Формирование паттерна при морфогенезе ветвления является предметом споров с начала эмбриологии [1]. С одной стороны, теоретики подчеркивают, что древо ветвления имеет самоподобную (фрактальную) природу, которая подтверждает простой, повторяющийся механизм генерации [2],[3]. С др. стороны, анатомы подчеркивают, что системы ветвлений разных органов легко различимы даже силуэтом и что даже внутри одного и того же органа разные генерации ветвления различны. В частности, первые события ветвления органа следуют стереотипическому рисунку, отличающимся от последующих событий ветвления, факт, который склоняет к предположению, что раннее ветвление может находиться под контролем специальной генетической программы [4]. Необходимо привлечение молекулярной биологии к морфогенезу ветвления [5].
Эпителиальное ветвление в развивающихся органах млекопитающих, как известно, регулируется большим числом факторов, включая происходящие из мезенхимы сигнальные молекулы и внеклеточного матрикса [6],[7]. Формирование рисунка древа обычно, как полагают, достигается с помощью пространственной изменчивости в продукции и диффузии паракринных факторов [8] и, в химерных органах, анатомия ветвления контролируется в основном источниками из мезенхимы [9]. Эти паракринные факторы без сомнения важны, но как эпителиальные линии клеток [10],[11] так и интактный эпителий [12] могут подвергаться морфогенезу ветвления в 3D геле, поскольку эти факторы предоставляются свободным раствором в отсутствии мезенхимных клеток. Форма древа в таких 3D системах не полностью идентична рассматриваемому органу (обнаруживается тенденция к расширению во всех направлениях без приобретения характерной общей формы легких, почек и т.д. ) но она состоит из дерева с раскидистыми ветвями. Это указывает на то, что эпителий д. обладать своей собственной базовой системой формирования древа, которая вызывает образование веточек и их расширение даже, когда обычные, происходящие из мезенхимы факторы повсеместны скорее, чем упорядочены. Исследование этой идеи с использованием эпителиальных клеток молочных желез в системах продвинутых клеточных культур [13] подтвердило возможность формирование паттерна с помощью аутокринной секреции эпителиальными клетками ингибитора инвазивной активности. Здесь мы расширили эту идею предварительно исследовав лишь простые интактные клеточные культуры и растущее древо собирающих канальцев развивающейся почки, растущей в органной культуре (Figure 1). Мы получили доказательство аутокринной системы формирования паттерна древа, которая распространяет веточки за счет взаимного отталкивания. Система может также объяснить `специальную' анатомию первых веточек без необходимости в каком-либо внешнем `специальном' механизме. Система использует передачу сигналов bone morphogenetic protein 7 (BMP7).
Figure 1. Development of the renal ureteric bud/collecting duct system. The ureteric bud begins as an unbranched epithelial tube that invades the metanephrogenic mesenchyme, and recruits cells of that mesenchyme to form a `cap? (this cap becomes the stem cell population that produces nephrons). The ureteric bud then bifurcates, and the cap splits along with it. As the branches of the ureteric bud grow, pieces of distal cap left behind differentiate to make first a nephrogenic condensate and then to become an epithelial early nephron. This process repeats to form a ureteric bud tree (the future collecting duct) and the nephrons that will later connect to it. A much more detailed, illustrated account of renal development can be found at www.gudmap.org webcite.
Discussion and conclusion
Fig.8.
Ureteric buds and their cells eschew sources of BMP7. Placing control, BSA-soaked Affigel beads near ureteric buds (a) shows no obvious repulsive effect and branches will run into beads that happen to be in their way. In contrast, branches do not make contact with BMP7-soaked Affigel beads (b), nor do they approach them very closely: these data are shown quantitatively in (c), which shows the distance between the branch and bead that are closest in each culture. (d) In a completely different assay, ureteric bud-derived cells were cultured on filters, with medium supplemented with different concentrations of BMP7 under the filter. The graph shows the frequency of cells crossing the filter: filter crossing is inhibited by BMP7.
Результаты, представленные выше, показали, что система уретрических зачатков рудиментов почки, культивируемых на плоскости, показали широкий угол первой дивергенции и более узкие последующие углы, которые типичны для трехмерных органов in vivo [14]. Культура кончиков от неразветвленных и один раз разветвленных зачатков показала, что угол дивергенции не контролируется c помощью разных, последовательных генетических программ, но c помощью близости др. веточек. Простая компьютерная модель подтвердила, что такое поведение могло бы объясниться c помощью само-избегающей системы, в которой растущие веточки отталкиваются c помощью тех, которые они сами секретируют. Важность этой модели, которая связывает попытки столкновений между деревьями зачатков, д. вмешиваться c помощью само-избегания, подтверждается c помощью культивирования реальных почек. Использование предпринятых коллизий в качестве метода идентификации передачи сигналов BMP посредством Alk рецепторов, критической для само-избегания, при этом BMP7 является, по крайней мере, одной из участвующих молекул. Блокирование передачи сигналов BMP7 вызывает достоверное возникновение коллизий, но многие веточки всё ещё, по-видимому, избегают контактов, так что они могут быть дополнительной параллельной системой удержания их обособлено.
Что же добавляет само-избегание (self-avoidance) к существующему репертуару системы наведения, такой как биофизика кончиков канальцев [25] и передача паракринных сигналов от стромы [26],[27], предположительно контролирующих формирование паттерна в древе канальцев? Во-первых, само-избегание может объяснить, как углы расхождения веточек могут изменяться автоматически от очень открытых к более закрытым без необходимости в специальных, управляющих памятью системах. Вместо этого изменение анатомии может быть результатом неизменного механизма контроля. Система может быть поэтому проще , чем казалось поначалу. Во-вторых, само-избегание может также предоставить средство автоматической коррекции ошибок. Важным свойством органной культуры, наблюдаемым многие годы, стало то, что древо уретрических зачатков, с нормальным трехмерным ростом и распространением, будучи культивируемым в двухмерной системе, продуцирует древо, которое всё ещё распространяется без коллизий. Простое упрощение с трехмерной анатомии нормального древа до двухмерной, напр., в проекции, д. давать изображение, в котором множественные тени веточек пересекаются. Это обычно не происходит в культуре: вместо этого, зачатки приспосабливаются и продуцируют соотв. образом двухмерное древо. Это демонстрирует как гибкость формирования паттерна, так и его способность компенсировать даже крупномасштабные отклонения от нормальной анатомии. Такая компенсация д. ожидаться в системе, использующей само-избегание; собственно распространение веточек двухмерного древа в компьютерной модели управляется c помощью лишь само-избегания.
Само-избегание является, по-видимому, не критическим для образования прежде всего древа. BMP7-/- мыши обладают тяжелым почечным дисгенезом с очень небольшими нефронами, и они имели небольшую и кистозную систему сорбирающих канальцев [28]. Присутствие любого типа системы собирающих канальцев подчеркивает тот факт, что эпителиальное древо, хотя и морфологически аномальное может быть создано даже без BMP7-обеспечиваемого само-избегания. Возможно, что др. системы само-избегания могут быть всё ещё активными; наши данные указывают на участие BMP7 в само-избегании, но не доказывают, что ответственен только он. Также возможно, что др. механизмы клеточного уровня [26],[27] достаточны, чтобы построить базовое и что само-избегание используется только для снижения эффектов случайных ошибок позиционирования.
BMP7 , как известно, является ингибитором первого возникновения уретрических зачатков из почечных канальцев [29] , а при высоких концентрациях, ингибитором пролиферации клеточных линий собирающих канальцев [30]. Подтверждением этого является наблюдение, что BMP рецептор Alk3 необходим для предупреждения избыточного ветвления уретрических (мочеточниковых) зачатков [31]. BMP7 не экспрессируется в любом органе, который участвует в морфогенезе эпителиального ветвления, но органы могут использовать разные члены сверхсемейства TGFβ для тех же самых причин. Аутокринная продукция ингибирующих подвижность TGFβ непосредственно клетками молочных желез [13] подтверждает, что протоки молочных желез могут использовать сходную систему само-избегания, но базирующуюся на TGFβ . Возможно, что точно также как разные органы используют разные активаторы ветвления (FGF7, FGF10, GDNF), которые питают сходные внутриклеточные пути [32], так что они используют разные члены сверхсемейства TGF?β в качестве аутокринных ингибиторов. Они могут также использовать более, чем одной молекулы, т.к. многие органы используют более одного активатора ветвления. Главный пункт сообщения не говорит в пользу какой-либо молекулы, являющейся в целом важной для само-избегания, а скорее иллюстрирует, что само-избегание, по-видимому, существует, по крайней мере, в почках и что это дает объяснение углов ветвления во время развития и веточек, не образующих сплетений даже, если система нарушена.
Тормозящее действие на миграцию клеток и клеточные процессы важны для формирования паттерна др. частей эмбрионов, таких как сегментация периферической нервной системы [33], картирование зрительного нерва по colliculus в головном мозге [34], позиционирование аорты с каждой стороны срединной линии [35], сегментация межсомитных сосудов [36], позиционирование передней кишки и контроль позиции, в которых возникают уретрические зачатки из Вольфовых протоков [37]. Эти системы используют разные молекулы, такие как Ephs/Ephrins, Semaphorins, Robo/Slit и BMP4, иногда сбалансированные c помощью их антагонистов [34],[39]. Имеются доказательства отталкивания, участвующего в формировании паттерна системы ветвления бактериальных колоний [40], дендритных дерев [41] и гифов грибов [42]. Некоторые исследования простых культур подтвердили, что эпителий, происходящий из ветвящихся канальцев молочных желез и слюнных желез могут демонстрировать отталкивание [13],[43]: здесь мы показали, что отталкивание работает в контексте рудимента целого органа.
