Посещений:
ТРАНСПОРТ ОРГАНЕЛЛ

Роль каркасных белков

Integrated regulation of motor-driven organelle transport by scaffolding proteins
Meng-meng Fu, Erika L.F. Holzbaur
Trends in Cell Biol. Volume 24, Issue 10, October 2014, Pages 564–574

Intracellular trafficking pathways, including endocytosis, autophagy, and secretion, rely on directed organelle transport driven by the opposing microtubule motor proteins kinesin and dynein. Precise spatial and temporal targeting of vesicles and organelles requires the integrated regulation of these opposing motors, which are often bound simultaneously to the same cargo. Recent progress demonstrates that organelle-associated scaffolding proteins, including Milton/TRAKs (trafficking kinesin-binding protein), JIP1, JIP3 (JNK-interacting proteins), huntingtin, and Hook1, interact with molecular motors to coordinate activity and sustain unidirectional transport. Scaffolding proteins also bind to upstream regulatory proteins, including kinases and GTPases, to modulate transport in the cell. This integration of regulatory control with motor activity allows for cargo-specific changes in the transport or targeting of organelles in response to cues from the complex cellular environment.


Microtubule-based transport in the cell


Пространственная сложность клеток эукариот базируется на точной регуляции внутриклеточного переноса. Транспорт органелл на длинные расстояния зависит от микротрубочкек, которые служат как поляризованные треки для перемещений внутри клетки. Доставка разнообразных грузов вдоль микротрубочкек поддерживает многие важные клеточные функции, такие как секреция белков, рост и передача сигналов о повреждениях, деградация белков и органелл, активносе распределение митохондрий и переност гранул РНК. Более того, клетки в точности регулируют транспорт органелл путем координации двигательной активности в соответствии с клеточными потребностями и в ответ на изменеия клеточного окружения.
Микротрубочки организованы в поляризованные массивы с динамичными плюс-концами, ориентированными в направлении периферии клетки и более стабильными минус концами, образующих кластеры в направлении центра большинства типов клеток. Антероградный транспорт или перемещения в направлении плюс концов, управляется членами крупного сверхсемейства кинезинов, включающего kinesin-1, kinesin-2 и kinesin-3; ретроградный транспорт или перемещение в направлении минус концов, управляется цитоплазматическим динеином (dynein), действующим совместно с аго активатором dynactin. Бмофизические свойства этих моторов, такие как скорость, длина пробега и сила торможения, были изучены детально на уровне одиночных молекул [1]. Однако менее известно о том, как эти моторые регулируются, когда связаны с грузом, чтобы управлять подвижностью, специфичной для органелл.
Недавний прогресс относительно роли адапторных или каркасных белков представил новую информацию о координации моторов на уровне клетки. Каркасные белки могут эффективно регулировать активности моторов, ассоциированных с органеллами, чтобы контролировать направленность. Каркасные белки также соединяются с вышестоящими регуляторными элементами, включая киназы, фосфатазы, Ca2+-сигнальные белки и G белки. Это делает возможной интеграцию разнообразных сигналов, чтобы вызывать специфичные для органелл реакции на локальные клеточные условия. Мы сконцентрируемся на регуляции ассоциированых с органеллами моторов с помощью каркасных и адапторных белков, включая Milton/TRAK, Miro (mitochondrial Rho GTPase), RILP (Rab7-interacting lysosomal protein), huntingtin, La, JIP1-4 и Hook.

Models for motor regulation during intracellular transport


Простейшая модель, описывающая специфичную для груза регуляцию подвижности органелл, описывает использование избирательного рекрутирования или ктнезиновых или динеиновых моторов ( Figure 1A). Если кинезин рекрутируется, то органеллы перемещаются в направлении плюс конца микротрубочки. Однако , если связанные кинезины диссоциируют и рекрутируется динеин, то груз будет перемещаться в направлении минус конца микротрубочки. Эта модель предсказывает обеспечение однонаправленного, чрезвычайно поступательного движения.



Figure 1. Three current models for the regulation of microtubule motors bound to vesicular and organelle cargo. (A) In the selective recruitment model, only one type of motor, either kinesin (KHC) or dynein-dynactin, is bound to cargo at a time. If kinesin is bound, the cargo will move unidirectionally in the anterograde direction toward the plus-end of the microtubule. If dynein-dynactin is bound, the cargo will move unidirectionally in the retrograde direction, toward the microtubule minus-end. (B) In thetug-of-war model, both kinesin and dynein-dynactin motors are bound to the cargo simultaneously. The cargo will move bidirectionally along the microtubule, depending on stochastic variations in the dominant motor type. Note that, for simplification, this figure only illustrates one dynein-dynactin complex per vesicle, but likely 6-8 dynein-dynactin complexes are on each vesicle to reach force balance with one kinesin. (C) In the coordination model, kinesin and dynein are bound to the cargo simultaneously, but the activities of these motors are governed by a scaffolding protein that coordinates the engagement of dynein-dynactin with the autoinhibition of kinesin. (Inset) Generalized model for the integration of upstream signaling with downstream motility by scaffolding proteins. Scaffolding proteins interact with vesicle/organelle linker proteins, upstream signaling proteins, and molecular motors, forming an integrated regulatory unit. Although scaffolding proteins may also mediate the association of motors with the vesicle or organelle, this is not always the case. KHC, kinesin heavy chain; MT, microtubule.

В противположность этой простой модели растут доказательства из исследований in vitro и in vivo и клеточные исследования подтверждают, что протовоположные кинезиновые и динеиновые моторы часто связаны одновременно с перемещаемым грузом 2-7. Предложены две модели для описания взаимодействий противоположных кинезиновых и динеиновых моторов, связанны с одним и тем же грузом и обеспечивающими конечный паттерн перемещения.
Многие органеллы в клетках обнаруживают двунаправленную подвижность, характеризующуюся короткими возвратами в направлении или плюс или минус концов микротрубочек, акцентируя частые переключения направления. Механизм перетягивания каната был предпложен для объяснения этих наблюдений. В этом сценарии направление транспорта определяется с помощью группы моторов направленным или к плюс концу или минус концу, которые создают большие усилия в любой данный момент времени ( Figure 1B). Зависимое от силы отсоединение противоположных моторов от микротрубочек предупреждает непродуктивные остановки. Стохастическое устранение моторов с трека ведет к альтерациям доминирующего типа мотора со временем, приводя к переключению направления [8].
Экспериментальные работы в нескольких системах подтвердили эту модель. Напр., поздние эндосомы и лизосомы, перемещающиеся вдоль нейрональных аксонов обнаруживают двунаправленную подвижность, характеризующуюся короткой длиной пробега или в направлении или прочь от тела клетки, перемежаясь частыми изменениями в направлении. Количественный иммуноблотинг очищенных пузырьков показал, что каждая органелла связывает немногие (1-2) кинезиновые моторы и большую группу (6-12) динеиновых моторов [3]. Однако поскольку кинезины в целом обладают высокими unitary stall forces (~5-7 pN), тогда как цитоплазматический динеин млекопитающих обладает низкой unitary stall force (~1 pN) [1], эти противополжно направленные моторы присутствуют почти на балансе сил на каждой органелле. Возникающее в результате стохастическое перетягивание каната между этими довольно равными группами конкурирующих моторов, как полагают, вызывают частые переключения в направлении и низкую общуюю поступательность [3].
Третья модель постулирует, что противоположные моторы одновременно соединяются с грузом, но их подвижность тонко скоординирована регуляторными механизмами. В этой координационной модели и кинезиновые и динеиновые моторы остаются постоянно связанными с органеллой, но они не активны посмтоянно ( Figure 1C). Вместо этого активность моторов может специфически регулироваться с помощью пост-трансляционных модификаций или с помощью адапторных и каркасных белков. Эта модель может объяснить подвижность быстро перемещаемых поступательных грузов с немногими изменениями направления, таких как аутофагосом, перемещающихся вдоль нейрональных аксонов. Эти органеллы стабильно связывают и кинезиновые и динеиновые моторы, но подвергаются преимущественно однонаправленному транспорту в направлении тела клетки [4], показывая, что ассоциированные кинезиновые моторы эффективно подавляются во время динеином, обеспечиваемой подвижности [9].
Каковы преимущества одновременного поддержания стабильных ассоциаций с противоположными моторами? В случае нерегулируемой модели перетягивания каната единственная возможность заключается в том, что поскольку стохастические смены направления дают менее эффективное перемщение на длинные дистанции, то это свойство может быть важным для развития и/или поддержания стабильного распределения органелл вдолшь удлиняющихся клеточных отростков, таких как аксоны. В координационной модели органеллы распространяются вдоль клеточных откостков так, как в аксоне. В координационной модели противоположные моторы могут позволять быстрые изменения направления, вообще-то, чтобы избежать заграждений или заторов уличному движению 10 and 11. Др. основное преимущество одновременного соединения противоположных моторов это обеспечение быстрых реакций на изменения в локальной клеточное среде.
Поскольку груз-специфическая регуляция позволяет клеткам избирательно модулировать подвижность разных популяций органелл, дополнительные механизмы также вносят вклад в регуляцию трафика внутри клетки. Имеются строгие данные, указывающие на трек-специфическую регуляцию транспорта органелл посредством пост-трансляционных модификаций микротрубочек 12-15 или посредством связываания microtubule-associated proteins (MAPs), которые могут способствовать или препятствовать поступательности моторов 10, 16-18. Кроме того, регион-специфическая регуляция транспорта может быть результатом различий в локальной организации цитоскелета, так как в случае обогащения динамических плюс концов микротрубочек вблизи кортекса клетки, в случает пересечений микротрубочек [19] или образования плотных актиновых филамент, которые вызывают переключения треков или мешают движению (rev. [20]). Наконец, принимая во внимание густонаселенную природу клеточной среды, растут доказательства, что многие выделяющиеся паузы или изменения направления, наблюдаемые во время перемещений органелл, являются результатом столкновений с др. клеточными органеллами, скорее всего, подобно автомобилям перемещающимся слишком быстро по переполненным автомагистралям 21 and 22. Однако сильно отличающиеся типы подвижности, наблюдаемые для разных грузов, еремещающихся в одном и том же регионе клетки, показывают, что груз-специфическая регуляция может быть доминантным механизмом, участвующим в контроле перемещений органелл in vivo .

Scaffolding proteins coordinate motor activity


Эукариотические клетки экспрессируют репертуар каркасных белков, которые действуют как платформа для связывания, чтобы обеспечить множественные межбелковые взаимодействия и интегрировать разнообразные активности (Figure 1C, inset; Table 1). Каркасные белки участвуют в регуляции молекулярных моторов, обычно соединяющихся со многими классами белков, включая (i) ассоциированные с мембранами рецепторы грузов, (ii) компоненты как кинезиновых (Box 1) , так и динеиновых (Box 2) моторных комплексов и (iii) сигнальные белки, такие как киназы и GTPases. Таким способом каркасные белки интегрируют на себе сигнальные белки чтобы локально регулировать перемещения груза. Каркасные белки часто являются стержневыми компонентами крупных комплексов и взаимодействуют с дополнительными добавочными или адапторными белками. Часто каркасные белки формируют множественные разнообразные взаимодействия с моторами и эти взаимодействия могут далее усиливать стабильность всего комплекса. Мы подчеркнем здесь наиболее охарактеризованные комплексы моторов с каркасными белками и их регуляторные схемы.

Table 1. Summary chart of scaffolding proteins and their associated motors and regulatory schemes

Box 1. Kinesins and regulation by autoinhibition

The kinesin superfamily includes a diverse collection of motors that are encoded by more than 45 genes. The majority of kinesins move toward microtubule plus-ends, although some move toward minus-ends (reviewed in [95]). Kinesin motors share a homologous motor domain that is fused to more diverse domains mediating specific protein and organelle associations.
Although multiple kinesin families are involved in organelle transport [95], kinesin-1, kinesin-2, and kinesin-3 motors have been best studied to date. Kinesin-1 consists of a KHC dimer, which usually associates with two light chains (KLC; Box 3). Mammalian KHC is encoded by three different genes - KIF5A, KIF5B, and KIF5C; whereas KIF5B is ubiquitously expressed, KIF5A and KIF5C are enriched in neurons [96]. Interestingly, different KIF5 proteins may selectively transport specific cargos as KIF5A preferentially binds to the GABA (?-amino butyric acid) receptor adaptor GABARAP in yeast two-hybrid assays [97]. Kinesin-2 is also a two-headed motor formed from either homodimerization or heterotrimerization (with a nonmotor subunit). Kinesin-3 motors are found as either monomers or dimers[83].
Kinesins not associated with cargo can be autoinhibited by intramolecular interactions 82, 83 and 98. Kinesin autoinhibition likely has two essential cellular functions - to prevent the unnecessary crowding of kinesins on microtubules (i.e., traffic jams) and to prevent wasteful ATP hydrolysis in the absence of associated cargo [98].
For KHC, direct binding between the N-terminal motor head and a conserved basic IAK motif in the C-terminal tail results in autoinhibition [99]. In vitro motility experiments indicate that full-length KHC has little motor activity, whereas truncation of the stalk and tail leads to a constitutively active motor [100]. In early micrographs of KHC, the tail appeared to fold back onto the head via bending of the stalk [101]. Deletion of the 'hinge 2' motif in the stalk blocks autoinhibition, indicating that the flexibility of this element may be pivotal for bending of the tail to meet the head [100]. Interestingly, scaffolding proteins may relieve autoinhibition by binding to both KHC stalk and tail. In vitro, the binding of a JIP1 fragment to the stalk domain is sufficient to activate KHC motility [72], although full activation in vivo may require binding of JIP1 to both the stalk and tail domains.
A single KHC tail is sufficient to autoinhibit a KHC head dimer [102]. One KHC tail peptide binds to the cleft between the two motor heads where it likely prevents ADP release by restricting the movement of the motor domains [103]. This 'double lockdown' model has an important cellular implication - relief of KHC autoinhibition requires that both tails of KHC dimer be blocked from binding to the motor domains. Interestingly, scaffolding proteins known to activate KHC motility in vitro via tail binding, including JIP1 and JIP3, exist as dimers 64 and 72; thus, dimerization of scaffolding proteins may be required for full activation of KHC in the cell.

Box 2. Cytoplasmic dynein and dynactin

Cytoplasmic dynein is the major minus-end-directed microtubule motor for organelle transport in eukaryotic cells. The enormous (?1.5 MDa) dynein complex consists of two dynein heavy chains (DHC; ?500 kDa), two dynein intermediate chains (DIC; ?74 kDa), two light intermediate chains (DLIC; ?33-59 kDa), and several dimers of light chains (DLC/LC7/roadblock, LC8, and TcTex1; ?10-14 kDa). The catalytic DHC is an AAA-protein that folds to form a large asymmetric ring that includes the primary ATPase domain; the microtubule-binding domain is localized to a stalk projecting from this ring [104]. Although DHC is both necessary and sufficient for motor activity, additional subunits contribute to complex stability and cargo interactions.
Single-molecule studies show that mammalian dynein is a weak motor with a stall force of ~1 pN and a variable step size of 8-24 nm [1]. Unlike kinesin, dynein can sidestep to move laterally onto adjacent protofilaments. Although single molecules of mammalian dynein can move bidirectionally along microtubules in vitro [105], in the cell dynein functions as a robust minus-end-directed motor. Dynein interacts directly with dynactin as well as with other activator or adaptor complexes including bicaudal D (BicD), lissencephaly 1 (Lis1), and nuclear distribution protein E (NudE or Nde1) or NudE-like (NudEL or Ndel1) 104 and 106. These activators may act in concert to enhance efficient minus-end-directed transport.
Dynactin is a large ~1 MDa complex that interacts directly with dynein via its largest subunit, p150Glued(Figure I), named for its size (~150 kDa) and its homology to the Drosophila Glued gene product [107]. The N-terminus of p150Glued contains the CAP-Gly microtubule-binding domain [108], followed in some isoforms by a lower-affinity microtubule-binding domain enriched in basic amino acid residues [109]. p150Glued forms a dimer that binds directly to the DIC subunit of cytoplasmic dynein, via a coiled-coil (CC1) domain 110, 111 and 112. A second coiled-coil domain (CC2) in p150Glued interacts with Arp1, which forms a short actin-like filament at the base of the dynactin complex. Additional dynactin subunits include p62, dynamitin (p50), pArp11, CapZ, p27, p25, and p24 [113]. There is a cargo-binding domain (aa ~1049-1278) at the C-terminus of p150Glued that binds to a growing list of vesicular adaptors, such as RILP [24], huntingtin-associated protein 1 (HAP1 [45]), the retromer protein SNX6 28 and 29), and JIP1[72] ( Figure I).




Figure I. Schematic of binding domains in the p150Glued subunit of dynactin. Several scaffolding proteins share a binding site on C-terminal p150Glued.

Retrograde scaffolding proteins: RILP complex and retromers


Каркасный белок RILP облегчает ретроградный транспорт поздних эндосом и лизосом. Когда ранние эндосомы созревают в поздние эндосомы, то активируют GTP-Rab7 (Ras-related protein), контролируея рекрутирование RILP и ORP1L (oxysterol-binding protein-like 1). Каркасный белок RILP затем рекрутирует dynactin за счет непосредственного связывания с C-концом p150Glued субъединицы dynactin [23]. RILP каркасный комплекс осуществляет дополнительные ассоциации с поздними эндосомами посредством Arp1 (actin-related protein 1) субъединицы динактина, которая может соединяться с ассоциированнным с пузырьками β III-spectrin 24 and 25.
Стехиометрия ассоциации RILP, как полагают, играет важну роль в рекрутировании группы dyneins на лизосомы. В экспериментах по оптическому отлавливанию в линиях клеток макрофагов грызунов, фагосомы обнаруживают двунаправленные движения с сопоставимыми силами, генерируемыми как кинезинами, так и динеинами 6 and 26. Однако, высокая поступательность ретроградного перемещения демострирует более высокие stall forces, которые дают кластеры с шагом в 2 pN. Поскольку динеин млекопитающих обладает унитарной stall force в 1 pN, то эти результаты подтверждают, что динеиновые моторы рекрутируются на пузырьки парами [26], это согласуется с рекрутированием димерного RILP с помощью Rab7 [23].
Регуляция ассоциации моторов за счет композиции мембранных липидов,по-видимому, важна, но недостаточно изучена в отношении транспорта пузырьков. Белок oxysterol-binding protein ORP1L, как полагают, является сенсором холестерола, он облегчает cсвязывание RILP/p150Glued с лизосомами, богатыми холестеролом, которые затем транспортируются в направлении ядра. Напротив, лизосомы, бедные холестеролом, остаются на перифериии клеток, поскольку органеллы, ассоциированные с ORP1L, подвергаются конформационным изменениям, чтобы рекрутировать белок эндоплазматического ретикулума (ER) VAP (vesicle-associated membrane protein-associated protein), это приводит к диссоциации p150Glued[27]. Ретромерный комплекс, который облегчает возвращение трансмембранных белков эндосом в сеть trans-Golgi (TGN), также базируется на композиции липидов, чтобы регулировать высвобождение ретроградного мотора. Как только пузырек достигает Гольджи, то компонент ретромера SNX6 (sorting nexin 6), который соединяется непосредственно с p150Glued 28 and 29, ощущает обогащенный в Гольджи phosphatidylinositol-4-phosphate (PI4P) и высвобождает dynactin [30].

Mitochondrial scaffolding proteins: Milton/TRAKs and Miro


В аксонах нейронов большинство митохондрий (~60%) или стационарны или движутся в двух направлениях с частыми сменами направления, тогда как оставшиеся движутся четко или в антероградном или ретроградном направлении 31-33. У Drosophila, комплекс Milton/Miro обеспечивает связывание бизирующихся на микротрубочках моторов с митохондриями ( Figure 2A). Miro ассоциирует с наружной митохондриальной мембраной посредством трансмембранного домена и рекрутирует Milton, который соединяется непосредственно с KHC (kinesin heavy chain) независимым от KLC (kinesin light chain) образом [34] ( Box 3).



Figure 2. Schematic of binding interactions between bidirectional scaffolding proteins with motor and regulatory proteins. (A-D) One feature of bidirectional scaffolding proteins is that binding domains of anterograde and retrograde motors often are located in close proximity or are overlapping. (A) TRAK binds to Miro, KHC, and p150Glued dynactin. (B) Huntingtin binds to DIC, optineurin, HAP40, and HAP1, which binds to KLC and p150Glued and can be phosphorylated at S421. (C) JIP3 binds to JNK, ARF6, KHC tail, KLC, and p150Glued. (D) JIP1 binds to JNK, KHC tail and stalk, KLC, and p150Glued. Abbreviations: ARF6, ADP-ribosylation factor 6; DIC, dynein intermediate chain; HAP, huntingtin-associated protein; Htt, huntingtin; JBD, JNK-binding domain; JIP, JNK-interacting protein; JNK, c-Jun N-terminal kinase; KHC, kinesin heavy chain; KLC, kinesin light chain; LZ, leucine zipper; Miro, mitochondrial Rho GTPase; PTB, phosphotyrosine-binding domain; Rab5; Ras-related protein 5; SH3, Src homology domain; TRAK, trafficking kinesin-binding protein.

Box 3.

Kinesin light chain - autoinhibitory clamp or cargo adaptor?
Cytoplasmic kinesin-1 is typically depicted as an inactive heterotetrameric complex with two KHCs bound to two KLCs. The tetratricopeptide repeat (TPR) domain of KLC binds to C-terminal KHC (aa 771-810) in a region distinct from the autoinhibitory KHC tail 114 and 115. Experiments with full-length proteins demonstrate that KHC homodimers are more robustly autoinhibited in the presence of KLC. Indeed, KHC/KLC heterotetramers have decreased microtubule-binding ability compared to KHC homodimers [114]. Moreover, when compared to the infrequent runs made by KHC, addition of KLC leads to ?30% decrease in run frequency and velocity, and a ?60% decrease in run length [100], consistent with a role for KLC in maintaining KHC autoinhibition.
Cargo-associated KHC may not always be associated with KLC. Sucrose density-gradient centrifugation has identified three separate pools of kinesin - a low-density pool containing only KLC, a high-density pool containing KHC and KLC, and a higher-density pool containing KHC alone [116]. Recent experiments also found that a pool of naked KHC in high-density sucrose-gradient fractions [64], consistent with the ability of many scaffolding proteins or cargo to bind to KHC in a KLC-independent manner, including JIP3 [64], Milton [34], and RNA granules in Drosophila [117]. By contrast, KLC acts as an adaptor that mediates the binding kinesin-1 to other cargos, such as bacteria-containing lysosomes118 and 119 and the neuronal cargo calsyntenin [120].
We propose a unifying hypothesis whereby soluble kinesin-1 exists as a KHC/KLC heterotetramer that is robustly autoinhibited. Activation of this complex involves relief of KHC autoinhibition, likely by a scaffolding protein. For some cargos, KLC is not necessary for this activation step. For others cargos, however, KLC may function as an obligate cargo adaptor by binding to cargo-associated proteins.


В нейрональных синапсах, которые обнаруживат высокие локальные энергетические траты, повышенные уровни кальция нарушают ассоциацию KHC с митохондриями, приводя к эффективной локальной секвестрации митохондрий. Miro, который обладает двумя связывающими кальций EF-hand доменами, регулирует эту реакцию с помощью двух молекулярных механизмов. Согласно одной модели, высокие уровни кальция вызывают связывание KHC головки моторного белка с Miro, это эффективно предупреждает головку от преобразований (processing) вдоль микротрубочек [35]. По др. модели соединение кльция с Miro приводит к высвобождению KHC от Milton, скорее всего, путем изменения связывания Milton и Miro [36]. В дополнение к регуляции путем ощущения уровней кальция, Miro может быть фосфорилирован с помощью PINK1 (PTEN-induced putative kinase 1) в ответ на повреждения или деполяризацию митохондрий и затем направляется на деградацияю с помощью ubiquitin лигазы Parkin. Этот механизм приводит к удалению комплекса Milton/Miro и ассоциированных моторов от поврежденных митохондрий; в результате наступает прекращение подвижности, что, как полагают, облегчает очистку с помощью митофагии [37].
Недавно гомологи у млекопитающих Milton, TRAK1 и TRAK2, как было установлено, ассоциируют с ретроградным моторным комплексом посредством p150Glued субъединицы dynactin. Интерсно, что N-конец TRAK соединяется и с dynactin и с KHC (Figure 2A), и эт о в принципе обеспечивает двунаправленный транспорт митохондрий. В соответствии с этой возможностью, искусственно индуцированное рекрутирование N-терминального фрагмента TRAK в пероксисомы вызывает двунаправленное движение [38]. Напротив, истощение TRAKs приводит к аресту антероградно и ретроградно перемещающихся пулов митохондрий как в аксонах, так и дендитах,одтверждая, что TRAKs обеспечивают поступательный транспорт регулируемым способом, который до конца пока не выяснен.
Подвижность митохондрий также ркгулируется с помощью митохондриального стыковочного белка syntaphilin, который стационарно закрепляет митохондрии вдоль микротрубочек [39]. В соответствии с идеей, что отлавливание митохондрий происходит в местах высоких энергетических затрат, LKB1 (liver kinase B1)/NUAK1 (novel (nua) kinase) путь, необходимый для ветвления аксонов, как было установлено, регулирует отлавливание митохондрий на преасинаптических сайтах с помощью syntaphilin [40]. остается установить, фосфорилирует ли LKB1/NUAK1 непосредственно syntaphilin или действует косвенно посредством промежуточных эффекторов. Более того, syntaphilin может конкурировать с Milton за соединение с митохондриями-ассоциированным кинезином. При высоких концентрациях кальция KHC хвост диссоциирует от Milton и соединяется с syntaphilin. В отличие от др. адапторных белков, которые соединяются с KHC хвостом, чтобы ослабить аутоингибирование и активировать активность KHC (Box 1), соединение KHC хвоста с syntaphilin устраняет способность моторного домена гидролизовать АТФ [41], хотя механизм пока неясен.

Huntingtin scaffolds kinesin-1 and dynein motors in neurons


Huntingtin, наиболее известен своей ролью в качестве причины болезни Гентингтона в мутантном состоянии, это крупный (~350 kDa) ассоциированный с органеллами белок, который предоставляет каркас как для направленных к минус концу, так и направленных к плюс концу моторов. Huntingtin соединяется непосредственно с промежуточной цепью цитоплазматического, DIC [42]. Huntingtin также соединяется с адапторным белком HAP1 (huntingtin-associated protein 1), который соединяется с KHC [43] и KLC [44]. HAP1, в свою очередь, взаимодействует с p150Glued субъединцей динактина 45 and 46, формируя тем самым вторичное взаимодействие между комплексом huntingtin и динеиновым мотором (Figure 2B).
Huntingtin,как было установлено, облегчает трафик динеином-обеспечиваемых органелл, включая поздние эндосомы/лизовомы в клетках HeLa 42 and 47. В нейронах, истощение huntingtin ингибироет аксональный транспорт грузов, включая и синаптические пузырьки [48], BDNF (brain-derived neurotrophic factor)- и APP (amyloid precursor protein)-позитивные пузырьки 49 and 50, и аутофагосомы [51]. Huntingtin также обеспечивает транспорт в дендритах β-активновой мРНК [52] и рецептора нейротрофина TrkB (tropomyosin related kinase B)[53]. Связывание huntingtin и HAP1 и динеином и динактином может усиливать стабильность активного моторного комплекса и тем самым повышать поступательную подвижность, тогда как HAP1 может модулировать аутоингибирование кинезина [51], хотя участвующие специфические молекулярные механизмы ещё предстоит определить. Фосфорилирование huntingtin, как полагают, действует как молекулярное переключение, чтобы регулировать направление транспорта на микротрубочках, поскольку фосфорилирование huntingtin по S421 с помощью Akt киназы способствует антероградному транспорту BDNF-позитивных пузырьков [50].
Huntingtin может быть уникально сбалансирован, чтобы интегрировать адапторы для базирующихся на микротрубочках и базирующихся на актине моторов. Huntingtin соединяется с myosin VI адаптором optineurin [54], а эксперименты по нокдауну в клетках HeLa подтверждают, что huntingtin может быть необходим для передачи эндосом и лизосом с актиновых треков на микротубулярные трекиe на периферии клетки [47]. В самом деле, др. huntingtin-связывающий адаптор, HAP40, также соединяется с ранним эносомным маркером Rab5; поэтому было предположено, что huntingtin позволяет сделать выбор между двумя состояниями - комплексом HAP40/optineurin/myosin, который облегчает базирующуюся на актине подвижность ранних эндосом и HAP1/kinesin/dynein комплексом, которые облегчает базирующийся на микротрубочках транспорт эндосом и лизосом [55].
Важно, что экспансия пролиглюаминов на N-конце huntingtin является причиной болезни Гентингтона из-за нарушения транспорта множественных органелл в нейронах 43, 48, 49, 51 and 56. Эти наблюдения могут связывать дефекты с образованием каркасов для моторных белков в патогенезе нейродегенеративных болезней. Моторная активность может быть также изменена более непосредственно при патологических условиях. Мутантный huntingtin индуцирует аберрантную активацию нейрон-специфичной JNK3 (c-Jun N-terminal kinase 3), киназы, которая может фосфорилировать KIF5C (kinesin family member 5C) по S176 in vitro 57 and 58. Исследования фосфомутантов (в консервативном KIF5B S175 сайте) показало, что хотя активность ATPase, связывания микротрубочек и поступательность не изменены, обнаруживается некоторое усиление аутоингибирования фосфорилированного кинезиновго мотора, которое может способствовать в пользу направления к минус концу по сравнению с перемещением в направлении к плюс концу в присутствии динеина [59]. Т.о., прямое фосфорилирование молекулярных моторов может также вносить вклад в тонкий контроль транспорта и эта тонкая настройка может быть изенена при боллези.

La scaffolding protein in RNA transport


Др. двунаправляющий каркасный белок участвует в доставке РНК-связывающего белка La, который облегчает связывание антероградных и ретроградных моторов с гранулами РНК в аксонах. La может быть ковалентно модифицирован по остатку K41 путем добавления неболшого ubiquitin-подобного модифицирующего пептида (SUMO). Sumoylated La ассоциирует с DIC, но не с KHC, подтвержая. чтосумоилирование La может предпочтительно способствовать ретроградному транспорту РНК . В самом деле, получение изображений живых клеток показывает, что дикого типа La-GFP перемещается как в антероградном, так и ретроградном направлении вдоль аксона, тогда как La-GFP, содержащий мутацию K41R может перемещаться только в антероградном направлении, указывая на несозможнрость ассоциации с динеином в отсутствии сумоилирования [60]. Важно, что эти результаты показывают, что SUMO лигазы могут обогащать или преимущественно активироваться в дистальных частях аксонов. Эта работа предоставила первую четкую демонстрацию, что пост-трансляционные модификации каркасного белка могут приводить к переключению в направлении транспорта для внутриклеточных грузов, подтвеирждая кординационную модель, предложенную выше (Figure 1C).

JNK-binding scaffolds: JIP3 and JIP4


JIPs являются каркасами, идентифицированными благодаря их способности соединяться мо множественными киназами JNK пути. 4 JIPs у млекопитающих обладают сходным JNK-связывающим доменом. Однако, доменовая структура, общая для JIP1 и JIP2 отличается от таковой, характерной для JIP3 и JIP4 [61]. JIP1 и JIP3/JIP4,как было установлено, функционируют как каркасные белки для микротрубочковых моторов, но эти белки обладают разными регуляторными механизмами и модулируют разные клеточные пути.
JIP3, первоначально был идентифицирован как Sunday Driver у Drosophila, затем был охарактеризован как адаптор, который ассоциирует с dynein/dynactin во время транспорта сигналов о повреждениях аксонов в нейронах [62]. Масс спектрометрия изолированных JIP3-позитивных пузырьков идентифицировала два самостоятельных класса - эндоцитическая популяция крупных пузырьков, скорее всего, участвующих инициальную ретроградную передачу сигналов о повреждениях в тело клетки, и пул малых пузырьков, содержащих синаптические белки, которые, как полагают, играют роль в росте в ведении аксонов [63]. JIP3 является двунаправленным каркасным белком, способным к связыванию как kinesin-1 , так и dynein моторные комплексы. Соединение JIP3 с хвостом KHC ослабляет аутоингибирование ( Box 1) и активирует подвижность KHC в методе анализа одиночных молекул [64]. JIP3 гомолог у C. elegans, UNC16 (uncoordinated 16), также,как было установлено, соединяется как с kinesin-1, так и легкой промежуточной цепью динеина (DLIC [65]).
Хотя JIP3 безусловно участвует в передаче сигналов повреждений в нейронах, ростовые факторы, такие как nerve growth factor (NGF) и BDNF также активно транспортируются из дистальной части аксона обратно в тело клетки. Эта доставка осуществляется посредством эндосомного пути, в котором эндосомы созревают из Rab5-позитивных ранних эндосом в Rab7-позитивные поздение эндосомы [66]. Одним из нижестоящих эффекторову активрованного NGF рецептора TrkB является extracellular signal-regulated kinase (ERK), которая может непосредсвенно фосфорилировать DIC по S80 сайту, чтобы эффективно поставлять динеины для ретроградного транспорта сигнальных эндосом [67]. Интерсно, что TrkB может непосредственно соединяться с каркасным белком JIP3 [68]. Это открывает возможность, что фосфорилирование DIC по S80 может усиливать рекрутирование динеина в сигнальные эндосомы зависимым от каркасного белка способом.
Оба гомологичных белка JIP3 и JIP4 являются эффекторами эндосомного мембранного белка ADP-ribosylation factor 6 (ARF6). Хотя JIP3 преимущественно экспрессируется в нейрональных клетках, JIP4 более широко экспрессируется и взаимодействует с ARF6, kinesin-1 и dynactin, чтобы регулировать доставку эндосом после рециклинга во время цитокинеза [69]. GTP-ARF6 соединяется непосредственно с LZII (leucine zipper II) регионом в JIP3 и JIP4, где он блокирует ассоциацию с TPR (tetratricopeptide repeat) доменом в KLC и тем самым способствует связыванию с динактином [69]. Однако, KHC хвост соединяется с JIP3 в N-терминальном регионе, отличающемся от KLC-связывающего домена (Figure 2C), и остается неясным, действительно ли связыание ARF6 с JIP3 эффективно ингибирует активацию кинезинового мотора.

JIP1 regulates highly processive organelle transport


Каркасный белок JIP1 обеспечивает аксональный транспорт органелл, которые перемещаются поступательно в направлении как плюс конроцо, так и минус концов микротрубочек, включая митохондрии, синаптические пузырьки [70] и APP-позитивные пузырьки 71 and 72. JIP1 также регулирует транспорт более однонаправляемых грузов, аутофагосом [9]. JIP1 является двунаправленным каркасным белком, который взаимодействует непосредственно с кинезиновым и динеиновым моторными комплексами 72 and 73. JIP1 также соединяется с трансмембранным грузовым белком APP 74 and 75 и с вышестоящими киназами и фосфатазами, включая JNK 76 and 77.
JIP1 регулирует моторную функцию kinesin-1 посредством разных связывающих взаимодействий как с основным, так и хвостовым доменами в KHC (Figure 2D). JIP1 связывание облегчает аутоингибирование KHC, приводя к активации подвижности кинезина в исследованиях одиночных молекул in vitro . JIP1 также взаимодействует с dynein моторным комплексом посредством прямого связывания с C-терминальным доменов в p150Glued. Поскольку JIP1 не может одновременно соединяться и с KHC и dynactin, то он собирается в два взаимно исключающих комплекса, которые обеспечивают транспорт или в направлении плюс конца или минус конца [72]. Этот механизм гарантирует поступательный транспорт в любом направлении.
Кроме непосредственных взаимодействий с KHC, JIP1 также соединяется непосредственно с KLC, и это может действовать как дополнительный аутоингибирующий зажим (clamp) для kinesin-1 мотора (Box 3). Активация KHC в присутствии KLC нуждается в KHC-связывающем белке FEZ1 (fasciculation and elongation protein zeta 1), который такж обнаруживается в комплексе с JIP1 [78]. Т.о., помимо обеспечения транспорта JIP1 может облегчать первоначальное образование активного транспортного комплекса для APP-позитивных пузырьков. В соответствии с этой возможностью, истощение JIP1 приводит к достоверному снижению в количестве APP пузырьков в аксоне [72].
Фосфорилирование JIP1 с помощью JNK, скорее всего, действует как направленное переключение для транспорта APP в аксонах. Фосфорилирование по S421, в KHC-хвостовом-связывающем домене в JIP1, стабилизирует комплекс JIP1-kinesin и предпочительно усиливает транспорт АРР в направлении плюс конца [72]. Напротив, экспрессия неспособного к фосфорилированию мутантного JIP1 (S421A) способствует перемещению в направлении минус конца APP пузырьков в аксонах. JIP1 может также соединяться с MKP (MAPK phosphatase) [77], подтверждая, что полный регуляторный механизм направленного контроля интегрируется с помощью этого каркасного белка.
JIP1 может гомодимеризоваться посредством своего SH3 (Src homology) домена [79] и, кроме того, может гетеродимеризоваться с JIP2 и JIP3. Пока неясно, являются ли JIP1 и JIP3 связывающие формы гетеродимерами или гетеротетрамерами, но комплекс JIP1/JIP3 может совместно транспортироваться [80] и может функционировать, чтобы облегчать транспорт APP. Иммуноокрашивание и совместная иммунопреципитация подтвердили, что JIP1 преимущественно ассоцирует с фосфорилированым APP [71], а дополнительная ассоциация JIP3 с этим комплексом может поддерживать фосфорилирование APP [81].

Scaffolds and adaptors regulating other kinesins


Хотя kinesin-1 является основным мотором для внутриклеточного транспорта, др. члены этого крупного сверхсемейства кинезинов также обнаруживают роли в доставке пузырьков (Box 1). И kinesin-2 и kinesin-3 регулируются с помощью аутоингибирования 82 and 83, но занчительно меньше известно о том, как эти кинезины скоординированы с активностью динеиновых моторов.
Хвостовой домен kinesin-2 мотора KIF17 взаимодействует с PDZ доменом каркасного белка Mint1 (Munc18-interacting protein). Mint1 в свою очередь соединяется с N-methyl D-aspartate (NMDA) рецепторной субъединицей 2B, чтобы обеспечить поставку в дендриты [84]. Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase (CaMKII) непосредственно фосфорилирует KIF17 хвост, чтобы разрушить его ассоциацию Mint1, освобождая тем самым груз от мотора [85]. Модуляция этого взаимодействия вносит вклад в пластичность синапсов, а целенаправленное разушение этого взаимодействия у мышей приводит к дефициту как поведения, так и памяти [86]. Kinesin-2, как было установлено, соединяется непосредственно с dynactin 87 and 88, возникает интересная возможность, что dynactin может служить для координации двунаправленности перемещений, но механизмы пока не открыты.
Kinesin-3 взаимодействует с DENN (differentially expressed in normal and neoplastic cells)/MADD (MAP kinase activating death domain) белком, Rab3 GDP-GTP exchange factor (GEF), который соединяется с регионом стебля kinesin-3 моторов KIF1A и KIF1Bβ. Это регулирует аксональный транспорт Rab3-позитивных предшественников синаптических пузырьков [89]. Хотя и не было продемонстрировано, что прямое соединение с DENN/MADD достаточно, чтобы активировать подвижность KIF1B in vitro, DENN/MADD, скорее всего, действует как каркасный белок, обеспечивающий регулируемую активность моторов в отношении грузов в клетке.
Недавняя работа предоставила информацию по скоординированой регуляции kinesin-3 моторов и динеина во время транспорта эндосом у гифомицетов. И у Ustilago maydis и Aspergillus nidulans, белок Hook необходим для транспорта ранних эндосом. C-терминальный домен Hok1/HookA обеспечивает связывание с эндосомами, а N-терминальный домен необходим для поставки dynein и dynactin в эндосомы, чтобы управлять подвижностью, направленной к минус концу вдоль микротрубочек 90 and 91, противодействуя активности направленного к плюс концу kinesin-3 мотора [91]. Остается определить, соединяются ли моторы с Hok1/HookA непосредственно или если в этом участвуют дополнительные связывающие партнеры, обеспечивающие эти взаимодействия.
В клетках млекопитающих экспрессируются три Hook белка и по разному располагаются внутри клетки; все три могут ассоциировать с микротрубочками или непосредственно или коспенно посредствоим консервативного N-терминального домена [92]. Hook1, как было установлено, ассоцирует с трубчатыми эндосомами посредством своего C-терминального домена и необходим для сортировки грузов в тубулярных эндосомах совместно с Rab22 [93], тогда как Hook2 участвует в цилиогенезе, а Hook3 обогащен в Гольджи. Все три Hook белка млекопитающих участвуют в доставке и/или слиянии пузырьков [94], но пока неясно, взаимодействуют ли эти белки с kinesin или dynein моторами, чтобы регулировать транспорт органелл вдоль микротрубочек.

Concluding remarks


Live cell imaging continues to reveal the complex dynamics of intracellular trafficking although many mechanistic questions remain (Box 4). Distinct organelle populations move with characteristic patterns of motility, some highly processive, others displaying frequent directional switching. This diversity is enabled by cargo-specific regulation of motility, integrated via organelle-bound scaffolding proteins. A summary chart of scaffolding proteins and their associated motors and regulatory schemes is provided in Table 1. By binding to molecular motors either directly or via adaptor proteins, scaffolding proteins coordinate the activities of opposing motors. The additional interactions of scaffolding proteins with regulatory proteins such as kinases and GTPases favor the formation of an organelle-specific regulatory module. This compartmentalized integration of signaling and motility may be essential for the sustained transport of organelles over long distances, such as transport along the axons of human motor neurons that can reach 1 m in length. Vesicle and organelle motility also varies with the local cellular environment and in response to extracellular stimuli. The ability of scaffolding proteins to fully integrate upstream signaling with downstream responses, such as the activation of motility or the induction of directional switching, allows rapid and effective responses to these stimuli.

Box 4.

Outstanding questions
  • Can multiple scaffolding complexes associate with a single cargo?
  • Depletion or mutation of one scaffolding protein often leads to transport defects in many different organelles. How does one adaptor associate with multiple cargos, and what accounts for cargo-specific motile characteristics such as directionality, speed, run length?
  • Because many scaffolding proteins and most molecular motors are dimers, what is the binding stoichiometry of scaffolding proteins to motors (e.g., 1:1 or 1:2)?
  • Are motors recruited from a cytoplasmic pool upon scaffolding protein activation, or are resident vesicle-associated motors activated upon scaffolding protein association? Alternatively, might dormant cargo-associated scaffolding proteins become activated and then bind to motors (Figure II)?
    • Figure II. Scaffolding proteins may regulate organelle motility by multiple different mechanisms. The scaffolding proteins known to regulate organelle motility are diverse, and may function through diverse mechanisms. In the motor recruitment model, a soluble scaffolding protein may mediate the association of the motor with its cargo. In a selective activation/inactivation model, scaffolding proteins do not recruit motors to cargo, but function instead to regulate motor activity, selectively activating or inactivating one of the vesicle-bound motors. In a third scaffolding protein activation model, vesicle-bound scaffolding proteins become activated to tightly control the activity of vesicle-bound motors.
  • How do upstream pathways (e.g., kinases) spatially regulate the initiation of transport? Is this step different from sustaining transport?
  • How is sustained transport effectively regulated over long distances (>100 ?m)?
    • A comparison of the diverse mechanisms by which scaffolding proteins function suggests some common themes, such as the simultaneous association but selective activation of opposing motors, and the important role for autoinhibition of kinesins. However, each type of cargo is likely governed by distinct mechanisms that provide specific regulatory control over organelle transport in the cell. Multiprotein binding platforms such as scaffolding proteins thus facilitate both integrated and specific regulation of intracellular motility.