Длинные кости, ребра, позвонки и др. части скелета позвоночных формируются посредством точно синхронизированного процесса, известного как эндохондральная оссификация. Очень сложная эндохондральная костная ткань, генерируемая из промежуточного хряща, состоит из многих типов клеток, включая происходящие из мезенхимы хондроциты, остеобласты и остеоциты, а также остеокласты и клетки костного мозга, источник гематопоэза [1].
Эндохондральная кость состоит из наружной компактной кости (кортекса) и внутренней губкообразной костной ткани с полостями для костного мозга. Превращению не снабжаемой кровью хрящевой матрицы в полностью минерализованную эндохондральную кость предшествуют отличающиеся и тесно связанные ступени [2]. Первая ступень инициируется, когда хондроциты в центре хрящевой модели подвергаются гипертрофической дифференцировке и клетки в надхрящнице, окружающие гипертрофическую зону, дифференцируются в остеобласты, чтобы сформировать промежуточный костный кортекс (костную манжетку). Параллельно происходит инициальная инвазия сосудов в тот же самый регион, импортирующий ассоциированные с кровеносными сосудами перициты, остеокласты и клетки предшественники, циркулирующие в крови. Непосредственно с началом формирования костной манжетки, гипертрофические хондроциты, и минерализованный хрящевой матрикс в центре хрящевой матрицы замещаются на высоко васкуляризированную трабекулярную костную ткань, а также костный мозг. Костные трабекулы первичной spongiosa образуются за счет отложения остеоида остеобластами на поверхности кальцифицированных хрящевых spicules.
Вплоть до недавнего времени точное происхождение остеобластов, продуцирующих трабекулы, оставалось в основном неизвестным. Исследования по отслеживанию клонов с использованием индуцируемых tamoxifen CreER трансгенных мышей, обладающих ROSA26R условным аллелем, показали, что Osx-экспрессирующие незрелые предшественники остеобластов, меченные в надхрящнице перед развитием первичного центра оссификации, были способны мигрировать в хрящ вместе с кровеносными сосудами и были ответственны, по крайней мере, частично за образование трабекул [3], [4].
Помимо клеток надхрящницы, несколько др. клеточных источников были проверены в качестве потенциальных кандидатов на роль формирования первичной spongiosa (губчатой кости), включая перициты, ассоциированные с внедряющимися кровеносными сосудами, предшественники костного мозга и гипетрофические хондроциты [4].
Вовремя эндохондральной оссификации окончательно дифференцированные гипертрофические хондроциты в конечном итоге полностью удалялись из первоначальной хрящевой матрицы или ростовых пластинок. Некоторые из этих хондроцитов, как было установлено, элиминируются посредством апоптоза или аутофагии (тип II запрограммированной клеточной гибели) [5], [6], [7], [8]. Однако судьба гипертрофических хондроцитов, по-видимому, не ограничивается продолжающейся клеточной гибелью. Было показано, что гипертрофические хондроциты экспрессируют также маркеры остеобластов, такие как Alkaline Phosphatase (ALPL), Osteonectin (SPARC), Osteocalcin (BGLAP), Osteopontin (SPP1) and Bone sialoprotein (IBSP), обеспечивающих важные сложные функции этих клеток [5], [6]. В сомом деле, ряд исследований сообщали, что клеточные культуры, содержащие аскорбиновую кислоту или органные культуры гипертрофических хондроцитов, вместо того, чтобы вымирать, возобновляли клеточную пролиферацию и подвергались асимметричным клеточным делениям, наделяя клетки морфологическими и фенотипическими характеристиками остеобластов, способных продуцировать минерализованный костный матрикс in vitro [6], [7], [8], [9]. Кроме того, гистологические эксперименты подтвердили, что у эмбрионов кур хондроциты длинных костей дифференцируются в клетки, формирующие кость, и откладывают костный матрикс внутри своих лакун [10], подкрепляя мнение о непосредственной роли гипертрофических хондроцитов в формировании трабекулярной кости. Однако большинство доказательств, подтверждающих трансдифференцировку, базируются на гистологических наблюдениях во время развития скелета или исследования in vitro [11]. В целом было предположено, что эти исследования не вполне убедительны (3). Результаты ранних ex vivo экспериментов, которые модифицировали ткань эмбриональных конечностей мыши, согласуются с гипотетической трансдифференцировкой хондроцитов в остеобласты, но эти клетки далее не были охарактеризованы [12]. Однако заключения двух недавних клональных исследований не подтвердили вклада зрелых хондроцитов в пул остеобластов и остеоцитов в центральных метафизарных регионах ниже роста хряща [3], [13].
Зрелые остеобласты, развиваются из Runx2-экспрессирующих предшественников остеобластов, которые происходят из мезенхимных предшественников [14], [15]. Osterix (Osx, Sp7) ключевой транскрипционный фактор, необходим для полной дифференцировки Runx2-экспрессирующих предшественников остеобластов и остеоцитов [16]. Osx экспрессируются в остеобластах и остеоцитах, но также на низком уровне в прегипертрофических и гипертрофических хондроцитах и в мезенхимных клетках предшественниках костного мозга вовремя и после эмбрионального развития [17]. Инактивация Osx вовремя или после эмбрионального развития полностью останавливает дифференцировку остеобластов и формирование кости [16], [17].
Задачей данного исследования стала проверка, могут ли гипертрофированные хондроциты приобретать остеогенную судьбу in vivo. Мы специфически метили или гипертрофические хондроциты с помощью Cre recombinase, управляемой трансгеном Collagen 10 BAC (Col10a1-Cre) [18] или хондроциты индуцибельной Cre recombinase, ДНК которой вносилась с помощью knock-in в 3' UTR гена Aggrecan (Agc1-CreERT2) [19]. Мечение осуществляли или с помощью EGFP [20], LacZ [21] или экспрессии Tomato [22]. Экспрессия LacZ и Tomato осуществлялась с условного аллеля в локусе ROSA. ДНК EGFP был предпослан сайт LoxP, внедренный в 3' poly-A сайта Osx, тогда как в этот аллель был помещен др. LoxP сайт в первый интрон гена Osx [23]. У мышей, обладающих этим аллелем, высокий уровень экспрессии EGFP появлялся только в клетках, экспрессирующих Osx после того как рекомбинировал LoxP сайт (S1A Figure) [23]. Ни один из этих двух Cres не экспрессировался в надхрящнице или надкостнице эндохондральной кости [18], [19]. После рекомбинации ROSA26R репортер мыши экспрессировал β -galactosidase (LacZ), ROSA-Tomato репортер мыши экспрессировал цитоплазматический тандемный димер Tomato, а Osx floxed мыши экспрессировали цитоплазматический EGFP. Поскольку мечение зрелых хондроцитов у мышей, обладающих Col10a1-Cre, происходило постоянно, как только его экспрессия начиналась и сохранялась до тех пор, пока промотор Col10a1 оставался активным, Время мечения хондроцитов с помощью Agc1-CreERT2 контролировалось с помощью воздействия tamoxifen и этот период мечения сохранялся в течение короткого периода. Одним из преимуществ Osx/EGFP аллеля в экспериментах с клеточными судьбами оказывалось то, что если он обнаруживался в нехондрогенных клетках, экспрессирующих EGFP, то эти клетки д. быть, скорее всего, клетками остеобластного клона [16], [23].
Наши данные показали, что меченные нехондроцитные клетки появлялись в первичной spongiosa
Col10a1-Cre или активированных tamoxifen
Agc1-CreERT2 эмбрионов и мышей. В случае
Col10a1-Cre эмбрионов и в
Agc1-CreERT2 эмбрионах, обработанных tamoxifen раньше, чем E14.5, то эти нехондроцитные репортерные
+ клетки начинали появляться в начале первичной оссификации. Позднее они обнаруживались по всем центрам первичной оссификации и впоследствии в endosteum и внутри костного матрикса. Их появление можно было также индуцировать в первичной spongiosa постнатально. Многие из этих клеток экспрессировали маркер зрелых остеобластов Osteocalcin и обнаруживали специфичную для остеобластов активность промотора Col1a1. Скорее всего, у обработанных tamoxifen
Agc1-CreERT2 мышей происходящие из хондроцитов репортерные
+ нехондроцитные клетки присутствовали в наростах репарируемых переломах берцовой кости. Позднее эти репортерные
+ клетки ассоциировали с оссифицированным костным матриксом наростов (calluses), и также обнаруживали активность промтора
Col1a1. Наши результаты предоставили
in vivo доказательства, что хондроциты, как из хрящевого зачатка, так и из сформировавшейся ростовой пластинки, а также из хондроцитов наростов репарации, обладают способностью к трансдифференцировке в остеобласты и представляют собой основной источник остеобластов в эндохондральной кости.
Discussion
Мы попытались проследить судьбу хондроцитов при эндохондральной оссификации и протестировать гипотезу, что хондроциты способны к трансдифференцировке в функциональные остеобласты in vivo.
При изучении судьбы меченных хондроцитов у Col10a1-Cre -содержащих эмбрионов и обработанных tamoxifen Agc1-CreERT2 -содержащих эмбрионов, мы наблюдали, что помимо меченных хондроцитов и гипертрофических хондроцитов со ст. E15.5 присутствовали многочисленные меченные клетки с морфологией, различающейся от таковой гипертрофических хондроцитов в первичном центре оссификации, где ни Col10a1-Cre, ни Agc1-CreERT2 не экспрессируются. Позднее меченные клетки были обнаружены в матриксе костных трабекул и постнатально в endosteum и в кортикальной части кости. Репортерные+ выстилали endosteum постоянно с дистальной ростовой пластинки вниз по стволу бедренной кости. Область эндоста, покрытая репортерными+ клетками со временем постепенно увеличивалась, занимая примерно три четверти кости спустя 1 мес. после рождения. Хотя мы иногда наблюдали очень редкие репортерные+ клетки, их, однако слишком мало, чтобы объяснить обилие репортерных+ клеток в первичной spongiosa.
У Col10a1-Cre;reporter эмбрионов появление не хондроцитных меченных клеток в первичной spongiosa происходило одновременно с началом первичной оссификации. Однако, использование Agc1-CreERT2; reporter эмбрионов позволило нам проконтролировать время Cre рекомбинации в хондроцитах и последующее появление меченных клеток в центрах первичной оссификации за счет изменчивого по времени воздействия tamoxifen.
Эксперименты с пульсовым воздействием tamoxifen на Agc1-CreERT2; ROSA26R эмбрионов (Fig. 3, Figure S2B, Figure S2C and Table S1) четко показало, что мечение хондроцитов и появление не хондроцитных клеток в primary spongiosa - это два последовательных события и что последнее необходимо отличать от начала остеогенеза. Эти эксперименты предоставляли исчерпывающие доказательства, что меченные клетки в первичных центрах оссификации происходят из хондроцитов и что их присутствие не обусловлено гипотетической активностью Cre в возникающих остеобластах.
Находка, что меченные клетки, присутствующие в трабекулярных и эндостальных регионах Col10a1-Cre -содержащих мышей экспрессируют два маркера остеобластов, а именно Osteocalcin и специфичный для остеобластов управляемый промотором Col1a1 EGFP, строго подтверждают, что эти клетки являются функциональными остеобластами. В трабекулах бедренной кости мышей, содержащих Agc1-CreERT2 и обработанных тамоксифеном, присутствие происходящих из хондроцитов остеобластов также было подтверждено одновременной экспрессией tomato репортера и EGFP, управляемого остеобласт-специфическим промотором Col1a1. Наши результат далее выявили, что околоt 60 процентов остеобластов в бедренной кости 3- и 4-недельных мышей происходили из хондроцитов. Такие же количества были подсчитаны уn Col10a1-Cre; reporter мышей, хотя нельзя полностью исключить, что 60% это может быть завышенная цифра, т.к. не исключена возможность эктопической активности Col10a1-Cre промотора. Мечение хондроцитов после одиночной инъекции тамоксифена беременным самкам у эмбрионов AgcCreERT2 вряд ли является полным. У новорожденных Agc1-CreERT2; 2.3Col1-GFP; ROSA-tdTomato мышей, обработанных tamoxifen на ст. E14.5 (Fig. 6) и у the 3-недельных и 6-недельных мышей, обработанных tamoxifen на ст. 2-недель (Fig. 8), некоторые остеобласты (EGFP+ клетки) в primary spongiosa происходили из зрелых хондроцитов до инъекции тамоксифена. Эта популяция EGFP+ клеток, следовательно, не может быть мечена с помощью Agc1-CreERT2 и эти клетки должны быть поэтому негативны по Tomato. Следовательно, количество Tomato+ EGFP+ клеток не может отражать действительное количество остеобластов, произошедших из хондроцитов у таких мышей.
Наши данные показывают, что зрелые хондроциты в хрящевых зачатках до образования ростовой пластинки, трансдифференцируются и вносят вклад в пул остеобластов. Репортерные+ клетки, меченные с помощью Agc-CreERT2 примерно на ст. E14.5, перед образованием ростовой пластинки, персистируют в период роста после рождения, т.к. они всё ещё находятся на поверхности трабекул и endosteum, и внедряются в костный матрикс в течение 2-х недель и 1 мес. (Figs. 3B and 3C). После образования ростовых пластинок, зрелые хондроциты ростовой пластинки сохраняют свою способность становиться остеобластами как во время позднего эмбрионального развития, так и во время постнатального роста (Figure S2D, Figs. 7 and 8). Во время периода быстрого роста в течение 2 недель, Agc1-CreERT2 индуцирует множество не хондроцитных репортерных+ клеток в primary spongiosa в течение более короткого периода (Figs. 7 and 8), чем вовремя более позднего периода роста в 11 недель (Figure S4B). Эти результаты подтверждают тезис, что вклад хондроцитов ростовой пластинки в пул остеобластов возможно ассоциирован с активностью ростовой пластинки и что этот вклад может даже в конечном счете прекращаться в какое-то время после периода роста.
После периода роста Col10a1-Cre индуцированные репортерные+ клетки всё ещё присутствуют в метафизных и кортикальных регионах у 6-мес. мышей (Figure S1F). Однако, большинство из этих клеток внедрено в костный матрикс и немногие из них обнаруживаются на поверхности кости по сравнению с 2- и 3-недельными мышами (Fig. 1D and Fig. 5A), это подразумевает, что количество активных остеобластов, происходящих из хондроцитов, скорее всего, снижается после периода роста. На ст. 8-мес. практически полностью отсутствуют Col10a1-Cre индуцированные репортерные+ клетки в primary spongiosa и очень немногие находятся на поверхности кости. Кроме того, интенсивность флюоресценции Tomato+ клеток оказывается значительно слабее, чем у более молодых мышей (Figure S1G). Эти результаты подразумевают, что Col10a1-Cre индуцированные клетки у 8-мес. мышей, скорее всего, происходили их хондроцитов ростовой пластинки во время периода роста, далее это было подтверждено ассоциацией между появлением происходящих из хондроцитов остеобластов и активностью ростовой пластинки.
При переломе тибии Agc1-CreERT2 индуцированные Tomato+ клетки присутствуют специфически в суставном хряще, ростовой пластинке и репарационных наростах, когда tamoxifen инъецируется спустя 6-7 дней после хирургии, приблизительно во время дифференцировки хондроцитов в мозоли [25], [26]. Agc1-CreERT2 индуцированные Tomato+ клетки продолжает оставаться в мозоли (calluses) после 14 и 29 дней после хирургии, когда Agc1-CreERT2 более не активен, подтверждая, что эти Tomato+ клетки является или хондроцитами из мозоли, меченными во время инъекции тамоксифена, приблизительно на 7 день после пере6лома, или клетками, происходящими из этих меченных хондроцитов. Важно, что не обнаруживаются достоверные количества Tomato+ клеток, наблюдаемых в регионе между ростовой пластинкой и мозолью во время процесса репарации, указывая, что Tomato+ клетки, присутствующие в мозоли, вряд ли происходят из хондроцитов ростовой пластинки (Figs. 9 and 10). Tomato+EGFP+ клетки были обнаружены в частично оссифицированных мозолях на 14-й день после хирургии, а вид этих Tomato+EGFP+ клеток был по времени и пространственно ассоциирован с оссификацией мозоли. Эти данные подтверждают, что хондроциты в репарируемой мозоли безусловно являются источником остеобластов, ответственных за заживление поломанной кости.
Несколько лаб. попытались разрешить вопрос, способны ли хондроциты трансдифференцироваться в остеобласты. В наиболее ранних ex vivo экспериментах, в которых инвазия сосудов и эндохондриальная оссификация были ингибированы удалением надхрящницы, Col1a1 экспрессирующие клетки наблюдались в области между зачатками хряща [12]. Хотя эти клетки не были в дальнейшем охарактеризованы, было предположено, что они или гипертрофические хондроциты, арестованные на терминальной стадии дифференцировки, или клетки, подвергшиеся трансдифференцировке. Недостатком этого ex vivo эксперимента было отсутствие надхрящницы, которая могла быть важной для завершения трансдифференцировки хондроцитов. Мы рассматриваем настоящее исследование как продолжение предыдущего эксперимента.
Исследования in vivo на специфических клетках Col2a1-CreER; ROSA26R эмбрионов в месте соприкосновения хряща и надхрящницы, которые экспрессировали трансген Col2a1-CreER, как было установлено, дают некоторое количество похожих на остеобласты клеток главным образом в endosteal регионе [3]. В этом исследовании был сделан вывод, что гипертрофические хондроциты не вносят существенного вклада в пул остеобластов и остеоцитов в центральном метафизарном регионе под ростовой пластинкой в пределах трех дней, это может быть объяснено более коротким промежутком времени после воздействия тамоксифена. В др. исследовании in vivo использовали трансгенных мышей, имеющих Col10a1-mCherry и или a2.3kbCol1a1-Emerald трансген или 3.6kbCol1a1-Topaz специфичный для остеобластов трансген. MCherry флюоресценция обнаруживалась в primary spongiosa, но не мРНК mCherry. Хотя большая часть флюоресценции mCherry была приписана распадающимся гипертрофическим хондроцитам, некоторая часть присутствовала в живых клетках, которые не экспрессировали трансгены emerald или topaze. Было предположено, что эти клетки могут быть редкой популяцией гипертрофических хондроцитов, обнаруживающих фенотип, отличающийся от или предшествующей фенотипу дифференцированных остеобластов. Однако исследование пришло к выводу, что трансдифференцировка вряд ли участвует в возникновении этого фенотипа. [13]. Здесь также временное запаздывание между мечением хондроцитов и их появлении в качестве клеток, экспрессирующих маркеры остеобластов, как и в нашей работе, может объяснить кажущееся расхождение между исследованиями.
Вовремя эндохондрального образования кости клетки клона остеобластов впервые выделяются из мезенхимных клеток предшественников, экспрессирующих Sox9, в процессе, использующем каноническую передачу сигналов Wnt/β -catenin, также как экспрессию Runx2 и Osx, а замалчивание экспрессии Sox9 и активности Sox9, чтобы сформировать надхрящницу и надкостницу [16], [27], [28], [29], [30]. Эти предшественники остеобластов дифференцируются далее в остеобласты, чтобы сформировать инициальный кортекс кости. Они также проникают в зачаток хряща вместе с остеокластами и кровеносными сосудами, чтобы дифференцироваться в зрелые остеобласты, формирующие костные трабекулы [3]. Параллельно с выделением клеток клона остеобластов, сегрегируют хондрогенные клетки из тех же самых предшественников и постепенно дифференцируются в хондроциты, экспрессирующие высокие уровни Sox9, чтобы сформировать инициальных хрящевой зачаток [31]. Последней ступенью в этом хондрогенном пути является образование гипертрофических хондроцитов, в которых более не экспрессируется Sox9. Наши данные предоставили доказательства, что гипертрофических хондроциты как до, так и после образования ростовой пластинки являются основным вторичным источником остеобластов, участвующих в образовании трабекулярной и кортикальной (Fig. 11). Это свойство таких хондроцитов быть непосредственным источником остеобластов сохраняется вплоть до 3 мес. возраста То же самое свойство хондроцитов давать остеобласты является очень активным при заживлении переломов кости.
Figure 11. Proposed model illustrating the sources of osteoblasts in endochondral bone.
doi:10.1371/journal.pgen.1004820.g011
Недавние успехи позволили пересмотреть устоявшееся мнение дифференцировки клеток млекопитающих в терминах их пластичности [32]. Как и в случаях др. примеров трансдифференцировки [33] возможно, что гипертрофические хондроциты могут сначала дедифференцироваться, затем пролиферировать, пока эти клетки повторно не дифференцируются в остеобласты. Наши предварительные неопубликованные эксперименты выявили существование клеток в костном мозге, которые происходят из Col10a1 -экспрессирующих хондроцитов. Эти клетки обладают свойствами клеток мезенхимных предшественников и способны дифференцироваться в остеобласты, хондроциты и адипоциты in vitro, хотя мы не знаем, обладают ли эти клетки способностью становиться остеобластами in vivo. Этот предварительный результат подтверждает возможность, что трансдифференцировка "гипертрофических хондроцитов в остеобласты" может на самом деле использовать дедифференцировку и затем процесс повторной дифференцировки. Мы заметили, что у молодых мышей происходящие их хондроцитов репортерные+ клетки, которые не обнаруживают маркеров остеобластов, персистируют в primary spongiosa в течение значительного периода времени, прежде чем стать функциональными остеобластами (Figs. 8A and 8B). Мы полагаем, что эти две гипотетические ступени могут независимо регулироваться разными сигнальными путями.
Итак, наши мышиные модели предоставили доказательства, что хондроциты из зачатка хряща и ростовой пластинки являются непосредственными предшественниками остеобластов, ответственных за образование эндохондральной кости во время развития и постнатального роста. Сходным образом, хондроциты в репаративной мозоли подвергаются трансдифференцировке, чтобы стать остеобластами, вносящими вклад в оссификацию мозоли при заживлении перелома. Мы полагаем, что остеобласты, происходящие из хондроцитов, могут также участвовать в др. процессах эндохондральной оссификации, таких как образование osteophyte при остеоартритах [34] и гетеротопическая оссификация при нарушении fibrodysplasia ossificans progressiva [35], [36].
Во время подготовки к печати данной статьи, опубликовано исследование [37], пришедшее к сходному заключению, что и в данной статье.