Мутации зародышевой линии в DNA mismatch repair (MMR) генах MLH1, MSH2, MSH6 и PMS2, являются причиной синдрома Lynch (первоначально обозначаемого как hereditary non-polyposis colorectal cancer, HNPCC), и др. родственных наследуемых раковых состояний, включая синдром Muir-Torre и constitutional mismatch repair deficiency syndrome (CMMR-D) [1-3]. Идентификация семей с мутациями важна для определения риска для родственников, для пресиндромального скрининга и ведения, уменьшающего риск, и для осуществления кли нической стратегии по снижению риска вторичных раковых опухолей у пациентов [4].

Растет осознание, что значительная доля germline вариантов, обнаруживаемая в генах, ассоциированных с болезнью, включая MMR гены, вызывают аномалии сплайсинга [5]. Эти 'spliceogenic' варианты возникают в результате альтераций в цис-действующих сигналах, способствующих сплайсингу, а именно, в сайтах сплайсинга (напр. разрушение канонического сплайст-сайта или использование сайта de novo обусловленное созданием нового сайта сплайсинга и/или активации скрытых сайтов) или в элементах, регулирующих сплайсинг (напр. энхансеры и сайленсеры экзонного сплайсинга, ESEs и ESSs, соотв.) [6]. Как показано на Fig.1, такие отклонения часто приводят к событиям, таким как полная или частичная делеция экзонов (включая тотальный пропуск экзонов) и превращение в экзоны интронных последовательностей (intron retention, pseudoexon inclusion) [7, 8].



Figure 1. Structural types of alternative splicing. Black denotes exons from the example reference sequence. White are exonic regions that become intronic (relative to reference sequence) due to alternative splicing events. Grey indicates intronic/intergenic regions that become exonic (relative to reference sequence) due alternative transcription or/and splicing events. Solid lines between exon boundaries indicate splicing events also present in the example reference sequence, whereas dashed lines represent alternative splicing events.

Из-за их очень высокого сходства, чтобы изменить сплайсинг, варианты нуклеотидов, вызывающие отклонения конесенсуса интронных динуклеотидов в естественных 5'-donor (GT) и 3'-acceptor (AG) сайтах часто рассматриваются как патогенные мутации без необходимости в проверке мРНК и используются только для непосредсвенного ведения пациента [5]. Что касается оставшихся интронных и экзонных вариантов, это является рутинным для большинства клинических лабораторий для проведения проверки мРНК, чтобы оценить их клиническое значение [9], после предварительного выбора, базирующегося на биоинформационных предсказаниях альтераций вариантов, индуцирующих сплайсинг. Наиболее высоко используемыми подходами для детекции интересующих транскрипов являются reverse transcriptase polymerase chain reactions (RT-PCR) сопровождаемая: электрофорезом на агарозном геле и секвениованием очищенных от шеля продуктов [10]; электорофорезом в капиллярах с использоанием флюоресцентно меченных праймеров [11]; и/или молекулярное клонирование продуктов RT-PCR [12]. Базирующийся на PCR метод для enriching alternatively spliced isoforms (EASI) был также разработан для идентификации новых вариантов транскрипов [13]. Подход минигенов предоставляет ex vivo меод для оценки эффектов вариантов сплайсинга. Они особенно пригодны, когда доступна РНК пациентов или когда появляется индуцированный аберрантно вариант in vivo, но трудно определить из-за деградации с помощью nonsense-mediated decay (NMD) [14-16]. Более того, подход минигенов может непосредственно оценивать взаимоотношения причина-эффект, а именно между вариантом и неожиданным вариантом, вызывающим дефект сплайсинга. Измененные паттерны сплайсинга, идентифицированные с помощью упомянутых выше экспериментальных подходов могут быть использованы в помощь определения молекулярных последствий и тем самым для оценки клинического значения вариантов нуклеотидов [5].

Альтернативный сплайсинг является является широко распространенным явлением у эукариот и имеет важные биологические последствия, т.к. он вносит вклад в регуляцию экспрессии генов и увеличивает разнообразие белковых изоформ, продуцируемых каждым геном. Напр., альтернативный сплайсинг может регулировать тканеспецифическую экспрессию ряда генов [17, 18]. В дополнение к функциональным изоформам белка альтернативный сплайсинг может приводить к продукции транскрипов с преждевременными стоп-кодонами (PTCs), которые деградируют с помощью NMD. Было предположено, что многие из этих транскрипов не функциональны и в большинстве своем не законсервированы у млекопитающих, но представляют, скорее всего, биологические шумы, вызываемые ошибками сплайсинга, иногда заканчивающиеся незаконным сплайсингом, [19-21]. Однако некоторые PTC-содержащие транскрипты, как было установлено, возникают в результате регулируемого альтернативного сплайсинга, который вносит вклад в регуляцию экспрессии белка, также наз. regulated unproductive splicing and translation (RUST) [22, 23].

В случае MMR и др. раковых генов были описаны некоторые альтернативно сплайсированные мРНК транскрипты с неочевидной ассоциацией с мутациями [7, 10]. Эти альтернативные транскрипты могут маскировать присутствие сходного размера аберрантных транскрипов, ассоциированных с мутациями при RT-PCR подходе или могут даже ошибочно приняты за специфичные для пациента абберации сплайсинга. Доказательства из крупных полуколичественных подходов показали, что количество и уровень альтернативных транскрипов, потенциально несущих PTCs, может заметно варьировать между индивидами и также между тканями данного индивида [10, 11, 24, 25]. Поэтому очень важно установить базовый уровень количества и уровень экспрессии естественно возникаюших сплайс-транскриптов для данного гена, по сравнению с которыми могут быть интерпретированы получаемые данные.

Это первый систематический обзор, сфокусированный на естественно возникающих транскриптах после сплайсинга MMR генов MLH1, MSH2, MSH6 и PMS2. Целью обзора было идентифицировать все представленные в печати MMR транскрипты (открытые базы данных и/или литература), в попытке создать каталог для проектирования и интерпретации тестов сплайсинга. Кроме того, те же самые данные были использованы для интерпретации нуклеотидных вариантов MMR генов вариантов, описанных в ассоциации в измененной экспрессией любого естественно возникшего транскрипта после альтернативного сплайсинга. Эти нуклеотидные вариенты были также оценены биоинформационно для оценки, действительно ли описанные профили транскриптов согласуются с эффектом варианта сигнала к сплайсингу. Этот обзор показал важность занния прототипа естественно возникающих альтернативных сплайс-транскриптов, чтобы интерпретировать варианты и создать каталог естественно возникающих MMR транскриптов, который может быть использован в качестве основы , чтобы информировать замысео и интерпретацию клинических мРНК подходов.



Figure 2. Mismatch repair gene naturally occurring mRNA transcripts identified from the literature and public sequence database searches: MLH1, n=31 (a), MSH2, n?=?23 (b); MSH6, n?=?5 (c); and PMS2, n?=?10 (d). A full explanation of the symbols used to annotate the transcripts is presented in the Methods section. Asterisks denote transcripts identified in public databases only. Solid lines denote predicted open reading frame (coding sequence) derived from exonic sequence (grey shading) and/or intronic/intergenic sequence (black shading). Predicted coding sequences were based on GENCODE annotated transcripts or recommendations in Mudge et al. [8]. Light shading denotes predicted non-coding sequence, derived from exonic sequence (dashed lines) and/or intronic/intergenic sequence (dot-dash lines). FL, full-length reference transcript sequences (RefSeq): NM_ 000249.3 (MLH1), NM_000251.2 (MSH2), NM_000179.2 (MSH6) and NM_000535.5 (PMS2). Δ: partial or complete exon deletion; маленький слошной треугольник : inclusion of intronic sequence within the transcript's body or inclusion of non-coding or intronic sequence as an alternative first or final exon; p: acceptor-site shift; q: donor-site shift.