Во время поздней гаструляции у позвоночных удлинение передне-задней оси управляется осевыми стволовыми клетками, находящимися в эпибласте, латеральнее первичной полоски, которые дают как нейральное, так и параксиальное мезодермальное потомство (Tzouanacou et al., 2009; Wilson et al., 2009). Нейральные потомки, происходящие из осевых стволовых клеток, которые остаются в эпителии эпибласта и впоследствии дифференцируются, чтобы сформировать нервную трубку и спинной мозг. Потомство параксиальной мезодермы, происходящее из осевых стволовых клеток, которое проникает вентрально через первичную полоску и подвергается эпителиально-мезенхимному переходу, чтобы сформировать пресомитную мезодерму (PSM). Когда первичная полоска регрессирует, блоки передней части PSM периодически и с обеих сторон дают сегменты посредством мезенхимно-эпителиального перехода, регулируемого в пространстве и во времени, т.о., формируются пары сомитов на каждой из сторон нервной трубки, которые позднее дают осевой скелет, ребра, скелетные мышцы, соединительную ткань и кожу спины (Pourqui?, 2011). Ряд сигнальных молекул необходим для контроля гаструляции и пространственно-временной динамики образования сомитов; среди них передача сигналов Wnt/β-catenin, причем секретируемые Wnt гликопротеины соединяются с рецепторами клеточной мембраны Frizzled, приводя к стабилизации и транслокации в ядро β-catenin, который впоследствии соединяется с транскрипционными факторами Tcf/Lef, чтобы модулировать транскрипцию (Logan and Nusse, 2004).

У мышей Wnt3a является первичным лигандом пути Wnt/β-catenin? который необходим во время удлинения оси тела. Эмбрионы с генетической потерей функции Wnt3a^-/- обнаруживают значительное укорочение сзади ниже уровня передних конечностей из-за потери экспрессии Fgf8 и T (Brachyury), необходимых для поддержания пула осевых стволовых клеток и продукции потомства параксиальной мезодермы (Takada et al., 1994; Greco et al.,1996; Yoshikawa et al., 1997; Yamaguchi et al., 1999; Aulehla et al., 2003; Dunty et al., 2008, 2014). Образование сомитов у Wnt3a^-/- эмбрионов нарушено, при этом первые 7-9 пар сомитов первоначально образуются, но постепенно уменьшаются в размере и исчезают в направлении укороченного заднего региона, тогда как эктопическая подобная нейральной ткань, экспрессирующая Sox2 формируется на месте параксиальной мезодермы после стадии семи сомитов (Takada et al., 1994; Yamaguchi et al., 1999; Nowotschin et al., 2012; Dunty et al., 2014). Wnt3a^vg/vg гипоморфные эмбрионы и кондиционные (T-cre управляемые) β-catenin^flox/flox эмбрионы демонстрируют, что каудальная экспрессия Fgf8 регулируется, находясь ниже передачи сигналов Wnt/β-catenin, которая оперирует в виде задне-переднего градиента ядерного β-catenin параллельно с FGF (Aulehla et al., 2003, 2008; Dunty et al., 2008). Кроме того, Wnt/β-catenin способствует нижестоящей передаче сигналов FGF в зоне каудальных предшественников, демонстрируя обоюдно позитивную Wnt/β-catenin-FGF ауторегуляторную петлю (Olivera-Martinez and Storey, 2007; Wahl et al., 2007; Naiche et al., 2011; Boulet and Capecchi, 2012).

Несколько линий доказательств подтверждают, что передача сигналов Wnt/β-catenin также важна для формирования паттерна мезодермы у низших позвоночных (лягушек и рыб), при этом wnt8a функционирует в качестве первичного лиганда (Table 1 номенклатура ортологов Wnt8a) (Christian et al., 1991; Hoppler et al.,1996; Hoppler and Moon, 1998; Lekven et al., 2001; Shimizu et al., 2005; Martin and Kimelman, 2009, 2012; Baker et al., 2010; Lu et al.,2011; Wylie et al., 2014). У Xenopus, избыточная экспрессия доминантно-негативной формы wnt8a нарушает спецификацию и развитие задней части (Hoppler et al., 1996). Сходным образом, вмешательство антисмыслового morpholino или генетический нокдаун двухцистронного локуса wnt8a рыб данио приводит к потере экспансии задней мезодермы, а также к дефектам постериоризации нейральной эктодермы (Lekven et al., 2001; Shimizu et al., 2005; Baker et al., 2010; Wylie et al., 2014). Др. эксперименты на рыбках данио идентифицировали позитивную Wnt/β-catenin-Ntl/Bra (два ортолога T у рыбок данио ) ауторегуляторную петлю, необходимую для спецификации мезодермы из осевых стволовых клеток, поскольку манипуляции на уровне одиночных клеток с использованием клеточно автономных ингибиторов и активаторов Wnt продемонстрировало дополнительную роль для спецификации мезодермы в сомиты (Martin and Kimelman, 2008, 2010, 2012). Позитивная Wnt/β-catenin-FGF ауторегуляторная петля была также обнаружена у рыб данио, необходимая для нормального удлинения оси тела, как у мышей (Stulberg et al., 2012).

Table 1. Wnt8a Ortholog Aliases Among Vertebrate Model Organisms (Older Names in Parenthesis)a

Т.о., эксперименты на разных модельных организмах согласуются с консервативными мультиплексными ролями канонической передачи сигналов Wnt/β-catenin в развитии оси задней части тела и в спецификации мезодермы во время удлинения оси тела. Четкое расхождение возникает в специфической игре Wnt лигандов; Wnt3a у мышей в противовес wnt8a у Xenopus и рыб данио, несмотря на тот факт, что все позвоночные обладают как Wnt3a, так и Wnt8a ортологами (Garriock et al., 2007). Здесь мы исследовали функцию Wnt8a млекопитающих во время удлинения оси тела, используя генетический подход потери функции. Мы установили, что каудальный Wnt8a наиболее сильно экспрессируется во время ранней сомитной стадии, во время, когда передняя часть туловища может формироваться в отсутствии Wnt3a. Поскольку мы установили, что Wnt8a^-/- эмбрионы не обнаруживают очевидных дефектов оси тела, то мы установили, что Wnt3a^-/-;Wnt8a^-/- двойные нокаутные эмбрионы по сравнению с Wnt3a^-/- эмбрионами обнаруживают более тяжелое заднее укорочение, меньше сомитов, более значительную потерю экспрессии каудального Fgf8 и более ранние проявления эктопической экспрессии Sox2 в нише осевых стволовых клеток. Эти находки показали, что мышиный Wnt8a кооперируется с Wnt3a во время ранних сомитных стадий, чтобы поддерживать гомеостаз осевых стволовых клеток, необходимый для нормального удлинения оси тела и сомитогенеза. Эти находки демонстрируют широкую консервацию функции Wnt8a у всех позвоночных.

Путь передачи сигналов Wnt/β-catenin используется во всем царстве животных и обнаруживается даже у базовых многоклеточных организмов (placozoa), расхождение Metazoa-Protozoa произошло приблизительно 700 миллионов лет тому назад (Croce and McClay, 2008; Srivastava et al., 2008; Holstein, 2012). Сложность семейства генов Wnt, по-видимому, родоначальная и высоко законсервированная; из 13 безусловных подсемейств Wnt генов (Wnt1-11, Wnt16 и WntA), 11 законсервированы у человека и морских анемон Nematostella vectensis (Cnidaria) которые дивергировали ~ 550 миллионов лет назад (Kusserow et al., 2005). Позвоночные обладают 12 Wnt подсемействами (Wnt1-11 и Wnt16), менее родоначальные удвоения генов объясняют изменчивость между разными классами позвоночных; подсемейство WntA оказалось потерянным в ветви хордовых (Croce and McClay, 2008; Holstein, 2012). Геномы мыши и человека имеют 7 удвоенных Wnt подсемейств генов, с общим количеством в 19 Wnt; куры имеют 8 удвоений и 20 Wnt генов; Xenopus имеют 12 удвоений и 24 Wnt гена; и рыбки данио 15 удвоений и 27 Wnt генов (Garriock et al., 2007).

Консервация функции Wnt, по-видимому, связана с родоначальной консервацией сложности Wnt, при этом ключевая роль по поддержанию зоны заднего роста является общей для животных с билатеральной симметрией (bilateria) (Martin and Kimelman, 2009; Petersen and Reddien, 2009). Wnt8 ортологи, по-видимому, наиболее широко законсервированные Wnt лиганды для заднего роста; анализ потери функции (с использованием доминантно негативных мРНК, RNAi, morpholino interference и генетического нокаута) показал потребность от лягушек и рыб (Wnt8a) до домового паука Achaearanea tepidariorum (at-wnt8) (Hoppler et al., 1996; Lekven et al., 2001; Shimizu et al., 2005; McGregor et al., 2008; Baker et al., 2010; Wylie et al.,2014).

В данном исследовании мы изучали функцию Wnt8a во время поздней гаструляции у эмбрионов мыши, чтобы определить, играет ли он роль во время формирования ранней мезодермы и удлинения оси тела, как это было описано у низших позвоночных. Мы установили, что экспрессия Wnt8a наиболее сильная на стадии ранних сомитов, когда формируются передние сомиты, но она подавляется во время развития более задних сомитов, это указывает на то, что Wnt8a в соотв. время и в соотв. месте влияет на удлинение оси тела во время развития передней части туловища.

Наш анализ Wnt8a^-/- эмбрионов выявил отсутствие нарушений в удлинении оси тела, что привело нас к исследованию возможности, что Wnt3a и Wnt8a могут действовать перекрываясь. Передние 7-9 авр сомитов всё ещё формируются у Wnt3a^-/- эмбрионов и кондиционных (T-cre управляемых) β-catenin^flox/flox эмбрионов (хотя позднее они деградируют в последние), подтверждая. что передние сомиты и передняя часть туловища может формироваться независимо от передачи сигналов Wnt/β-catenin или они находятся под контролем др. Wnt гена (Takada et al., 1994; Yoshikawa et al., 1997; Yamaguchi et al., 1999; Aulehla et al., 2003; Dunty et al., 2008; Nowotschin et al., 2012).

Мы установили, что Wnt3a^-/-;Wnt8a^-/- двойные нокаутные эмбрионы обнаруживают более сильное заднее укорочение по сравнению с Wnt3a^-/- одиночными нокаутами, указывая тем самым, что Wnt8a необходим для формирования сомитных пар с 3-го по 9-й в отсутствие Wnt3a. Первые две до 3-й пары сомитов д. быть независимы от передачи сигналов Wnt/β-catenin; однако, скорее всего, дополнительны Wnt лиганды играют роль на этой очень ранней стадии. Первым кандидатом является Wnt3a паралог Wnt3, который экспрессируется на высоком уровне перед развитием сомитов и необходим для образования первичной полоски и инициации мезодермы; мРНК Wnt3 исчезает после стадии E7.5 перед началом сомитогенеза (Liu et al., 1999), но присутствует ещё достаточно белка вплоть до ст. E8.0, чтобы действовать во время образования первых двух-трех пар сомитов. Интересно, что у рыб данио вмешательство morpholino в wnt3a дает немного фенотипических отклонений во время удлинения оси тела; однако, комбинированное вмешательство wnt8a/wnt3a morpholino вызывает тяжелые задние укорочения, включая значительное уменьшение числа сомитов по сравнению с одиночными wnt8a морфантами (Shimizu et al., 2005). Т.о., действие Wnt8a и Wnt3a во время удлинения оси тела законсервировано от рыб до млекопитающих, при этом Wnt8a доминирует у низших позвоночных, а Wnt3a доминирует у высших позвоночных.

Другим критическим сигналом для удлинения оси тела и образования сомитов является FGF, так Fgfr1^-/- эмбрионы неспособны формировать сомиты из-за потери передачи сигналов FGF4 и FGF8 (Yamaguchi et al., 1994; Naiche et al., 2011; Boulet and Capecchi, 2012). Мы установили, что Wnt3a^-/-;Wnt8a^-/- двойные нокауты не имеют или имеют сильно сниженную экспрессию Fgf8 в каудальном домене на ст. E8.5 (ст. 10 сомитов), в противовес легкому снижению каудальной экспрессии Fgf8 у одиночных Wnt3a^-/- нокаутов, тем самым объяснятся уменьшение числа сомитов и более тяжелое заднее укорочение у двойных нокаутов. Существует позитивная caudal Wnt/β-catenin-FGF ауторегуляторная петля для поддержания обоих этих критических сигналов (Aulehla et al., 2003; Olivera-Martinez and Storey, 2007; Wahl et al., 2007; Dunty et al., 2008; Naiche et al., 2011; Boulet and Capecchi, 2012; Stulberg et al., 2012), а Wnt8a безусловно участвует в этом пути во время образования передних сомитов. Вторая позитивная ауторегуляторная петля существует между Wnt3a и его мишенью T, необходимой для формирования мезодермы во время гаструляции (Martin and Kimelman, 2008). T^-/- мышиные эмбрионы обнаруживают сходный с эмбионами Wnt3a^-/- фенотип и формируют только первые ~ 7 пар сомитов (Herrmann et al., 1990; Yamaguchi et al., 1999; Martin and Kimelman, 2008). Это наблюдение подтверждает, что наиболее передние сомиты могут формироваться независимо от Wnt3a/β-catenin-T ауторегуляторной петли и что Wnt8a не участвует в T ауторегуляторной петле, это согласуется с тем фактом, что экспрессия Wnt8a располагается более кпереди по отношению к T и Wnt3a (которые перекрываются на наиболее каудальном конце эмбриона). Т.о., мы полагаем, что Wnt3/Wnt3a/Wnt8a/β-catenin-FGF позитивная ауторегуляторная петля устанавливается рано, чтобы обеспечить развитие передней части туловища и инициировать образование передних сомитов, это сопровождается позднее действием Wnt3a/β-catenin-FGF и Wnt3a/β-catenin-T позитивных ауторегуляторных петель, при этом первая действует, чтобы поддерживать сомитогенез и формировать задние сомиты, а последняя действует. чтобы поддерживать продолжающуюся продукцию мезодермы во время поздних стадий (Martin and Kimelman, 2009) (Fig. 6).

Figure 6. Schematic representation of Wnt-FGF-RA and Wnt-T regulatory loops during formation of anterior and posterior somites. During anterior somitogenesis in which the first seven to nine somite pairs form, at least two Wnt ligands (Wnt3a and Wn8a) cooperate to form a positive autoregulatory loop with FGFs (Wnt3 may also function to generate the first three anterior somite pairs); at the same time, RA generated in the somites directly antagonizes both Wnt8a and Fgf8 expression. During posterior somitogenesis, only Wnt3a is critical, forming positive autoregulatory loops with both T and FGFs. At later stages (beyond E8.5) when posterior somites form, RA is no longer required to antagonize caudal Fgf8 expression (Cunningham et al., 2011) and RA repression of Wnt8a is moot because it is no longer expressed.

Ранее было показано, что Sox2-позитивная похожая на нервную ткань на месте параксиальной мезодермы у Wnt3a^-/- эмбрионов (Takada et al., 1994; Yamaguchi et al., 1999; Nowotschin et al., 2012; Dunty et al., 2014), подтверждает роль передачи сигналов Wnt3a/β-catenin для поддержания потенциала спецификации мезодермы. Здесь мы продемонстрировали, что Wnt3a и Wnt8a кооперируются в этой роли во время ранней сомитной стадии. Показано, что мутантные эмбрионы обладают также высокими уровнями экспрессии Sox2 в каудальной части эпибласта по сравнению с эмбрионами дикого типа, которые поддерживают низкие уровни и активность Sox2 усиливается до высоких уровней только, когда клетки подвергаются нейрональной дифференцировке в нервную пластинку. Это подтверждает, что передача сигналов Wnt/β-catenin действует. чтобы ограничивать экспрессию Sox2 до низкого уровня в каудальной части эпибласта, чтобы предотвратить преждевременную дифференцировку нейронов и тем самым поддерживает пул не дифференцированных осевых стволовых клеток. Считается, что Wnt активирует Sox2 каудальный энхансер N1 совместно с сигналами FGF (Takemoto et al., 2006, 2011). Напротив, мы наблюдали эктопическую экспрессию Sox2 , несмотря на потерю Wnt3a, Wnt8a и Fgf8. Т.о., в точности представить, как сигналы Wnt и FGF взаимодействуют, чтобы контролировать нишу осевых стволовых клеток, пока невозможно.

RA, генерируемая в сомитах, передает сигналы, чтобы противодействовать Fgf8 и Wnt в каудальной части (Diez del Corral et al., 2003; Vermot et al., 2005; Sirbu and Duester, 2006; Olivera-Martinez and Storey, 2007; Zhao and Duester, 2009; Kumar and Duester, 2014), тем самым добавляется дополнительный слой контроля удлинения оси тела (Fig. 6). Мы продемонстрировали, что Wnt8a является, скорее всего, непосредственной мишенью для передачи сигналов RA у эмбрионов мыши, посредством RARE , расположенного выше на 4.9 kb от места старта транскрипции Wnt8a, это лишь частично законсервировано у человека, вообще-то благодаря избыточной природе передачи сигналов Wnt8a по отношению к др. лигандам Wnt. Этот RARE является элементом типа DR2 (2 bp spacing between hexameric repeats), это согласуется с тем, что элемент DR2 обнаруживается выше Fgf8, необходимого для RA-обеспечиваемой репрессии каудального Fgf8 (Kumar and Duester, 2014). Более того, было бы интересно открыть в точности, что репрессивные RAREs имеют общего, чтобы детерминировать свою репрессивную модальность (modality), по сравнению с большинством in vivo обнаруженных RAREs вблизи др. генов мишеней (discovered to date), которые вызывают активацию транскрипции (Cunningham and Duester, 2015).

In this study, we reveal that cooperative Wnt3a/Wnt8a signaling maintains the axial stem cell niche needed for posterior growth during early somite stages, thus demonstrating that Wnt/?-catenin signaling is required during anterior as well as posterior body axis extension in mammals. By assigning a function for Wnt8a during somite formation in mouse, which primarily uses Wnt3a for this purpose, we demonstrate a tighter conservation of the Wnt ligands at play during body axis extension between mammals and lower vertebrates, which primarily use Wnt8a. In the only other loss-of-function study conducted to date on both of these ligands, Wnt3a was found to be a nonessential but redundant partner with Wnt8a in zebrafish (Shimizu et al., 2005), reciprocal to the situation in mouse. Thus, cooperative Wnt3a/Wnt8a signaling is conserved from fish to mammals, but genetic drift has seemingly switched the dominant partner during evolution of the mammalian lineage. Our studies also provide new insight into how Wnt-FGF-RA signals interact during body axis extension.