Kinesin-5 plays a critical role in the mitotic spindle

Митотическое веретено является сложной мультибелковой машиной, состоящей из микротубулярных (MT) филамент, двигательных белков, которые перемещаются вдоль и организуют эти филаменты, не-моторных с микротрубочками ассоциированных белков (MAPs) и различных не структурных сигнальных молекул. MTs действуют как основной структурный каркас митотического веретена, тогда как динамические свойства митотического веретена зависят от разных белков, которые прикреплены к MTs в разных регионах митотического веретена.

Поскольку сотни компонентов, как известно, ассоциируют с митотическим веретеном (Sauer et al., 2005), то теоретические и экспериментальные доказательства подчеркивают центральную роль kinesin-5. При моделировании только 4 механические активности необходимы, чтобы создать и поддерживать стабильность базирующегося на MT веретена: (1) расширение и сжатие MTs, (2) фактор когезии с полюсом, который стягивает минус-концы MTs вместе, (3) силы поперечного связывания MT из минус конца управляемые моторным белком, dynein и (4) наружу направляемые силы между MTs между полюсов, генерируемые с помощью kinesin-5 моторов (Loughlin et al., 2010) (Figure 1A). RNAi скрининг всех MT-based двигательных белков идентифицировал только три, которые абсолютно необходимы для завершения митозов: kinesin-5, kinesin-6 (который участвует в разделении двух дочерних клеток) и kinesin-8 (который действует, чтобы укорачивать MTs) (Goshima and Vale, 2003). Т.о., определение, как функционирует kinesin-5 является важной целью.

Figure 1. Kinesin-5 structure, function and regulation (A) Kinesin-5 slides spindle poles apart during mitosis. The motor associates with dynein (pink) and TPX2 (dark blue) for proper localisation. The Eg5 tail interacts with the p150glued subunit of dynactin (Blangy et al., 1997). It is not known which domain(s) of Eg5 interact with TPX2. (B) Bar diagram of kinesin-5, showing conserved domains and known phosphorylation sites. Colouring is as in A, with the BimC box in red. The BASS domain has only been identified in the D. melanogaster homolog Klp61F and is shown in grey and white (Acar et al., 2013). Phosphorylation sites in the heads are only known to occur in non-mammalian kinesin-5 homologs. These are indicated with dashed lines along with the homolog. Tail phosphorylation sites are conserved among metazoan kinesin-5 motors and are shown in solid lines. (C) Left, Eg5 head structure (PDB ID#3KEN (Kim et al., 2010)) showing Loop 5 and the binding site for allosteric inhibitors. This view would be top-down for a MT-bound Eg5 head, with the MT plus end up as indicated. Right, side view, with MT plus end to the right. The MT-binding site is at the bottom of the molecule. The neck linker is shown in orange. The cover strand is not ordered in this structure, but its approximate position is shown in dashed lines, based on the works of Goulet et al. (2012) and Hesse et al. (2013).

Несмотря на главную функцию, общую всем эукариотическим гомологам kinesin-5, каждый белок, по-видимому, играет некую отличительную роль в митотическом процессе в своем организме. У Saccharomyces cerevisiae и эмбрионов Drosophila избыточная экспрессия kinesin-5 увеличивает длину метафазного веретена (Saunders et al., 1997; Straight et al., 1997; Brust-Mascher et al., 2009), тогда как в др. типах клеток, включая Drosophila S2 клетки, длина веретена не меняется при избыточной экспрессии kinesin-5 (Goshima and Vale, 2005). У S. cerevisiae и эмбрионов D. melanogaster kinesin-5 ответственен за растягивание полюсов веретена в анафазе (Straight et al., 1997; Brust-Mascher et al., 2009). Напротив, в клетках млекопитающих kinesin-5 необходим в раннем митозе для разделения центросом (Blangy et al., 1995; Tanenbaum et al., 2008). В отличие от др. членов семейства kinesin-5, которые важны для митоза и генерируют внешние силы, чтобы обеспечить разделение с помощью веретена, C. elegans kinesin-5 BMK-1, по-видимому, не нужен для митоза и действует, чтобы замедлить скорость удлинения веретена (Saunders et al., 2007). Гомологи kinesin-5 мотора у этих организмов в целом сходны, исходя из первичной последовательности. Определение, как эти моторы выполняют свою основную роль по растягиванию полюсов митотического веретена и идентификация, какие вариации этого процесса происходят у разных организмов является главным вопросом в этой области.

Molecular anatomy of kinesin-5

Kinesin-5 является гомотетрамерным белком, при этом каждая субъединица, содержит N-терминальный домен кинезинового мотора, центральный стволовой домен и C-терминальный хвостовой домен (Figure 1B). Эти субъединицы, как полагают, располагают сами себя в биполярные гомотетрамеры, при этом пара моторных доменов оказывается на каждом из концов. Поскольку только D. melanogaster kinesin-5 Klp61F и S. cerevisiae kinesin-5 Kip1, как было установлено, непосредственным наблюдением, формируют биполярные гомотетрамеры, у позвоночных kinesin-5s скользят по двум MTs навстречу др. др. при микроскопическом наблюдении, что согласуется с такой их организацией (Kashina et al., 1996; Gordon and Roof, 1999; Kapitein et al., 2005; Acar et al., 2013).

N-терминальный моторный домен kinesin-5 состоит из ~350 остатков и обладает всеми консервативными структурными элементами, которые составляют загадку каждого кинезина (Vale and Milligan, 2000). Все кинезиновые моторные домены, миозиновые моторы и малые GTPases обладают центральным beta-sheet, фланкированным альфа спиралями. Эти белки также обладают общими некоторыми критическими структурными элементами, которые переводят гидролиз нуклеотидов в конформационные изменения. Некоторые из этих структурных свойств особенно интересны для kinesin-5 моторов. Они идентифицированы здесь с N-конца до C-конца моторного домена и показаны на Figure 1C.

Cover strand: Покрывающая нить - короткий ~5-10 остатков сегмент на N-конце моторного домена. Этот элемент не часто наблюдается в кристаллической структуре кинезина, но, как было установлено, является критическим для перемещения вперед в kinesin-1 моторах (Khalil et al., 2008). Покрывающая нить образует короткий beta-sheet сегмент, обозначаемый как покрытие шейки пучка (cover neck bundle), с neck linker во время перемещения вперед kinesin-1 и kinesin-5 человека, Eg5 (Goulet et al., 2012; Hesse et al., 2013).

Loop 5: альфа 2 спираль во всех кинезиновых моторах расправляется в короткую петлю, наз. петлёй 5, вблизи нуклеотидного кармана. Последовательности этой петли являются специфичными для семейства кинезинов и неясно, выполняет ли петля 5 консервативную функцию для всех кинезинов. В kinesin 5 моторах, петля 5 участвует в высвобождении АДФ (Waitzman et al., 2011) и в поддержании связи изменений в составе нуклеотидов с neck linker и MT-связывающими регионами моторного домена (Goulet et al., 2012).

Switch I and Switch II: Switch I и Switch II являются консервативными ощущающими нуклеотиды элементами, обнаруживаемыми во всех кинезинах, миозинах и малых GTPases. Эти элементы, как было установлено, играют роль в индуцируемых нуклеотидами конформационных изменениях. Switch I играет важную роль в обеспечении высвобождения нуклеотидов, это стимулируется с помощью факторов обмена во всех этих энзимах (Vale and Fletterick, 1997; Kull and Endow, 2002). Некоторые аллостерические ингибиторы для Eg5, подобные S-trityl L-cysteine (STLC) молекуле, как показано на Figure 1C, соединяются в борозде между loop 5, alpha 2, alpha 3 и switch I и сильно влияют на MT-стимулируемое высвобождение АДФ (Cochran et al., 2005). Switch II играет роль в связывании факторов обмена, т.е. MTs для кинезинов. Switch II сообщает об изменениях в состоянии моторных нуклеотидов, чтобы обеспечить переключение спирали в MT-связывающем сайте и neck linker, который управляет перемещениями вперед (Kull and Endow, 2002; Sindelar and Downing, 2010).

Neck linker: элемеент шеечный линкер подвергается зависимым от нуклеотида и МТ конформационным изменениям, чтобы привести к направленному перемешению всех кинезиновых моторов (Rice et al., 1999; Vinogradova et al., 2004; Endres et al., 2006; Goulet et al., 2012). Это направленное движение, как полагают, скоординированное, проворное перемещение моторных доменов как в kinesin-1, так и в kinesin-5 моторе человека Eg5 (Vale et al., 1996; Valentine et al., 2006), а neck linker является критическим для его координации между движущими головками (Jiang et al., 1997; Yildiz et al., 2008).

Принимая во внимание важность человеческого kinesin-5, Eg5 может служить мишенью для лекарств, kinesin-5 моторный домен стал предметом многих кристаллографических скринингов и его механохимический механизм интенсивно исследовался. Пригодная находка структурных и механистических данных по kinesin-5 информировала нас как о его механизме в частности и о энзимологи кинезинов и ATPases в целом. Рентгеновская кристаллическая структура Eg5, связанная с AMPPNP (PDB ID#3HQD) показала, что кинезины и возможно некоторые др. ATPases также гидролизуют нуклеотиды путем координации позиций двух критических молекул воды (Parke et al., 2010). Базирующиеся на структуре исследования молекулярной динамики и cryo-EM исследования kinesin-5 моторов продемонстрировали, что многие семейства кинезинов, скорее всего, инициируют поступательные движения с помощью сходного механизма (Goulet et al., 2012; Hesse et al., 2013). Поскольку эти сообщения обогатили наше общее понимание сверхсемейства кинезинов, др. сообщения выявили существенные различия между энзиматическими и кинематическими свойствами kinesin-5s в противовес др. семействам кинезинов, продемонстрировав семейство kinesin-5 моторов с его уникальной ролью в митозах. См. Table 1.

Table 1. ADP release, ATPase and motility rates of human Eg5 motor proteins

Удивительно, kinesin-5 нуждается не только в своих энзиматических головках, но и также в своем не-моторном стержневом (stalk) и хвостовом доменах, чтобы соединяться и скользить по MTs. Центральный стержневой домен kinesin-5 ориентирует моторные субъединицы относительно одна др. Крепкие димеры моторных доменов могут быть сформированы с использованием N-терминальной части моторного домена и половины стержня (остатки 1-513 в Eg5 человека; Figure 1B). Используя ЭМ и электронну парамагнитную резонансную спектроскопию для Drosophila Klp61F, Acar et al. (2013) идентифицировали биполярную сборку ('BASS') домена в направлении C-терминального конца стержня (остатки 671-791), это позволяет двум димерам ассоциировать анти-параллельным способом, чтобы сформировать биполярные гомотетрамеры.

C-терминальный хвост kinesin-5, по-видимому, выполняет две основные функции: чтобы поддержать локализацию моторов в митозе и увеличить сродство моторов к MTs (Weinger et al., 2011). В ранней работе по kinesin-5, было отмечено, что мотор располагается на митотическом веретене. Эта локализация зависит от BimC box, участк в 20 остатков в C-терминальном хвосте мотора, который содержит консенсустный сайт для киназы клеточного цикла M-CDK в остатке Thr926 человеческого Eg5 и в Thr937 в Xenopus Eg5 (Blangy et al., 1995; Sawin and Mitchison, 1995) (Figure 1B). Хвосты всех известных kinesin-5 моторов, за исключением S. pombe Cut7, по-видимому, фосфорегулируется с помощью M-CDK (Drummond and Hagan, 1998).

Mechanism of kinesin-5

Поскольку Eg5 позвоночных прежде всего исследовался in vitro, чтобы определить механизм kinesin-5 моторов, то недавняя работа на дрожжевых kinesin-5 моторах подтвердила удивительное расхождение в поведении, которое поставило в затруднение представление о том, как предопределяется направленность движения моторов сверхсемейства кинезинов.

В целом кинезины, чей моторный домен располагается на белковом N-конце, движется поступательно в направлении плюс конца MT's, в то время как те, чей моторный домен располагается на C-конце движутся в направлении минус конца MT's. Это мнение подтверждено с помощью структурных и компьютерных данных, показавших, что смена позиции neck linker и α6 спирали на C-конце в противовес N-терминальным моторам объясняет различия в направленности движения (Vinogradova et al., 2004; Jana et al., 2012). Однако новые результаты по направленности для S. cerevisiae kinesin-5 Cin8 поставили эту идею под вопрос.

Две группы наблюдали перемещение Cin8 в направлении минус-конца MT; т.к. мотор содержит N-терминальный моторный домен, то этот результат оказался полностью неожиданным (Gerson-Gurwitz et al., 2011; Roostalu et al., 2011). Roostalu et al. (2011) наблюдали, что тетрамеры Cin8 перемещаются в направлении минус конца MT, когда присоединены к одиночной микротрубочке, но меняют направление, когда соединяются с двумя MTs, так что обе пары моторных доменов перемещаются в направлении плюс концов MTs, к которым они прикреплены. Авт. относят такое переключение к коллетивному поведению мотора, т.к. мотор действует в направлении минус конца будучи в очень низких концентрациях. Gerson-Gurwitz et al. (2011) отмечают, что такое предпочтение в направленности базируется на присутствии сайтов M-CDK фосфорилирования в Loop 8 и ионной силе используемого буфера. Недавно та же самая лаб. сообщила о сходном поведении переключения направления в Kip1, др. S. cerevisiae kinesin-5 моторе (Fridman et al.,2013). Биофизические основы этого поведения переключения и роли, которую оно играет в митозе, пока не установлены и это находится в четком контрасте по отношению к 'N-терминальным моторам, путешествующим в направлении плюс конца'.

В отличие от дрожжевых kinesin-5 моторов Cin8 и Kip1, человеческий Eg5 следует эталону направленности кинезина. Eg5 тетрамеры перемещаются в направлении плюс концов обеих MTs, к которым они прикреплены, это позволяет моторному белку генерировать направленные наружу силы на митотическое веретено. Это представление элегантно продемонстрировано в работе Kapitein et al. (Kapitein et al., 2005; Kapitein et al., 2008). Авт. наблюдали, что когда кинезины прикрепленны к пучку МТ, связанных с поверхностью, то флюоресцентный Eg5 диффундирует случайно вдоль длины MT's; когда же дополнительные флюоресцентные MTs были внесены, то Eg5 действовали, чтобы образовать связи между поверхностью и свободными MTs и укладывали (slide) их анти-параллельно по отношению др. к др. за счет поступательного перемещения к MT плюс концам. Недавняя работа Thiede et al. (2013) на химерных kinesin-1/Eg5 показала, что диффузионное и поступательное поведение моторов разделены с помощью энергетического барьера и предположили, что такое переключение обеспечивается взаимодействием между головками и хвостами Eg5. Поскольку взаимодействие голова-хвост в Eg5 никогда не наблюдалось непосредственно, то понимание природы поведения переключения между диффузионным и поступательным перемещением этого мотора предоставит важную информацию о роли в митозе и предоставит потенциальное окно для разработки специфических ингибиторов.

Принимая во внимание размер kinesin-5 тетрамера и трудность изучения 4-х идентичных, но не синхронизированных каталитических сайтов, много усилий было сфокусировано на определении механизма моторных доменов мономеров и димеров. Аминокислотные последовательности моторного домена Eg5 на 45% идентичны таковому для хорошо изученного kinesin-1, и использование стабильных димеров Eg5 человека в большинстве таких исследований позволило напрямую сравнить активность Eg5 с таковой kinesin-1. Поскольку оба мотора гидролизуют АТФ, чтобы осуществить механическую работу, однако имеются некоторые свойства механизма Eg5, которые отличают его от kinesin-1 (Table 1).

Поскольку стержневые структурные элементы, которые делают возможным гидролиз АТФ и MT подвижность законсервированы между kinesin-5 и kinesin-1, имеются всё же существенные различия между последовательностями в моторах, которые проявляются в различиях энзиматических свойств и функции. Наибольшее различие между kinesin-1 и Eg5 заключается в инсерции 8-остатков в Loop 5 у Eg5 (остатки 125-132; see Figure 1C). Петля 5 сворачивается в α2 спираль, которая появляется у всех членов семейства кинезинов; однако длина петли более длинная в kinesin-5, чем у др. членов семейства. Eg5 также имеет заметно более длинную Loop 1 и neck linker, чем kinesin-1.

Внутри одиночной головки Eg5 аллостерические коммуникации между Loop 5, нуклеотид ощущающими элементами (P-loop, Switch I и Switch II), и neck linker объясняют отличающуюся кинетику моторов и функциональные свойства. Эти коммуникации были выявлены с помощью исследований кинетики головок мономерных кинезиновых моторов, которые показали существенные и до некоторой степени необъяснимые различия между Eg5 и kinesin-1. Мощность высвобождения АДФ и мощь ATPase активности дикого типа Eg5 значительно меньше активируются при добавлении MTs , чем у kinesin-1 (25-раз в противовес 3000-раз; Table 1). Делеция 7 остатков в Loop 5 у Eg5 устраняет стимуляцию с помощью MT высвобождения АДФ после инициального соединения, но оказывает лишь слабые эффекты на ATPase активность и подвижность Eg5 вдоль MTs после этой медленной ступни вовлечения (engagement) (Waitzman et al., 2011). Причина, почему Loop 5 является критической для Eg5 в высвобождении АДФ неясна. Обладает ли Loop 5, которая обнаруживается во всех кинезинах, законсервированной функцией в сверхсемействе, неизвестно.

Eg5 димеры обладают курьёзными свойствами. Eg5 димеры высвобождают АДФ из одной головки быстро (28/s), но затем высвобождение их второго АДФ происходит после медленного ~1/s событи изомеризации. Это событие изомеризации, по-видимому, уникально для Eg5, и это событие изомеризации возникает только во время Eg5's инициального соединения с MT. Последующие ступени и связанный с ними гидролиз АТФпроисхродит значительно более быстро, чем на первой ступени, около 13/s (Table 1) (Valentine et al., 2006; Krzysiak et al., 2008). Эти данные подтверждают, что Eg5 димер высвобождает АДФ очень медленно, т.к. это зависит от первой ступени на MT. Однако, принимая последующие ступени, связанные с событиями гидролиза АТФ, Eg5 высвобождает как АТФ, так и фосфат одновременно и значительно более быстро, чем инициальное MT-стимулированное высвобождение (Waitzman et al., 2011). Этот механизм может помочь в становлении энергетического барьера между диффузионным и целенаправленным перемещением kinesin-5's или в создании скорость-ограничивающей ступени привлечения моторов, которая может подвергаться целенаправленному воздействию экзогенных регуляторов. Структурные свойства, которые ответственны за этот уникальный признак Eg5 неизвестны. Однако появился намек из недавних cryo-EM данных, подтверждающий, что соединение двух соседних сайтов на MT вызывает ограничения конформаций neck linker от двух головок. Эти ограничения могут влиять на конформацию Loop 5 и на свойства высвобождения ADP·Pi или АДФ с помощью Eg5 благодаря аллостерическим связям (Goulet et al., 2012).

Подобно димерам головок kinesin-1, Eg5 димеры перемещаются в направлении плюс концов MTs, чередуя его головки hand-over-hand способом (Valentine et al., 2006). И kinesin-1 и Eg5 димеры являются поступательными (processive), это означает, что они могут использовать множественные сцепленные механические и ферментативные ступени перемещаясь по MTs. Однако, Eg5 димеры значительно более слабые в отношении processive, чем у kinesin-1. Eg5 димеры способны совершать 8-10 поступательных шагов вдоль одиночной MT (Valentine et al., 2006). Напротив, kinesin-1 может совершать сотню или более шагов вдоль MT без отсоединения (Vale et al., 1996). Специфические механические и кинетические свойства, ответственные за Eg5's низкую processivity пока неизвестны, но были высказаны некоторые идеи. Кинетические исследования димеров Eg5 показали, что димер инициирует поступательное движение, если одна из его головок высвобождает FLA и занимает MT (Krzysiak et al., 2008). Та же самая головка затем соединяется с АТФ, пропуская вторую головку вперед к её сайту связывания. Если вторая головка остается связанной с АДФ или преждевременно связывает АДФ из APO состояния, то она не может прочно связываться с MT, если первая головка гидролизует АТФ и отсоединяется (Valentine and Block, 2009). Eg5 имеет более длинный neck linker, чем kinesin-1, но исследования различаются, т.к. неясно Eg5's более длинный шеечный линкер может ли быть ответственен за его пониженную поступательную способность (processivity) (Shastry and Hancock, 2011; Duselder et al.,2012). Др. возможное объяснение заключается в том, что Eg5 остается связанным с MT во время поступательного шагания до тех пор, пока он высвобождает АДФ из ADP·Pi состояния, но если он высвобождает Pi прежде АДФ или связывает АДФ с его др. головкой, то отсоединяется. Т.о., механомеханические свойства Eg5's могут быть результатом его уникальной кинетики, которая безусловно использует Loop 5.

Loop 5 of the human kinesin-5, Eg5, is a target for inhibitor development

Помимо своей важной роли в механохимическом цикле в Eg5's, Loop 5 является мишенью для структурно разнообразных классов химических ингибиторов, которые останавливают активность Eg5 человека. Первый Eg5 ингибитор был идентифицирован при скрининге группой Tim Mitchison's в 1999, и назван 'monastrol' по mono-astral spindle фенотипу, индуцируемому в обработанных клетках остеосаркомы человека U2OS (Mayer et al., 1999; Kapoor et al., 2000). дальнейшие исследования идентифицировали ряд лекарств, которые ингибировали активность Eg5, включая ispinesib, enastron и STLC. Эти агенты нуждаются в остатках в Loop 5 и в α 3 спирали для связывания мотора и ингибирования его (Brier et al., 2006; Maliga and Mitchison, 2006) (Figure 1C). Кинетические характеристики этих агентов показали, что они ингибируют моторы с помощью аллостерического механизма, который редуцирует сродство мотора к MTs и ингибирует его ATPase активность. Интересно, что эти агенты, по-видимому, соединяются с Eg5 преимущественно из-за того, что мотор находится в растворе, поскольку связанный с MT Eg5 обладает низким сродством к monastrol, а связанный с monastrol Eg5 обладает низким сродством к MT (Maliga et al., 2002; Cochran et al., 2005). Эти свойства Loop 5, направляющие ингибиторы, согласуются с кинетикой Eg5 Loop 5, содержащей делецию (Waitzman et al., 2012), подтверждая, что Loop 5 необходима для соединения Eg5 с MTs.

Loop 5 безусловно является 'горячей точкой' для связывания Eg5 ингибитором. Для большинства историй разработки лекарств Eg5, почти каждый из агентов был нацелен на Loop 5 (Brier et al., 2004). Однако, новые классы Eg5 ингибиторов были разработаны, которые, по-видимому, соединяются с др. частями мотора или имеют альтернативный каталитический эффект. Химический FCPT (2-(1-(4-fluorophenyl)cyclopropyl)-4-(pyridin-4-yl)thiazole), по-видимому, соединяется с сайтом вблизи Loop 5, но обнаруживает ATФ-соперникам подобные эффекты на кинетику Eg5 (Groen et al., 2008). Кроме того, новая работа группы Kozielski идентифицировала BI8 (2-(3-fluoro-4-methoxyphenylamino)-1-((2-tri-fluoromethylbenz-yl)-1H-benzo[d]imidazole-5-carb-oxylic acid), агент, который соединяется с новым карманом Eg5 (Ulaganathan et al., 2013). Поскольку эти агенты пока в начале клинических испытаний и демонстрируют эффективность, определение роли, выполняемой Loop 5 в Eg5 двигательном механизме остается под вопросом.

Eg5 ингибиторы, нацеленные на Loop 5, были протестированы в нескольких разных клинических испытаниях Phase I и II, где их эффективность оказалась слабой. Хорошим заключением этого может быть найденное Sarli and Giannis (2008). Такая плохая эффективность оказалась неутешительной для разработчиков, поскольку ингибирование Eg5 очень сильно прекращало клеточные деления в культуре клеток. Eg5 ингибиторы работают в избирательных условиях, таких как модели xenograft опухолей (Sakowicz et al., 2004). Имеется несколько возможных причин для неспособности Eg5 ингибиторов в этих ранних испытаниях. Одна из причин общая для всех анти-митотических средств; опухолевые клетки человека подвергаются митозам значительно менее части, чем клетки внутри опухолевых ксенотрансплантатов у мышей и клетки вступают в митозы, чтобы Eg5 ингибиторы вызывали апоптоз (Chan et al., 2012). Во-вторых, мутации в Eg5 могут наделять резистентностью к Eg5 ингибиторам посредством или прямых или аллостерических механизмов (Brier et al., 2006). Наконец, митоз это чрезвычайно сложный процесс и альтерации регуляторных факторов или др. митотических белков могут в принципе преодолевать ингибирование Eg5 (Raaijmakers et al., 2012). Поэтому возможно, что агенты, действующие на Eg5 или др. митотические белки мишени, могут быть более эффективны в комбинации, чем при использовании в отдельности. Сначала необходимо понять, какая терапевтическая комбинация, нацеленная на Eg5 , будет наиболее эффективной, мы должны знать, как Eg5 регулируется и как он взаимодействует с др. потенциальными лекарствами в митозе. Какие др. мишени окажутся более эффективными в связи с Eg5? Существуют ли киназы или др. регуляторные партнеры по связыванию, стоящие выше Eg5, которые могут оказаться более подходящими мишенями со сходными цитотоксическими эффектами?

Regulation of kinesin-5 by binding partners

Т.к. следует ожидать, учитывая их критическую роль в митозах, что kinesin-5 моторы регулируются с помощью партнеров по связыванию, а также с помощью фосфорилирования. Изменения в локализации Kinesin-5 в ходе митоза регулируется тонким способом. Во время метафазы kinesin-5 располагается вдоль MTs веретена и на полюсах веретена. Моторы меняют свою локализацию на среднюю зону веретена в анафазе (Gable et al., 2012). Kinesin-5, как было установлено, ассоциирует непосредственно с NuMa (Nuclear Mitotic Apparatus protein), который участвует в сборке полюсов веретена. NuMa,по-видимому, нуждается в как в kinesin-5, так и dynein, но kinesin-5 не нуждается в NuMA для локализации на полюсах веретена (Iwakiri et al., 2013).

Хотя kinesin-5 не нуждается в NuMA, он необходим для направления движения к минус концу мотора динеина для собственно целенаправленной доставки в ходе митоза. Хвост Eg5 человека взаимодействует с dynein посредством p150glued субъединицы dynactin, и это взаимодействие регулируется с помощью формирования паттерна консервативного сайта в Eg5 , Thr926 (Blangy et al., 1997). Ассоциированный с ядерной оболочкой динеин кооперирует с Eg5 чтобы отделить полюса веретена во время профазы и фактически этот динеин может разделять полюса веретена в линиях клеток с полным отсутствием функционального Eg5 (Raaijmakers et al., 2012). Во время метафазы фракция Eg5 остается стационарно в средней зоне веретена, тогда как остальная часть транспортируется к полюсам. Ингибирование dynein с помощью инъекции CC1 фрагмента p150 блокирует это перемещение, приводя к изменению длины и организации веретена (Gable et al., 2012).

Собственно доставка Eg5 также нуждается в MAP TPX2 (Targetting Protein for Xenopus kinesin-like protein 2 (Xklp2)). Xklp2 является моторным белком семейства kinesin-15, который располагается на полюсах веретена и важен для их разделения. Поскольку TPX2 необходим для доставки и Eg5 и Xklp2 кинезинов, то очевидно, он играет множественные роли в сборке митотического веретена. TPX2 располагается в интерфазном ядре и подвергается зависимой от динеина смене положения на MTs вблизи полюсов веретен в раннем митозе.

Wittmann et al. (2000) показали, что TPX2 является критическим для установления расположения двигательного белка Xklp2 во время разделения полюсов веретена. Они также отметили, что добавление избытка TPX2 приводит к образованию структуры однополюсного веретена (Wittmann et al.,2000). Эта находка не соответствует той, что сделана декаду позднее, когда Eckerdt et al. (2008) показали, что инъекция эмбрионам Xenopus или полной длины или C-терминальной половины TPX2 приводит к аресту расщепления. Базируясь на наблюдении, что и TPX2 и Eg5 были выделены вместе в комплексе (Koffa et al., 2006), Eckerdt et al. (2008) осуществили разделение между Eg5 и разными TPX2 конструкциями. Авт. отметили, что TPX2 взаимодействует с Eg5 и что это взаимодействие нуждается в C-терминальных 35 остатках из TPX2. Кроме того, только TPX2 белки, которые д. вызывать арест расщепления у эмбрионов Xenopus содержат этот C-терминальный регион, взаимодействующий с Eg5 (Eckerdt et al., 2008). Используя клетки LLC-Pk1, Ma et al. (2010) сходным образом продемонстрировали, что нарушение взаимодействия TPX2-Eg5 путем делеции C-терминальных 35 остатков TPX2 приводит к неправильной локализации TPX2 и плохо организованным митотическим веретенам. Находка, что TPX2, по-видимому, непосредственно взаимодействует с Eg5 и что избыток количества Eg5-взаимодействующего региона в TPX2 индуцирует образование однополярного веретена, подтверждает, что TPX2 может регулировать активность Eg5. Подтверждает это мнение то, что TPX2 помогает локализовать Eg5 на митотическом веретене (Ma et al., 2011), и TPX2 необходим для Eg5 для перехода веретена к расположению в средней части (Gable et al., 2012). In vitro, TPX2 замедляет активность скольжения по MT у Eg5, но не kinesin-1 (Ma et al., 2011). Эти данные показывают, что TPX2 может облегчать замедление, но вообще-то более существенно перемещение Eg5 в среднюю зону веретена.

Предыдущие исследования предположили механизмы, c помощью которых MAPs будут регулировать кинезиновые моторы посредством альтераций локальной МТ решетки и/или конкуренции за сайты связывания на MT (Seitz et al., 2002; McVicker et al., 2011). Взаимодействие TPX2/Eg5 определенно различается, поскольку эффекты TPX2 являются специфическими для Eg5 и не наблюдаются в kinesin-1 (Ma et al., 2011). Это подтверждает более высокую специфичность, чем можно было бы объяснить за счет или локальных изменений MAPs, затрагивающих решетку MT, или за счет конкуренции за сайты связывания. Интересно, что была предположена сходная высоко специфичная регуляция kinesin-1 c помощью MAP (Metzger et al., 2012; Barlan et al., 2013). Следовательно, TPX2 регуляция kinesin-5 может стать типичным представителем нового класса механизмов для регуляции кинезиновых моторов, которые до конца непонятны.

Phosphoregulation of kinesin-5

Фосффорилирование почти всех гомологов kinesin-5 консервативно для треонина в BimC box (Thr926 in human Eg5, Thr937 in Xenopus) оно важно для доставки моторов на митотическое веретено (Blangy et al., 1995; Sawin and Mitchison, 1995). Единственное известное исключение представляет S. pombe kinesin-5, Cut7 (Drummond and Hagan, 1998). В торое место фосфорилирования - это остаток Ser1033 в хвосте Eg5, фосфорилируемое c помощью Nek6/7, это,как было установлено, помогает локализовать около 3% от всех Eg5 белков полюсах веретена (Rapley et al., 2008). Фосфорилирование тереонина в BimC box (Thr926 in human Eg5) также регулирует взаимодействие Eg5 с dynactin, подтверждая, что ассоциация с dynein и dynactin может помочь нацелить Eg5 на MTs (Blangy et al., 1997). Однако, in vitro, Cahu et al. (2008) показали, что фосфорилирование у Xenopus Eg5 хвоста c помощью M-CDK увеличивает сродство Eg5 к MTs примерно в10 раз и также увеличивает количество времени, затрачиваемого на MT, пи этом не нужны дополнительные факторы. Это указывает ан то, что регуляция c помощью фосфорилирования хвоста kinesin-5 осуществляет непосредственный1 эффект на двигательную активность которая не обусловливается исключительно партнерами по соединению. Это увеличивает сродство к MT после фосфорилирования против логики, принимая во внимание что поверхность MT заряжена негативно. Неизвестно, как фосфорилирование изменяет структуру хвоста Eg5 или голоэнзима Eg5, чтобы усилить связывание с MT.

Помимо механизма фосфорегуляции, который контролирует локализацию kinesin-5 посредством хвоста двигательного белка, недавнее исследование показало, что фосфорилирование энзиматических головок kinesin-5 может изменять их активность. IChee and Haase идентифицировали три сайта в S. cerevisiae моторном домене у Cin8 и четыре сайта в моторном домене Kip1, которые обнаруживают минимум консенсусной последовательности для checkpoint kinase M-CDK (Chee and Haase, 2010). Один из этих сайтов (Ser388 в Kip1/Ser455 в Cin8) законсервирован в двух моторных белках и у многих др. членов семейства kinesin-5 Авт. установили, что делетирование Cin8 и мутирование Ser388 в Kip1 в аланин или делетирование Kip1 и мутирование Ser455 в Cin8 в аланин приводит к дефектам разделения тел полюсов веретена.

Затем Avunie-Masala et al. (2011) установили, что консенсустный сайт для M-CDK в моторном домене Cin8, которая фосфорилирует эти сайты, нарушая подвижность Cin8's. Cin8 фосфорилируется в анафазе, но мутации этих тех консенсусных сайта для M-CDK устарняют это фосфорилирование phosphorylation (Avunie-Masala et al., 2011). Два из трех идентифицированных сайтов, Ser239 и Thr247, расположены у дрожжей в специфичной инсерции в Loop 8 мотора, тогда как третий, Ser455, является законсервированным сайтом, идентифицированным выше. Cin8 со всеми тремя фосфорилируемыми остатками мутировавший к аланину, располагается преимущественно на полюсах веретена в анафазе, что не характерно для моторов дикого типа, которые преимущественно занимают срединную зону. Второе исследование, осуществленное той же самой группой, установило, что Cin8 белки, содержащие мутации Ser239Ala и Thr247Ala, обнаруживают направленное к полюсам веретена (или к минус концам MT) движениям, подтверждая, что Loop 8 помогать определять направленность перемещения мотора (Gerson-Gurwitz et al., 2011). Напротив, Cin8 со всеми тремя фосфорилированными остатками, мутировавший в аспарат, не способен лакализовать аппарат веретена и клетки, экспрессирующие этот мутантный Cin8-3D, не жизнеспособны.

Garcia et al. (2009) показали, что у D. melanogaster kinesin-5 мотор Klp61F фосфорилирован по трем тирозинам в своем моторном домене c помощью киназы клеточного цикла dWee1 in vitro. Чтобы определить эффекты этого события фосфорилирования, Garcia et al. (2009) экспрессировали Klp61F с мутантным акцептором фосфора, вызывающим мутирование тирозина в фенилаланин у эмбрионов Drosophila, и обнаружили увеличение летальности и дефекты веретена. Эта работа подтвердила интересное взаимодействие между M-CDK и Wee1 в начале митоза. Wee1 фосфорилирует и деактивирует M-CDK вплоть до начала митозов (Russell and Nurse, 1987). В свою очередь, активация M-CDK негативно регулирует Wee1 (McGowan and Russell,1995). M-CDK также фосфорилирует и активирует хвосты kinesin-5. Интересно, что киназа, которая непосредственно активирует Eg5, противодействует киназе, которая его непосредственно ингибирует. Предполагается, что Eg5 действует как механический проводник между двумя механизмами антагонистической передачи сигналов, обеспечивающих митозы, Wee1 и M-CDK. Итак, данные фосфорилирования kinesin-5 моторов рассказывают две истории: во-первых, высоко консервативный механизм, c помощью которого M-CDK фосфорилирование рекрутирует kinesin-5 на MTs и, во-вуторых, множественные, возможно видоспецифичные, механизмы регуляции c помощью фосфорилирования (M-CDK у дрожжей, Wee1 у Drosophila и возможно др.) настройку активности моторных доменов.

Предстоит ещё много работы в отношении регуляции фосфорилированием kinesin-5 и кинезиновых двигательных белков в целом. База данных PhosphoSitePlus идентифицировали места фосфорилирования почти в каждом члене семейства кинезинов человека (Hornbeck et al., 2012). Многие из этих мест были воспроизведены с помощью сложной MS техники, но очень мало исследований изучало механистические эффекты этих событий фосфорилирования на активность кинезиновых моторов in vitro и in vivo. Трудно оценить насколько эти открывают возможность открытия , специфических, плохо понимаемых регуляторных механизмов, управляющих кинезинами и насколько вероятно. что это артефакт. Механистические исследования механизмов фосфорегуляции кинезиновых моторов продолжаются, такие как работа Mennella et al. (2009), которая механистически связала фосфорилирование Drosophila kinesin-13 Klp10A с изменениями деполимеризации MT.

Kinesin-5 roles beyond mitosis

Поскольку kinesin-5 рассматривается как 'митотический' кинезин, но несколько линий доказательств подтверждают роль этого мотора помимо митоза. Группа Peter Baas's опубликовала несколько исследований, демонстрирующих, что Eg5 регулирует длину аксонов и миграцию нейронов в культуре (Myers and Baas, 2007; Falnikar et al., 2011). Недавняя работа группы Baas подтвердила, что фосфорилирование BimC box в Eg5 может действовать как переключатель, который сворачивает двигательную активность на ростовые кончики, также как в митозах (Nadar et al., 2012).

Кроме того, Bartoli et al. (2011) сообщили о глобальном снижении синтеза белков в клетках, обработанных специфическими ингибиторами Eg5 и показали, что Eg5 помогает структуировать полисомы вдоль каркасов из MT.

Conclusions: directions for future study

Investigations of the mechanism and the biological role of kinesin-5 motors have generated several emerging and controversial storylines that force the entire kinesin field to re-examine many of its assumptions. Having highlighted many of these storylines above, we conclude here with a series of questions that, in our view, would make excellent topics for future research.

How and why is it that yeast kinesin-5s, which have N-terminal motor domains, switch directions? Is this direction switching the target of regulatory mechanisms that establish unique roles for yeast kinesin-5s?

Does loop 5 have a conserved function for all kinesins that is amplified for the kinesin-5 family? Is this structural element a natural regulatory target region for kinesins, and/or a 'hot spot' for inhibitors?

How can a specific MAP, TPX2, regulate a specific kinesin, Eg5?

Can combination drug therapies be developed with the knowledge of how Eg5 interacts with regulatory proteins and mitotic kinases?

Does kinesin-5 require different binding partners to fulfill its conventional roles in mitosis versus 'moonlighting' roles in axonal length regulation and protein synthesis? Does kinesin-5 perform different mechanochemical activities in these settings?

Does kinesin-5 have other 'moonlighting' roles besides axonal length regulation and protein synthesis?

Mechanism and regulation of kinesin-5, an essential motor for the mitotic spindle Joshua S. Waitzman and Sarah E. Rice Biology of the Cell Volume 106, Issue 1, pages 1-12, January 2014

Mechanism and regulation of kinesin-5, an essential motor for the mitotic spindle
Joshua S. Waitzman and Sarah E. Rice
Biology of the Cell Volume 106, Issue 1, pages 1-12, January 2014