Известны методы получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (Takahasi, Yamanaka, 2006)/ Наконец, было достигнуто получение iPSC лишь с помощью химических соединений (Hju et al., 2013). В данной работе продемонстрировано значительное улучшение эффективности и кинетики хим. репрограммирования и также установлен уникальный характер пути репрограммирования от соматических клеток к химически индуцированным плюрипотентным стволовым клеткам (CiPSCs).

Авт. продемонстрировали, что экспрессия энтодермальных маркеров не только характерный признак, но и указывает на существование стабильного промежуточного состояния. Успешное отлавливание клеток в этом промежуточном состоянии в культуре показало, что эти клетки сильно напоминают клетки из embryo-derived extra embrionic entoderm (eXEN). Клетки eXEN происходят из клеток первичной энтодермы, сохраняя при этом свою способность вносить вклад во внеэмбриональный клеточный клон после инъекции в бластоцист. Химически индуцированные XEN (CeXEN) клетки обладают также способностью вносить вклад во внеэмбриональные клеточные клоны у химерных эмбрионов. Более того, eXEN и CeXEN компетентны к репрограммированию в плюрипотентное состояние в результате второй ступени репрограммирования химическим коктейлем. Более того, было показано, что нокдаун ассоциированных с энтодермой транскрипционных факторов, таких как Gata6, нарушает первую ступень химического репрограммирования, тогда как избыточная экспрессия дополнительного транскрипционного фактора Sall4 замещает некоторые компоненты первой ступени коктейля химического репрограммирования.

XEN-подобное состояние является промежуточным в химическом репрограммировании. Было установлено, что XEN-ассоциированные транскрипционные факторы Gata4 и Gata6 способны замещать Oct3/4 в наборе транскрипционных факторов Yamanaka, чтобы обеспечить репрограммирование (Shu et al/ 2013)

Поскольку связанные с мезодермой гены, такие как C/EBPα , также способны замещать Oct3/4. Интересно, что C/EBPα известен также как фактор prime компетентности к репрограммированию В клеток. Di Stefano et al. показали, что временная экспрессия C/EBPα перед индукцией 4-х транскрипционных факторов Yamanaka драматически увеличивает эффективность репрограммирования. Физиологически C/EBPα участвует в формировании предшественников для макрофагов/гранулоцитов (GMPs);, которые гиперкомпетентны к репрограммированию с помощью 4-х транскрипционных факторов (Eminli et al., 2009). Эти находки подтверждают, что определенное состояние дифференцировки обладает высокой компетентностью для репрограммирования, выступая как переходное промежуточное состояние.

Должны существовать множественные промежуточные состояния в зависимости от стратегии репрограммирования. Даже в случае репрограммирования с помощью транскрипционных факторов, такие факторы, как Sall4, Nanog, Esrrb, Lin28, могут заместить оригинальный коктейль (Theunissen, Jaenisch, 2014). Соматические клетки могут выбирать разные состояния в качестве промежуточного в зависимости от их исходного состояния и стратегии репрограммирования. Это может происходить сходным образом со сдвигом между стабильными состояниями (attractor states) из сети транскрипционных факторов. Поскольку сеть транскрипционных факторов в XEN клетках обладает общими компонентами с сетью транскрипционных факторов, ассоциированных с плюрипотентностью, таких как Sall4 и Klf4, а избыточная экспрессия Gata4 и Gata6 в эмбриональных стволовых клетках эффективно индуцируют дифференцировку в XEN-подобные клетки, XEN-подобное состояние близко к состоянию плюрипотентности, чем к состоянию соматических клеток, таких как MEFs.

Идентификация промежуточного состояния позволила авт. улучшить протокол химического репрограммирования. Исходный коктейль состоял из 6 маленьких соединений: VPA, CHIR99021, 616452, Traylcypromine, Forskolin для обеих ступеней и DZNep для ступени 2. Эти ступени репрограммирования д. происходить в культуре в 2i- среде, содержащей CHIR99021 и ЗВ0325901 (Ying et al., 2008). Вессь процесс занимает 48-60 дней и с очень низкой эффективностью: только 1 CiPSC колония на 40000 инициальных клеток. Теперь добавляются АМ580 и EPZ004777 в первой ступени и SGC0946 и 5-aza-вС во второй ступени с оптимизацией дозы CHIR99021, что привело к драматическому улучшению как эффективности, так и кинетики. Используя новый протокол, 1000-9000 колоний получается на 50000 инициальных клеток в течение 40 дней. Новый протокол пригоден не только для MEFs, но и для кожных фибробластов и фибробластов лёгких взрослых.