Это исследование примиряет некоторые предыдущие неожиданные наблюдения и предоставляет последовательное описание образования границ, исходя из селективного отталкивания между двумя популяциями клеток. В частности, оно объясняет, как в тканях с широко распространенной экспрессией множественных ephrin лигандов и Eph рецепторов, межклеточное отталкивание, обусловленное взаимодействием рецепор-лиганд, может быть ограничено на границе между тканями. Ситуации, где ephrins и Ephs экспрессируются совместно, были ожидаемы как устрашающие комплексы, принимая во внимание множественные возможные перекрёстные регуляции, предположительно возникающие, и потенциально различающиеся пути, которые могут стимулировать каждого из членов этих семейств. Однако мы установили, что сущность ранних границ может быть представлена удивительно простой моделью, где финальный результат может быть в основном предсказан, исходя из относительно избирательности внеклеточных взаимодействий и обилия различных компонентов.

Важно подчеркнуть, что система не может быть просто сведена к сумме бинарных сигналов индивидуальных специфических пар, экспрессирующихся в противоположных тканях, а должна, скорее всего, рассматриваться как интегрированная сеть, состоящая из полуселективных пар. Большинство молекул имеет более одного партнера (ephrinB2 может взаимодействовать со всеми рецепторами), и партнеры по экспрессии располагаются в пределах от равного распределения на обеих сторонах границы до строгого преобладания в одной из тканей с наиболее частыми промежуточными частичными асимметриями. Эти характеристики сети хорошо объясняют их реакцию на экспериментальные манипуляции: хотя главный компонент необходим в такой степени, которая в целом соответствует его уровням экспрессии и распределению, специфичность потребности не абсолютна, т.к. она в некоторых случаях может быть заменена на др. подтипы, обладающие тем же партнером (ephrinB2 и ephrinB3 с EphA4; Figure 1D). Др. словами, роль каждого из ephrins и из Eph рецепторов диктуется возможностью становления взаимодействия с партнером через границу. Отметим, что некоторая более слабая степень избавления достигается также с помощью компонентов, которые не взаимодействуют с тем же самым партнером, как в случае с ephrinB1 и ephrinB3 (Figure S2B). В таких случаях избыточная экспрессия должна, по-видимому, поднимать передачу сигналов посредством разных ephrin-Eph пар, хотя это не может эффективно компенсировать потерю оригинального сигнала (Figure S2B). Эти частичные компенсации полностью ожидаемы в сети такого типа. Спорность большинства определяющих оценок модели получены в экспериментах по обмену местами ephrinB3-EphA4 (Figure 3), которые продемонстрировали, что разделение не зависит от присутствия определенного ephrin или Eph в эктодерме или мезодерме, но от способности селективных пар устанавливать взаимодействия через границу.

Можно сказать, что система является интегрированной сетью, столь же важно подчеркнуть тот факт, что только субнабор потенциальных ephrin-Eph комбинаций (5 из 9) может устанавливать взаимодействия функционального значения (Figure 7). Этот субнабор функциональных пар идентичен одной, определяемой как способной к связыванию in vitro [13]. Т.о., наши данные представляют солидную in vivo оценку мнения о частичной специфичности ephrin-Eph взаимодействий лиганд-рецептор. Как обсуждается в Text S1, тот факт, что ephrins и Ephs все экспрессируются на сходных уровнях, и что сродство 5 функциональных пар одного и того же диапазона и что влияние изменчивости этого сродства, как полагают, ограничено, позволяет нам подытожить систему в виде простой модели, где все функциональные пары могут рассматриваться, как вносящие равный вклад. Исход, по-видимому, зависит от частично комплементарных паттернов нескольких из этих пар (Figure 7).

В целом имеющиеся данные предоставляют нашему сведению обширную сеть, состоящую из множественных лигандов и рецепторов. Эта удача связана с обширным использованием экспериментов с комбинаций потерь и избыточности функций, в параллельном сравнении разных ephrins и Ephs. Проблемы чаще всего возникают, когда делается попытка оценить способность одного члена из семейства генов путем замены его на другого, это связано с трудностью контроля активности реагентов. В этом контексте сила наших экспериментальных систем базируется на сильной связи систематических сравнений множественных условий, включая перекрестное восстановление, где каждый реагент был оценен, по крайней мере, в одном из комплементарных условий (e.g., Figure 1D,E, and Figure S2B).

Сравнение трех морфологически сходных щелеподобных границ, которые формируются во время гаструляции Xenopus и зависят от передачи сигналов Eph-ephrin, позволяет нам выявить повторяющиеся регуляторные мотивы в форме комплементарности пар рецептор-лиганд: ephrinB3-EphA4, ephrinB1-EphB2 и ephrinB2-EphB4 (Figure 7). Для каждой границы, по крайней мере, две из трех этих пар обнаруживают комплементарность паттернов экспрессии. Более того, мы показали ранее, что образование полной границы между эктодермой и мезодермой нуждается в антипараллельной передаче сигналов лиганд-рецептор [4]. Здесь мы наблюдали, что все три изученные границы в отношении комплементарности пар были организованы в виде антипараллельного паттерна (напр., ephrinB3-EphA4 из эктодермы к мезодерме, ephrinB2-EphB2 от мезодермы к эктодерме). Из комплементарных пар, пара ephrinB3-EphA4 наиболее систематически используется в разных контекстах, подтверждая, что она специализируется на разделении тканей.

В целом логика регуляции ephrin/Eph-зависимого отталкивания на поверхности раздела (interfaces) тканей может быть реконструирована следующим образом. Для полного щелеподобного разделения необходимы минимум две антипараллельные пары рецептор-лиганд. Если оба рецептора и оба лиганда были полностью специфичными, то передача сигналов должна быть полностью ограничена границей, т.к. лиганды и рецепторы одновременно экспрессируемые в каждой из тканей должны взаимодействовать только с партнерами в соседней ткани. Если взаимодействия были бы полностью случайными, то интенсивность передачи сигналов в каждой из тканей была бы сходной с таковой поперек границы, приводя к дезинтеграции всей структуры. Если же взаимодействия были бы относительно специфичными, в пользу передачи сигналов между комплементарно экспрессирующимися парами, то отталкивание д. быть ограничено границей с помощью порогового механизма, когда полное разъединение клеток на границе происходит только выше определенного уровня интенсивности передачи сигналов. В такой ситуации дополнительная экспрессия рецепторов и лигандов с дополнительными сильными или слабыми взаимодействиями, д. быть совместима с формированием соотв. границы до тех пор, пока передача сигналов остается ниже порога внутри каждой ткани и превосходит его на интерфейсе тканей. Этот третий сценарий тот, с которым мы столкнулись у эмбрионов. Такая динамика системы с высокой живучестью, по-видимому, совершенно подходит для сложного морфогенеза эмбрионов позвоночных. Напр., она позволяет комбинировать множественные функции передачи сигналов ephrin/Eph внутри одной и той же ткани ([39],[40] and Winklbauer unpublished).

Правила, идентифицированные в данном исследовании, предоставляют взаимосвязанную логику разделения тканей. Напр., теперь понятно, как устанавливается разделение между дорсальной эктодермой и мезодермой в начале гаструляции [19]. Система строится на EphB рецепторах, которые уже экспрессировались до гаструляции (Figure S1A). Их концентрация в проспективной эктодерме является обычным (default) распределением для материнских компонентов. Эта прирожденная склонность в экспрессии становится функционально значимой, как только мезодерма начинает экспрессировать ephrinB2, самый сильный лиганд для EphB рецепторов, инициируя прохождение прямого сигнала в эктодерму. Одновременная экспрессия ephrin B3 в эктодерме и его рецептора EphA4 в мезодерме создает антипараллельную передачу прямого сигнала в мезодерму, выполняя потребность для полного разделения тканей на их границе. На последующих стадиях этот паттерн прогрессивно модифицируется. Комплементарная экспрессия ephrinB3 и EphA4 всё ещё участвует во всех случаях, но др. компоненты, включая те, что являются матерински экспрессируемыми, теперь тщательно регулируются и изменяют паттерн свой экспрессии. Это случай для ephrinB1, который экспрессируется повсеместно и поэтому нейтрален во время образования границы между дорсальной эктодермой и мезодермой, но становится обогащенным в мезодерме, чтобы выполнять важную роль на вентральной стороне. Др. пары, такие как ephrinB2-EphA4, д. взаимодействовать обширно внутри ткани, преимущественно обеспечивая ткане-специфичные функции.

Контролируются ли др. границы сходной интегральной сетью? Информация о паттернах экспрессии ephrin/Eph в др. системах неполная и не оценена количественно, но сомиты и большинство ромбомеров экспрессируют более одного ephrin и/или Eph [1],[3], в виде паттернов, соответствующих базовым принципам, описанным в нашем исследовании: напр., ephrinB3 и EphA4 экспрессируются в виде комплементарных паттернов в некоторых ромбомерах и никогда не концентрируются на одной из сторон границы. EphrinB2, напротив, обнаруживается как на противоположной, так и на той же самой стороне, что и его рецепторы [3],[14],[41].

Эти находки показывают, что поверхность эмбриональных клеток насыщена богатым набором рецепторов, которые после непосредственного контакта с соседними клетками могут устанавливать очень специфические взаимодействия. Мы показали, как такие системы путем интеграции сигналов генерируются с помощью всех комбинаций взаимодействий высокого и низкого сродства, могут давать чёткие решения для тканевых интерфейсов и в то же самое время противостоять в достаточной степени внутритканевой передаче сигналов. Ключом такого поведения системы ephrin/Eph является баланс притягивания и отталкивания и им регулируемый пробой в имеющемся пороге отталкивания.

Хотя эта модель может в основном объяснить разделение тканей, наши результаты не исключают, что определенные ephrins или Ephs могут выполнять важные дополнительные роли. Они могут участвовать в тонкой настройке различных сигналов, как на границе, так и внутри ткани. EphrinB2-EphA4 представляют пример пары, которая на всех стадиях взаимодействует экстенсивно внутри ткани и выполнять тканеспецифичные функции. Одним из таких дополнительных слоёв регуляции, которые предстоит исследовать, это выявленный нами пример, который показал, что истощение ephrinB2 или EphB4 снижает слипчивость эктодермы [4], показывая, что, по крайней мере, при некоторых условиях эти молекулы ведут себя как "pro-adhesive" в эктодерме, тогда как они являются отталкивающими в мезодерме и поперек границы.

Мы также предоставили здесь важное отличие между активностями, которые является прирожденными для каждой ткани и реакциями, которые возникают специфически на границе. Наши наблюдения, что глобальные уровни активации myosin значительно более высокие в эктодерме, это полностью согласуется с хорошо известной жесткостью и значительно меньшей способностью распространения по адгезивным субстратам и миграции [19],[29],[31],[42],[43]. Однако мы также установили второй пул p-MLC, который в отличие от первого, является Eph-зависимым и концентрируется на высоком уровне на границе (Figure 3C). Несмотря на значительные различия в активности "базового" myosin, две ткани не могут оставаться разделенными в отсутствии передачи сигналов Eph. Предыдущие гипотезы базировались на дифференциальной адгезии и натяжении, неспособных аккуратно описать эту ситуацию [29],[44],[45]. Наши наблюдения, однако в полном согласии с нашей моделью "selective repulsion", контролируемого с помощью мощных и высоко локальных реакций еphrin-Eph, доминирующих на специфических межклеточных контактах над адгезивными и вязкими свойствами ткани. Адгезия (и кортикальное натяжение) участвуют в глобальном выравнивании путем наделения ткани генеральными свойствами и мы показали здесь, что разделение, возникающее в результате баланса между адгезией и обеспечиваемым ephrin отталкивании. Сеть из передачи сигналов Ephrin является т.о. набором на соотв. уровне для преодоления адгезии вдоль границы, без опасности риска слипчивости внутри ткани. Экспериментальные манипуляции с уровнями cadherin могут нарушать этот баланс, по крайней мере, в ситуации ранней эктодермы и мезодермы (Figure 5 and Figure S5). Граница хорды однако является примером, где разделение чрезвычайно мощное, противостоящее довольно сильным изменениям в уровнях cadherin [38],[46],[47]. Как адгезия, базальное натяжение и передача сигналов ephrin закладывают дифференциальные различия на границах, чтобы обеспечить им специфические характеристики необходимо выяснить в будущем.

Чтобы объяснить свое оригинальное открытие сортировки клеток Holtfreter высказал предположение, что разные типы клеток имеют отличающиеся сигналы на поверхности, которые он назвал "сродством." Комбинаторная сеть ephrins и Ephs, как показано здесь составляет молекулярную основу этой концепции. Ephrins и Ephs и др. сходные зависимые от межклеточных контактов сигналы экспрессируются в широком разнообразии тканей эмбрионов и взрослых, и мы полагаем, что принципы, открытые на гаструле Xenopus могут быть приложимы к значительному спектру клеточных процессов и могут объяснить способность типов клеток отличать "своих" и "чужих" и т.о. организовывать многоклеточные структуры.