Neural crest cells (NCC) это набор мигрирующих, мультипотентных клеток, возникающих в дорсальных нейральных складках (Gammill and Bronner-Fraser 2003) и способных давать многие дифференцированные типы тканей, включая кости, хрящи, нейроны и соединительную ткань (Schneider and Helms, 2003; Santagati and Rijli, 2003). За исключением некоторых задних костей, происходящих из мезодермы, большинство черепно-лицевого скелета происходит из NCC (Jeong et al., 2004). У млекопитающих формирование паттерна и морфогенез нижней челюсти, основной черепно-лицевой структуры, начинаются с миграции краниальных NCC (NCC) в 1-ю фарингеальную дугу (PA1); у мышей эта миграция стартует на день эмбриогенеза 8.0 (E8.0) и заканчивается на E9.5. После миграции NCC заселяют часть мезенхимы фарингеальной дуги, эктомезенхиму, которая отличается от мезодермальной мезенхимы. Дальнейшее развитие эктомезенхимы зависит от множественных сигналов от компонентов не-нейрального гребня, лежащего поверх эпителия и мезодермальной мезенхимы (Ferguson et al., 2000; Trainor et al.,2002; Trainor and Krumlauf, 2000; Couly et al., 2002; Hu et al., 2003). Развитие первой дуги состоит из двух принципиальных частей, верхнего максилярного зачатка и нижнего мандибулярного зачатка. Зачаток верхней челюсти превращается в нёбо и верхние черепно-лицевые структуры, тогда как мандибулярный зачаток развивается в некоторые отические компоненты, зубные кости и поддерживающие хрящи и мышцы (Chai and Maxson Jr., 2006). Meckel's хрящ - это ключевая структура во время развития нижней челюсти, он образует каркас для оссификации зубных костей (Radlanski and Renz, 2006). Развитие Мекелева хряща начинается в PA1 приблизительно на ст. E11.5 в виде кластера эктомезенхимы, известного как предхрящевой конденсат (Chai and Maxson Jr., 2006; Chai et al., 2000). Эта конденсация затем удлиняется, чтобы сформировать полностью палочковидный Мекелев хрящ, состоящий как из NCC, так и клеток, не относящихся к нервному гребню (Chai et al., 2000; Ito et al., 2002). В то времякогда Мекелев хрящ удлиняется, кость, поддерживающая зубы, оссифицируется и окружает палочковидный хрящ. Помимо Мекелева хряща и зубной кости, нижняя челюсть имеет три др. проксимальные структуры: клювовидный (coronoid), мыщелковый (condylar) и угловой (angular) отростки. Эти структуры важны для правильного височно-челюстного соединения.

Дефекты развития нижней челюсти могут быть результатом общих врожденных дефектов развития, микрогнатии, когда нижняя челюсть укорочена. Микрогнатия часто возникает совместно со случаями holoprosencephaly (HPE), при которой нарушается формирование паттерна ростро-вентральной срединной линии и происходит укорочение черепно-лицевых структур. Ген, который сцеплен с HPE человека, это Sonic Hedgehog (SHH) (Roessler et al., 1996). У мышей Shh экспрессируется в трех эпителиях вблизи развивающейся фарингеальной дуги: фарингеальной эктодерме, ротовой эктодерме и нейроэпителии вентральной части переднего мозга (Jeong et al., 2004). Генетическое устранение всех источников Shh у мышей приводит к тяжелой голопрозэнцефалии, включая укорочение нижней челюсти (Chiang et al., 1996).

К сожалению, тяжесть эти ранних черепно-лицевых дефектов у Shh^-/- мутантных модельных мышей осложняется поздними дефектами, вызываемые поздней ролью Shh в развитии нижней челюсти мыши. Куры также являются подходящей моделью для изучения роли Shh в развитии нижней челюсти с помощью экспериментов с избыточностью и потерей функции, которые подтвердили, что эпителиальный Shh необходим и достаточен для жизнеспособности и пролиферации эктомезенхимы в PA1 (Hu and Helms, 1999; Ahlgren and Bronner-Fraser, 1999). Точнее, удаление фарингеальной энтодермы у эмбрионов кур приводит к потере мандибулярных выростов, которые могут быть восстановлены воздействием белка SHH (Couly et al., 2002; Haworth et al., 2007; Brito et al., 2006). Более того, добавление SHH в PA1 индуцирует развитие эктопического Мекелева хряща (Brito et al., 2008). В то время ка работы на курах подтвердили роль Shh из фарингеальной энтодермы в мандибулярных выростах, большинство этих работ производилось с добавлением внешних источников SHH.

Важная информация о роли передачи сигналов Shh получена при удалении Shh рецептора специфически в NCC. Jeong с колл.(2004) использовали NCC-специфический Cre, Wnt1Cre (Danielian et al., 1998), чтобы устранить Smoothened (Smo), обязательный рецептор для лигандов семейства hedgehog и тем самым ингибировать передачу сигналов всех hedgehog (Hh) в NCC. В результате эмбрионы Wnt1cre;Smo^fx/- формируют сильно гипопластичные нижние челюсти вместе с др. черепно-лицевыми и гортанными дефектами (Jeong et al., 2004). Однако, существуют множественные лиганды в передаче сигналов hedgehog, включая desert, Indian и sonic hedgehog, все они передают сигналы посредством Smo. У мышей делеция или Ihh (St-Jacques et al., 1999) или Shh (Chiang et al., 1996) приводит к черепно-лицевым дефектам. Однако, Ihh не присутствует в мандибулярной дуге вплоть до ст. E12.5, который появляется после инициального роста нижней челюсти. Следовательно, дефекты, возникающие в результате потери передачи сигналов Hh в NCC, скорее всего, обусловлены передачей сигналов Shh. Этот результат подтверждает предыдущие исследования га курах, показавших, что Shh необходим для развития нижней челюсти, но ни одна из этих работ не заинтересовалась, какие специфические домены Shh необходимы у мышей.

Базируясь на предыдущих экспериментах, по нарушению передачи сигналов Hh у кур и мышей, основная роль Shh в развитии нижней челюсти может способствовать раннему выживанию фарингеальных NCC (Jeong et al., 2004; Brito et al., 2006; Couly et al., 2002; Haworth et al., 2007; Benouaiche et al.,2008). Альтернативным механизмом может быть то, что эндогенный Shh регулирует развитие NCC, чтобы привести к росту и дифференцировке хряща. У Shh^-/- мышей конденсаты Мекелева хряща обнаруживают в регионе нижней челюсти на ст. E13.5 (Melnick et al., 2005). Однако, эти конденсаты, по-видимому, не растут и не дифференцируются у мутантов (Melnick et al., 2005). Когда Мекелев хрящ дикого типа культивируется ex vivo и подвергается воздействию cyclopamine, антагониста SHH, то не происходит дифференцировки хондроцитов (Melnick et al., 2005). Кроме того, SHH, как было установлено, важен для хондрогенеза производных краниальных NCC у рыбок данио (Wada et al., 2005a). Следовательно, SHH, в самом деле, важен для дифференцировки мандибулярного хряща, но механизм остается неизвестным (Chai and Maxson Jr., 2006).

В данном исследовании мы использовали генетическое устранение у мышей, чтобы выявить домен экспрессии Shh, который необходим для развития нижней челюсти, и затем проанализировать его клеточную роль. Наши результаты выявили двойную роль Shh во время развития нижней челюсти: Shh, секретируемый фарингеальным эпителием, необходим у мышей для жизнеспособности ранних PA1 мезенхимных клеток и также для более поздней дифференцировки хрящевых конденсатов в развивающейся мандибулярной дуге.



Figure 9.

Epithelial Shh is necessary for early PA1 mesenchymal cell survival and for regulation of differentiation factors during mandibular cartilage condensation development. There are two main stages where epithelial signaling is necessary for mandibular development. A,B: Cell survival at E10.5, and (C,D) cartilage condensation differentiation at E11.5. A: When epithelial (dark blue) Shh is present, neural crest–derived mesenchymal cells (light blue) are protected against apoptosis. At E10.5, the majority of PA1 is made up of NCC but there are some non-neural crest mesenchymal cells present. B: However, when Shh is removed from the epithelial (marked by red X), the mesenchymal cells undergo increased cell death (red cells) due to p53 activation. The loss of Shh results in increased cell death supporting an early cell survival role of Shh. C: Later in development Shh from the epithelium is important in regulating expression of cartilage differentiation factors Sox9 and Col2a in the condensing mesenchymal cells (light green). D: Interestingly, a rescue of the cell death phenotype in Nkx2.5Cre;Shhfx/- mutants does not rescue the cartilage development phenotype suggesting that Shh pays a later role in cartilage development. Based on qPCR data, it appears that Shh signaling is important in regulating cartilage differentiation but not initiation or adhesion.

Данное исследование показало, что в развитии млекопитающих Sonic Hedgehog из фарингеального эпителия необходим для собственно образования нижней челюсти. Эти результаты подтверждают ранние исследования, показавшие, что передача сигналов hedgehog необходима для развития краниальных NCC (Jeong et al., 2004; Brito et al., 2006; Couly et al., 2002; Trainor and Krumlauf, 2000; Haworth et al., 2007; Wada et al., 2005b). Полученные результаты показали с определенностью, что Shh является критическим hedgehog сигнальным белком для развития нижней челюсти и что важным для этого источником Shh является эпителий PA1 скорее, чем осевые по срединной линии домены (Fig. 9).

Эмбриологические эксперименты на курах подтвердили, что Shh из фарингеальной энтодермы достаточен и необходим для развития PA1. Наше исследование расширило эти находки с модельных птиц на млекопитающих Мы с определенностью показали, что у млекопитающих Shh, продуцируемый в эпителии PA1, является важным сигналом для PA1 мезенхимы во время развития нижней челюсти.

В противовес предыдущим работам, изучавшим последствия нарушения передачи сигналов Hh специфически в CNCC (Jeong et al., 2004), мутантная модель здесь непосредственно указывает на эффект эпителиальной экспрессии Shh целиком на PA1 эпителий и мезенхиму, включая как производные NCC, так и мезодермы. Сравнение мутантных фенотипов, возникающих в результате потери восприятия передачи сигналов Hh клетками NCC, в противовес фенотипам из-за потери Shh, исходящего из фарингеального эпителия, демонстрирует более тяжелые фенотипы, когда отсутствует эпителиальный источник SHH, т.к. это приводит к потере Мекелева хряща, тогда как он всё ещё формируется, когда чувствительность к Hh отсутствует в NCCs. Это указывает на то, что существует др. популяция клеток, помимо мезенхимы. происходящей из NCC, которая нуждается в восприятии передачи сигналов Shh для собственно развития нижней челюсти. Эта популяция клеток может быть сама по себе эпителием и/или происходящим из не NCC мезодермальным стержнем PA1.

Посредством детального анализа черепно-лицевого скелета Nkx2.5Cre;Shh^fx/- эмбрионов, мы определили, что производные PA1 были нарушены, включая множественные скелетные и хрящевые элементы. Нёбные, базисфеноидные и зубные (dentary) кости были гипопластичными, тогда как др. элементы отсутствовали полностью у Nkx2.5Cre;Shh^fx/- эмбрионов, включая отические компоненты (барабанное кольцо, наковальня, молоточек и стремя) и Мекелев хрящ. Остальная часть черепно-лицевого скелета, по-видимому, развивалась нормально в отсутствие источника Shh. Эти результаты показывают, что эпителиальный Shh играет важную роль в происходящих из PA1 и PA2 ушных элементах.

Рание исследования не выявили очевидных дефектов в способности клеток нервного гребня мигрировать и занимать PA1 собственно у Nkx2.5Cre;Shh^fx/- мышей (Goddeeris et al., 2007). Различия в размерах мандибулярной PA1 у Nkx2.5Cre;Shh^fx/- и контрольных эмбрионов не выявляются вплоть до ст. E11.5, это согласуется с гипотезой, что передача сигналов Shh из эпителия PA1 не обязательна для миграции NCC. Мы исследовали, является ли Shh необходимым для пролиферации мезенхимных клеток в PA1, т.к. Shh действует как митоген в др. контекстах. Однако, когда уровни пролиферации были оценены у мутантов по сравнению с контролем, то не выявлено различий. Следовательно, Shh не действует как митоген в данном контексте.

Напротив, передача сигналов Shh необходима для жизнеспособности субнабора PA1 мезенхимных клеток, т.к. заметно усиливался латеральный апоптоз на ст. E10.5, после завершения миграции NCC у Nkx2.5Cre;Shh^fx/- эмбрионов. Однако, на ст. E9.5 не отмечается очевидного увеличения апоптоза у мутантных эмбрионов (data not shown). При сравнении кондиционное удаление Smo в NCC приводило к увеличению апоптоза по срединной линии на ст. E9.5, а на ст. E10.5 к увеличению апоптоза по срединной линии и по бокам (Jeong et al., 2004). Два разных паттерна в распределении апоптических клеток выявили различия в функциональной значимости потери эпителиального Shh в противовес потере чувствительности к Hh в NCCs. Один важный момент, которые может объяснить эти различия, заключается в том, что потеря Smo, приводит посредством Wnt1Cre к потере чувствительности к передаче сигналов Hh с самых ранних стадий миграции NCC. Напротив, потеря экспрессии Shh в PA1 эпителии является более поздним событием, которое д. влиять на NCC в основном после того, как они мигрировали в PA1 и определилась их пространственная специфичность. Вторая точка зрения заключается в том, что NCC, лишенные Smo не только не способны отвечать на Shh, но и также извлекать пользу от любой др. функции Smo, независимо от реакции Shh per se. Во всяком случае уровни и распределение апоптоза, выявляемые у эмбрионов, лишенных экспрессии Shh в PA1 подтверждают, что большинство PA1 мезенхимных клеток вносят вклад в жизнеспособность нижней челюсти доже без эпителиального Shh. Это далее подтверждает, что апоптоз является только частью патологической проблемы, лежащей в основе дефектов развития нижней челюсти, лишенной передачи сигналов PA1 Shh.

Базируясь на роли, что Shh участвует в возникновении множественных типов рака, мы заподозрили, что Shh регулирует P53в ходе развития мандибулярной дуги. Когда P53 ингибируется фармакологически у Nkx2.5Cre;Shh^fx/- эмбрионов, то жизнеспособность ранних клеток снижена, подтверждая ингибирующую роль SHH на активность P53 в этом онтогенетическом контексте. Хотя мы не изучали биохимический механизм, лежащий в основе этого эффекта, но предыдущая работа подтвердила. что передача сигналов Hh необходима для MDM2, чтобы убиквитинировать и деградировать p53 (Malek et al., 2011); т.о., когда необходимый Hh сигнал отсутствует, то MDM2 не вызывает деградации p53. Независимо от механизма данное исследование демонстрирует устранение связанных с Shh апоптозом дефектов in utero, предоставляя тем самым потенциальный механизм для изучения др. дефектов, связанных с повышенным апоптозом из-за потери передачи сигналов Shh, включая дефекты спинного мозга, нёба и гениталий (Thibert et al., 2003; Rice et al., 2004; Haraguchi et al., 2001).

Формирование паттерна мандибулярной дуги строго контролируется с привлечением многих генов. Многие экспрессируются в одном из двух доменов, проксимальном (вентральном) или дистальном (медиальном) (Ferguson et al., 2000; Mina et al., 2002; Thomas et al., 1998). Дистальный домен является основным регулятором развития нижней челюсти (McGonnell et al., 1998; Mina et al., 2002; Thomas et al., 1998). Когда мы исследовали локализацию двух маркеров из проксимальных генов, Dlx2 и Dlx5, мы нашли, что потеря эпителиального Shh приводит к изменению локализации Dlx2/5. У Nkx2.5Cre;Shh^fx/- эмбрионов, Dlx2 теряется в дистальной эктодерме, но не в проксимальной мезенхиме, это интересно, поскольку эпителиальный Dlx2 устанавливается с помощью передачи сигналов эпителиального BMP4 (Thomas et al., 2000). Потеря Dlx2 в эпителии подтверждает, что передача сигналов BMP может быть снижена.

C др. стороны, проксимальная экспрессия Dlx5 расширяется на домен срединной линии PA1 у Nkx2.5Cre;Shh^fx/- эмбрионов. Изменение экспрессии Dlx5 может быть обусловлено потерей дистального домена PA1 или экспансией проксимального домена. Мыши с кондиционным устранением Hand2 в NCC обнаруживают расширение экспрессии Dlx5 дистально, приводя к потере языка и гипоплазии dentary кости (Barron et al.,2011). Эти фенотипические отклонения напоминают потерю языка и гипоплазию нижней челюсти, наблюдаемые при потере эпителиального Shh. Кроме того, исследование Barron вывило гипоплазию Мекелева хряща. Экспрессия Dlx5 индуцирует экспрессию Runx2, необходимого для остеогенеза, а увеличение дистального Dlx5 может вызывать преждевременную оссификацию dentary кости (Barron et al., 2011). Возможно, что Shh прямо или косвенно регулирует сеть экспрессии генов, которая защищает нижнюю челюсть от преждевременной оссификации.

В дополнение к нарушениям экспрессии Dlx2 и Dlx5, потеря эпителиального Shh приводит к потере эктодермального Fgf8 специфически в проксимальном эпителии PA1. Shh, как было установлено, регулирует в PA1 экспрессию Fgf8 у Shh^-/- мышей (Yamagishi et al., 2006; Moore-Scott and Manley 2005; Aoto et al., 2009). Fgf8 важен для развития нижней челюсти на ст. E10.5 для жизнеспособности клеток PA1 (Trumpp et al., 1999; Tucker et al.,1999) и необходим позднее при развитии нижней челюсти для дифференцировки хряща (Abzhanov and Tabin 2004; Melnick et al., 2005). Наши результаты показали, что у мышей эпителиальный Shh необходим для экспрессии Fgf8, которая, в сою очередь, важна для жизнеспособности клеток и становления Мекелева хряща.

Ключевое различие между кондиционным удалением Smo в NCC и удалением Shh из фарингеального эпителия является нарушение эпителиального Fgf8. Поскольку экспрессия Fgf8 не была изучена непосредственно у мутантов Smo^cko, то нормальная экспрессия Spry подтверждает, что передача сигналов Fgf8 не изменена (Jeong et al., 2004). Возможно, что потеря Fgf8, экспрессирующегося проксимально, ответственна за усиление апоптоза, наблюдаемого латерально у наших мутантов. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы установить потребность во времени экспрессии Fgf8 для образования Мекелева хряща у мышей.

Наконец, мы наблюдали лёгкую потерю наиболее дистального домена у мутантных Barx1 эмбрионов. Barx1 является нижестоящей мишенью передачи сигналов Edn1, но он также регулируется с помощью др. сигнальных путей, включая Fgf8 (Trumpp et al., 1999). Следовательно, снижение Barx1, скорее всего, обусловлено потерей эпителиального Fgf8. Более того, Barx1 важен для дифференцировки клеток в хрящ, а потеря Barx1 приводит к потере хряща нижней челюсти (Nichols et al., 2013). Связь между экспрессией Barx1 и Shh нуждается в дальнейшем исследовании, чтобы определить регулирует ли Shh непосредственно Barx1.

Предыдущая работа на курах показала, что Shh важен для формирования Мекелева хряща, но механизм не изучен. Наши результаты подтверждают роль Shh в становлении конденсатов Мекелева хряща пред образованием выростов, однако, предыдущее исследование идентифицировало области плотных клеток в Shh^-/- мандибулярных дугах, предположительно хрящевые конденсаты (Melnick et al., 2005). Возможно, что конденсаты, наблюдаемые в ранних исследованиях, не являются фактически Мекелевым хрящом (Melnick et al., 2005). Кроме того, когда Smoothened удаляется из NCC перед развитием нижней челюсти, то формируются небольшие Мекелевы хрящи и dentary кость (Jeong et al., 2004). Эти результаты отличаются от тех, где показана полная потеря Мекелева хряща, когда удаляется эпителиальный Shh. Несоответствие, скорее всего, обусловлено воздействием тотальной потери Shh лиганда в PA1 эпителии и мезенхиме у Nkx2.5Cre;Shh^fx/- мышей, по сравнению со специфической потерей в эктомезенхиме у Wnt1Cre;Smo^fx/- мышей. У последних мутантов эпителиальные и мезенхимные не-NCC клетки д. всё ещё быть способны воспринимать и отвечать на сигналы Shh, тогда как этого нет у Nkx2.5Cre;Shh^fx/- мутантов. Различия в фенотипе от двух скрещиваний указывает на то, что передача сигналов Shh важна для развития Мекелева хряща посредством передачи сигналов в др. популяциях клеток помимо мезенхимы, происходящей из нервного гребня.

Наши результаты показали, что Shh выполняет, по крайней мере, две роли во время развития нижней челюсти: (1) способствует жизнеспособности мезенхимных клеток PA1 (NCC и не-NCC); и (2) регулирует дифференцировку хрящевых конденсатов. Обработка Nkx2.5Cre;Shh^fx/- мышей с помощью фармакологического ингибитора P53 позволила разделить эти две потенциальные роли Shh. Если передача сигналов Shh необходима только для жизнеспособности во время развития PA1, то ингибирование апоптоза д. приводить к нормальному развитию хряща (Fig. 9A,B). Однако, наши результаты показывают, что ингибирование восстанавливает жизнеспособность PA1 клеток, но не образование хряща (Fig. 9C,D). Более того, мы не получили доказательств, что Shh необходим на стадии инициации хряща и для адгезии при изучении маркеров Tgfβ-1 и NCAM с помощью qPCR. Возможно, что эти гены недостаточно экспрессируются в контрольной ткани, чтобы можно было увидеть небольшие изменения в экспрессии генов. Альтернативно, Shh может быть не обязателен для инициации конденсатов хряща. Мы не имеем способа визуализовать конденсаты до стадии адгезии и дифференцировки и поэтому не можем оценить присутствуют ли они у Nkx2.5Cre;Shh^fx/- эмбрионов.

Поскольку Shh, по-видимому, не нужен для инициации хряща, но мы нашли, что позднее во время развития хрящевых конденсатов, Shh регулирует экспрессию Col1a, Sox9 и Col2a. Потеря экспрессии генов Sox9 и Col2a у pifithrin-αNkx2.5Cre;Shh^fx/- эмбрионов подтверждает, что передача сигналов Shh необходима для дифференцировки хряща. Интересно, что мы нашли усиление экспрессии гена Col1a у Nkx2.5Cre;Shh^fx/- эмбрионов. Collagen-I обычно участвует в обеспечении развития кости (Grant et al., 1996), подтверждая, что избыток животных экспрессии Collagen-I у мутантных эмбрионов может быть результатом преждевременного образования кости. Возможно, что усиление экспрессии Col1a ответственно за развитие маленькой dentary кости без Мекелева хряща. Наши данные подтверждают новую роль передачи сигналов Shh как транскрипционного регулятора экспрессии Col1a при развитии конденсатов нижней челюсти.

В др. онтогенетических контекстах Shh является регулятором хондрогенеза и наши результаты подтверждают роль Shh в хондрогенезе во время развития нижней челюсти. Механизм, лежащий в основе хондрогенеза Мекелева хряща д. быть исследован далее, т.к. это может предоставить информацию о нормальном развитии многих хрящей. В этой связи наше исследование демонстрирует возможность обхода дефектов, связанных с гибелью клеток из-за потери Shh, чтобы достичь лучшего понимания Shh в позднем развитии фарингеальных дуг.

Млекопитающие обладают чрезвычайным разнообразием черепно-лицевых структур, особенно лицевой части черепа, скелета, окружающего рот (Fish et al., 2014). Наши результаты подтверждают, что вариабельность в уровнях Shh в PA1 различных млекопитающих, или в чувствительности к Shh в CNCC, может играть ключевую роль в контроле размеров и формирования паттерна Мекелева хряща. Различия в Мекелевом хряще могут, в свою очередь, приводить к соотв. вариабельности размера и формы нижней челюсти и частично объясняют видо-специфическую изменчивость в развитии нижней челюсти.