WMZ: Z191701361450 WMR: R209318204033 |
Microarray identification of novel genes downstream of Six1, a critical factor in cranial placode, somite, and kidney development | |
Six1 plays an important role in the development of several vertebrate organs, including cranial sensory placodes, somites, and kidney. Although Six1 mutations cause one form of branchio-otic syndrome (BOS), the responsible gene in many patients has not been identified; genes that act downstream of Six1 are potential BOS candidates. Results: We sought to identify novel genes expressed during placode, somite and kidney development by comparing gene expression between control and Six1-expressing ectodermal explants. The expression patterns of 19 of the significantly up-regulated and 11 of the significantly down-regulated genes were assayed from cleavage to larval stages. A total of 28/30 genes are expressed in the otocyst, a structure that is functionally disrupted in BOS, and 26/30 genes are expressed in the nephric mesoderm, a structure that is functionally disrupted in the related branchio-otic-renal (BOR) syndrome. We also identified the chick homologues of five genes and show that they have conserved expression patterns. Conclusions: Of the 30 genes selected for expression analyses, all are expressed at many of the developmental times and appropriate tissues to be regulated by Six1. Many have the potential to play a role in the disruption of hearing and kidney function seen in BOS/BOR patients. Developmental Dynamics 244:181-210, 2015. Рисунки к статьям |
Гены Six позвоночных близко родственны Drosophila sine oculis гену, который является критическим для развития зрительной системы мух (Cheyette et al.,1994). Они играют главные роли в развитии глаз, а также в др. чувствительных органах, краниальных сенсорных ганглиях, ЦНС, мышцах, почках, гениталиях, зачатках конечностей и лёгких (Oliver et al., 1995; Kawakami et al., 1996; Ohto et al., 1998; Spitz et al., 1998; Pandur and Moody, 2000; Ghanbari et al., 2001; Fougerousse et al., 2002; Laclef et al., 2003; Bessarab et al., 2004; Xu et al., 2003; Zheng et al., 2003; Brodbeck and Englert, 2004; Ozaki et al., 2004; Zou et al., 2004, 2006; Brugmann and Moody, 2005; Grifone et al., 2005; Konishi et al., 2006; Ikeda et al., 2007, 2010; Chen et al., 2009; Sato et al., 2010; Guo et al., 2011). Некоторые эксперименты показали, что Six1 выполняет центральную роль в контроле развития краниальных сенсорных плакод, которые являются участками утолщенной эмбриональной эктодермы, которые дают переднюю часть гипофиза, обонятельный сенсорный эпителий, хрусталики, слуховые и вестибулярные структуры внутреннего уха и крупные дистально расположенные нейроны краниальных сенсорных ганглиев (rev. Streit, 2004, 2006; Bailey and Streit, 2006; Schlosser, 2007, 2010; Streit, 2007; Ladher et al., 2010; Park and Saint-Jeannet, 2010; Graham and Shimeld, 2013; Saint-Jeannet and Moody, 2014). Потеря функции Six1 или репрессия его нижестоящих мишеней у Xenopus, кур и рыбок данио приводит к потере маркеров, специфичных для preplacodal region (PPR) и плакод (Brugmann et al., 2004; Bricaud and Collazo, 2006, 2011; Schlosser et al., 2008; Christophorou et al., 2009). В частности наблюдаются дефекты слуховой плакоды (Christophorou et al., 2009) и потеря волосковых клеток внутреннего уха (Bricaud and Collazo, 2006, 2011). Six1-нулевые мыши имеют аномалии обоняния, внутреннего уха и краниальных сенсорных ганглиев (Oliver et al., 1995; Laclef et al., 2003; Zheng et al., 2003; Ozaki et al., 2004; Zou et al., 2004; Konishi et al., 2006; Ikeda et al., 2007, 2010; Chen et al., 2009). Напротив, избыточная функция Six1 специфически в PPR расширяет домены плакодных генов у лягушек и кур (Brugmann et al., 2004; Christophorou et al., 2009), демонстрируя, что он является ключевым регулятором судеб плакод.
У человека SIX1 могут вызывать branchio-otic syndrome (BOS, особенно BOS3; Online Mendelian Inheritance in Man [OMIM]#608389; www.omim.org), чьи фенотипические отклонения включают умеренные черепно-лицевые дефекты и значительную потерю слуха (Ruf et al., 2004). Описано 9 мутаций у пациентов с BOS3 от 16 неродственных семей. 7 являются миссенс мутациями в N-терминальном домене, называемом Six Domain (SD; Kawakami et al., 2000), которые нарушают взаимодействия с ко-факторами, и две мутации в гомеодомене, которые нарушают взаимодействия с ДНК (Ruf et al., 2004; Ito et al., 2006; Sanggaard et al., 2007; Kochhar et al., 2008; Patrick et al., 2009, 2013; Noguchi et al., 2011). У рыбок данио экспрессия мутантной Six1 мРНК, которую несут BOS пациенты в SD (R110W) вмешивается во взаимодействие Six1/Eya1, которое необходимо для образования волосковых клеток (Bricaud and Collazo, 2011). Мутантные Catweasel (Cwe) мыши обладают миссенс мутацией в SD (Bosman et al., 2009), которая сходна, по крайней мере, с одной в семье с BOS (Mosrati et al., 2011). Гетерозиготные Cwe мыши имеют эктопический ряд волосковых клеток в улитке, а гомозиготные Cwe мыши обнаруживают потерю волосковых клеток в улитке, полукружных каналах и utricle. Мутации в Six1 ко-факторе EYA1 (Ohto et al., 1999) вызывают BOS1 (OMIM #602588) и родственный branchio-otic-renal (BOR1; OMIM #113650) синдром, при котором нарушается дополнительно развитие почек (Abdelhak et al., 1997; Kumar et al., 1997; Ozaki et al., 2002; Rodriguez-Soriano, 2003; Spruijt et al., 2006). Однако, мутации в Six1 и Eya1 объясняют только приблизительно половину случаев BOS и BOR, указывая тем самым, что имеются и др. гены в генетическом пути Six/Eya, которые вносят вклад в этот синдром.
Чтобы идентифицировать потенциальные причинные гены для BOS и BOR, мы сгенерировали более полный список генов, регулируемых, скорее всего, с помощью транскрипционного фактора Six1. Мы экспрессировали Six1 в animal cap ectodermal explants (ACs), которые подращивали до ст. ранней нервной пластинки, времени, когда Six1 экспрессируется на высоком уровне в PPR, и сравнивали профили их экспрессии с контролем, с не инъецированными ACs, которые давали не нейральный эпидермис. Мы описали паттерны экспрессии 30 генов, которые достоверно отличались в этих двух наборах данных, большинство из которых ранее не было охарактеризовано у Xenopus. мы также идентифицировали несколько гомологов у кур и представили паттерны их экспрессии. Большинство охарактеризованных генов экспрессировалось в правильное время, т.е. , скорее всего, регулировалось с помощью Six1, в частности в отических плакодах и нефрической мезодерме. Т.о., они могут играть роль в нарушениях слуха и функции почек, наблюдаемых при BOS/BOR. Results and Discussion Six1 Alters the Expression of Numerous Genes in Ectodermal Explants Из примерно 14,400 генов, представленных на Affymetrix GeneChip v1, 72 экспрессировались вдвое на более высоком уровне (P < 0.05, analysis of variance [ANOVA]) в Six1-инъецированных ACs (Table 1). Характеристики генов определяли с помощью BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) и GOs были определены с помощью поиска баз данных генов для Xenopus и мышей (http://www.xenbase.org; http://www.informatics.jax.org). Гены с известной функцией наиболее часто вовлекались в метаболические процессы (15.2%), передачу сигналов (11.1%) и транскрипцию (9.7%); было идентифицировано и немного др. функций (Fig. 1A).
Table 1. Genes Up-regulated >2-Fold by Six1 in Microarray Assays
Affymetrix Probe set ID Fold change Accession no. Gene title, unigene cluster, or EST name Xl.19919.1.A1_at 4.613 BQ400635 UniGene Xl.940; neuropilin1 (nrp1), aka A5-protein Xl.17484.1.A1_at 4.428 BG812762 EST: daf30h01.y1; similar to arrestin beta2 (arrb2) Xl.24006.1.S1_at 4.300 AW640051 UniGene Xl.78601; aldehyde dehydrogenase 7 family, member A1 (aldh7a1) Xl.3228.1.A1_at 3.811 BG022063 EST: dg21d06.x1 Xl.26192.1.A1_at 3.561 CD324856 EST: AGENCOURT_14164067; most similar to Xenopus laevis clone CH219-20I13 Xl.20029.2.S1_a_at 3.484 M80798.1 PDGF? receptor Xl.21032.1.S1_at 3.413 AF546707.1 Cryptic tubulin Xl.6623.1.S1_at 3.200 BU900288 UniGene Xl.22052; heterogeneous nuclear ribonuclear protein R (hnrnpr) Xl.23944.1.S1_at 3.057 BG885936 UniGene Xl.37859; hypothetical protein LOC100037047 Xl.12902.1.A1_at 3.046 BJ092409 EST: BJ092409 Xl.19820.1.A1_at 3.030 BQ399495 EST: NISC_mp03h05.x1; most similar to Xenopus laevis clone CH219-33D5 Xl.2439.1.A1_at 2.996 BG023545 UniGene Xl.2439; hypoxanthine phosphoribosyltransferase1 (hrpt1) Xl.23880.1.A1_at 2.989 BJ083747 UniGene Xl.4536; RNA binding motif protein 42 (rbm42-b) Xl.19782.1.A1_at 2.958 BQ398913 UniGene Xl.52003; hypothetical protein LOC 414689 Xl.12791.1.A1_at 2.944 BJ090916 EST: BJ090916 Xl.23533.1.S1_at 2.918 BC044278.1 Uncx4.1 homeobox Xl.19504.1.S1_at 2.879 BQ386473 UniGene Xl.19504; xyloside xylosyltransferase 1 (xxylt1) Xl.11568.1.S1_a_at 2.859 AW872117 EST: db22e02.y1; matches several genes at 5? end Xl.21833.1.A1_at 2.839 BG345845 EST: dg42a07.y1 Xl.17880.1.A1_at 2.826 BG812152 EST: daf66c03.x1 Xl.4077.2.A1_at 2.780 BF024988 EST: dc82d05.x1; similar to mitogen-activated protein kinase binding protein 1 Xl.15434.2.A1_at 2.689 BJ079756 UniGene Xl.15434; N-acetylglucomsamine-1-phosphate transferase, gamma subunit (gnptg) Xl.17452.3.A1_at 2.665 BG409705 UniGene Xl.54929; cyclin L1 (ccnl1) Xl.3765.1.A1_at 2.641 BF428468 UniGene Xl.6193; Polymerase (RNA) II polypeptide I (polr2i) Xl.17267.1.S1_at 2.638 BM262144 UniGene Xl.17267; Predicted hamartin-like (aka tuberous sclerosis 1; tsc1) Xl.6714.1.S1_at 2.620 CD360857 UniGene Xl.6714; MACRO domain containing protein 2 (macrod2) Xl.8697.1.A1_at 2.618 AW764878 UniGene Xl.8697; empty spiracles homeobox 2 (emx2) Xl.20538.1.S1_at 2.546 CD327089 UniGene Xl.20538; strongly similar to malignant fibrous histiocytoma amplified sequence 1 (mfhas1) Xl.21807.1.S1_at 2.526 BC041247.1 Guanine nucleotide binding protein 13 gamma Xl.16468.1.A1_at 2.513 BJ048720 EST: BJ048720; most similar to Xenopus laevis clone CH219-51A4 Xl.26433.1.A1_at 2.502 BJ077709 EST: BJ077709 Xl.15912.2.A1_at 2.482 BJ055680 UniGene Xl.18703; phosphatase, orphan 2 (phospho2) Xl.14658.1.A1_at 2.479 BJ052130 EST: BJ052130 Xl.9485.1.A1_x_at 2.479 BG264616 UniGene Xl.10876; strongly similar to Xenopus tropicalis predicted nucleoporin 133kDA (nup133) Xl.11066.1.A1_at 2.449 AW764707 UniGene Xl.11066; autophagy related 4D, cysteine peptidase (atg4d) Xl.9896.1.A1_at 2.432 BG019991 EST: dc46e08.x1; most similar to Xenopus tropicalis clone CH216-157J16 Xl.25648.2.A1_at 2.398 BI940543 UniGene Xl.76517; strongly similar to Xenopus tropicalis predicted t-lymphoma invasion and metastasis-inducing protein 1 (tiam1) Xl.21726.1.S1_at 2.323 CA790591 EST: AGENCOURT_10301409 Xl.18330.1.S1_at 2.311 BJ049080 UniGene Xl.64976; moderately similar to Xenopus tropicalis predicted zinc finger protein 335-like Xl.4441.1.A1_at 2.305 BF072093 EST: db51d10.x1 Xl.11394.1.A1_at 2.297 AW639023 UniGene Xl.11394; strongly similar to JNK1/MAPK8-associated membrane protein (jkamp) Xl.535.2.S1_a_at 2.290 AF172400 P75 neurotrophin receptor a-2 (p75NTRa) Xl.8063.1. S1_at 2.255 AY099224 Tumorhead (trhd-a) Xl.22358.1.A1_at 2.249 BG021407 UniGene Xl.34405; E74-like transcription factor (elf2) Xl.14141.1.A1_at 2.192 BJ079748 EST: BJ079748; most similar to ribosomal protein L14 (rpl14) Xl.2873.1.A1_at 2.187 BG018413 UniGene Xl.18253; Uncharacterized LOC 100037177 Xl.26415.1.S1_at 2.187 CD361045 UniGene Xl.26415; testis, prostate and placenta expressed (tepp) Xl.18588.1.S1_at 2.184 BI442945 UniGene Xl.77328; Uncharacterized LOC496297 Xl.3096.1.A1_at 2.171 BJ085327 UniGene Xl.57373; transmembrane and coiled-coiled domain family 2 (tmcc2) Xl.13487.1.A1_at 2.164 CB564242 UniGene Xl.13487; Uncharacterized protein MGC154312 Xl.11706.1.S1_at 2.163 AY221506.1 Putative polyA-binding protein (PABPN2) Xl.11463.3.S1_a_at 2.162 BU917037 UniGene Xl.19374; G protein-coupled receptor kinase-interacting ArfGAP (git2) Xl.1095.1.S1_at 2.162 S71764.1 Sperm-specific basic nuclear protein 5 (sp5) Xl.13738.1.A1_at 2.149 BJ075690 EST: BJ075690; most similar to WNT-inhibitory factor 1 (wif1) Xl.16242.1.A1_at 2.145 BJ100481 UniGene Xl.16242; strongly similar to sperm associated antigen 16 protein-like (spag16) Xl.16853.1.S1_at 2.137 BG579925 UniGene Xl.46098; weakly similar to predicted protein FAM178A Xl.25532.1.A1_at 2.127 BJ055327 UniGene Xl.25532; strongly similar to hypothetical protein LOC100488559 Xl.18739.1.S1_at 2.119 BI445731 UniGene Xl.18739; KIAA1456 Xl.12870.1.A1_at 2.119 BJ082868 UniGene Xl.12870; moderately similar to zinc finger protein 665-like Xl.21416.1.S1_at 2.107 AW638131 UniGene Xl.28718; Pseudouridylate synthase 7 homolog (pus7) Xl.12763.1.A1_at 2.104 BJ082426 EST: BJ082426 Xl.21588.1.A1_at 2.093 AB054535.1 Heparan sulfate 6-O-sulfotransferase (hs6st1) Xl.13831.3.S1_at 2.088 BJ075928 UniGene Xl.72612; moderately similar to predicted coiled-coiled domain-containing C6orf97 Xl.9563.1.S1_at 2.078 AF480430.1 Pbx1b Xl.6583.1.S1_at 2.078 AW635173 UniGene Xl.6583; weakly similar to wars2 gene product Xl.15729.1.A1_at 2.066 BJ050119 EST: BJ050119 Xl.401.1.S1_at 2.058 AF032383 Metalloprotease-disintegrin (MDC11b, aka adam11) Xl.3198.1.A1_at 2.050 BG021827 UniGene Xl.53283; testis expressed 26 (tex26) Xl.19719.1.A1_at 2.049 BQ398489 EST: NISC_mo08b08.x1; moderately similar to Xenopus laevis canopy FGF signaling regulator 1 (cnpy1) Xl.8108.1.A1_at 2.045 BJ047639 UniGene Xl.47742; Uncharacterized LOC100036828 Xl.9031.1.A1_x_at 2.019 BG579679 UniGene Xl.9031; Chromosome 5 open reading frame 22 (c5orf22) Xl.12209.1.A1_at 2.010 BJ082981 EST: BJ082981; most similar to Xenopus laevis hypothetical protein MGC115205 Figure 1. Gene Ontology analysis of the genes whose expression levels in animal cap explants were significantly altered >two-fold by Six1 in a microarray analysis. A: The proportions of genes up-regulated by Six1 in each of several GO functional classes. B: The proportions of genes down-regulated by Six1 in each of several GO functional classes. Из этих 72 генов лишь немногие обнаруживали свое участие в развитии краниальных плакод: Nrp1, platelet-derived growth factor-alpha (PDGFα ) receptor, и p75 neurotrophin receptor. Передача сигналов Nrp1-semaphorin регулирует миграцию нервного гребня, которая влияет на вклад плакод в краниальные ганглии у Xenopus и мышей (Koestner et al., 2008; Schwarz et al., 2008). Передача сигналов PDGF может индуцировать формирование офталмической плакоды (McCabe and Bronner-Fraser, 2008) и в комбинации с fibroblast growth factor (FGF) играет роль в спецификации PPR (Kwon et al., 2010). p75 neurotrophin рецептор экспрессируется в клетках нервного гребня и плакод при развитии краниальных ганглиев (Vazquez et al., 1994). Кроме того, некоторые из идентифицированных генов выполняли функции, сходные с теми, что приписываются Six1, подкрепляя идею, что они может быть в том же самом генетическом пути. Напр., Six1, как известно, регулирует клеточную пролиферацию и избыточно экспрессируется при некоторых раках (Ford et al., 1998; Coletta et al., 2004; Patrick et al., 2009; Li et al., 2013; Patrick et al., 2013); гены, известные своим участием в регуляции клеточного цикла (Uncx4.1; Mitogen-activated protein kinase binging protein 1, Cyclin L1; Trhd1-a) и клеточных движений/рака (Tiam1, Elf2, Nrp1, p75, Pbx1; MDC11b) были найдены в категории усиливающих свою активность. Развитие плакод у некоторых позвоночных усиливается с помощью передачи сигналов FGF и снижается с помощью передачи сигналов Wnt (Phillips et al., 2001; Leger and Brand, 2002; Maroon et al., 2002; Liu et al., 2003; Brugmann et al., 2004; Ahrens and Schlosser, 2005; Litsiou et al., 2005; Martin and Groves, 2005; Matsuo-Takasaki et al.,2005; Bailey et al., 2006; Hong and Saint-Jeannet, 2007; Park and Saint-Jeannet, 2008; Esterberg and Fritz, 2009; Patthey et al., 2008, 2009; Kwon et al., 2010; Grocott et al., 2012); предполагаемые регуляторы пути FGF (Cnpy1, Elf2, Ism1) и Wnt (Arrb2, Wif1) оказались в категории с усилением активности. Мы также искали гены, усиливающие свою активность более 1.6-раз (P < 0.05, ANOVA), чтобы идентифицировать ранее охарактеризованные гены, которые могли бы находиться на пути Six1, исходя из опубликованных паттернов (Table 2). Среди этих генов, экспрессирующихся в краниальных сенсорных плакодах (Ism1, Pax6, Irx1, Arnt), сомитах (Arnt, HoxA3) и/или в развитии почек (Arnt, Mdx4, Irx1).
Table 2. Selected Genes Regulated >1.6-Fold by Six1 in Microarray Assays Чтобы оценить значимость результатов микрочипа, мы осуществили несколько экспериментов. Во-первых, мы измерили экспрессию 10 активируемых генов с помощью quantitative polymerase chain reaction (qPCR); все 10/10 экспрессировались на высоких уровнях в Six1-инъецированных ACs по сравнению с контрольными ACs, половина из них была статистически достоверной (Table 3). Во-вторых, мы вызывали нокдаун эндогенного Six1 у целых эмбрионов путем инъекции morpholino антисмысловых олигонуклеотидов; это снижало экспрессию 17 из 20 обычно активированных кандидатов (Table 4). Figure 2 показывает пример: потеря экспрессии в сомитах Cdca7l; потеря экспрессии в нервном гребне HoxA3; потеря экспрессии в нервной трубке Ism1. В-третьих, мы повышали экспрессию Six1: при этом 12 из 20 активируемых кандидатов обнаруживали расширение доменов экспрессии после инъекции мРНК, кодирующей дикого типа Six1 или активирующую Six1-VP16 конструкцию и ни один из 20 не расширял домен экспрессии после репрессивной EnR-Six1 конструкции (Table4). Напр., Figure 2 показывает: более широкую нервную пластинку и/или экспрессию нервного гребня с помощью дикого типа Six1 (BG022063, Nfya) или Six1-VP16 (Frizzled 10b, Pbx1); снижение Frizzled 10b с помощью EnR-Six1. Хотя почти все протестированные кандидаты нуждаются в Six1, стало неожиданностью, что только приблизительно половина из них усиливала или расширяла свой домен экспрессии с помощью дикого типа или активирующего Six1. Однако, эти результаты согласуются с SO активностью в глазном поле мух: избыточная экспрессия редко индуцировала ткань эктопических глаз (Jusiak et al., 2014) и это способствовало выбору судьбы глаз в основном за счет репрессии альтернативных судеб (Anderson et al., 2012). Т.о., многие из генов, усиливающих свою активность были идентифицированы с помощью микрочипа как, скорее всего, нижестоящие по отношению Six1, исходя из опубликованных функциях у Xenopus, кур или мышей, опубликованных паттернов экспрессии и/или изменений экспрессии после потери или избыточной функции Six1. Однако, Six1 ChIP анализ необходим для подтверждения, что любой из этих кандидатов является непосредственной мишенью.
Table 3. qPCR Analysis of Expression Levels in Six1-Injected Animal Cap Explants Relative to Control Explants Table 4. Percentage of Embryos Showing Altered Expression Domains of Up-regulated Genes in Response to Changes in Six1 Activity Figure 2. Examples of changes in gene expression of putative Six1 targets after knock-down of endogenous Six1 levels by injection of antisense morpholino oligonucleotides (Six1 MOs), increased levels of wild-type Six1 by mRNA injection (Six1 WT), activation of Six1 targets by mRNA injection of an activating construct (Six1-VP16), or repression of Six1 targets by mRNA injection of a repressive construct (EnR-Six1) (see Brugmann et al., 2004 for validation of these constructs). Six1 MOs: Expression of Cdca7l in the segmenting somites (arrows on control [ctrl] side) is lost on the injected (inj) side (side views, anterior to left). Expression of HoxA3 in the neural crest (nc) is greatly reduced on the injected side, whereas hindbrain (hb) expression is maintained (side views, anterior to left). Expression of Ism1 is lost in the midbrain (arrow) (frontal view, dorsal to the top). Expression of IMAGE 3399268 is expanded in the neural plate (line depicts width from midline to lateral border) on the injected side (dorsal view, anterior to the bottom). Expression patterns of Cnfn1-a in the hatching gland (arrows) and of Snail1 in the migrating neural crest are reduced and disrupted on the injected sides (frontal views, dorsal to the top). Six1 WT: Expression of BG022063 is broader in the neural plate (line) and neural crest (bracket) on the injected side (frontal view, dorsal to the top). Expression of Nfya is broader in the neural tube (line) on the injected side (dorsal view, anterior to the top). Expression of IMAGE 3399268 in the segmented somites (arrows, ctrl side) is lost on the injected side (side views, anterior to left). Expression of IMAGE 4057931 in the neural crest (bracket), otocyst (oto) and trigeminal ganglion (arrow) is greatly diminished on the injected side (side views, anterior to left). Six1-VP16: Expression of Frizzled10b, Pbx1, and Zic2 in the neural plate is expanded (line) on the injected side (frontal views, dorsal to the top). EnR-Six1: Expression of Frizzled10b in the neural plate is reduced (line) on the injected side (frontal view, dorsal to the top). Expression of IMAGE 4057931 is reduced in the PPR (arrows on the control side; frontal view, dorsal to the top). Expression of Zic2 and Otx1 in the neural tube is reduced (line) on the injected sides (arrows; frontal views, dorsal to the top). In MO-injected embryos, injected sides were confirmed by the use of lysamine-labeled MOs (not shown). In mRNA-injected embryos, injected sides were confirmed by the presence of nuclear β -galactosidase lineage labeling (pink dots visible in most images). Из генов, представленных на GeneChip, 58 экспрессировались примерно вдвое более низкий уровень (P < 0.05, ANOVA) в Six1-экспрессирующих ACs (Table 5). Самая большая категория среди подавляемых генов обладала "неизвестной" функцией (36.2%). Гены с известной функцией наиболее часто участвовали в метаболических процессах (10.3%), передаче сигналов (19.0%) и транскрипции (10.3%); идентифицировано небольшое количество и др. функций (Fig. 1B). Экспрессия большинства из 58 генов была охарактеризована на разных ст. развития Xenopus, но с помощью поиска в базе данных экспрессии у мышей (www.informatics.jax.org), мы установили, что многие из тех, для которых идентифицированы гомологи, экспрессируются в развивающейся ткани, регулируемые с помощью Six1. Сюда входят: краниальные плакоды (Glcci1, Rcan1, Naga, Rilpl1, Etl4, Xspr2, Jun, Phb2, Mt1, Pigc, Gap43, Tusc3), нервный гребень (Zic2), мышцы (Rcan1, Jun, Krm2, Phb2, Rras2, Pigc, Sytl1) и нефрическая мезодерма (Naga, Pik3r5, Cdc42ep2, Xspr2, Rab40B, Akt, Rras2, Pigc, Vwc2, Gap43, HNF1a, Sytl1, Tusc3). Некоторые транскрибируются также в тканях, в которых Six1 обычно не экспрессируется. Сюда входят: нервная пластинка/трубка (Socs3, Glcci1, Dnaj4.2, Rhot1, Pik3r5, Axin2, Xspr2, Jun, Rab40b, Akt, Krm2, Metrn, Phb2, Akap2, Ap4m1, Rras2, Mt1, Zic2; Pigc, Vwc2, Gap43, HNF1a, Sytl1, Vta1, Tusc3), эпидермис (Fgk, Cnfc1, Axin2, Krm2, Phb2, Krt18-a, Pigc, Tusc3) и мезодерма (Socs3, Pik3r5, Adam13, Xspr2; Jun, Krm2, Rras2, Mt1, Pigc, HNF1a). Мы также искали гены подавляемые более чем в 1.6-раз (P < 0.05, ANOVA), чтобы идентифицировать ранее охарактеризованные гены, как ожидалось репрессируемые с помощью Six1, базируясь на исследованиях у кур и Xenopus (Brugmann et al., 2004; Christophorou et al., 2009). Известны гены, экспрессируемые в нервной пластинке (Otx1), нервном гребне (Snail1, HoxA1) и эпидермисе (Foxi1/Xema) (Table 2).
Table 5. Genes Down-regulated >2-Fold by Six1 in Microarray Assays Чтобы оценить значимость результатов микрочипа, мы осуществили несколько экспериментов. Во-первых, мы измеряли экспрессию пяти подавляемых генов с помощью qPCR; 3 из 5 экспрессировались на более низких уровнях в Six1-инъектированных ACs по сравнению с контрольными ACs, один из которых достигал статистической значимости (Table 3). Во-вторых, мы подвергали нокдауну эндогенный Six1 в целых эмбрионах с помощью инъекции morpholino антисмысловых олигонуклеотидов; такие измененные паттерны экспрессии были у 10 из 15 подавляемых кандидатов (Table 6). Домены экспрессии двух были расширены (e.g., IMAGE 3399268), тогда как у других были уменьшены (e.g., Cnfn1-a, Snail1; Fig. 2). В-третьих, мы повышали экспрессию Six1: и у 15/15 подавляемых кандидатов уменьшались домены экспрессии с помощью инъекции мРНК, кодирующих или дикого типа Six1 или репрессивной конструкции EnR-Six1 и только 4 из 15 с помощью активирующей конструкции Six1-VP16 (Table 6). Figure 2 показывает примеры: уменьшения сомитов (IMAGE 3399268) и нервного гребня/плакоды (IMAGE 4057931) при экспрессии дикого типа Six1; уменьшение экспрессии в PPR (IMAGE 4057931) и нервной трубке (Zic2, Otx1) с помощью EnR-Six1. Интересно, что экспрессия Zic2 в нервной трубке расширялась с помощью Six1-VP16 (87.5%, n = 17; Fig.2). Т.о., многие из подавляемых генов, идентифицированных с помощью микрочипа, скорее всего, находятся ниже Six1, исходя из опубликованных функций у Xenopus, кур или мышей, опубликованных паттернов экспрессии и/млм изменений в экспрессии после потери или избыточной функции Six1 . Однако, Six1 ChIP анализ необходим для подтверждения, что эти кандидаты являются непосредственными транскрипционными мишенями. Table 6. Percentage of Embryos Showing Altered Expression Domains of Down-regulated Genes in Response to Changes in Six1 Activity Expression Patterns of Uncharacterized Genes Представленные выше данные подтверждают, что многие из генов, чей паттерн экспрессии изменен с помощью Six1, скорее всего, участвуют в связанных с Six1 онтогенетических процессах. Из-за большого количества таких генов с неизвестной функцией (Fig. 1) и/или из-за того, что их паттерны онтогенетической экспрессии не описаны для Xenopus, мы случайно выбрали 10 генов с неизвестной функцией, чья активность увеличивалась вдвое (shaded in Table1) и 10 генов с неизвестной функцией, чья активность снижалась вдвое (shaded in Table 5) и осуществили анализ экспрессии. Мы также выбрали немногие не охарактеризованные гены с изменениями в 1.6-раза, чтобы проанализировать и получть больше деталей для немногих охарактеризованных генов (shaded in Tables 1, 2, and5).
На стадии нервной пластинки все 19 генов, экспрессируемые в эктодерме/эпидермисе, с повышенной экспрессией на дорсальной стороне эмбриона, включая раннюю нервную пластинку и нейральную border zone (BZ); для почти всех из этих генов у эмбрионов обнаруживалась их экспрессия в дорсальной мезодерме (Table 7; Fig. 8). На ст. ранней нервной пластинки, Arrb2 дополнительно экспрессируется в цементной железе, а Ism1 в фарингеальной энтодерме. На ст. закрытия нервной трубки, все 19 генов экспрессируются в нервной трубке и нервном гребне; 15 из 19 кроме того экспрессируются в PPR или субнаборе краниальных плакод. На ст. хвостовой почки и личиночных стадиях паттерны экспрессии дивергируют (Fig. 5; Table 7). Однако, каждый из 19 генов экспрессируется, по крайней мере, в двух тканях, чье развитие регулируется с помощью Six1: по крайней мере, в структуре, происходящей из плакоды (17/19), сомита (18/19), или нефрической мезодермы (17/19); последнее согласуется с потенциальной ролью дефектов почек при BOR. Из тех, что экспрессируются в плакодах, 17/17 экспрессируются и в отоцисте, что согласуется с потенциальной ролью в дефиците слуха при BOS3. Хотя Six1, как полагают, в первую очередь важен для развития плакод, недавняя работа показала, что он необходим для некоторых производных из нервного гребня (Yajima et al., 2014; Garcez et al., 2014); в соответствии с этими сообщениями мы нашли, что все 19 активируемых гена выявляются в краниальном нервном гребне и мезодерме бранхиальных дуг. Однако, необходимо отметить, что большинство из 19 генов также обнаруживают выраженную экспрессию в тканях, которые не имеют обнаружимых уровней Six1 на этих ст. развития: нервная трубка/сетчатка (19/19), сердце (4/19), цементная железа (3/19), фарингеальная энтодерма/карманы (2/19) и кровяные островки (1/19). Следовательно, дополнительные транскрипционные пути д. регулировать эти гены в этих дополнительных тканях.
Поскольку паттерны экспрессии 5 генов, идентифицированных при анализе микрочипа были опубликованы ранее, но не на всех стадиях развития, мы довершили анализ их паттернов экспрессии (Figs. 4-6; Table 7). Известный, Nrp1, рецептор для Sema3a, экспрессируется в глубоком слое PPR (Fig. 4) и в некоторых плакодах, включая отические (Fig. 5). Trhda является экспрессируемым матерью белком, ингибирующим нейральную дифференцировку (Wu et al., 2001); поэтому ISH данные пока недоступны для всей онтогенетической серии (Fig. 6). Pbx1, содержащий гомеобокс транскрипционный фактор взаимодействует с Meis и Hox белками, чтобы повлиять на экспрессию генов заднего мозга и нервного гребня (Maeda et al., 2002), дополнительно экспрессируется в анимальной эктодерме, некоторых плакодах и сомитах (Fig. 6). Ism1 это новый секретируемый фактор, экспрессирующийся совместно в доменах, экспрессирующих FGF8 (Pera et al., 2002); мы установили, что помимо опубликованного паттерна экспрессии он экспрессируется в фарингеальной энтодерме и сомитах (Fig. 6). Arnt является bHLH/PAS фактором, который регулирует многие аспекты развития и туморогенеза позвоночных (Crews and Fan, 1999; Labrecque et al., 2013); мы установили, что помимо опубликованного паттерна экспрессии (Bollerot et al., 2001), он экспрессируется в нервной пластинке, нервном гребне, PPR, обонятельных плакодах, краниальных ганглиях и сомитах (Fig. 6; Table 7). HoxA3 гомеодоменовый транскрипционный фактор участвует в формировании черепно-лицевого паттерна и паттерна оси (Quinonez and Innis,2014); мы установили, что кроме паттерна, описанного в Xenbase (http://www.xenbase.org/gene/showgene.do?method=display&geneId=482266&), он экспрессируется в виде паттерна, очень сходного с др. активируемыми генами перед закрытием нервной трубки, но в последствии не экспрессируется в плакодах (Fig. 6; Table 7).
Table 8. Developmental Expression Patterns of Down-regulated Genes Summary Итак, паттерны экспрессии генов, идентифицированных в данной работе в качестве потенциальных мишеней для Six1 согласуются с предыдущими сообщениями, показавшими, что Six1 играет важную роль в развитии краниальных сенсорных плакод позвоночных, сомитов и почек. Большинство усиливающих свою активность генов, экспрессируются в тканях, экспрессирующих Six1 (PPR, плакодах, сомитах, нефрической мезодерме), которые, как полагают, является активируемыми мишенями. Однако, их экспрессия в тканях, негативных по Six1, включая нервную пластинку и эпидермис, указывает на то, что они регулируются также дополнительными факторами. Подавляемые гены, экспрессирующиеся в Six1-негативных тканях, что предполагалось для ожидаемых предполагаемых репрессируемых мишеней; их экспрессия в некоторых Six1-позитивных тканях указывает на то, что они также могут усиливать свою активность под действием дополнительных факторов, даже в присутствии Six1. Поскольку большинство генов, описанных здесь, экспрессируются в онтогенетических предшественниках двух органов, чьи дефекты являются диагностическими для BOS и BOR синдромов, внутреннее ухо и почки, поэтому они являются новыми кандидатами, предположительно участвующими в этих врожденных дефектах. |