Lysophosphatidic acid (LPA) небольшой повсеместно распространенный фосфолипид, действующий как внеклеточный сигнал, как полагают, участвующий в многочисленных физиологических и патологических процессах. Он вызывает широкий круг клеточных реакций в разных типах клеток, включая эффекты на пролиферац3ию, миграцию, адгезию, изменения формы и гибель клеток (Noguchi et al., 2009; Skoura and Hla, 2009; Choi et al., 2010). Эти разнообразные клеточные функции обеспечиваются, по крайней мере, 6 членами крупного сверхсемейства G-protein-coupled receptors (GPCR): LPA рецепторами 1 - 3 (LPAR1-3), относящимися к подгруппе Endothelial differentiation gene (EDG), которая также включает рецепторы для биоактивного липида Sphingosine-1-phosphate, тогда как LPA рецепторы 4 - 6 (LPAR4-6) к подгруппе Purinergic receptor (P2Y), которая включает рецепторы для внеклеточных Adenosine triphosphate (ATP) и Uridine triphosphate (UTP) (Choi et al., 2010). Все 6 рецепторов сцеплены с множественными подтипами G-белков, и регулируют множественные внутриклеточные пути передачи сигналов, включая Cyclic adenosine monophosphate (cAMP), Ca²⁺, Mitogen-activated protein (MAP) киназа и Rho GTPases.

LPA рецепторы широко экспрессируются у эмбрионов позвоночных, при этом наблюдаются отличающиеся, но перекрывающиеся паттерны экспрессии (Ohuchi et al., 2008; Masse' et al., 2010a). Некоторые рецепторы LPA экспрессируются в развивающейся нервной системе (Ohuchi et al., 2008), но исследования с потерей функции дали мало информации относительно их роли в нейральном развитии. Наблюдались лишь незначительные фенотипические отклонения, это указывает на перекрываемость функций между рецепторами LPA (Contos et al., 2000; Contos et al., 2002; Ye et al., 2005; Lee et al., 2008). Аномалии были описаны в коре головного мозга у Lpar1^-/- мутантных мышей, включая уменьшение нейрональных предшественников (Estivill-Torrus et al., 2008) - фенотип, согласующийся с экспрессией Lpar1 в вентрикулярной зоне развивающейся коры (Hecht et al., 1996). Lpar5 строго экспрессируется в субнаборе нейронов в ганглиях дорсальных корешков, а исследования с потерей функции выявили его участие в нейропатической боли (Lin et al., 2012). Некоторые нейральные дефекты были также описаны у эмбрионов, лишенных Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 2 (ENPP2; также известной как Autotaxin и Lysophospholipase D), энзима, участвующего в синтезе внеклеточных LPA (Tokumura et al., 2002; Umezu-Goto et al., 2002). Enpp2^-/- мутантные мыши неспособны завершать закрытие нервной трубки и обнаруживают дефекты в переднем мозге и на границе между средним и задним мозгом (MHB) (Fotopoulou et al., 2010; Koike et al., 2010; Koike et al., 2011).

LPAR6 был совсем недавно охарактеризован как член семейства рецепторов LPA (Chun et al., 2010). Идентифицированный как орфановый GPCR (Kaplan et al., 1993), он впоследствии был назван P2Y5 из-за гомологии нуклеотидов с рецепторами (Webb et al., 1996). Однако не удалось вызывать четкие реакции на внеклеточные нуклеотиды (Li et al., 1997). Недавно, LPAR6 был определен как рецептор для LPA, активирующий Gα_i и Gα12/13 G белки, ингибирующий Adenylyl cyclase, фосфорилирующий ERK1/2 и активирующий Rho GTPase (Pasternack et al., 2008; Lee et al., 2009; Pasternack et al., 2009; Yanagida et al., 2009). Мало известно о роли LPAR6 в клеточной физиологии за исключением того, то он необходим для роста волос у человека (Pasternack et al., 2008; Shimomura et al., 2008; Pasternack et al., 2009; Shimomura et al., 2009a). LPAR6 экспрессируется во внутреннем слое корня волосяного фолликула (Pasternack et al., 2008; Shimomura et al., 2008) а мутации потери функции в этом рецепторе обнаружены в семьях с аутосомными дефектами волос (Pasternack et al., 2008;Pasternack et al., 2009; Shimomura et al., 2008). Сходные дефекты волос наблюдались в семьях, несущих мутации потери функции в гене Lipase H (LIPH), также экспрессирующимся во внутреннем слое волосяного фолликула и кодирующем секретируемый энзим, участвующий в синтезе внеклеточных LPA (Kazantseva et al., 2006; Shimomura et al., 2009b). Однако и LPAR6, и LIPH широко экспрессируются в тканях человека, указывая, что они выполняют множественные роли.

Мы показали, что lpar6 экспрессируется у эмбрионов Xenopus со ст. поздней бластулы головастика и что потеря его функции нарушает нейральное развитие нервов. Эмбрионы, которым инъецировали antisense morpholinos (AMO) к lpar6, обнаруживали сильно пониженную экспрессию маркеров телэнцефалона (foxg1, emx1 и nkx2-1) и пониженную экспрессию маркеров глазного поля (rax и pax6). Маркеры среднего мозга (en2) и заднего мозга (egr2) не были затронуты, демонстрируя, что дефекты ограничиваются развивающимся передним мозгом. Экспрессия Foxg1 нуждается в присутствии LPAR6 в эктодерме, но не в мезодерме. Удивительно, дефекты, вызываемые инъекциями lpar6-AMO, усиливались также ингибированием передачи сигналов FGF, при этом маркеры среднего мозга (en2) и заднего мозга (egr2) оказывались значительно сниженными у таких эмбрионов. Это подтверждает, что передачи сигналов LPAR6 и FGF взаимодействуют в переднем нейральном развитии. Наконец, мы показали, что AMO, нацеленные на Xenopus ENPP2, вызывают сходные дефекты с теми, что наблюдаются при lpar6-AMO. Наше исследование показало, что передача сигналов LPA необходима для спецификации клеточных судеб в передней части нервной системы, возможно благодаря участию в кооперации с передачей сигналов FGF.

DISCUSSION

Xenopus LPAR6

В данном исследовании мы описали Xenopus LPAR6, рецептор GPCR для биоактивного липида LPA (Choi et al., 2010; Chun et al., 2010). Мы показали, что он транскрибируется со ст. поздней бластулы и обогащен в мезодерме ранней гаструлы, при этом его транскрипция контролируется передачей сигналов FGF. Распределение транскриптов lapr6 в ранней гаструле очень сходно с таковым для fgf4 и fgf8 (Isaacs et al., 1995; Christen and Slack, 1997; Lea et al., 2009) и для активности FGF-зависимой Extracellular-signal-related kinase (ERK) (Christen and Slack, 1999). Транскрипция быстро индуцируется (30 мин. - 1 ч) с помощью FGF4 в анимальной шапочке на ст. бластулы и ингибируется на ст. ранней гаструлы с помощью доминантно негативных рецепторов FGF. Мы также установили, что lpar6 является одним из первых генов, чувствительных к FGF, транскрибируемых на ст. поздней бластулы, это подтверждает, что он транскрибируется как рано реагирующий в ответ на передачу сигналов FGF. Ингибирование передачи сигналов FGF вызывает специфические дефекты в формировании задней части мезодермы (Amaya et al., 1991; Isaacs et al., 1998) и сходные дефекты наблюдаются после ингибирования ряда генов мишеней для FGF, включая bra и cdx4 (Conlon et al., 1996; Isaacs et al., 1998). Неожиданно, мы оказались не в состоянии выявить какой-либо эффект ингибирования функции LPAR6 на формирование мезодермы. Или LPAR6 не является эффектором передачи сигналов FGF в этих процессах или до. подтипы рецепторов LPA могут компенсировать дефекты передачи сигналов LPAR6. Транскрипты lpar1, lpar2, lpar4 м lpar5 были выявлены ц эмбрионов Xenopus (Lloyd et al., 2005; Masse' et al., 2010a). Поскольку разные подтипы рецепторов LPA, как было установлено, активируют сходные внутриклеточные пути передачи сигналов внутри одной клетки (Dubin et al., 2010), то возможно, что один или несколько из этих Xenopus рецепторов могут компенсировать дефекты функции LPAR6 на этой стадии.

LPA is required for anterior neural development

Xenopus lpar6 экспрессируется в нейральной эктодерме на ст. ранней гаструлы и в нейруле и он присутствует в эктодерме нейрулы, где мы наблюдали первые дефект от потери его функции. Мы установили, что толщина нервной пластинки увеличивается по всей её длине, как показывает экспрессия sox2 и cdx4. Это может быть вызвано дефектами в конвергенции и удлинении, в скоординированной интеркаляции клеток, что делает нервную пластинку уже и длиннее (Elul and Keller, 2000). Необходимы дальнейшие исследования, чтобы подтвердить это, но мы наблюдали уменьшение передне-задней оси у эмбрионов, которым инъецировали lpar6-AMO, что ожидается в случае нарушений конвергенции и удлинения. Однако мы отметили, что нервная трубка lpar6-AMO-инъецированных эмбрионов полностью закрыта, тогда как дефекты нервной трубки широко распространены у эмбрионов с нарушениями convergent-extension перемещений (Wallingford and Harland, 2002). Уменьшение размера переднего мозга также наблюдалось у эмбрионов после инъекции lpar6-AMO, как это было продемонстрировано снижением экспрессии телэнцефалического маркера foxg1. Как дорсальный (emx1 экспрессия), так и вентральный (nkx2-1 экспрессия) регионы конечного мозга оказывались затронутыми. Мы также наблюдали снижение экспрессии fgf8 и активности ERK (в ANR и MHB), а также снижение экспрессии rax и pax6 (в глазном поле). Наиболее задние регионы головного мозга (экспрессия en2 и egr2) не были затронуты. Снижение экспрессии foxg1 зависело от ингибирования LPAR6 в эктодерме, указывая тем самым, что роль LPAR6 внутренне присуща развивающемуся переднему мозгу. Наши результаты подтверждают, что передача сигналов LPA посредством LPAR6 необходима в передней нейральной эктодерме для развития телэнцефалона.

Мы наблюдали сходные дефекты у эмбрионов, которым инъецировали AMO для ENPP2, секретируемого энзима, который синтезирует внеклеточные LPA (Tokumura et al., 2002; Umezu-Goto et al., 2002). Enpp2 экспрессируется в ходе развития Xenopus и обогащен в нейральной пластинке на ст. нейрулы, затем в передней части нервной системы и нервном гребне после завершения нейруляции (Masse' et al., 2010b). Наиболее очевидным дефектом, наблюдаемым после инъекции AMO было укорочение передне-задней оси, которое часто сопровождалось дефектами закрытия передней части нервной трубки. Оба дефекта согласуются с ролью ENPP2 в регуляции конвергенции-удлинения в нервной пластинке. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы подтвердить это. Мы также наблюдали снижение экспрессии маркеров телэнцефалона foxg1, emx1 и nkx2-1 в нейруле, показывающее, что затрагиваются и дорсальный и вентральный регионы телэнцефалона. И экспрессия fgf8 и активность ERK снижены в передней части нервной пластинки у эмбрионов после инъекции AMO. В противоположность lpar6-AMO-инъецированным эмбрионам, мы не наблюдали снижения экспрессии маркера глазного поля rax. Наши результаты согласуются с исследованиями на мышах, гомозиготных по мутации в Enpp2. На ст. E8.5 гомозиготные мутантные эмбрионы обнаруживают дефекты в передней части нервной системы, дефекты нервной трубки и снижение экспрессии передних нейральных маркеров (van Meeteren et al., 2006; Fotopoulou et al., 2010). Снижение экспрессии было описано для Otx2, Six3, Tcf4 и Fgf8, демонстрирующее дефекты в развитии переднего мозга (Koike et al., 2011). В противоположность нашим результатам у Xenopus, экспрессия маркера вентральной части телэнцефалона Nkx2-1 не была снижена у мышей Enpp2^-/- (Koike et al., 2011). Однако мы отметили, что снижение экспрессии nkx2-1 (но не foxg1 или emx1) у enpp2-AMO-инъецированных эмбрионов Xenopus было лишь временным, при этом экспрессия восстанавливалась на стадии ранней хвостовой почки (supplementary material Fig. S6). Сходство между результатами исследований потери функции у Xenopus и мыши подтверждает ключевую роль LPA в регуляции развития телэнцефалона. Более того, они подтверждают, что Xenopus является идеальным организмом для изучения этих дефектов. Эмбрионы Xenopus доступны на всех стадиях развития и могут выживать с сосудистыми дефектами, которые убивают мышиные эмбрионы Enpp2^-/- на день эмбриогенеза (E) 9.5-10.5 (van Meeteren et al., 2006; Fotopoulou et al., 2010).

Functional cooperation between LPAR6 and FGF signalling

Конечный мозг является наиболее передним регионом переднего мозга позвоночных и в конечном счете формирует головной мозг, включая полушария головного мозга, обонятельную систему и базальные ганглии. Его развитие регулируется с помощью многочисленных сигналов из организующих центров в соседних регионах эмбриона, включая ANR (He'bert and Fishell, 2008; Hoch et al., 2009). Этот регион является источником ряда FGF сигналов, включая FGF8, и FGF должен индуцировать эктопическую экспрессию foxg1 в передней части нервной пластинки (Shimamura and Rubenstein, 1997; Eagleson and Dempewolf, 2002). Более того, fgf8 мутантные эмбрионы рыбок данио и мыши обнаруживают дефекты телэнцефалона (Meyers et al., 1998; Shanmugalingam et al., 2000; Walshe and Mason, 2003). Кроме того, прогрессивно всё более тяжёлые дефекты были описаны у эмбрионов мыши с одиночной, двойными или тройными мутациями Fgfr1, Fgfr2 и Fgfr3 (Paek et al., 2009). Эти результаты подчеркивают важность передачи сигналов FGF в развитии телэнцефалона. Мы отметили, что AMO как для lpar6, так и для enpp2 снижают экспрессию fgf8 в ANR в нейруле Xenopus и dpERK в передней части нервной пластинки, демонстрируя снижение передачи сигналов FGF в презумптивном телэнцефалоне. Это подтверждает объяснение наших результатов, что передача сигналов LPA необходима для экспрессии fgf8 в ANR, снижения экспрессии fgf8 оказывается ответственным за дефекты в развитии телэнцефалона. Однако эксперименты с инъекциями fgf8-AMO к Xenopus не позволили определить роль FGF8 в развитии переднего мозга (Fletcher et al., 2006). Это может отражать перекрывание функций между разными FGFs, т.к. и fgf3 и fgf8 необходимы для развития телэнцефалона у рыбок данио (Walshe and Mason, 2003).

Т.к. была продемонстрирована связь между передачей сигналов LPAR6 и FGF в развитии передней части нервной системы также в экспериментах, в которых мы подавляли оба пути. dnFGFR1 нарушает развитие туловища и хвоста эмбрионов Xenopus, но оказывает незначительный эффект на развитие головы (Amaya et al., 1991; Isaacs et al., 1998). Всё же, когда мы комбинировали с подавлением LPAR6, то мы наблюдали драматическое уменьшение развития головы, значительно более существенное, чем при дефектах переднего мозга после ингибирования только LPAR6. Мы наблюдали тот же самый эффект, когда ингибировали передачу сигналов FGF с помощью SU5402, малой молекулы ингибитора рецепторов FGF (Mohammadi et al., 1997). Фенотипическое углубление, наблюдаемое при этом, обычно указывает на генетическое взаимодействие и, скорее всего, отражает степень функционального перекрывания. Мы подтвердили, что передача сигналов LPAR6 и FGF необходима в ходе всего развития головного мозга, но только телэнцефалон чувствителен к снижению передачи сигналов только LPAR6. Только с помощью ингибирования обоих путей выявляет более широкую роль в развитии головного мозга. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить уровень, на котором эти пути взаимодействуют, но ERK1/2 является потенциальным кандидатом. ERK1/2 является ключевым компонентом канонического пути передачи сигналов FGF (Dorey and Amaya, 2010; Pownall and Isaacs, 2010), а также мишенью для передачи сигналов LPAR6 (Lee et al., 2009). Хотя активация ERK1/2 у ранних эмбрионов Xenopus преимущественно зависит от FGF (LaBonne and Whitman, 1997; Christen and Slack, 1999) степень зависимости от LPAR6 не может быть исключена. Как передача сигналов LPA регулирует активность ERK к эмбрионов Xenopus, необходимо исследовать, но здесь может участвовать G protein Gα_i, так как LPA-индуцируемая активация ERK в клетках hBRIE 308i блокируется с помощью Gα_i ингибитора токсина pertussis (Lee et al., 2009). Альтернативный механизм был предположен в исследовании развития волосяных фолликулов у мышей, обнаружившим, что LPAR6 действует посредством Gα13, чтобы стимулировать обусловленное с помощью TNFα converting enzyme (TACE) потерю (shedding) эктодомена TGFα (Inoue et al., 2011). TGFα стимулирует активность ERK посредством рецептора Epidermal growth factor (EGF). Интересно, что AMO для EGF-подобного рецептора ERBB4 вызывает задние дефекты, сходные с теми, что вызываются с помощью dnFGFR1, дефекты устраняемые с помощью увеличения активности ERK (Nie and Chang, 2007).

Conclusions

Our results show that LPA signalling, acting through the LPAR6 receptor, is required in the initial specification and/or maintenance of the telencephalon, the most anterior region of the vertebrate brain. This is only the second LPAR receptor, after LPAR1 (Estivill-Torrus et al., 2008), that has been shown to have a role in early neural development, even though multiple receptor subtypes are expressed in the developing nervous system (Ohuchi et al., 2008;Masse' et al., 2010a). The cellular and molecular basis of this role will require further studies, as will identifying the source of the LPA signals. Previous studies have shown that LPAR6 is required for hair growth in humans, but no evidence for a role in brain function was obtained. Either LPAR6 has evolved different roles in amphibians and mammals, or functional redundancy among the different LPA receptor subtypes masks the role of LPAR6 in mammalian forebrain development.

An essential role for LPA signalling in telencephalon development Timothy J. Geach, Laura Faas, Christelle Devader, Anai Gonzalez-Cordero, Jacqueline M. Tabler, Hannah Brunsdon, Harry V. Isaacs and Leslie Dale Development. 2014 Feb;141(4):940-9. doi: 10.1242/dev.104901.

An essential role for LPA signalling in telencephalon development
Timothy J. Geach, Laura Faas, Christelle Devader, Anai Gonzalez-Cordero, Jacqueline M. Tabler, Hannah Brunsdon, Harry V. Isaacs and Leslie Dale
Development. 2014 Feb;141(4):940-9. doi: 10.1242/dev.104901.