Establishing the totipotency of early embryos

Исследования iPSCs предоставили информацию о становлении плюрипотентности для потенциального клинического использования. Однако генетические и эпигенетические аномалии гасят энтузиазм по их использованию в регенеративной медицине и становление тотипотентности представляет собой лучшую возможность в этом отношении [1]. В отличие от плюрипотентности тотипотентность определяется как способность клеток дифференцироваться в любой клеточный тип и давать полный организм [2]. Хотя молекулярные основы такой способности остаются в основном неизвестны, 4 процесса необходимы, чтобы получить тотипотентные клетки: (i) слияние окончательно дифференцированных гаплоидных спермия и яйцеклетки в одну (1C) диплоидную зиготу (see Glossary) in vivo или с помощью in vitro оплодотворения (IVF); (ii) somatic cell nuclear transfer (SCNT), базируется на репрограммирующей активности яиц; (iii) выделение временных ESC/iPSC популяций с двухклеточным (2C)-подобным эмбриональным транскриптомом [3]; и (iv) генерация in vivo iPSCs с тотипотентными свойствами [4]. Последние три представляют интерес для исследователей, SCNT страдает от неэффективности и скоротечности популяций ESC, а in vivo продуцируемые PSCs лишены способности развиваться в интактный организм. Т.о., стадии дробления эмбрионов из слитых гамет после оплодотворения предоставляют наиболее физиологическую платформу для изучения характеристик тотипотентности и изобретения стратегий по репрограммированию окончательно дифференцированных клеток.

Несмотря на совместное использование основных регуляторных сетей тотипотентные и плюрипотентные клетки обладают существенными различиями, такими как подвижность стержневых гистонов [5] и использование регуляторных факторов для экспрессии генов [6]. Центральным для развития мышиных эмбрионов из дифференцированных гамет являются эпигенетические модификации, гарантирующие экспрессию или молчание генов, определяющих тотипотентность. После оплодотворения гаплоидный спермий проникает в цитоплазму гаплоидных яиц, чтобы сформировать диплоидную 1C зиготу. Это заставляет отцовский геном восстановить нуклеосомные структуры с сохранившимися материнскими гистонами, это сопровождается быстрым образованием мужского и женского пронуклеусов. Присутствует минорная активация родительских геномов на ст. 1C, но обнаруживается незначительная трансляция с de novo транскриптов. Описаны как embryonic genome activation (EGA), так и zygotic genome activation (ZGA). Первый акроним и будет использован в обзоре.

Первоначально отцовский и материнский хроматин имеют разделённые и асимметричные эпигенетические профили. Деление 1C зиготы формирует 2C эмбрионов с существенно увеличенной транскрипцией и каждый из двух бластомеров является тотипотентным [7]. Вновь синтезируемые продукты эмбриональных генов постепенно замещают материнские факторы в качестве регуляторов раннего развития. Хотя причинные взаимоотношения не установлены, происходит сопутствующая потеря тотипотентности эмбриона. Напр., одиночные из 4-кл. и 8-клеточных эмбрионов (4C, 8C) бластомеры не могут формировать все клоны эмбриона без агрегации с др. бластомерами [8]. В конечном итоге эмбриональные клетки дифференцируются, чтобы сформировать или inner cell mass (ICM, источник ESCs) или trophectoderm (TE, предшественницу плаценты) т.к. бластоцист готовится к имплантации (Figure 1A).

Figure 1. Mouse preimplantation development and maternal-to-embryonic transition. (A) After ovulation from the ovary into the oviduct, terminally differentiated mature eggs (surrounded by the extracellular zona pellucida) are fertilized by sperm to establish totipotent zygotes that divide during preimplantation development to become blastocysts prior to implantation in the uterus at embryonic day 4.5. (B) Upon fertilization, stored maternal factors activate the embryonic genome to trigger maternal-to-embryonic transition that results in formation of a totipotent zygote. Specifically, parental genomes are reorganized by chromatin remodeling factors with the aid of cytoplasmic streaming, and form pronuclei that import nuclear reprogramming factors and crosstalk with other cellular compartments. Abbreviations: BRG1, a chromatin remodeling protein; CTCF, CCCTC-binding factor; GV, germinal vesicle; NPM2, nucleoplasmin protein 2; SCMC, subcortical maternal complex; TET3, ten-eleven translocation protein 3; TIF-?, transcription intermediary factor 1α.

Здесь будут рассмотрены исследования, которые определяют прогрессивные изменения в эпигенетическом репрограммировании, которые влияют на динамику хроматина и делают возможной тотипотентность в ранних эмбрионах мыши. Персонализованные тотипотентные клетки из окончательно дифференцированных клеток смогут предоставить пул клеток, из которых могут быть получены специфические типы клеток для лечения дегенеративных болезней, таких как диабет и паркинсонизм. Эволюция сформировала наиболее эффективные способы становления тотипотентных клеток из окончательно дифференцированных гамет и понимание этих молекулярных механизмов д. предоставить информацию о том, как воспроизвести её для лечения пациентов.

Stored maternal factors

Во время оогенеза объем зародышевой клетки увеличивается драматически и предоставляет хранилище для материнских факторов, необходимых, чтобы компенсировать отсутствие транскрипции вовремя мейотического созревания, овуляции и раннего развития. При оплодотворении каждая гамета вносит вклад в виде гаплоидного генома, но яйцеклетка является первичным источником для генных продуктов (РНК, белков) жизненно важных для становления тотипотентности и EGA (Figure 1B). Эти факторы закодированы генами с материнским эффектом, такими как гены, кодирующие nucleoplasmin (NPM) 2 [9] и subcortical maternal complex (SCMC) 10-12. Их генетическое устранение у мышей демонстрирует важную роль как ядерных, так и цитоплазматических факторов в становлении тотипотентности в ранних эмбриональных клетках [13]. Большой объем цитоплазмы 1C зиготы может осложнять доставку белков и недавние сообщения подчеркивают целостность и стабильность субклеточных структур [14] и перераспределение цитозольных компонентов вовремя репрограммирования генома [15].

Хотя был достигнут определенный прогресс в понимании сложности репрограммирования тотипотентности, бедность биологического материала у мышей сдерживает попытки составить полный инвентарь и идентифицировать ключевые регуляторы. Поскольку созревшие яйцеклетки транскрипционно неактивны, информация о профиле трансляции [16] и детальное исследование протеома яйца [17] крайне важно. Дальнейшая идентификация внутри- и внеклеточных материнских факторов, и их функций сильно облегчит наше понимание, как улучшить репрограммирование хроматина 18-20. Накопление доказательств, также документов активности в цитоплазме [21] и потенциального общения между ядром и цитоплазмой (особенно в субкортексе) еще более расширяет пределы функционального репрограммирования.

Re-establishment of paternal chromatin

Повторная упаковка мужского генома во время сперматогенеза стирает большинство, но не все метки хроматина. После оплодотворения ядро спермия подвергается деконденсации и повторной конденсации. В это время протамины замещаются хранимыми материнскими гистонами и формируются нуклеосомы из унаследованных отцовских и вновь отложенных материнских гистонов.

Sperm epigenome for intergenerational inheritance

Во время сперматогенеза соматические гистоны гиперацетилируются для удаления и замещения с помощью transition nuclear proteins (кодируемых Tnp1, Tnp2). Они в свою очередь замещаются протаминами (кодируемыми Prm1, Prm2), которые являются ядерными белками, обогащенными аргинином и дисульфидными мостиками, которые конденсируют мужской гаплоидный геном. Во время этого перехода от гистонов к протаминам немногие регионы генома самцов (~ 1% у мыши и 10% у человека) избегают удаления гистонов и сохраняют нуклеосомную структуру.

Низкая эффективность SCNT [21] и аберрантный геном у клонируемых эмбрионов [22] иллюстрируют важность предварительно организованного эпигенома спермия для корректного репрограммирования с помощью материнских факторов. Профилирование ДНК метилома и ChIP-seq анализ спермиев у мыши и человека выявили сохранение гистоновых вариантов и эпигенетической памяти, связанных с модификациями ДНК и гистонов 23-28 (Figure 2A). Поскольку различия, наблюдаемые между мышью и человеком значительные, но не предопределяющими, взаимоотношения между онтогенетическими регуляторами у ранних эмбрионов подтверждают отцовскую трансмиссию эпигенетической информации эмбрионам стадии дробления. Более изощренные экспериментальные подходы необходимы, чтобы выявить степень, с которой эпигенетические маркеры в гаметах наследуются ранними эмбрионами, чтобы детерминировать их молекулярные механизмы и их значение для развития.

Figure 2. Male genome reorganization during protamine-to-histone exchange. (A) Structural changes of male chromatin before and after fertilization. The male genome in sperm is densely packaged by protamines with a few regions retaining histones (including canonical histones and histone variants). After the protamine-to-histone exchange, protamines are replaced by maternal histones. The retained paternal histones may help determine gene expression in the early embryo. (B) During reorganization, the male genome experiences decondensation, recondensation, and re-decondensation, with protamine-to-histone exchange possibly collectively mediated by nucleoplasmin (NPM) family proteins, including NPM1, NPM2, and NPM3. Abbreviation: PTM, post-translational modification.

Protamine-to-histone exchange

После оплодотворения геном спермия деконденсируется, чтобы удалить протамины и повторно упаковаться сохранившимися материнскими гистонами в отсутствие репликации ДНК. Это одно из наиболее драматических событий ремоделирования хроматина во время развития. Получение непрерывных time lapse изображений показало, что после быстрой деконденсации асимметричной формы гомогенно деконденсированный отцовский хроматин повторно конденсируется в симметричную яйцевидную структуру, что сопровождается быстрым набуханием этой сферической структуры в пронуклеус и немедленным импортом ядерных факторов [29] (Figure 2B). Эти драматические морфологические изменения отцовского хроматина, от возобновления мейоза до образования пронуклеуса, происходят спустя 2 ч у мыши в отсутствие ядерных структур. Следовательно, материнское окружение предоставляет возможность цитоплазматическим и ядерным факторам сотрудничать в инициальном репрограммировании родительских геномов, чтобы сформировать пронуклеусы.

Чтобы изучить этот процесс ремоделирования хроматина, бесклеточные системы с использованием яйцевых экстрактов были разработаны для разных видов. NPM2 был впервые идентифицирован у лягушек в качестве шаперона, необходимого и достаточного для удаления со спермиев ядерных базовых белков (промежуточных образований между протаминами и гистонами), и добавления гистонов, чтобы сформировать стержневые нуклеосомы 30 and 31. У мыши Npm2 ортолог устранялся генетически без нарушения деконденсации ядра спермия во время эмбрионального развития [9]. Это подтверждает, что др. nucleoplasmins (NPM1 и NPM3) компенсируют потерю NPM2, это подтверждено исследованиями in vitro, показавшими кооперацию NPM1, NPM2 и NPM3 для разборки и сборки хроматина [32] (Figure 2B). Сравнительный анализ замены гистонов на протамины в сперматогенезе д. предоставить дальнейшую информацию о молекулярном механизме замены протаминов на гистоны, т.к. эти два процесса ремоделирования могут обладать сходными механизмами, включая деградацию белков [33], временную инкорпорацию белков и замещение гистоновыми вариантами [34].

Chromatin reprogramming towards totipotency

Два раздельных пронуклеуса, обладающие асимметричными эпигенетическими модификациями, приближаются др. к др. вовремя сингамии и образуют 1C диплоидную зиготу, которая затем делится [35]. Во время эмбриогенеза на ст. дробления, происходят поразительные изменения в эпигенетических модификациях (отложении гистоновых вариантов, повторном восстановлении гистоновых меток и деметилировании ДНК) по всему геному.

Histone variant dynamics

Канонические гистоны (H2A, H2B, H3, H4) экспрессируются преимущественно в S фазе и инкорпорируются в хроматин связанным с репликацией способом. Кроме того, варианты гистонов, обладающие гомологией последовательностей и структурным сходством с каноническими гистонами, но обладающие специализированными функциями (Figure 3A). Эти варианты экспрессируются и инкорпорируются в хроматин в ходе всего клеточного цикла и преимущественно замещают канонические гистоны в специфических геномных регионах, чтобы сформировать нуклеосомы с уникальными биофизическими характеристиками. Гистоновые варианты играют важную роль в репрограммировании хроматина 20, 36, 37 and 38 и участвуют в раннем эмбриогенезе (Figure 3B) помимо др. онтогенетических процессов.

Figure 3. Histone variants during preimplantation development. (A) Schematic representation of nucleosome structure and histone variants. (B) Changes in histone variant deposition during preimplantation development. Notably, there are significant contributions of H2A.X and H3.3 to totipotent 1C and 2C chromatin, which links the presence of these histones to totipotency. Abbreviation: CENP-A, centromeric histone 3.

Помимо двух канонических изоформ (H3.1 and H3.2), гистон H3 имеет три варианта у млекопитающих: H3.3, центромерный CENP-A и тканеспецифический H3.4. Наиболее изученный вариант H3.3, который инкорпорируется в хроматин как независимым от репликации, так и связанным с репликацией способом. H3.3 отличается от канонического H3 только четырьмя аминокислотами которые важны для взаимодействия с шаперонами HIRA и Daxx/ATRX. Ранняя иммунофлуоресценция и ChIP-seq метод задокументировали обогащение H3.3 в транскрипционно активных регионах, где многие регуляторные элементы зависят от его шаперона HIRA 39 and 40. H3.3 также обнаруживается на теломерах, где ого присутствие зависит от ATRX [40]. После оплодотворения у мыши, HIRA откладывает материнский H3.3 на отцовский хроматин вовремя замены протаминов на гистоны 41-43, чтобы создать новые отцовские нуклеосомы [44] и активировать гены плюрипотентности [45]. H3.3 временно удаляется с материнского хроматина во время этой стадии, указывая на стирание материнской эпигенетической памяти [42]. H3.3 оккупирует как эухроматин (не конденсированный), так и гетерохроматин (конденсированный) вплоть до ст. 4-х клеток, после которой его распределение ограничивается эухроматином [42]. H3.3 необходим для становления, зависимого от двунитчатой РНК (dsRNA) перицентромерного гетерохроматина у ранних эмбрионов, активность, зависимая от H3.3 лизина 27 [46]. Кроме того, H3.3 поддерживает деконденсированное состояние хроматина у ранних мышиных эмбрионов с помощью противодействующего линкера H1, активность, зависимая от H3.3 лизина 36 [47].

Гистон H2A наиболее отличающиеся варианты среди основных гистонов у млекопитающих. Так, H2A варианты включают H2A.X, H2A.Z и macroH2A. H2A.X многочислен в хроматине на стадиях дробления, а его С-терминальные аминокислоты детерминируют его специфическую ассоциацию с хроматином ранних эмбрионов [48]. H2A.Z необходим для плюрипотентности [49], а macroH2A ингибирует эпигенетическое репрограммирование к плюрипотентности [50]. H2A.Z и macroH2A экспрессируются на высоком уровне в хроматине зрелых яиц и позднее замалчиваются после оплодотворения [48], указывая тем самым, что H2A.X является основным вариантом H2A у тотипотентных ранних эмбрионов.

Чтобы расшифровать эффект гистоновых вариантов на тотипотентность необходимы дополнительные исследования: (i) взаимоотношений между сохраняемыми спермиями гистоновыми вариантами и вновь откладываемыми гистонами на отцовский хроматин после оплодотворения; (ii) профилей связывания индивидуальных вариантов гистонов у ранних эмбрионов; и (iii) присутствие и возможную функцию гомотипических и гетеротипических нуклеосом, содержащих один или более гистоновых вариантов у ранних эмбрионов 51 and 52.

Asymmetric histone modifications

Получение изображений в реальном времени предоставляет динамическую картину гистоновых модификаций во время раннего развития 53 and 54. После удаления протаминов созревающий отцовский геном упаковывается по-новому за счет вновь синтезированных и ацетилированных материнских гистонов. Напротив, материнский хроматин сохраняет свой паттерн метилирования гистонов в течение всех ранних стадий дробления, приводя к эпигенетической асимметрии между отцовским и материнским геномом (Figure 4A). Эта асимметрия коррелирует с асимметричной транскрипционной активностью и может объяснить разные способности к репрограммированию двух пронуклеусов [55].

Figure 4. Epigenetic changes during the maternal-to-embryonic transition. (A) Summary of histone and DNA modification dynamics. Acetylated histones are deposited on the male genome after fertilization and re-establish histone methylation patterns that correlate with reduced DNA methylation. Density of color reflects extent of modification. (B) Epigenetic asymmetry among blastomeres is detected as early as four-cell (4C) embryos and this polarity predicts the contributions of the individual blastomere to the inner cell mass (ICM) or trophectoderm layer (TE). (C) TET enzymes, specifically TET3, mediates active DNA demethylation during maternal-to-embryonic transition by converting 5mC to 5hmC, but can be protected from demethylation by H3 lysine 9 di-methylation (H3K9me2)-recruited Dppa3.

На ст. дробления эмбриогенеза мыши эпигенетическая скорее, чем транскриптомная асимметрия связана с выбором клетками судеб и может быть обнаружена самое раннее на ст. 4C [56]. Используя активность аргинин метилтрансферазы, определяли глобальные паттерны асимметричного метилирования аргинина в H3 у 4C эмбрионов мыши [57] (Figure 4B). Бластомеры с высокими и низкими паттернами метилирования преимущественно возникали в ICM и TE, соотв. Сходная молекулярная асимметрия наблюдалась для сайтов связывания POU5F1 (Oct4) по мере перехода эмбрионов от ст. 4C к 8C и отражала разную доступность POU5F1 геному [58] (Figure 4B). Несмотря на это остается неясным, как первоначально устанавливается полярность эмбрионов и нет доказательств асимметричного распределения материнской РНК или белка в оплодотворенном яйце. Следовательно, др. механизмы, включая межклеточные контакты [59] и восприятие клетками своего положения [60] могут играть регуляторные роли в этом процессе. Понимание механизмов, лежащих в основе раннего становления клеточной полярности может предоставить информацию о стратегии развития с ингибированием дифференцировки и поддержанием тотипотентности во время клеточных делений.

Несмотря на прогресс в установлении важной роли гистоновых модификаций на стадиях дробления эмбриогенеза, экспериментальные подходы сложны из-за перекрывания гистоновых генов, негистоновых мишеней для модифицирующих гистоны энзимов и неясности механизмов доминантно негативных гистоновых мутантов.

Active DNA demethylation activity

Недавние исследования активного деметилирования показали важность эксцизии и репарации нуклеотидов. Одним из важных путей является зависимый от предыдущей модификации метилированный цитозин. Белки ten eleven translocation (TET) превращают 5-methylcytosine (5mC) в 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) [61] и далее в 5-formylcytosine (5fC) и 5-carboxymethylcytosine (5caC) для вырезания 62 and 63. 5hmC может быть распознан с помощью эпигенетических регуляторов для регуляции генов, это указывает на его роль помимо деметилирования промежуточных образований [64].

Отцовский геном, высоко метилированный во время сперматогенеза, активно деметилируется, начиная с ранних 1C эмбрионов 65 and 66. Гистоновая модификация, H3 lysine 9 ди-метилирование, специфически увеличивается в материнском хроматине и рекрутирует материнский фактор Dppa3/PGC7/Stella [67] (Figure 4C). Давно пытаются понять защиту материнской ДНК и импринтируемых локусов от деметилирования, недавние данные по последовательностям подтвердили активное деметилирование как материнской, так и отцовской ДНК 68 and 69. Высокие уровни 5hmC на отцовском геноме обнаруживаются в 1C зиготе 70 and 71, которая также испытывает зависимую от репликации потерю [72]и среди белков семейства TET только TET3 экспрессируется в этот момент. В отсутствие TET3, отцовский геном остается высоко метилированным у ранних эмбрионов и сильно снижается плодовитость [73], это указывает на жизненно важную роль деметилирования отцовской ДНК для репрограммирования хроматина. Cullin-ring finger ligase-4 (CRL4) ubiquitin лигаза, как недавно было установлено, индуцирует активность TET3 и играет существенную роль в плодовитости самок [74], подкрепляя еще больше важность активного деметилирования ДНК. Приведенные выше наблюдения недавно были расширены за счет картирования метилирования ДНК по всему геному у мышей 68, 69 and 75 и человека 76 and 77 перед имплантацией, они выявили специфические паттерны метилирования повторяющихся элементов и differentially methylated regions (DMRs) [75]. Получение изображений в реальном времени динамики метилирования ДНК у живых эмбрионов облегчит идентификацию дополнительных эпигенетических регуляторов ранних эмбрионов мыши [78].

Higher-order chromatin structure

Ещё большую сложность внесли в исследования геномного репрограммирования архитектура и локализация хроматина высокого порядка в ядре как детерминантов эпигенетической модификации и регуляции транскрипции. Напр., когда ранние мышиные эмбрионы экспрессируют белок ядерной оболочки, слитый с основной распознающей сателлитной последовательностью белка цинковые пальчики, то перицентрический хроматин оказывается прикреплен к периферии ядра, а образование гетерохроматина и развитие нарушаются [79]. Сходная стратегия была использована, чтобы связать взаимодействия энхансер-промотор с изменениями экспрессии эндогенных генов в эритроидных клетках [80]. Следовательно, было бы важно охарактеризовать динамику изменений архитектуры хроматина высшего порядка у ранних эмбрионов мыши и определить её взаимоотношение с транскрипционной активностью и ядерной локализацией.

Итак, хотя динамика изменений эпигенетического статуса вовремя репрограммированная к тотипотентности активно исследовалась, только исследования всего генома описали метилом ДНК 68, 69, 75-77. Небольшие количества материала, доступные из эмбрионов не только затрудняют сканирование расположения вариантов гистонов по геному и гистоновые модификации, но и накладывают ограничения на биохимический анализ гистоновых шаперонов и энзимов, модифицирующих гистоны. Напр., H3.3 намного превосходит H3 изоформу в упаковке мужского генома на ранней ст. зиготы, но концентрируется ли связывание H3.3 с определенными локусами с помощью специфических шаперовнов, неизвестно. Кроме того, неясно, действительно ли индивидуальные варианты гистонов являются маркированными с помощью модификаций, наделяющих вариант-специфическими функциями, это, по-видимому, верно для триметилирования H3.3 лизина 36 [81]. Следовательно, необходима новая стратегия для детальных исследований эпигеномных изменений во время перехода от окончательно дифференцированных гаплоидных зародышевых клеток к ранним эмбрионам, чтобы лучше понять эпигенетическое репрограммирование, необходимое для тотипотентности.

Embryonic genome activation and totipotency

После оплодотворения материнские факторы репрограммируют родительские геномы, чтобы восстановить тотипотентность ранних эмбрионов и гарантировать активацию эмбриональных генов. EGA впервые обнаруживается у мышей на поздней ст. 1C, при этом более высокая активность в пронуклеусе самца, чем самок и становится наиболее сильной на ст. 2C.Напр., перицентрические сателлиты, которые существенны для, формирования хромоцентра у ранних эмбрионов, активируются с родительской асимметрией в 1C зиготах и драматически усиливают свою активность на ст. 2C [82]. Блокирование EGA с помощью α -amanitin, ингибитора элонгации РНК полимеразы II, приводит к аресту развития эмбриона на ст. 2C, это коррелирует EGA со становлением тотипотентности (Figure 5A). Недавнее исследование описало временные популяции ESCs/iPSCs с транскриптомом, сильно напоминающим таковой, наблюдаемый в тотипотентных бластомерах 2C эмбрионов [3] (Figure 5B). Т.о., тотипотентность случайно может быть восстановлена в плюрипотентных клетках и может возникать в результате флюктуации экспрессии регуляторов плюрипотентности, которые преодолевают геномные эпигенетические барьеры и ведут к тотипотентности. EGA характеризуется более эффективным использованием промоторов без последовательности TATA [83], активацией повторяющихся элементов (особенно ретротранспозонов, замалчиваемых в большинстве типов клеток) [84], разобщенной транскрипцией и трансляцией в 1C зиготах [85] и активацией энхансеров транскрипции у 2C эмбрионов [86].

Figure 5. Embryonic genome activation as a hallmark of totipotency. (A) Preimplantation development is blocked at the two-cell (2C) stage by treatment with ?-amanitin that inhibits transcription elongation. (B) A transient subpopulation of mouse embryonic stem cells has been identified as totipotent with 2C-like transcriptome, which correlates embryonic genome activation with totipotency. (C)Transcriptome profiling documents distinct patterns of maternal transcript degradation and waves of transcription activations during preimplantation development. (D) Retrotransposons are activated during the preimplantation stage and provide alternative first exons to activate downstream embryonic genes, producing chimeric transcripts that are absent in other cell types. Abbreviation: FACS, fluorescence-activated cell sorting.

Крайне крупная шкала и профилирование транскриптома одиночной клетки одновременно с nano-CAGE анализом, выявили волны транскрипции de novo у предимплантационных эмбрионов мыши и человека, которые запускались путем активации моделей экспрессии функциональных генов в виде стадио-специфических паттернов 87-89 (Figure 5C). В частности, анализ одиночных клеток, использующий отлавливание экспрессии транскрипционных факторов и эпигенетических модификаторов вовремя предимплантационного развития, выявил сложную транскрипционную сеть и паттерн асимметричной экспрессии среди индивидуальных клеток 90 and 91. Несмотря на достигнутый прогресс, трудно идентифицировать самые ранние de novo транскрипты из-за крупного остаточного материнского пула РНК в ранних эмбрионах мыши. Один подход связан с ингибированием транскрипции с помощью α-amanitin и сравнением транскриптома обработанных и необработанных эмбрионов 92 and 93, хотя выводы данного исследования могут быть осложнены возможными эффектами, индуцируемыми лекарствами, на последующее развитие.

Ретротранспозоны и транскрипционные факторы семейства Zscan4 являются хорошо известными EGA генами. Экспрессия ретротранспозонов вносит существенный вклад в транскриптом ранних эмбрионов мыши. По крайней мере, одна функция - это действие их в качестве альтернативных промоторов для активации белок-кодирующих генов путем генерации химерных транскриптов результат соединения ретротранспозон-ген [84] (Figure 5D). Наиболее активный LINE-1 ретротранспозон создает стимулирующую само-усиливающую петлю, демонстрируя, что транскрипты материнского ретротранспозона в геноме мощно активируют ретротранспозоны генома после оплодотворения [89]. Эти ретротранспозоном активируемые EGA гены могут быть реактивированы в плюрипотентных ESCs в отсутствии lysine-специфической деметилазы LSD1, показывая, что гистон-модифицирующие энзимы замалчивают EGA гены во время перехода от тотипотентности к плюрипотнтности [94]. Экспрессия гена Zscan4 семейства ограничена по времени и в пространстве и важна для раннего развития мыши, при этом один член, Zscan4d, идентифицирован как ген, специфичный для 2C. Это семейство генов играет важную роль в стабильности генома и поддержании теломер [95]. Zscan4 реактивирует также ранние эмбриональные гены во время генерации iPSCs, на это указывает иерархия активируемых эмбриональных генов [96].

Concluding remarks

Recent investigations document that the totipotency of early embryos is specified by unique epigenetic status including histone variants, histone modifications, and patterns of DNA methylation. These structural features of chromatin may facilitate access of reprogramming factors/cofactors to specific genomic regions and promote formation of higher-order chromatin structure necessary to activate or repress the genes needed for totipotency. Detailed understanding of this reprogramming process should provide insight into fundamental mechanisms that may translate into improved reprogramming of differentiated adult cells for therapeutic use in regenerative medicine. The field is still in its infancy and there is much to be learned about interacting genetic and epigenetic hierarchies, transcriptome dynamics and the role of maternal and embryonic regulators (Box 1). Further detailed molecular analyses and screening will necessitate technological advances to improve micromanipulation of early mouse embryos and overcome the lack of available biological materials. The use of nanofluidics [97] and rapid progress in micro-technologies hold promise for genome-sequencing [98], methylome analyses [99], allele specific histone modification assays[100], chromosome conformation mapping [101], and nucleosome mapping [102] of individual embryonic cells. By focusing these technologies on the physiological reprogramming that occurs in the transition from terminally differentiated gametes to the totipotency of the early embryo, greater insight is anticipated in establishing protocols for converting somatic cells to totipotency for use in regenerative medicine and control of degenerative diseases that afflict patients worldwide.

Reprogramming the genome to totipotency in mouse embryos Li-quan Zhou, Jurrien Dean Trends in Cell Biol. Volume 25, Issue 2, February 2015, Pages 82–91

Reprogramming the genome to totipotency in mouse embryos
Li-quan Zhou, Jurrien Dean
Trends in Cell Biol. Volume 25, Issue 2, February 2015, Pages 82–91