Нервный гребень является удивительным типом клеток, характеризующимся своей способностью мигрировать на дальне расстояния и дифференцироваться в разные производные (Fig. 1A-E). Эволюционное новшество, нервный гребень, как полагают, является критическим для возникновения и разнообразия позвоночных (Gans and Northcutt, 1983). Иногда он обозначается как 'четвертый зародышевый листок' (Hall, 2000). Открытие нервного гребня оспаривает важные концепции относительно развития и эволюции плана тела позвоночных, особенно если учесть, что этот эктодермальный тип клеток дает мезенхимные производные (Hall, 1999). Более того, идентификация нервного гребня демонстрирует, что становление поля предшественников во время формирования частей тела д. включать вклады от клеток, приходящих из дальних мест.

В последнее столетие довольно много установлено с помощью экспериментальной эмбриологии о пластичности клеток нервного гребня и его вкладе в разные производные (Le Douarin and Kalcheim, 1999). трансплантационные эксперименты сначала на эмбрионах амфибий (Horstadius, 1950) и позднее на птицах с использованием новых классических химер перепел-курица Le Douarin (1973), установили пути, которыми следуют клетки нервного гребня и разнообразные производными, в которые они вносят вклад (Fig. 1F).

Здесь мы коротко рассмотрим развитие нервного гребня (относительно деталей см., Le Douarin, 1982; Sauka-Spengler and Bronner-Fraser, 2008). Затем опишем современное состояние знаний относительно связей внутри нервного гребня gene regulatory network (GRN), разработанной на базе новых регуляторных взаимодействий. Мы используем BioTapestry платформу (Longabaugh et al., 2005, 2009) и обсудим важность эпигенетической регуляции в формировании нервного гребня. Большинство взаимодействий, присутствующих в этой версии GRN, были охарактеризованы для краниального нервного гребня, хотя была включена и информация о др. осевых уровнях, если она соответствовала топологии сети.

A brief overview of neural crest development

Клетки нервного гребня индуцируются в эктодермальном зародышевом слое во время гаструляции и первоначально располагаются на пограничной территории с нервной пластинкой, которая находится на латеральных краях ЦНС (Fig. 1B). Во время нейруляции, эта пограничная территория поднимается когда нервная пластинка закрывается, чтобы сформировать нервную трубку (Fig. 1C,D). В результате зарождающиеся клетки нервного гребня оказываются расположенными на дорсальной стороне смыкающихся нервных складок, инициируя экспрессию генов нервного гребня, такие как FoxD3 (Labosky and Kaestner, 1998) и Sox10 (Southard-Smith et al., 1998), это отражает их спецификацию как настоящих клеток нервного гребня. После закрытия или кавитации нервной трубки, они постепенно покидают ЦНС в результате эпителиально-мезенхимного перехода (EMT) (Fig. 1D), превращаясь в популяцию мигрирующих и мультипотентных клеток предшественников (Fig. 1E), которые часто перемещаются на большие расстояния вдоль стереотипических путей.

Вследствие миграции клетки нервного гребня прогрессивно дифференцируются в разные типы клеток в соответствии с влиянием окружения, с которым они сталкиваются во время своего путешествия и на своих окончательных местах они кооперируются с др. клеточными популяциями, чтобы сформировать соотв. ткани и органы (Bronner and LeDouarin, 2012). Они создают множественные производные в виде разнообразных элементов черепно-лицевого скелета, сенсорных и автономных ганглиев ПНС, и пигментные клетки кожи (Le Douarin, 1982) (Fig. 1F). Т.о., клетки нервного гребня позвоночных определяются по их происхождению на границе нервной пластинки, по их способности покидать нервную трубку посредством EMT и их мультипотентности.

Эксперименты по отслеживанию клонов идентифицировали производные и пути миграции разных популяций клеток нервного гребня (Le Douarin, 1982). Регионализация оси тела спереди назад отражается в возникновении субпопуляций нервного гребня, которые вносят вклад в некоторые перекрывающиеся, а также в производные, специфичные для осевых уровней. Напр., клетки краниального нервного гребня формируют лицевой скелет, включая верхнюю и нижнюю челюсть и кости шеи, а также глию и некоторые нейроны краниальных сенсорных ганглиев (Couly et al., 1998). Непосредственно ниже головы, вагусные клетки нервного гребня заселяют тракт оттока сердца и энтерические ганглии кишечника (Le Douarin and Teillet, 1973; Creazzo et al., 1998). Нервный гребень туловища вносит вклад в ганглии дорсальных корешков и в симпатические ганглии ПНС (Le Douarin and Smith, 1988), мигрируя посегментно через сомиты. Однако, нервный гребень туловища обычно лишен способности формировать хрящ и кости или вносить вклад в сердечно-сосудистую систему - как это делают более передние популяции (Le Lievre and Le Douarin, 1975; Le Lievre et al., 1980). Пигментные клетки кожи и периферическая глия возникают из клеток нервного гребня на всех уровнях оси (Le Douarin, 1982).

The neural crest gene regulatory network

Успехи молекулярной биологии последних 20 лет существенно расширили наши знания по генетическому контролю разных событий развития нервного гребня (Simoes-Costa and Bronner, 2013). Многочисленные исследования привели к идентификации многох транскрипционных факторов, важных для образования нервного гребня, а также некоторых регуляторных связей между этими регуляторами. Регуляторная информация, получаемая от разных модельных организмов позвоночных, привела к концепции сети GRN нервного гребня, которая лежит в основе процесса формирования нервного гребня (Meulemans and Bronner-Fraser, 2002;Betancur et al., 2010b) (Fig. 2). Согласно этой модели, край нервной пластинки образуется в результате комбинированного действия разных сигнальных путей. Конечные результаты этих путей вместе с транскрипционными факторами, экспрессирующимися по краю нервной пластинки, затем устанавливают новое регуляторное состояние, которое закладывает клетки презумптивного нервного гребня из др. эктодермальных доменов. Этот процесс, который известен как спецификация нервного гребня достигает кульминации в экспрессии bona fide маркеров нервного гребня, таких как FoxD3, Snai1/2 и Sox8/9/10. Как только нервный гребень оказывается специфицированным, он подвергается радикальным изменениям регуляторных генов, которые оказываются способными вовлечь эти клетки в EMT и инициировать миграторное их поведение и диверсификацию.

Induction and formation of the neural plate border

Инициация развития нервного гребня происходит во время гаструляции и приводит к становлению границы нервной пластинки, которая является широкой территорией между будущим нейральным и эпидермальным доменами. Граница нервной пластинки содержит популяцию клеток для многих предшественников, способных давать клетки нервного гребня (Meulemans and Bronner-Fraser, 2002; Sauka-Spengler and Bronner-Fraser, 2008) (Fig. 3A) , а также эктодермальные плакоды, эпидермальные клетки, клетки верхней части нервной трубки и сенсорные нейроны ЦНС (Groves and LaBonne, 2014). Образование края нервной пластинки тесно связано с нейральной индукцией, преимущественно базирующейся на тех же самых сигналах. Хотя имеются некоторые отличия между видами в деталях, процесс индукции нервного гребня схож у лягушек, кур и рыбок данио и, по-видимому, такой же у остальных позвоночных.

Во-первых, сигнальные пути, как полагают, управляют экспрессией набора генов, известных как специфические для края нервной пластинки гены. Эти гены первоначально экспрессируются в виде широкого домена, включающего части нервной пластинки или проспективного эпидермиса. Затем серия позитивных регуляторных взаимодействий приводит к становлению четкого домена, представленного перекрывающейся экспрессией генов, специфичных для границы нервной пластинки (Fig. 3B). Наконец, дальнейшие преобразования сопровождаются ингибирующими взаимодействиями между нейральными и не-нейральными транскрипционными факторами, которые делают более четкой границу между этими территориями и приводят к появлению домена предшественников, наделенных регуляторным состоянием, которое отличается как от нервной пластинки, так и не-нейральной эктодермы.

Первая из этих регуляторных ступеней происходит во время процесса нейральной индукции, когда FGFs работают сочетанно с ингибиторами BMP и WNT, чтобы активировать экспрессию нейральных генов, таких как Erni, Otx2 и Sox1/3 (Fig. 3B) (Streit et al., 2000). Сигналы WNT и BMP возникают в латеральных регионах эмбриона, тогда как ингибиторы этих путей секретируются из медиальных регионов, таких как домен нервной пластинки. Баланс между этими активирующими и ингибирующими сигналами создает медио-латеральный градиент активности WNT и BMP (Fig. 3B), так что будущие клетки края нервной пластинки возникают внутри зоны, подверженной воздействию промежуточных уровней активности WNT и BMP (rev. Groves and LaBonne, 2014). FGFs - секретируемые у кур подлежащим гипобластом, мезодермой у лягушек или латеральной пластинкой у рыбок данио - и передача сигналов Notch также может участвовать в предопределении края нервной пластинки (Endo et al., 2002; Monsoro-Burq et al., 2003; Yardley and Garcia-Castro, 2012). Хотя точный источник этих сигналов и ингибиторов варьирует между видами, картина в целом заключается в том, что комбинированное действие этих сигнальных событий приводит к индукции домена границы нервного гребня.

Хотя цис-регуляторные исследования ранних генов границы нервного гребня довольно скудны, некоторые из этих взаимодействий, как было установлено, являются непосредственными. Напр., X. laevis Gbx2 непосредственно активируется с помощью β-catenin посредством проксимального энхансера, расположенного на 500 п.н. выше точки старта транскрипции (Li et al., 2009). Недавняя работа Garnett с колл. (Garnett et al., 2012) на рыбках данио пролила свет на то, как такие сигналы интерпретируются с помощью цис-регуляторного аппарата генов границы нервной пластинки. Авт. показали, что экспрессия zic3 и pax3a (ортологов Pax3/7 рыбок данио) зависит от множественных энхансеров, которые дифференциально реагируют на BMP, WNT и FGFs. Согласованная активация таких регуляторных элементов приводит к четкой эндогенной экспрессии в домене между нейральной и не-нейральной эктодермой (Garnett et al., 2012). Важно подчеркнуть, что экспрессия генов границы нервной пластинки не униформна, т.к. некоторые гены спецификаторы экспрессируются в более медиальных доменах, тогда как др. экспрессируются более латерально. Напр., Zic1 экспрессируется также в нервной пластинке и играет роль в нейральной индукции (Marchal et al., 2009; Aruga, 2004), тогда как Tfap2a остается активным в проспективном эпидермисе (Luo et al., 2002, 2003; Li and Cornell, 2007). Такая асимметрия, скорее всего, имеет важное значение для последующих стадий, когда граница нервной пластинки становится отделенной в премиграторный нервный гребень и на преплакодные домены. В соответствии с этим, относительные уровни экспрессии генов спецификаторов границы нервной пластинки влияют на судьбы клеток, выбираемые этой популяцией предшественников (Hong and Saint-Jeannet, 2007).

После восприятия этих пересекающихся сигнальных событий клетки границы нервной пластинки включают экспрессию определенных новых наборов транскрипционных факторов, при этом сохраняются др. первоначальные характеристики или из нервной пластинки или не-нейральной эктодермы. Эти гены, которые наз. спецификаторами края нервной пластинки, первоначально транскрибируются на ст. ранней гаструлы и включают Tfap2, Msx1, Zic1, Gbx2, Pax3/7, Dlx5/6, Gata2/3, Foxi1/2 и Hairy2 (Meulemans and Bronner-Fraser, 2004; Nichane et al., 2008; Khudyakov and Bronner-Fraser, 2009) (Fig. 3B). Исследования на многих позвоночных показали, что сначала их экспрессия начинается в регионе границы нервной пластинки, эти транскрипционные факторы участвуют в серии взаимных перекрестно-регуляторных взаимодействий, которые приводят к стабилизации этого регуляторного состояния (Fig. 3C) и гарантируют их продолжительную экспрессию (Monsoro-Burq et al., 2005; Sato et al., 2005; Nikitina et al., 2008; Bhat et al., 2013).

Благодаря своему медленному развитию эмбрионы миног являются пригодной моделью для идентификации взаимодействий между ранними генами границы нервной пластинки и такие исследования также подтвердили, что это родоначальные circuit, которые функционально законсервированы у позвоночных. Напр., Nikitina с колл. показали, что Tfap2a и Msx1 активируют не только один др., но и также Zic1 и Pax3/7 (Nikitina et al., 2008). Tfap2a, как полагают, является ключевым активатором спецификаторов границы нервной пластинки, также необходим для экспрессии Foxi генов и gata2/3 у рыбок данио (Bhat et al., 2013). Более латеральные гены границы нервной пластинки (Dlx5/6, Gata2/3 и Foxi1/3) также позитивно регулируют один др. с помощью многих регуляторных петель (McLarren et al., 2003; Matsuo-Takasaki et al., 2005;Kwon et al., 2010; rev. Grocott et al., 2012). Такие взаимодействия закрепляют регуляторное состояние и делают возможным поддержание экспрессии спецификаторов границы нервной пластинки, которые часто сохраняются в развивающихся предшественниках в ходе поздних стадий развития.

Наконец, граница между нервной пластинкой и границей нервной пластинки становится более четкой за счет ингибирующих взаимодействий между нейральными и не-нейральными факторами (Fig. 3B). Напр., эктопическая экспрессия некоторых генов границы нервной пластинки (Tfap2a, Dlx5/6, Msx1, Foxi1/3) в нервной пластинке приводит к потере нейральных спецификаторов Sox2/3, тогда как нокдаун тех же самых генов вызывает расширение нейрального домена (Feledy et al., 1999; Luo et al., 2001; Matsuo-Takasaki et al., 2005; Pieper et al., 2012). Более того, избыточная экспрессия Sox2/3 приводит к потере маркеров нервного гребня и эпидермиса, подтверждая, что нейральные факторы также могут репрессировать спецификаторы границы нервной пластинки (Wakamatsu et al., 2004; Rogers et al., 2009). Т.о., цис-регуляторные взаимодействия между нейральными генами и спецификаторами границы нервной пластинки приводят к большей четкости границы, отделяющей нервный гребень от предшественников ЦНС (Fig. 3C).

Establishing neural crest identity: the neural crest specifier genes

Становление нервного гребня из границы нервной пластинки характеризуется экспрессией группы генов, дублирующих спецификаторы нервного гребня. Их экспрессия управляется с помощью сочетанного действия более медиальных спецификаторов границы нервной пластинки и сигнальных путей, которые активируются во время спецификации (Fig. 4). Спецификаторы нервного гребня обладают ключевыми функциями. Они активируют программу EMT эффекторов, которая позволяет нервному гребню отделиться от эктодермы и стать миграторными типом клеток. Более того, они также регулируют позитивно др. др., чтобы стабилизировать регуляторное состояние, которое обеспечивает поддержание ряда генов спецификаторов в вычленяющемся и миграторном нервном гребне. Это важно, т.к. комбинация этих транскрипционных факторов, как полагают, поддерживает нервный гребень в недифференцированном состоянии (Sauka-Spengler and Bronner-Fraser, 2008). Фактически, пластический и онтогенетический потенциал нервного гребня, скорее всего, кодируется генами регуляторных circuits, которые характеризуют эту популяцию.

Первые спецификаторы нервного гребня, экспрессирующиеся в возникающем нервном гребне кур, являются FoxD3, Ets1 и Snai1/2 (Khudyakov and Bronner-Fraser, 2009). Экспрессия нервным гребнем FoxD3 регулируется с помощью спецификаторов границы нервной пластинки Pax3/7 и Msx1, которые непосредственно соединяются с двумя регуляторными регионами, которые управляют дифференциальной экспрессией в клетках краниального и туловищного нервного гребня эмбрионов кур (Simoes-Costa et al., 2012). Более того, Pax3/7 и Msx1 необходимы также для экспрессии Ets1 (Barembaum and Bronner, 2013), подчеркивая их важность во время ранних ступеней спецификации нервного гребня. Сходным образом, Pax3/7 также обнаруживают кооперацию с Zic1, чтобы управлять спецификацией нервного гребня у эмбрионов лягушек (Bae et al., 2014; Plouhinec et al., 2014). У X. laevis, напр., Zic1 вместе с Pax3/7 (Milet et al., 2013) соединяются непосредственно с промоторами Snai1 и Snai2 (Plouhinec et al., 2014). Они также непосредственно регулируют экспрессию FoxD3 в нервном гребне туловища кур (Simoes-Costa et al., 2014). Более того, эксперименты на миногах подтвердили, что потребность в Pax3/7, Msx1 и Zic1 для спецификации нервного гребня эволюционно законсервирована, т.к. нокдаун этих трех спецификаторов границы нервной пластинки приводит к потере экспрессии FoxD и SoxE1 (Sauka-Spengler et al., 2007). Итак, эти результаты подтверждают, что Pax3/7, Msx1 и Zic1 являются критическими генами для приобретения качественных особенностей нервного гребня и непосредственно активируют ряд генов спецификаторов нервного гребня у многих видов (Fig. 4B).

Недавно геномное профилирование активных энхансеров в клетках нервного гребня на эмбриональных стволовых клетках человека показало, что TFAP2A действует как всеобщий регулятор генов спецификаторов нервного гребня совместно с ядерными рецепторами NR2F1 и NR2F2 (Rada-Iglesias et al., 2012). Согласно этому исследованию занятие энхансерами нервного гребня с помощью этих трех регуляторов приводит к становлению пермиссивного состояния хроматина, которое необходимо для активации экспрессии генов. Это согласуется с функциональными исследованиями, показавшими, что Tfap2a необходим для спецификации нервного гребня у рыбок данио, лягушек и кур (Schorle et al., 1996; de Croze et al., 2011; Wang et al., 2011b), также продемонстрирована роль Tfap2a во время спецификации нервного гребня, которая не зависит от более ранней функции в становлении границы нервной пластинки (de Croze et al., 2011). Т.о., возможно, что Tfap2a действует как первый транскрипционный фактор в процессе нейральной спецификации, реогранизации конформации хроматина, чтобы предоставить доступ др. транскрипционным регулятором к цис-регуляторным элементам. В соответствии с этой гипотезой, Tfap2a может позволять спецификаторам границы нервной пластинки, таким как Msx1, Pax3/7 и Zic1, получать доступ к энхансерам, которые контролируют экспрессию генов спецификаторов нервного гребня.

Одновременно устанавливается преплакодная область латеральнее домене нервного гребня благодаря экспрессии ключевых плакодных регуляторов Six1, Eya1/2 и Irx1. Эти гены активируются спецификаторами латерального края нервной пластинки (Foxi1/3, Gata2/3 и Dlx5/6) (Fig. 4), которые, в свою очередь, регулируются рядом транскрипционных факторов, приводя к спецификации эктодермальных плакод (Grocott et al., 2012; Sato et al., 2010). Подобно событиям, наблюдаемым на границе нейральной и не-неральной зоны, гены нервного гребня и преплакод используют ряж ингибирующих взаимодействий, которые оперируют, чтобы молекулярно разделить эти две популяции. Напр., у X. laevis Pax3/7 и Msx1 репрессируют транскрипцию Six1 (Sato et al., 2010), тогда как Six1 и Eya1/2 репрессируют Msx1, Pax3/7 и FoxD3 (McLarren et al., 2003; Brugmann et al., 2004; Christophorou et al., 2009) у кур и лягушек. Интересно, что хотя молекулярные маркеры поддерживают четкое разделение между доменами нервного гребня и преплакод, эксперименты по картированию судеб показывают, что эти два типа клеток предшественников всё ещё сущетвенно перемешаны. Мечение индивидуальных клеток на границе поздней нервной пластинки показывает, что индивидуальные клетки предшественники могут давать клетки и нервного гребня и эктодермальные клетки (Selleck and Bronner-Fraser, 1995), демонстрируя, судьба этих клеток ещё не фиксирована.

Те не меее очевидно, что регуляторная программа клеток края нервной пластинки оперирует, чтобы делать разными эти типы клеток с самого начала: с самых ранних стадий, ключевыми регуляторами нервного гребня являются более медиально расположенные относительно плакодных регуляторов и взаимодействия между ними уже могут очерчивать расхождение доменов нервного гребня и преплакод. В соответствии с этим медио-латеральная компартментализация эктодермы позвоночных д. оперировать способом, сходным с действием Drosophila gap геном GRN (Jaeger, 2011): морфогенами, поляризующими и подразделяющими эктодерму на широкие территории, активирующими генами, которые д. осуществлять множественные перекрестно-регуляторные взаимодействия, приводя к прогрессивному ограничению и размежеванию территорий клеток, обладающих сходными регуляторные состояниями.

Важность Msx1, Pax7 и Zic1 в формировании нервного гребня ясна, но др. гены, экспрессирующиеся на границе нервной пластинки, такие как Myb, Myc и Prdm1a (Bellmeyer et al., 2003; Betancur et al., 2010b;Powell et al., 2013), также участвуют в спецификации нервного гребня. Более того, передача их сигналов, по-видимому, важна для экспрессии генов спецификаторов нервного гребня. Ингибирование передачи сигналов WNT после спецификации границы нервной пластинки приводит к потере экспрессии Snai2 и FoxD3 (Garcia-Castro et al., 2002) у эмбрионов кур, в то же время WNTs, как было установлено, действуют совместно с Zic1 и Pax3, чтобы управлять спецификацией нервного гребня у лягушек (Sato et al., 2005). Это окрывает интересную возможность, что WNTs д. действовать как пермиссивные факторы в спецификации нервного гребня. Однако, цис-регуляторный анализ оказался неспособен открыть многие непосредственные места связывания TCF/LEF, которые важны для экспрессии спецификаторов нервного гребня (Betancur et al., 2010b; Barembaum and Bronner, 2013; Simoes-Costa and Bronner, 2013). Исключением, по-видимому, является Snai2, который имеет проксимальный энхансер, непосредственно активируемый с помощью TCF/LEF и β-catenin (Vallin et al., 2001). Т.о., хотя WNTs , как полагают, играют важную роль в спецификации нервного гребня, лежащий в основе механизм остается неизвестен. Интригующая возможность заключается в том, что эти факторы нижестоящих сигнальных систем кооперируют с транскрипционными факторами на краю нервной пластинки, чтобы обеспечить спецификацию нервного гребня.

Очень возможно, что гены спецификаторы края нервной пластинки, гены спецификаторы нервного гребня позитивно взаимно регулируют др. др. Такие взаимодействия трудно анализировать, принимая во внимание, что они действуют в течение короткого периода времени, т.к. клетки быстро переходят в следующее регуляторное состояние (Nikitina et al., 2008). В немногих примерах прямые регуляторные взаимодействия между генами спецификаторами нервного гребня включают краниально-специфический контроль FoxD3 с помощью Ets1 (Simoes-Costa et al., 2012). Тем не менее ясно, что позитивные регуляторные петли приводят к консолидации регуляторного состояния спецификаторов нервного гребня. Напр., у лягушек Snai1/2, по-видимому, позитивно регулирует Twist, FoxD3 и Sox9 (Aybar et al., 2003), тогда как Foxd3 способствует экспрессии Sox10 у мышей (Dottori et al., 2001). Sox10, с другой стороны, активирует Snai2 и самого себя (Honor? et al., 2003), тогда как Sox8 важен для экспрессии др. SoxE генов в той же самой модели у лягушек (O'Donnell et al., 2006). Характеризация более прямых взаимодействий у многих видов будет необходима, чтобы выяснить иерархию и логику контроля экспрессии этих транскрипционных факторов.

Процесс спецификации нервного гребня приводит дискретную клеточную популяцию, расположенную между нервной пластинкой и преплакодным регионом к обладанию общего регуляторного состояния. На этих стадиях премиграторный нервный гребень экспрессирует полный набор генов спецификаторов (включая FoxD3, Snai2, Ets1,Sox8/9/10 и Pax3/7), также как и некоторые гены границы, чья экспрессия сохраняется (Tfap2, Msx1, Zic1). Это новое регуляторное состояние вызывает серьезные структурные изменения на клеточном уровне, которые приводят к отслоению от нервной трубки посредством EMT.

Transcriptional control of the neural crest EMT program

После того как клетки нервного гребня специфицируются, они отделяются от нервной трубки, чтобы начать миграцию (Fig. 5A). Интересно, что те же самые регуляторы транскрипции, которые определяют качественные особенности нервного гребня также являются частью молекулярного аппарата, управляющего EMT, показывая, что качественные особенности клеток нервного гребня и поведение, по крайней мере, частично взаимосвязаны. EMT является сложным процессом, поскольку структурное ремоделирование, происходящее в премиграторном нервном гребне, использует точный контроль за сотнями генов эффекторов. Более того, пути передачи сигналов, таких как WNT также, как полагают, участвуют в EMT, особенно за счет транскрипционной и пост-транскрипционной регуляции Snai1/2 (Vallin et al., 2001;Yook et al., 2006). Большинство работ по EMT нервного гребня сфокусировано на адгезивных изменениях, которые позволяют клеткам отделяться. Эти исследования показывают, что двигателем EMT является прямая репрессия генами спецификаторами нервного гребня структурных генов, участвующих в поддержании эпителиального состояния (Fig. 5B).

Процесс EMT вызывает изменения на клеточной поверхности, которые приводят к растворению слипчивых соединений, делая возможной сегрегацию премиграторного нервного гребня на индивидуальные клетки. Транскрипционная регуляция cadherins, как полагают, является центральной в этом процессе. Исследования на курах показали, что отслоение краниального нервного гребня необходимо для переключения между type 1 cadherins [такими как cadherin 1 (Ecad) и cadherin 2 (Ncad)] и type 2 cadherins (Cad7 и Cad11). Поскольку кадгерины типа 1 обеспечивают более сильные межклеточные взаимодействия и поэтому важны для стабилизации эпителия, они д. подавляться и замещаться кадгеринами типа 2 в мигрирующих клетках. Хотя кадгерины модулируются после EMT у всех модельных организмов, имеются важные межвидовые различия в соответствии с используемыми кадгеринами. Напр., Ncad остается важным для отслоения краниального нервного гребня и миграции у лягушек (Vallin et al., 1998; Kashef et al., 2009). Ряд генов спецификаторов нервного гребня, как полагают, участвует в регуляции кадгеринов во время EMT. Напр., Sox10, по-видимому, репрессирует Ncad в мигрирующих клетках кур (Cheung et al., 2005). Более того, избыточная экспрессия, FoxD3 приводит к подавлению Ncad и активации Cad7 (Dottori et al., 2001; Cheung et al., 2005) у эмбрионов кур, хотя неясно, являются ли эти взаимодействия непосредственными. FoxD3 также участвует в репрессии Tspan18, трансмембранного белка, который способствует зависимой от кадгерина клеточной адгезии и предупреждает отделение нервного гребня (Fairchild and Gammill, 2013). Контроль доступности кадгеринов также распространяется и на др. способы регуляции. Напр., уровни Ncad, ассоциированные с мембранами клеток нервного гребня, с помощью интернализации белка, обеспечиваемой с помощью lysophosphatidic acid (LPA) receptor 2. Активация пути LPA снижает уровень мембранного Ncad, увеличивая текучесть ткани и позволяя клеткам мигрировать коллективно (Kuriyama et al., 2014).

C момента своего открытия, Snai1/2 был связан с EMT во многих системах, от линий раковых клеток до гаструлирующих эмбрионов (Nieto et al., 1994; Blanco et al., 2007). В нервном гребне Snai1/2 функционирует в качестве репрессоров и играет важную роль в подавлении типа 1 кадгеринов во время EMT. Он играет важную роль в репрессии Ncad, при этом он кооперирует с Lmo4, чтобы ингибировать транскрипцию как в нервном гребне, так и в раковых клетках (Ferronha et al., 2013). Важно, что Snai1/2 репрессирует также Cad6b (Taneyhill et al., 2007), классический типа 2 кадгерин, который д. быть подавлен при вычленении нервного гребня (Coles et al., 2007). Это осуществляется посредством прямого взаимодействия с парой E-box сайтов, расположенных вблизи Kozak консенсусной последовательности. Важным партнером Snai1/2 во время процесса EMT является транскрипционный фактор Sox9, который будучи фосфорилирован физически взаимодействует с Snai1/2, чтобы управлять EMT (Cheung and Briscoe, 2003; Liu et al., 2013b).

Две ступени EMT, а именно выделение и дисперсия клеток, по-видимому, частично не связаны с развитием нервного гребня. У X. laevis, клетки краниального нервного гребня отделяются от нервной трубки как группа и как только становятся настоящими мезенхимными на более поздних стадиях, когда они начинают миграцию (Theveneau et al., 2010). Диссоциация клеток нервного гребня обеспечивается частично с помощью Twist, который репрессирует Ecad в вычленяющихся клетках. Нокдаун Twist и его регулятора Hif1α приводит к усилению активности Ecad и ингибированию дисперсии клеток (Barriga et al., 2013). В противовес лягушкам, Twist не экспрессируется в нервном гребне амниот на премиграторной и миграторной стадии, а эффекты нокаута Twist на ранее развитие нервный гребень, по-видимому, вторичные мезодермальные эффекты (Chen and Behringer, 1995). Это подтверждает, что др. регуляторы транскрипции могут существовать у амниот, чтобы обеспечивать EMT.

Одним из таких факторов является, по-видимому, регулятор транскрипции Zeb2 (также известный как Sip1), который подобно Snai1/2, по-видимому, действует как репрессор. У кур нокдаун Zeb2 приводит к сохранению Ecad, который обычно репрессируется в клетках миграторного нервного гребня. Такая неправильная регуляция Ecad не предупреждает вычленения из нервной трубки, а скорее приводит к агрегации слипичивых клеток нервного гребня вблизи нервной трубки (Rogers et al., 2013). Т.о., в то время как репрессия Cad6b необходима для потери адгезии между популяцией нервного гребня и нервной трубки, Ecad обеспечивает межклеточную адгезию между самими клетками нервного гребня и эта репрессия, управляемая с помощью Twist и/или Zeb2, необходима для диссоциации нервного гребня. Итак, эти находки подтверждают, что нервного гребня EMT является двухступенчатым процессом, при этом первая приводит к вычленению нервного гребня от нервной трубки, а вторая участвует в приобретении ими мезенхимных свойств и миграторной морфологии. Процесс вычленения, по-видимому, использует репрессию Cad6b с помощью Snai2, это позволяет клеткам нервного гребня покидать нервную трубку. Ступень дисперсии клеток использует репрессию Ecad с помощью Zeb2 и/или Twist, это делает возможным разделение нервного гребня на индивидуальные мигрирующие клетки.

В дополнение к модуляции адгезии, др. структурные изменения необходимы, чтобы сделать возможной отделение и дисперсию мигрирующих клеток. Сюда входят деградация базальной мембраны с помощью metalloproteases, способствующая инвазии клеток (Theveneau and Mayor, 2011). Доказательства транскрипционного контроля этих событий скупы, хотя Zeb2 и Snai1/2 являются, скорее всего, регуляторами белков ADAM и matrix metalloproteinases в нервном гребне, принимая во внимание их хорошо известные роли в деградации базальных мембран в др. контексте (Joseph et al., 2009). Более того, изменения в организации цитоскелета, которые используют полимеризацию актина в микрофиламенты и их прикрепление к клеточной мембране, являются фундаментальными для дисперсии клеток (Yilmaz and Christofori, 2009). Эти события могут быть обеспечены частично с помощью RhoGTPases, которая выполняет важную роль в контроле динамики актина (Liu and Jessell, 1998; Sit and Manser, 2011) и поэтому, скорее всего, участвует в изменениях клеточной формы, необходимых для EMT. RhoB экспрессируется на высоком уровне в клетках нервного гребня кур и, по-видимому, транскрипционно активируется с помощью Sox5, члена семейства SoxD, который также необходим для экспрессии спецификаторов нервного гребня Snai1/2, FoxD3 и Sox10 (Perez-Alcala et al., 2004). Хотя существуют некоторые противоречия относительно роли RhoGTPases в EMT (Fort and Theveneau, 2014), они, по-видимому, важны для отсоединения клеток нервного гребня (Clay and Halloran, 2013) и могут также влиять на спецификацию нервного гребня путем модулирования экспрессии генов нервного гребня (Guemar et al., 2007). Необходимы дополнительные исследования для выяснения как регуляторный аппарат участвует в спецификации контролируемой цитоскелетной реорганизации когда клетки нервного гребня покидают нервную трубку и приобретают миграторное поведение.

Regulatory interactions in the migratory neural crest

После вычленения мигрирующие клетки нервного гребня приобретают новое регуляторное состояние, экспрессируя ряд транскрипционных факторов, важных для миграции клеток и для инициации программ дифференцировки, которые д. приводить к определенным производным (Fig. 6A). Экспрессия некоторых генов спецификаторов нервного гребня, таких как FoxD3, Ets1 и Sox8/9/10, сохраняется в некоторых или во всех мигрирующих клетках (Khudyakov and Bronner-Fraser, 2009; Betancur et al., 2010a). Однако, цис-регуляторный анализ выявил важные различия между GRNs пермиграторного и миграторного состояний. Напр., экспрессия FoxD3 в премиграторных клетках краниального нервного гребня контролируется с помощью раннего энхансера, NC1, который инициирует экспрессию FoxD3 в только что закрывшейся краниальной части нервной трубки, но быстро выключается, когда клетки вычленяются (Simoes-Costa et al., 2012). Поддержание экспрессии FoxD3 в миграторных клетках сопровождается активацией др. энхансера (NC2) (Simoes-Costa et al., 2012), который нуждается в определенных регуляторных импульсах. Т.о., даже если премиграторные и миграторные клетки обладают рядом общих транскрипционных факторов, программы, лежащие в основе экспрессии одних и тех же регуляторов могут существенно отличаться в зависимости от времени.

Миграторные клетки нервного гребня являются сложными с регуляторной точки зрения, т.к. они постоянно подвергаются действию разных средовых сигналов и также начинают дифференцироваться в разные производные. Удивительно, лишь немногие регуляторы транскрипции идентифицированы в регуляторной ступице (hub) миграторных клеток нервного гребня, в основном благодаря тому факту, что эти клетки перемешаны с др. типами клеток, это затрудняет их изоляцию и характеризацию по сравнению с популяцией чистых клеток. Недавний анализ транскриптома чистых популяций Sox10+ миграторных клеток нервного гребня кур (Simoes-Costa et al., 2014) существенно расширил эти данные. Это исследование выявило ~50 транскрипционных регуляторов, которые концентрируются в миграторных клетках нервного гребня по сравнению с клетками в др. частях тела (Simoes-Costa et al., 2014). Этот набор данных представляет ценный ресурс, хотя роль индивидуальных генов и как они приспосабливаются др к др. в GRN нервного гребня, предстоит ещё установить.

Цис-регуляторный анализ генов внутри регуляторного модуля миграторного нервного гребня подтверждает, что экспрессия этих транскрипционных факторов регулируется с помощью генов спецификаторов нервного гребня (Fig. 6B). Напр., детальный анализ геномного локуса Sox10 у кур показал, что его экспрессия в миграторных клетках нервного гребня обеспечивается одним из двух энхансеров, Sox10E2 и Sox10E1, которые активны в краниальном и туловищном нервном гребне, соотв. Краниальный Sox10E2 энхансер непосредственно регулируется с помощью генов спецификаторов нервного гребня Myb, Ets1 и Sox9, которые достаточны для управления активностью энхансера в нативной эктодерме (Betancur et al., 2010b). Эти результаты согласуются с недавними данными, которые указывают, что Ets1 и Sox9 являются критическими регуляторами миграторного модуля GRN краниального нервного гребня. Нокдаун этих транскрипционных факторов у эмбрионов кур приводит к потере некоторых генов, которые обычно экспрессируются краниальным нервным гребнем, включая Lmo4, RxrG и Ltk (Simoes-Costa et al., 2014). Удивительно, Ets1, по-видимому, является критическим регулятором в приобретении качественных особенностей цефалического нервного гребня за счет обеспечения en masse отслоения от нервной трубки, приводя к волнообразной миграции, наблюдаемой в краниальном нервном гребне (Theveneau et al., 2007).

Цис-регуляторный анализ Sox10 у мышей показал, что множественные энхансеры с полу-перекрывающимися доменами активности, по-видимому, обеспечивают экспрессию этого гена. Эти регуляторные регионы контролируются с помощью Pax3/7, Tfap2a, Sox и LEF/TCF транскрипционных факторов (Werner et al., 2007). Более того, Sox10, как было установлено, непосредственно регулирует самого себя, это обеспечивает его непрерывную экспрессию в миграторных клетках нервного гребня. Эта позитивная саморегулирующая петля базируется на синергичной активности Tfap2a и FoxD3 (Wahlbuhl et al., 2012). То, что FoxD3 действует как прямой регулятор Sox10 в миграторных клетках, подтверждается др. исследованием, которое выявило интронный энхансер в локусе sox10 рыбок данио, который содержит сайты связывания FoxD3, Sox и LEF/TCF (Dutton et al., 2008). Sox9, др. ген из SoxE, который поддерживается в ходе всей миграции клеток нервного гребня, как было установлено, непосредственно активирует свою собственную транскрипцию посредством удаленного вышестоящего энхансера у мыши (Mead et al., 2013). Т.о., позитивная само-регуляция является общераспространенным признаком генов, которые постоянно экспрессируются в миграторных клетках нервного гребня. Обширные цис-регуляторные исследования др. регуляторов миграторных клеток нервного гребня необходимы, чтобы прояснить, как регуляторное состояние клеток нервного гребня возникает во время миграции и как на это влияют внешние сигналы.

Как и ожидалось ряд сигнальных систем участвует в направлении миграции клеток нервного гребня и становлении правильных путей миграции (Takahashi et al., 2013). Мало информации о том, как эти сигнальные молекулы и рецепторы контролируются с помощью миграторной GRN нервного гребня. Тем не менее, Sox10, по-видимому, играет критическую роль и обладает, напр., способностью регулировать экспрессию рецептора neuregulin Erbb3 (Britsch et al., 2001) посредством интронного энхансера, которые активирует миграторные клеткии нервного гребня (Prasad et al., 2011). Sox транскрипционные факторы, как было установлено, регулируют рецепторы для Robo в др. контекстах (Samant et al., 2011). Однако, не совсем ясно, как эти сигнальные системы влияют на миграцию клеток нервного гребня и контролируются на транскрипционном уровне.

From a multipotent neural crest cell to distinct derivatives

Т.к. клетки нервного гребня мигрируют и колонизируют разные части эмбриона, их переход из потоков миграции, чтобы агрегировать с клетками внутри сложных структур, они часто подвергаются реципрокному EMT, т.е. mesenchymal-to-epithelial transition (MET). Они затем вносят вклад в нейроны и глию периферических ганглиев, хрящевые конденсаты и многие органы. Этот процесс обеспечивается с помощью генетических регуляторных программ, которые компартментализуют предшественники нервного гребня на территории с разными регуляторными состояниями. Это прекрасно проиллюстрировано путем профилирования черепно-лицевых энхансеров Attanasio и колл. (Attanasio et al., 2013). В этом исследовании авт. идентифицировали более 100 энхансеров, которые активны в черепно-лицвом секлете, происходящим из нервного гребня, в удивительно разнообразных доменах активности. Функциональный анализ посредством манипуляций с энхансерами показал, что вариации в черепно-лицевой морфологии, также, как и черепно-лицевые аномалии, зависят от комбинированной активности энхансеров (Attanasio et al., 2013). Понимание того, как такая регуляторная сложность разворачивается из программ спецификации и миграции нервного гребня сильно затруднено.

Процесс диверсификации клеток нервного гребня начинается с активации путей (circuits) дифференцировки в субпопуляциях мигрирующих клеток. Эти пути концентрируются вокруг транскрипционных факторов, экспрессирующихся нервным гребнем, которые актиивруют клон-специфичные батареи генов. Диверсификация на разные производные зависит от взаимодействия между регуляторным состоянием миграторных клеток нервного гребня и средовыми сигналами, часто передаваемых разными сигнальными системами. Такие средовые сигналы, особенно взаимодействия с др. тканями, являются ключевыми игроками в детерминации судеб мигрирующих клеток (Takahashi et al., 2013). (Fig. 7).

Chondrocytes

Краниальный нервный гребень играет критическую роль в становлении черепно-лицевого скелета, давая Meckel's хрящ и окружающую мембранозную кость, хрящи языка и мембраны костей челюстей и свода черепа (Noden, 1983; Couly et al., 1996, 1998). Как следствие эта популяция имеет исключительно важное медицинское значение, оказываясь затронутой в большом проценте врожденных дефектов (Hall, 1999). Развитие черепно-лицевого скелета - это сложный процесс, которые использует многие типы клеток и разного типа процессы оссификации (Wilkie and Morriss-Kay, 2001). Важный генетический путь, которые обеспечивает дифференцировку клеток нервного гребня в хондроциты, связан с транскрипционным фактором Sox9, который является непосредственным регулятором некоторых генов, которые важны для дифференцировки хондроцитов. Инактивация Sox9 в клоне нервного гребня приводит к тяжелым черепно-лицевым дефектам у мышей (Mori-Akiyama et al., 2003). Sox9, как полагают, кооперирует с SoxD генами. чтобы активировать нижестоящие мишени, такие как Col2a1 и Agc1 (также известен как Acan). В миграторном краниальном нервном гребне Sox9 регулируется с помощью передачи сигналов WNT и обладает также строгой ауторегуляторной активностью (Bagheri-Fam et al., 2006; Mead et al., 2013) (Fig. 7B).

Транскрипционный контроль Agc1, маркера дифференцировки хряща, иллюстрирует, как регулируются хрящевые гены. У мышей энхансер, расположенный на 10 kb выше точки старта транскрипции, обеспечивает экспрессию репортера, которая воспроизводит экспрессию. эндогенного Agc1. Sox9 соединяется с критическим сайтом в этом энхансере, но только в присутствии Sox5/6. Эти SoxC факторы взаимодействуют с тремя дополнительными сайтами связывания, которые усиливают экспрессию репортера (Han and Lefebvre, 2008). Сходный способ регуляции, базирующийся на прямой активации с помощью Sox9 и SoxD генов, наблюдается и для Col2a1 у мышей (Bell et al., 1997;Lefebvre et al., 1998). Sox9-зависимая активация хондрогенных генов связана с рекрутированием histone acetyltransferase CBP/p300 (Tsuda et al., 2003), которое обеспечивается с помощью Smad3; это показывает, как TGFβ путь может функционировать в качестве пермиссивного сигнала во время формирования хряща (Furumatsu et al., 2005). И Sox9, и SoxD гены также являются критическими для жизнеспособности производных нервного гребня, т.к. их потеря вызывает массивный апоптоз этих клеток у кур и мушей (Cheung et al., 2005; Bhattaram et al., 2010). В мягких тканях лица, таких как язык, Sox9 д. подавляться, чтобы избежать образования хряща. Транскрипционный фактор Osr1 обеспечивает эту репрессию за счет непосредственного связывания промотора Sox9 (Liu et al., 2013a), а его потеря приводит к образованию эктопического хряща в языке мыши. В то время как Osr1 экспрессируется в языке мыши, он отсутствует в языке птиц; интересно, что последний содержит хрящевую ткань. Это иллюстрирует, как изменения в регуляторных импульсах от генов могут приводить к морфологическим изменениям во время эволюции (Liu et al., 2013a).

Melanocytes

Дифференцировка нервного гребня в меланоциты базируется на действии транскрипционных факторов Sox10 и Pax3/7, а также на сигнальных системах, таких как WNTs, endothelins и передача сигналов Kit. Процесс меланогенеза концентрируется вокруг транскрипционного фактора Mitf, маркера спецификации клона меланоцитов (Hou and Pavan, 2008) (Fig. 7C). Sox10 управляет спецификацией меланоцитов путем непосредственной активации Mitf (Lee et al., 2000; Potterf et al., 2000; Verastegui et al., 2000) в клеточных линиях мышей и человека. Mitf , свою очередь, действует как контролер терминальных факторов дифференцировки, активируя некоторые энзимы, ответственные за синтез меланина в пигментных клетках, таких как те, что кодируются с помощью Dct, Tyr и Si (известен также как Pmel) у мыши (Murisier et al., 2007), , также как факторов, важных для жизнеспособности и пролиферации меланоцитов. В этом контексте Sox10 и Mitf оперируют как feed-forward circuit. Во-первых, Sox10 непосредственно активирует Mitf, и затем оба гена кооперируют, чтобы управлять экспрессией меланогенных энзимов (Ludwig et al., 2004). Регуляция Mitf зависит и от др. транскрипционных факторов, включая транскрипционный фактор Pax3/7, который кооперирует с SOX10, чтобы способствовать экспрессии гена (Watanabe et al., 1998) в линиях клеток человека. β-catenin/TCF также важен для само-активации MITF с помощью петли обратной связи в линиях клеток человека, подчеркивая роль передачи сигналов WNT во время этого процесса (Saito et al., 2002). Интересно, что FoxD3 ингибирует экспрессию Mitf, действуя как переключатель транскрипции, чтобы изменять предшественники в направлении др. судеб (Curran et al., 2010). Важно проанализировать, как активация сети дифференцировки меланоцитов ограничивается на определенном субнаборе клеток нервного гребня.

Др. пример feed-forward петли касается Sox10 и Mef2c. Mef2c нокаутные мыши обнаруживают дефекты пигментации при рождении, при этом наблюдается резкое снижение количества меланоцитов в коже. Такие животные также обнаруживают потерю экспрессии Mitf и Dct. Mef2c непосредственно активируется с помощью Sox10, и впоследствии кооперирует с последним, чтобы активировать самого себя и возможно др. мишени (Agarwal et al., 2011). Данные по амниотам подтверждают, что спецификация и дифференцировка меланоцитов в основном базируется на feed-forward транскрипционных circuits, использующих Sox10 и др. транскрипционные факторы, экспрессирующиеся в клетках предшественников, приводящие в результате к мощной активации меланогенных энзимов. Однако, недавний анализ этого circuit у рыбок данио подтвердил альтернативную возможность, согласно которой sox10 вместо этого негативно влияет на экспрессию меланогенных энзимов. Согласно этому исследованию Mitf репрессирует sox10, кооперируясь с HDACs, делая возможной дифференцировку меланоцитов (Greenhill et al., 2011). Такие расхождения в результатах на мышах и рыбках данио могут отражать видо-специфические механизмы, лежащие в основе регуляции меланогенеза у этих организмов (Hou et al., 2006).

Neuronal lineages

Как и у меланоцитов дифференцировка клеток нервного гребня в нейральный и глиальный клоны базируется на контроле Sox10 экспрессии генов. Сигнальные пути влияют на клетки предшественники в отношении типа клеток, в которые они будут вносить вклад. Напр., передача сигналов neuregulin склоняет предшественники нервного гребня адаптировать судьбу периферической глии, тогда как BMPs способствуют нейрональной дифференцировке (Stemple and Anderson, 1993). Симпатические нейроны специфицируются с помощью передачи сигналов BMP, секретируемых дорсальной частью аорты (Saito et al., 2012), которые кооперируют с Sox10, чтобы активировать гены спецификаторы симпатических нейронов Phox2b и Ascl1 (Morikawa et al., 2009) (Fig. 7D and Fig. 8). Эти транскрипционные факторы активируют нижестоящие мишени, такие как Gata3, Insm1 и Hand2, которые обеспечивают контроль клеточного цикла, поддержание жизнеспособности т дифференцировки симпатических нейронов (Rohrer, 2011). Большинство этих данных происходит из генетического анализа нокаутных мышей и мало известно о молекулярных механизмах в этом контексте. Однако, Tfap2a, как было установлено, непосредственно регулирует tyrosine hydroxylase и dopamine β-hydroxylase и, скорее всего, участвует в дифференцировке этих клеток (Kim et al., 2001). Дальнейшая диверсификация симпатических нейронов базируется на транскрипционном факторе Hmx1, которые направляют дифференцировку в направлении noradrenergic симпатической судьбы. Этот регулятор репрессируется в cholinergic нейронах с помощью Trkc (также известным как Ntrk3) и Ret (Furlan et al., 2013).

Приведенные выше примеры диверсификационных circuits никоим образом не представляют исчерпывающий диапазон. Помимо меланоцитов, хрящей и симпатических ганглиев, клетки нервного гребня формируют многие др. производные, включая сенсорные нейроны, Шванновские клетки, адипоциты и гладкомышечные клетки. В общем, диверсификация нервного гребня зависит от взаимодействия присущего клеткам транскрипционного аппарата и интерпретации им внешне-средовых сигналов, передаваемых по разными сигнальным путям. В этом отношении, SoxE гены играют критическую роль, стоящую выше многих клонов клеток нервного гребня, или непосредственно управляя дифференцировкой (напр., как в случае Sox9 в дифференцировке хондроцитов) или регулируя драйверы, которые активируют батареи генов дифференцировки. Более того, др. компоненты ранней GRN нервного гребня (Tfap2, Pax3/7 и Sox5/6) также участвуют в более поздних процессах диверсификации нервного гребня, подчеркивая что транскрипционный аппарат нервного гребня может быть перепрофилирован, так что факторы. которые действуют для поддержания плюрипотентности, могут впоследствии использоваться в программах дифференцировки.

Epigenetic regulation in neural crest formation

Хотя мы сфокусировались на роли факторов транскрипции в программе, лежащей в основе развития нервного гребня, становится всё яснее, что этот процесс содержит дополнительные слои сложности регуляции. Напр., транскрипционные факторы часто работают совместно с модификаторами хроматина, чтобы активировать или репрессировать экспрессию генов (Wang et al., 2011a; Strobl-Mazzulla and Bronner, 2012). Сходным образом, экспрессия генов может быть модулирована с помощью пост-транскрипционной регуляции, обеспечиваемой с помощью РНК-связывающих белков и малых регуляторных РНК, а также пост-трансляционных модификаций транскрипционных факторов самих себя с помощью фосфорилирования, сумоилироания и др. изменений, которые модифицируют эффективность и стабильность связывания (Taylor and LaBonne, 2007). Модификации ДНК и гистонов играют особенно важную роль в специфкации и EMT нервного гребня .

Метки метилирования ДНК, располагающиеся на промоторных регионах генов с помощью DNA methyltransferases (DNMTs), играют важную роль в замалчивании генов и тем самым действуют, чтобы ограничить выбор судеб во время развития (Okano et al., 1999; Smith and Meissner, 2013). В нервном гребне, DNMTs, как было установлено, важны для сегрегации нервного гребня от нейральных клонов. Dnmt3a, которые экспрессируются на краю нервной пластинки, непосредственно репрессируют экспрессию нейральных генов Sox2/3 с помощью метилирования CpG островков на территории предшественников нервного гребня. Нокдаун Dnmt3a вызывает экспансию нервной пластинки и потерю спецификации нервного гребня (Hu et al., 2012). Хотя неясно, как Dnmt3a рекрутируются на промоторный регион Sox2/3 в дорсальной части нервной трубки, существует интригующая возможность, что она может быть рекрутирована с помощью транскрипционных факторов, экспрессирующихся в регионе предшественников нервного гребня. Роль её паралога Dnmt3b менее ясна. Мутации в DNMT3B, по-видимому, сцеплены с черепно-лицевыми дефектами у человека, присутствующими у носителей синдрома ICF (Jin et al., 2008), и имеются доказательства роли этого регулятора в черепно-лицевом развитии у рыбок данио (Rai et al., 2010). Однако, кондиционный нокаут Dnmt3b в нервном гребне мыши не вызывает очевидных связанных с нервным гребнем фенотипических отклонений (Jacques-Fricke et al., 2012). Т.о., могут существовать видо-специфические различия в функции энзимов.

Метилирование гистонов влияет на регуляцию генов, предопределяя репрессивное или транскрипционно активное состояние. Метки метилирования, закрепленные на гистонах нуклеосом с помощью methyltransferases, удаляются с помощью demethylases (Dambacher et al., 2010). Интересно, что удаление репрессивных меток метилирования необходимо для программ спецификации нервного гребня. Это выполняется с помощью histone demethylase Kdm4a (Jmjd2a), которая удаляет эти метки с промоторов Sox10 и Snai2 (Strobl-Mazzulla and Bronner, 2012). На последних ст. развития нервного гребня гистоновая деметилаза Phf8 действует сходным образом и деметилирует промоторы генов, важных для черепно-лицевого развития (Qi et al., 2010).

Разные типы гистоновых модификаций возникают в результате ацетилирования лизина, которые ассоциируют с активными транскрипционными состояниями (Haberland et al., 2009b), и пригодны для исследований регуляции генов в нервном гребне (Rada-Iglesias et al., 2012). Во время EMT, как известно, белки Snail непосредственно репрессируют cadherins. В клетках нервного гребня мишенью для Snai2 является Cad6b, чья репрессия вызывает рекрутирование histone deacetylase (HDAC) репрессивного комплекса на промотор Cad6b , это осуществляется за счет взаимодействий между Snai2, Sin3a и адапторным белком Phd12 (известным также как Phf12 или Pf1) (Strobl-Mazzulla and Bronner, 2012). HDACs также экспрессируются в мигрирующих клеткаъ нервного гребня (Simoes-Costa et al., 2014) и участвуют в диверсификации производных. Напр., HDACs участвуют в репрессии foxd3 во время спецификации меланофоров у рыбок данио (Ignatius et al., 2008)и, как было установлено, играют важную роль в развитии периферической глии (Jacob et al., 2014) и производных эктомезенхимы (Haberland et al., 2009a) у мышей.

Эти примеры демонстрируют, что эпигенетические модификации являются интегральной частью механизма регуляции генов, играя критическую роль в модуляции экспрессии генов. Подобно др. популяциям клеток предшественников, клетки нервного гребня сходным образом подвергаются глобальному ремоделированию хроматина, когда они специфицируются и дифференцируются в разные производные (Chen and Dent, 2014). Однако, энзимы, которые катализируют добавление или удаление эпигенетических меток, по большей части, неспособны интерпретировать геномный код. Как следствие, эпигенетический механизм зависит от транскрипционных факторов GRN, чтобы установить свое предназначение в геноме и корректно маркировать соотв. последовательности мишени. В самом деле, исследования показали, что эпигенетические репрессивные комплексы рекрутируются на цис-регуляторные регионы и промоторы с помощью транскрипционных факторов (Ropero and Esteller, 2007; Wang et al., 2011a; Tam and Weinberg, 2013). Т.о., эти добавочные слои регуляции от природы связаны с GRN нервного гребня.

Conclusions

The data presented here knit together our current knowledge of the neural crest program, from early establishment of the neural plate border to diversification into varied derivatives. The neural crest GRN is a feed-forward self-assembly 'machine' that combines positive transcriptional inputs with repressive interactions that establish firm borders between adjacent tissues, such as non-neural ectoderm, ectodermal placode, presumptive neural crest and future neural plate territories. Although these regulatory principles are shared among all developing neural crest cells, it is important to keep in mind that the neural crest is not a homogenous population and that differences in GRN structure underlie the regional properties observed in cranial, vagal, trunk and sacral neural crest. Thus, comparative gene regulatory analysis will be crucial to uncover the molecular mechanisms that are responsible for the differences in potential and behavior observed between neural crest subpopulations at different axial levels.

Our current view of this GRN is summarized in the BioTapestry visualization in Fig. 8, which focuses on the cranial neural crest. This is, by definition, overly simplified since many inputs have yet to be placed within the network and there are important differences between organisms that have been largely collapsed here into a pan-vertebrate model. Furthermore, although we have emphasized the role of transcription factors in the GRN, these regulators often function in large complexes in concert with epigenetic modifiers and non-coding RNAs including lncRNAs and microRNAs. Future experiments will need to further refine this GRN and focus on identifying direct interactions therein, as best accomplished by detailed cis-regulatory analysis. New technologies for identifying neural crest enhancers and performing genome editing will greatly facilitate elaboration of the neural crest GRN. This, in turn, will facilitate expansion of this network to other axial levels and provide increasingly detailed resolution of the events that underlie the formation of this fascinating cell type - the neural crest.

Establishing neural crest identity: a gene regulatory recipe Marcos Simoes-Costa, Marianne E. Bronner Development 2015 142: 242-257; doi: 10.1242/dev.105445

Establishing neural crest identity: a gene regulatory recipe
Marcos Simoes-Costa, Marianne E. Bronner
Development 2015 142: 242-257; doi: 10.1242/dev.105445