., 2006; Karumbayaram et al., 2009;Boulting et al., 2011; Son et al., 2011; Amoroso et al., 2013). Экспрессия этих транскрипционных факторов, как полагают, является общей для большинства MNs; однако по ходу развития становится ясно, что некоторые MNs экспрессируют разные субнаборы этих белков (Vult von Steyern et al., 1999; Amoroso et al., 2013). Использование одиночного маркера для MNs осложняется наблюдением, что некоторые канонические MN маркеры. такие как Isl1, также экспрессируются в др. типах нейрональных клеток (Sun et al., 2008).
Основная оценка подтипов MN subtype может быть получена при определении профиля экспрессии Hox генов и дополнительных факторов, таких как FoxP1 (Amoroso et al., 2013). Альтернативные методы иммуногистохимии включают гибридизацию in situили qRT-PCR одиночной клетки, которые могут позволить определить экспрессию мРНК маркеров в одиночной MN клетке. Необходимо подчеркнуть, что хотя экспрессия канонических MNs маркеров, как было установлено, является надежным индикатором др. характеристик MN, экспрессия небольшого количества маркеров самих по себе недостаточна для измерения, чтобы оценить успешность стратегии дифференцировки. По этой причине, геномный анализ транскрипционных профилей очищенных MNs с помощью секвенирования РНК или микромассивов представляет собой более эффективную стратегию для оценки MNs и их эквивалентности с bona fide MNs.

Electrophysiological activity


первичной функцией всех нейронов является трансмиссия электрохимических сигналов, свойство, которое необходимо для поддержания градиентов напряжения (voltage) на клеточной мембране. Точная комбинация ионных насосов, ионных каналов и рецепторов, внедренных в мембрану позволяет разным типам нейронов интерпретировать и реагировать уникально на стимулы. Физиологические записи продемонстрировали, что MNs, полученные in vitro исползуют множественные стратегии и обладают множественными электрофизиологическими характеристиками, имеющими отношение к функции и circuitry двигательных нейронов (Fig. 3B). Как происходящие из стволовых клеток MNs, так и iMNs отвечают на воздействие GABA, glutamate и glycine повышением внутренних (inward) токов, показывая, что они экспрессируют соотв. рецепторы и могут извлекать корректную реакцию на эти стимулы (Miles et al., 2004;Boulting et al., 2011; Son et al., 2011; Amoroso et al., 2013). MNs, продуцируемые in vitro также обладают спонтанной активностью, экспрессируя ряд активируемых напряжением каналов и могут возбуждать потенциалы действия в ответ на короткое воздействие током (current injections), также как и генерировать переходы кальция в ответ на kainate (Boulting et al., 2011; Son et al., 2011; Amoroso et al., 2013). Некоторые электрофизиологические фенотипы MNs, полученных in vitro, зависят от времени, проведенном в культуре, включая снижение резистентности к входящим сигналам (input), адаптацию к частотам spike и отдачу от возбуждения потенциала действия (Miles et al., 2004; Takazawa et al., 2012).
Как и в случае с молекулярными маркерами MNs, одной стереотипической электрофизиологической реакции недостаточно, чтобы охарактеризовать клетки как MNs. Важно также отметить, что разные типы MNs обладают различиями в паттернах возбудимости и действия (firing) и что эти реакции как только MNs созревают in vitro и in vivo (Kanning et al., 2010). Напр., эмбриональные и постнатальные MNs крыс обнаруживают заметные различия в амплитуде и скорости потенциала действия, а также различную чувствительность к нейротрансмиттерам (Gao and Ziskind-Conhaim, 1998). Поскольку фиксация потенциала индивидуальных клеток представляет собой технически трудно выполнимый и низко эффективный метод, то часто трудно определить степень, с которой элекрофизиологические характеристики варьируют между клетками одной и той же культуры. Новые достижения, такие как мультиэлектродные подходы (arrays) могут позволить более глобальную оценку многих клеток параллельно и предлагают благоприятную возможность скринировать многие генетические фоны и последствия действия лекарств по изменениям электрофизиологической активности.

Formation of NMJs and in vivo engraftment


Главной функцией MNs in vivo является иннервация мышц мишеней и интеграция сигналов от ЦНС, позволяющая скоординировать мышечное сокращение и передвижение тела. Т.о., в конечном счете доказательством того, что происходящие in vitro MNs воспроизводят свих аналогов in vivo является способность постоянно встраиваться во взрослый спинной мозг, чтобы давать проекции к соотв. мишеням и восстанавливать связь от поврежденной ЦНС посредством формирования NMJs.
На более базовом уровне ясно, что происходящие из PSC мыши и человека MNs, также как и iMNs могут формировать функциональные NMJs in vitro, если совместно культивируются с мышечными волокнами (Miles et al., 2004; Son et al., 2011) (Fig. 3C). Образование кластеров из ацетилхолиновых рецепторов на мышечных трубках по соседству с развивающимися аксонами наблюдается в течение одного дня совместного культивирования с MNs, дифференцированными из ESCs мыши. Спустя 2 дня после инициации совместной культуры, потенциалы с небольших концевых пластинок могут обнаруживаться путем фиксации потенциала иннервированных мышечных трубок (Miles et al., 2004). Помимо электрофизиологической реакции в происходящих из PSC MNs или iMNs, иннервированные мышечные трубки начинают обнаруживать скоординированные сокращения, которые могут быть устранены c помощью ингибитора обратимых ацетилхолиновых рецепторов кураре (Miles et al., 2004; Son et al., 2011) (Fig. 3C). Хотя образование кластеров из ацетилхолиновых рецепторов на мышечных трубках является характерным признаком образования NMJ, но ничего не известно, могут ли разные субстраты способствовать образованию кластеров ацетилхолиновых рецепторов даже в отсутствие MNs (Peng and Cheng, 1982; Gingras et al., 2009). Поэтому важно также оценить функциональность NMJs. Недавние доказательства в оптогенетике открыли возможность искусственного преобразования MNs, которые экспрессировали активируемые светом каналы родопсинов, так что нейрональная активность и как следствие контракции мышечных трубок, могли быть индуцированы просто освещением светом специфической длины волны совместной культуры (Weick et al., 2010; Tye and Deisseroth, 2012). Способность тонкого контроля активации MN д. позволить более углубленные исследования формирования синаптических соединений in vitro ит могут бы предоставить способ контроля активности MN, имплантированных in vivo. Более того, поскольку NMJs,как было установлено, подвергаются зависимой отвозраста дегенерации, то у мышей дикого типа и у трансгенных моделей ALS, было бы чрезвычайно интересно установить, могут ли эти события быть воспроизведены и изменены in vitro (Valdez et al., 2010; Valdez et al., 2012).
Помимо образования функциональных нейромышечных сосединений при совместном культивировании с мышечными трубками, трансплантационные эксперименты показали, что происходящие in vitro MNs способны интегрироваться в развивающийся спинной мозг. Вообще-то благодаря лени манипуляций, большинство исследований было осуществлено с использованием эмбрионов кур (Wichterle et al., 2002; Soundararajan et al., 2006; Son et al., 2011; Amoroso et al., 2013). Напр., трансплантации дифференцированных MNs и промежуточных нейронов от Hb9::GFP репортерной линии ESC в нервную трубку эмбрионов кур продемонстрировали жизнеспособность большинства GFP+ MNs после трансплантации. Важно, что хотя дорсо-вентральное положение трансплантата не контролировалось, GFP+ MNs располагались в вентро-латеральном домене, тогда как промежуточные нейроны (маркированные c помощью специфичных для грызунов антител к Lim2) обнаруживались в дорсо-вентральном домене (Wichterle et al., 2002). Кроме того, трансплантированные Hb9::GFP+ MNs дифференцированные из ESCs мышей,как было установлено, проецируют аксоны на периферию, где они достигают мышечных мишеней и обнаруживают полностью сформированные окончания, экспрессирующие множественные синаптические маркеры (Wichterle et al., 2002; Soundararajan et al., 2006). Сходные результаты были получены при использовании происходящих из ESC MNs человека, а также iMNs мыши (Son et al., 2011;Amoroso et al., 2013).
Доказательство, что полученные in vitro MNs могут правильно встроиться в развивающийся спинной мозг, подтверждает элегантное исследование с использованием различных малых молекул, чтобы управлять дифференцировкой ESCs мышей в специфические два подтипа MN: шейные MMC MNs и плечевые LMC MNs. Когда GFP-меченные LMC MNs смешивались с RFP-меченными MMC MNs и инъецировались в нервную трубку эмбрионов кур, то тела клеток эти х нейронов располагались в соотв. доменах внутри спинного мозга, а их аксоны проецировались к мишеням, предсказываемым экспрессией их транскрипционных факторов (Peljto et al., 2010) (Fig. 3D). Недавно работа Corti и коллег продемонстрировала, что MNs дифференцированные из генетически исправленных SMA iPSCs могут переживать трансплантацию и правильно встраиваться в спинной мозг однодневных мышей, моделирующих SMA (Corti et al., 2012). Более того, эти клетки могли улучшать фенотипические отклонения болезни и удлинять продожите6льность жизни SMN мутантных мышей, по крайней мере частично, предоставляя нейротрофическую поддержку (Corti et al., 2012). Было показано, что происходящие из ESC MNs, будучи трансплантированными в тибиальный нерв взрослых животных, смогли формировать функциональные NMJs и ослаблять мышечную дистрофию, вызываемую пересечением нерва (Yohn, et. al 2008).
В целом трансплантационные исследования предоставили строгие доказательства, ч то происходящие из PSC MNs и iMNs обнаруживают сильное сходство с их аналогами in vivo. Однако эти исследования технически затруднительны, в основном качественные и предоставляют ограниченные возможности для механистического исследования. Поскольку способность генерировать MNs in vitro c помощью разных методов продолжает прогрессировать было бы важно достичь консенсуса от наилучших практик для оценнки MNs. Взятые в отдельности, экспрессия генов, электрофизиологическая реакция и образование NMJ in vitro являются по нашему мнению недостаточными показателями успешности стратегий дифференцировки MN . Мы полагаем, что многоуровневые подходы , которые комбинируют каждый из этих показателей, позволят оценить разнообразные аспекты биологии MN .

Concluding remarks and perspectives


Decades of research into CNS development and spinal MN specification have been synthesized to allow the in vitro generation of MNs through diverse methods. These cells can provide additional mechanistic insights into developmental principles and MN biology, though perhaps their most exciting application is the prospect of modeling human MN diseases. Several studies have shown the usefulness of these cells in studying the mechanisms of neural degeneration. For example, human MNs have been shown to exhibit selective sensitivity to glia cells expressing a mutant gene linked to ALS (Di Giorgio et al., 2008; Marchetto et al., 2008). Additionally, multiple groups have reported disease-specific phenotypes in differentiated iPSC-derived MNs from patients with SMA (Ebert et al., 2009;Chang et al., 2011; Corti et al., 2012; Wang et al., 2013) or ALS (Bilican et al., 2012;Egawa et al., 2012; Donnelly et al., 2013; Sareen et al., 2013). Building on this, the in vitrogeneration of MNs via direct conversion of fibroblasts may additionally accelerate disease-modeling studies with patient cells, as it does not require the time-consuming step of iPSC generation and characterization. iMNs could be utilized to provide a snapshot of disease processes from a large cohort of patient fibroblasts, and cell lines showing particularly interesting phenotypes could be then reprogrammed into iPSCs to allow the production of differentiated MNs in large quantities for further studies.
The progress in producing and understanding MNs has been remarkable; however, substantial challenges still remain. The molecular diversity of MN subtypes in vivo is only partially understood. Perhaps as a consequence of this, only a small number of markers are currently used to evaluate MN subtypes generated in vitro, and the extent to which altering methods of MN production may influence the resulting subtypes is largely unknown. The application of RNA sequencing, single-cell qRT-PCR and proteomics approaches will allow comprehensive comparison of MNs generated via different strategies. Moreover, as genome-wide interrogation of bona fide human MNs is only possible through laser-capture of post-mortem samples (Ravits et al., 2005), high-throughput analysis of human PSC-derived MNs as well as human iMNs may provide additional insights into the biology of human spinal MNs.
Regardless of the strategy used to generate MNs, downstream applications warrant careful consideration of the experimental conditions used for plating and culturing these cells. These include variations in the methods of dissociation, cell density, substrate, media composition and cellular heterogeneity of the cultures (Sandoe and Eggan, 2013). Without controlling for and understanding these variables, we run into the risk of comparing the MN 'apples' generated and cultured by one protocol or in one laboratory to the MN 'oranges' generated by another.
Spinal MNs were among the first specific neuronal cell types to be derived from PSCs and the rapid progress made towards making MNs in vitro might have provided inspiration to the locked-in Bauby who wondered, 'Does the cosmos contain keys for opening my diving bell? A subway line with no terminus? A currency strong enough to buy my freedom back?' (Bauby, 1998). We are optimistic that continued efforts to collaboratively establish best practices for MN production, culture and evaluation in vitro will provide the keys to unlock novel therapeutic strategies for devastating neurological disorders, including ALS.