The formation and function of the cardiac conduction system
Jan Hendrik van Weerd, Vincent M. Christoffels Development 2016 143: 197-210; doi: 10.1242/dev.124883
The cardiac conduction system (CCS) consists of distinctive components that initiate and conduct the electrical impulse required for the coordinated contraction of the cardiac chambers. CCS development involves complex regulatory networks that act in stage-, tissue- and dose-dependent manners, and recent findings indicate that the activity of these networks is sensitive to common genetic variants associated with cardiac arrhythmias. Here, we review how these findings have provided novel insights into the regulatory mechanisms and transcriptional networks underlying CCS formation and function.
Функция сердца начинается рано во время эмбриогенеза и является критической для поддержания эмбриона питательными веществами и кислородом. С начала своего образования сердце вырабатывает и распространяет электрические импульсы, которые необходимы для инициации скоординированных сокращений, чтобы эффективно качать кровь по всему телу. В развитом сердце эти функции выполняются cardiac conduction system (CCS), которая состоит из различных компонентов, каждый из которых выполняет определенную цель (Fig. 1). Напр., специализированные задающие ритм (pacemaker) миоциты синоатриальном узле (sinoatrial node (SAN)), который располагается в месте соединения правого предсердия и верхней полой вены, генерируя импульсы. Импульсы затем быстро распространяются по всему миокарду предсердия и достигают atrioventricular node (AVN), где они замедляются. Эта задержка позволяет предсердиям сокращаться и позволяет желудочкам заполняться прежде, чем желудочки сами будут активированы и сократятся. Миокардиальные ткани предсердий и желудочков электрически изолированы др. от др. с помощью плоскости соединительной ткани, формируемой фиброзным кольцом (annulus fibrosus) и центральным фиброзным телом. Единственный электрический проход из предсердий в миокард желудочков сформирован быстро-проводящим atrioventricular bundle (AVB), или пучком Гиса, который соединен с AVN и проходит через гребель желудочковой перегородки. Он проводит импульсы в левую и правую веточки пучка (bundle branches (BBs)) и в сеть волокон Пуркинье, которые активируют миокард желудочков (Fig. 1). Итак, tбыстро проводящие структуры (AVB/His пучок, левая и правая BBs, и сеть волокон Пуркинье) обозначаются как проводящая система желудочков (ventricular conduction system (VCS)).
Fig. 1.
The components of the cardiac conduction system.
Врожденные аномалии или болезни, возникающие в результате нарушеня развития или функции компонентов CCS, могут приводить к тяжелым аритмиям, которые требуют терапевтического (напр. блокаторов ионных каналов) или хирургического (напр., устранение, имплантация электронного ритмоводителя) вмешательства (Wolf and Berul, 2006). Хотя достигнут определенный прогресс в понимании и анализе (напр., посредством электрокардиограмм; see Box 1) электрофизиологических свойств структур CCS (Mangoni and Nargeot, 2008; Christoffels et al., 2010; Munshi, 2012), молекулярные механизмы, контролирующие развитие CCS всё ещё недостаточно поняты.
Box 1. The electrocardiogram
The function of the CCS can be analysed using an electrocardiogram (ECG); the configuration of the adult heart dictates the shape of the ECG. The electrical impulse generated by the SAN is conducted to the left and right atria and leads to depolarization of the atrial cardiomyoctes, which is visualized in the ECG by the P wave. Ventricular depolarization, by contrast, is reflected by the QRS complex, and the T wave represents ventricular repolarization. The morphology of the ECG thus provides measurable characteristics that can be used to assess CCS function: heart rate reflects SAN function; the PR interval reflects the period from the onset of the P wave to the beginning of the QRS complex and is indicative of the time required for the impulse to travel through the atria, AVN and AVB; VCS function is indicated by the duration of the QRS complex; and the QT interval is a measure for the period of ventricular depolarization and repolarization. Deviations from normal ECG intervals, e.g. an increased heart rate and prolongation of the PR interval and QRS duration, are therefore indicative of CCS dysfunction and are associated with cardiac arrhythmias.
<
Early development of the CCS: setting up the building plan of the heart
Во время раннего развития во время формирования складок эмбрионом, происходит слияние двух формирующих сердце регионов в латеральной пластинке мезодермы с образованием первичной трубки сердца (Fig. 2A). В это время миокардиальные клетки первичной трубки являются автоматизированными (т.e. они спонтанно деполяризуются), медленно проводящими электрические импульсы и имеют недоразвитые саркомеры и саркоплазматический ретикулум, что обусловливает бедные сократительные свойства. Доминантный автоматизм (т.e. активность ритмоводителя) располагается на каудально в венозной части сердечной трубки, в области, обозначаемой как тракт притока (inflow tract (IFT)). У эмбрионов кур активность ритмоводителя впервые обнаруживается на ст. 7-8 сомитов, ещё до появления первых сердцебиений (van Mierop, 1967; Kamino et al., 1981). Эмбриональная сердечная трубка образует окончательный левый желудочек и атриовентрикулярный канал (AVC). Трубка удлиняется путем добавления миоцитов, происходящих из клеток предшественников вторичного поля сердца (SHF) к обоим полюсам сердца. Это приводит к образованию окончательного правого желудочка, тракта оттока (OFT), предсердиев и венозного синуса (SV) (Kelly et al., 2014; Meilhac et al., 2014). По ходу удлинения сердечной трубки активность доминантного водителя ритма находится в регионе притока, подразумевая, что клетки, добавляемые к венозному полюсу сердца, быстро приобретают фенотип ритмоводителя, который доминирует над всеми имеющимися миоцитами (de Haan, 1965). Как результат, однонаправленные волны сокращений пробегают вдоль удлиняющейся трубки в направлении артериального полюса, отражаемые синусоидальной электрокардиограммой (ECG) (Fig. 2A).
Fig. 2.
Schematic overview of heart development in higher vertebrates.
Во время последующего образования петли сердечной трубкой, регионы наружного изгиба трубки экстенсивно пролиферируют и расширяются, чтобы сформировать будущие предсердные и желудочковые камеры (Fig. 2B). Программа миокардиальных генов камер активирует экспрессию среди большого количества, гены, кодирующие субъединицы высокой проводимости щелевых соединений Cx40 и Cx43 (Gja5 and Gja1, соотв.) и кардиальный натриевый канал Scn5a (известен также как Nav1.5), все они важны для проводимости. Более того, гены, кодирующие компоненты саркомер и факторы, регулирующие активность митохондрий, активируются, направляя кардиомиоциты развивающихся камер на фенотип работающего миокарда в направлении быстрого проведения и высокой сократимости (Moorman and Christoffels, 2003). Напротив, генная программа работающего миокарда активно репрессируется в миоцитах развивающихся SV, AVC и внутреннего изгиба, фланкирующего расширяющиеся камеры, делая возможным, чтобы эти части сохраняли свою низкую скорость пролиферации и узелковый фенотип с автоматизмом и низкой проводимостью.
Возникающая в результате конфигурация эмбрионального сердца - с доминантной активностью ритмоводителя в регионе притока, с быстрой активацией и распространением импульсов по предсердиям, с сохранением медленно проводящего фенотипа в AVC, и быстрой активацией желудочков - дает более похожую на зрелую ЭКГ (Fig. 2B). Более того, характеристики медленной релаксации миоцитов в AVC, заполненном подушками, предупреждает кровь от обратного потока в предсердия во время активации и сокращений желудочков, эта роль впоследствии переходит к зрелым атриовентрикулярным клапанам (AV). Базовый паттерн активации сердца, т.о., уже устанавливается на ранней стадии развития, на день эмбриогенеза (E) 9.5 у мышей и на Hamburger Hamilton (HH) ст. 13 у кур (van Mierop, 1967; Paff et al., 1968), даже если компоненты зрелой CCS морфологически ещё не распознаваемы (Fig. 2B).
The origin and development of the SAN
SAN развивается внутри миокарда SV и может быть распознан морфологически, начиная со ст. E11.5 у мышей, в правом роге синуса в месте соединения с предсердием (Vir?gh and Challice, 1980). Первоначально сформированная сердечная трубка экспрессирует стержневой кардиальный гомеобоксный транскрипционный фактор Nkx2-5. Между E9-9.5 и E11.5-12.5, Nkx2-5- SV миокард добавляется к венозному полюсу за счет дифференцировки Tbx18+/Nkx2-5- предшественников (Christoffels et al., 2006; Mommersteeg et al., 2007;Wiese et al., 2009). Клетки тракта притока на ст. E9.5 сердечной трубки развиваются в клетки предсердий. Hcn4, первоначально экспрессируется в первых сформированных миоцитах, он непосредственно активируется в этом домене Tbx18+/Nkx2-5- SV и подавляется в Nkx2-5+ миокарде, тем самым эффективно сдвигается домен его экспрессии, во вновь добавленную часть SV и первичный домен ритмоводителя (Garcia-Frigola et al., 2003; Mommersteeg et al., 2007; Liang et al., 2013; Sp?ter et al., 2013). Генетическое отслеживание клонов показало, что Tbx3+ зачаток SAN формируется вместе с SV между E9-9.5 и E11.5-12.5 путем добавления Tbx18+/Isl1+/Nkx2-5- клеток к венозному полюсу сердечной трубки (Sun et al., 2007; Mommersteeg et al., 2007, 2010; Wiese et al., 2009). На ст. E10 SV и SAN дивергируют из Nppa+ эмбриональных клеток предсердий (Hoogaars et al., 2007). Экспрессия Hcn4 оказывается ограниченной этим Tbx3+ доменом в ходе дальнейшего развития (Fig. 3A). Во время плодного периода сайт первичного ритмоводителя, по-видимому, сдвигается из SV в SAN (Vicente-Steijn et al., 2010), тогда как оставшаяся часть Tbx3- SV воспринимает атриальный фенотип и формирует правую и левую верхнюие полые вены и sinus venarum (Mommersteeg et al., 2007).
Fig. 3.
Development of the SAN.
У эмбрионов кур клетки SAN были отслежены возвратно до небольшой популяции в правой латеральной пластинке мезодермы клеток предшественников кзади от Nkx2-5+ поля сердца на HH стадии 5 эмбриогенеза. Клетки из этого региона обладают потенциалом действия подобным ритмоводителю, начиная с HH ст. 8, указывая на раннюю спецификацию судьбы клеток ритмоводителя (Bressan et al., 2013).
Transcriptional programming of the SAN
Первая молекулярная информация об образовании SAN получена лишь декаду тому назад в результате серии исследований, посвященных развитию SAN у мышей, дефицитных по Tbx3, Tbx5, Tbx18, Shox2, Nkx2-5 и Pitx2 (Mori et al., 2006; Christoffels et al., 2006; Hoogaars et al., 2007; Mommersteeg et al., 2007; Blaschke et al., 2007; Wiese et al., 2009; Espinoza-Lewis et al., 2009). Полученные находки предоставили ценную информацию о том, где эти транскрипционные факторы экспрессируются в развивающемся сердце и как они влияют на развитие и функцию SAN (Fig. 3).
Транскрипционный фактор Tbx5 играет ключевую роль в формировании SAN. Он экспрессируется в SV и предсердиях в ходе всего развития и взаимодействует с Nkx2-5, чтобы регулировать экспрессию short stature homeobox transcription factor 2 (Shox2), Tbx3 и Bmp4 - ключевых регуляторов программирования SAN (Mori et al., 2006; Puskaric et al., 2010; Fig. 3). Shox2 специфически экспрессируется в SV и необходим для раннего развития и функционирования SAN (Blaschke et al., 2007; Espinoza-Lewis et al., 2009; Puskaric et al., 2010). В культивируемых эмбриональных стволовых клетках (ESCs), Shox2 управляет дифференцировкой в направлении фенотипа, схожего с таковым ритмоводителя (Ionta et al., 2015). In vivo, Shox2 супрессирует программу генов работающего миокарда путем репрессии Nkx2-5 (Espinoza-Lewis et al., 2011). Делеция Shox2 приводит к гипоплазии SV, активации Nkx2-5 и соотв. к подавлению Hcn4 и Tbx3 в зачатке SAN и в ESCs (Blaschke et al., 2007; Espinoza-Lewis et al., 2009; Hashem et al., 2013). Соответственно, потеря генетической программы ритмоводителя приводит к дефектам проведения у Shox2-дефицитных мышей (Blaschke et al., 2007; Espinoza-Lewis et al., 2009; Ye et al., 2015).
Tbx3 экспрессируется в SAN, но не в предсердиях или оставшейся части SV, и он действует как главный регулятор генетической программы SAN путем активной репрессии факторов генетической программы работающего миокарда, включая Cx40, Cx43, Scn5a и Nppa/b, чтобы предупредить превращение в предсердия (Fig. 3). Эктопическая экспрессия Tbx3 приводит к образованию клеток истинного функционального ритмоводителя в этих предсердиях (Hoogaars et al., 2007; Bakker et al., 2012). Tbx3 т.о., обеспечивает фенотип ритмоводителя в клетках домена его экспрессии. В соседнем развивающемся миокарде предсердий Nkx2-5 репрессирует экспрессию Tbx3 и Hcn4. В соответствии с этим эмбрионы, дефицитные по Nkx2-5, которые погибают до ст. E10, обнаруживают эктопическую экспрессию Tbx3 и Hcn4 в сердечной трубке (Mommersteeg et al., 2007), тогда как эктопическая экспрессия Nkx2-5 в кардиомиоцитах, включая те, что в SAN, подавляет образование SAN (Espinoza-Lewis et al., 2011). Это указывает на то, что Nkx2-5 ограничивает домены экспрессии Tbx3 и Hcn4 лишь Nkx2-5- SV. Отсутствие Nkx2-5 в SAN, но не в др. подтипах кардиомиоцитов предоставляет пригодный инструмент для идентификации клеток SAN в дифференцированных ESCs человека. Последние дифференцируются в направлении кардиального клона (использующего MYC и активацию fibroblast growth factor и передачу сигналов bone morphogenetic protein), давая NKX2-5+ миоциты камер и NKX2-5- клетки ритмоводителя (Birket et al., 2015).
Транскрипционный фактор Pitx2, который детерминирует лево-правосторонюю асимметрию внутренних органов, включая сердце позвоночных (Franco et al., 2014), также участвует в развитии SAN. У Pitx2-дефицитных эмбрионов образование SAN наблюдается на левом и правом сино-атриальном соединении (Mommersteeg et al., 2007). Эктопический левый сайт SAN экспрессирует SAN-подобную генетическую программу, которая включает Tbx3. Pitx2 непосредственно репрессирует Shox2, чтобы обеспечить транскрипционную репрессию на левой стороне SV, и он позитивно регулирует экспрессию microRNAs, которые репрессируют SAN гены, такие как Shox2 и Tbx3, в этом регионе (Wang et al., 2014). Pitx2 т.о., действует как медиатор лево-правостороннего развития SAN путем супрессии генетической программы SAN на левой стороне SV (Fig. 3).
Tbx18 экспрессируется во всех клетках предшественников SV (включая SAN) и в последствии образуемых рогах синуса и главе SAN (Christoffels et al., 2006; Wiese et al., 2009), а дефицит Tbx18 у мышей приводит к уродливому и сильно гипопластичному SV и SAN. Однако, Tbx18-дефицитные плоды не обнаруживают обычной брадикардии, и генетическая программа SAN поддерживается в их гипопластичном SAN (Wiese et al., 2009), подтверждая, что Tbx18 не непосредственно регулирует генетическую программу SAN, но необходим для корректного морфогенеза и разворачивания клеток предшественников. Тем не менее, экспрессируемый вирусами Tbx18 супрессирует экспрессию Cx43, но не Cx40 и Cx45 (Gjc1), в миоцитах желудочков (Kapoor et al., 2011). В желудочках свиней и морских свинок это приводит к 'репрограммированию' вентрикулярных миоцитов в миоциты ритмоводителя и к эктопической активности ритмоводителя, сопровождаемой супрессией Cx43 и Nppa (известен также как Anf), и активацией Hcn4 (Kapoor et al., 2013; Hu et al., 2014). Мы полагаем, что различия между потерей и избыточностью функции Tbx18 может быть объяснены исходя из предположения, что Tbx18, который является, прежде всего, репрессирующим T-box фактором (Farin et al., 2007), воспроизводит функцию Tbx3 когда экспрессируется избыточно (Fig. 3).
Недавно LIM-гомеобоксный транскрипционный фактор Isl1 также привлек внимание как важный регулятор развития SAN (Hoffmann et al., 2013; Liang et al., 2015; Vedantham et al., 2015). Isl1 временно экспрессируется в и необходим для кардиальных мезодермальных предшественников и подавляется сразу же, когда они дифференцируются в кардиомиоциты. Однако, его экспрессия избирательно поддерживается в миоцитах SAN, во время эмбриогенеза и у взрослых (Sun et al., 2007; Mommersteeg et al., 2010; Sizarov et al., 2011; Weinberger et al., 2012; Vedantham et al., 2015; Liang et al., 2015). У рыбок данио Isl1 маркирует клетки ритмоводителя в месте соединения венозного синуса с предсердием и это необходимо для развития и нормальной функции ритмоводителя (Tessadori et al., 2012). У мышей, Isl1 необходим для пролиферации и функционирования клеток SAN, а специфичная для SAN делеция Isl1 приводит к эмбриональной летальности (Liang et al., 2015). Более того, Isl1-дефицит у мышей приводит к подавлению ключевых регуляторов развития SAN, таких как Tbx3, Shox2 и Bmp4, и ионных каналов для функции SAN, включая Hcn4, Hcn1 и Cacna1g (Liang et al., 2015; Vedantham et al., 2015), тогда как избыточная экспрессия Isl1 в произошедших из ESC кардиомиоцитах приводит к усилению активности генетической программы SAN и подавлению генетической программы для миокарда камер (Dorn et al., 2015). Isl1 является мишенью для Shox2 в SAN и может восстанавливать фенотип брадикардии, вызываемый дефицитом Shox2 (Hoffmann et al., 2013).
The origin and development of the AVC and AVN
AVC может быть впервые быть различим морфологически примерно на ст. E9, когда миокард соседних будущих предсердий и желудочков активирует генетическую программу рабочего миокарда и начинает расширяться. Bmp2, Tbx2 и Tbx3 находятся среди первых маркеров AVC (Hoogaars et al., 2004; Singh et al., 2012). Картирование судеб с помощью мечения липофильной краской показало, что левая задняя часть SHF на ст. 4-6 сомитов у эмбрионов мыши (E8-8.5) вносит вклад в верхнюю часть AVC, тогда как правая задняя часть SHF вносит вклад в нижнюю часть AVC (Dominguez et al., 2012). Генетическое отслеживание клонов показало, что AVC происходит из Tbx2+ клеток IFT раннего трубчатого сердца (Aanhaanen et al., 2009). Хотя точный клеточный источник миоцитов AVN остается спорным, современное мнение заключается в том, что эмбриональный AVC содержит большинство предшественников для AVN и AV кольцевого пучка (Aanhaanen et al., 2009; Vicente-Steijn et al., 2011).
Эмбриональный AVC содержит клетки с фенотипом медленного проведения в результате присутствия прирожденной миокардиальной генетической программы, которая активно репрессирует гены миокарда камер. Кроме того, отложение кардиального геля в начале образования AV клапанов физически отделяет миокард AVC от эндокарда, предупреждая Cx40-индуцирующие эндокардом управляемые сигналы от достигших AVC миоцитов (Bressan et al., 2014). Начиная приблизительно с E12 эпикардиальная мезенхима проникает в миокард между AVC и миокрадом желудочков и контактирует с происходящей из эндокарда мезенхимой подушек/клапанов, чтобы сформировать annulus fibrosus (Wessels et al., 1996; Zhou et al., 2010; Lockhart et al., 2014), отделяя тем самым атриальный и вентрикулярный работающий миокард. Tbx3+ клетки AVC образуют окончательные AVN и AV кольцевой пучок на атриальной стороне annulus fibrosus. Предсердия и желудочки теперь электрически независимы, поскольку миокардиальное соединение между обеими камерами теряется. Единственным миокардиальным соединением между предсердиями и желудочками остается AVB, который образуется из клеток гребня вентрикулярной перегородки и дорсальной стороны остающегося в контакте зачаток AVN в AVC.
Transcriptional regulation of AVC and AVN development
AVC приобретает свой фенотип посредством сети регуляторных генов, которые супрессируют дифференцировку, стимулируют развитие узла и четко разграничивают границу между AVC и миокардом камер (Fig. 4). Оценка профилей дифференциальной экспрессии генов эмбрионального и плодного миокарда AVC и камер показала, что хотя поздние плодные AVC/AVN в основном поддерживают генетическую программу эмбрионального AVC, все же AVC подвергается существенной дифференцировке во время развития (Horsthuis et al., 2009). Более того, эмбриональный и плодный AVC экспрессирует ряд нейрональных генов, не экспрессируемых миокардом камер.
Fig. 4.
Development of the AVC and AVN.
Ключевыми игроками в сети, лежащей в основе развития AVC, являются Tbx2 и Tbx3, с перекрывающимися и частично избыточными функциями (Fig. 4). Tbx2 и Tbx3 действуют путем репрессии экспрессии факторов генетической программы миокарда камер, включая Nppa, Cx40 и Scn5a, чтобы сохранять примитивный фенотип медленного проведения (Christoffels et al., 2004a; Harrelson et al., 2004; Aanhaanen et al., 2011;Singh et al., 2012). Более того, эти T-box факторы образуют позитивную петлю обратной связи с Bmp2 (Rutenberg et al., 2006; Singh et al., 2012). Инактивация Tbx2, или глобально или специфически в развивающемся миокарде, приводит к аномалиям annulus fibrosus и эктопической экспрессии генов камер в AVC, приводя к образованию эктопических проводящих AV путей, напоминая ситуацию, наблюдаемую при синдроме Wolff-Parkinson-White преждевременного возбуждения желудочков (Aanhaanen et al., 2011). Tbx2 и Tbx3 взаимодействуют с muscle-segment homeobox Msx2 транскрипционным фактором, который экспрессируется в AVC, чтобы супрессировать непосредственно экспрессию Cx43 directly (Boogerd et al., 2008; Chen et al., 2008). Они также конкурируют с Tbx5 за связывание с T-box элементами в генах мишенях, таких как Nppa и Cx40 (Hoogaars et al., 2004; van den Boogaard et al., 2012) , и за взаимодействие с Nkx2-5, чтобы репрессировать Nppa в AVC (Habets et al., 2002).
Bone morphogenetic protein 2 (Bmp2) экспрессируется специфически в эмбриональном AVC и необходим для развития AVC, действуя, чтобы контролировать ограниченную AVC экспрессию Tbx2 и Tbx3 (Ma et al., 2005; Singh et al., 2012). Соотв., AVC-ограниченный дефицит Bmp рецептора Alk3 (Bmpr1a) приводит к дефектному морфогенезу AVN (Gaussin et al., 2005; Stroud et al., 2007). Bmp2/Smad передача сигналов активирует Tbx2, чтобы управлять его экспрессией в AVC (Ma et al., 2005; Singh et al., 2009); Tbx20, который необходим для образования сердечной трубки и развития камер, репрессирует эту активацию, чтобы ограничить экспрессию Tbx2 AVC и определить границу AVC (Singh et al., 2009). В сердец рыбок данио экспрессия tbx2b в AVC управляется с помощью транскрипционного фактора, кодируемого foxn4 (известен также как sli) (Chi et al., 2008), хотя гомологичный мышиный Foxn4-обеспечиваемый механизм не установлен.
Граница между AVC и камерами далее очерчивается с помощью передачи сигналов Notch. В миокарде камер кур передача сигналов Notch активирует Hey1 и Hey2, которые репрессируют экспрессию Bmp2. Напротив, Bmp2-активированный Tbx2 репрессирует экспрессиюe Hey1 и Hey2 в AVC, обеспечивая петлю обратной связи, которая заостряет границу AVC (Rutenberg et al., 2006). У мышей Hey1 и Hey2 предупреждают экспрессию Tbx2 в миокарде предсердий и желудочков, соотв., хотя экспрессия Hey1 и Hey2 не затрагивается эктопической избыточной экспрессией Tbx2 или Notch2 или инактивацией Notch2 (Kokubo et al., 2005; Rutenberg et al., 2006). Ингибирование передачи сигналов Notch у мышей приводит к гипоплазии AVN и к нарушению задержки в AV узле, тогда как, напротив, миокардиальная активация Notch продуцирует дополнительные пути и преждевременное возбуждение желудочков (Rentschler et al., 2011). Каноническая передача сигналов Wnt также необходима для корректного развития AVC и электрического программирования. У рыбок данио передача сигналов Wnt необходима для активации экспрессии bmp4 и tbx2b в AVC (Verhoeven et al., 2011). Более того, у мышей потеря миокардом передачи сигналов Wnt приводит к гипоплазии правого желудочка, которая ассоциирует с потерей миокарда AVC, а эктопическая активация канонической передачи сигналов Wnt в развивающихся желудочках приводит к поразительному AVC фенотипу стенки желудочков (Gillers et al., 2015).
Наконец, GATA транскрипционные факторы члены семейства Gata4 и Gata6, которые выполняют множественные роли в развитии сердца, участвуя также в специфичной для AVC экспрессии генов и в развитии AVC/AVN (Zhou et al., 2012; Stefanovic et al., 2014; Stefanovic and Christoffels, 2015). Gata4 гетерозиготные мутантные мыши имели укороченные PR интервалы, подтвердив, что Gata4-обусловленная регуляция генов мишеней замедленной проводимости AV вносит вклад в собственно AV задержку (Munshi et al., 2009). Вместе с Tbx5, Gata4 обеспечивает экспрессию Cx30.2 (Gjd3), который кодирует низкой проводимости субъединицы щелевых соединений в AVC/AVN (Munshi et al., 2009). Напротив, basic helix-loop-helix (bHLH) транскрипционный фактор MyoR (musculin; Msc) репрессирует Gata4-зависимую активацию Cx30.2, тонко контролируя тем самым становление нормальной AV задержки (Harris et al., 2015). Gata4 и Gata6 также регулируют экспрессию репрессора транскрипции Id2 и кардиального sodium-calcium exchanger Ncx1 (Slc8a1), важного фактора для собственно функции кардиального ритмоводителя (Lim et al., 2008; Liu et al., 2015). Специфичная для миокарда делеция Gata6 приводит к подавлению обоих этих генов, а также к подавлению Hcn4, снижение выхода из клеточного цикла Tbx3+ клеток приводит к уменьшению Tbx3+ клеток в AVN, и удлинению PR интервала (Liu et al., 2015).
Development of the ventricular conduction system
Проводящая система желудочков (VCS), которая составляет лишь 1% от общей мышечной массы желудочков (Miquerol et al., 2010), представлена AVB (или пучком Гиса), левой и правой веточками BBs, идущими от гребня перегородки в направлении верхушки и сети волокон Пуркинье. VCS имеет миокардиальное происхождение (Gourdie et al., 1995; Cheng et al., 1999). Дистальные части BB и сеть волокон Пуркинье образуют тонкий слой специализированных миоцитов непосредственно под эндокардом. VCS обладает общим профилем генов и некоторыми аспектами фенотипа узелка (напр. бедность сократительного аппарата, небольшое количество саркомеров, большие количества гликогена и латентным автоматизмом) с SAN и AVN. Однако, в противоположность миокарду узелка, миокард VCS проводит импульсы быстро и экспрессирует высокие уровни Cx40 и Scn5a, которые обеспечивают быстрое проведение импульсов от AVN к работающим миоцитам желудочков. Cx40 наиболее охарактеризован и наиболее специфичный из известных маркеров клеток VCS; он не экспрессируется AVN или работающим миокардом желудочков. Др. специфические и пригодные VCS маркеры были идентифицированы у мышей, это Irx3 (Christoffels et al., 2000; Zhang et al., 2011), Hcn4 (after birth; Liang et al., 2013), CCS-lacZ (Rentschler et al., 2001) и Cntn2-EGFP (Pallante et al., 2010). Более того, Tbx3 избирательно экспрессируется в AVB и BB, но не в сети волокон Пуркинье (Hoogaars et al., 2004).
Источник клеток VCS хорошо известен, хотя некоторые важные детали всё ещё неизвестны. Домен в AVC, позитивный по экспрессии G1N2 и Tbx3 распространяется дорсально и вентрально в компартменте желудочков и проходит через гребень межжелудочковой перегородки, образуя межжелудочковое кольцо, из которого и образуется AVB (Wessels et al., 1992; Hoogaars et al., 2004). Он непосредственно связан с происходящим из AVC узлом AVN, но соотв. предшественники для этих двух тканей сегрегируют перед началом экспрессии Tbx2 (Aanhaanen et al., 2009) в предшественниках AVC и пред активацией энхансера Mef2c (маркируется с помощью Mef2c-AHF-enhancer-Cre; Verzi et al., 2005) в предшественниках перегородки приблизительно на ст. E8-9 (Aanhaanen et al., 2010). Расположение предшественников AVB (гребень перегородки) в эмбрионе перед образованием желудочков не было оценено. BBs образуются из миоцитов под эндокардом в трабекулах перегородки. Эти компоненты присутствуют только у млекопитающих и птиц, но не у рептилий и рыб, которые лишены (полной) перегородки. Сеть волокон Пуркинье также обнаруживается тольк у птиц и млекопитающих. Она возникает из трабекулярного миокарда; во время эмбриогенеза эмбриональные желудочки уже состоят из трабекулярного миокарда, который действует как функциональный эквивалент и клеточные предшественники сети волокон Пуркинье. Он экспрессирует Cx40, Irx3 и др. маркеры VCS и быстро проводит импульсы (Rentschler et al., 2001; Miquerol et al., 2010; Zhang et al., 2011). У рыб, амфибий и рептилий Cx40+ трабекулярная стенка миокарда сохраняется у взрослых. Напротив, у млекопитающих и птиц (Fig. 5A), этих 'низших' endothermic позвоночных не образуется массивной Cx40-негативной компактной стенки желудочков. Как таковой, трабекулярный миокард также, скорее всего, является эволюционным предшественником системы волокон Пуркинье у endotherms (Jensen et al., 2012).
Fig. 5.
Development of the VCS.
Паттерн пространственно-временной экспрессии Cx40 подтверждает, что Cx40+ 'подобный Пуркинье' эмбриональный трабекулярный миокард является предшественником и Cx40-негативного компактного вентрикулярного работающего миокарда, и Cx40+ дефинитивной сети волокон Пуркинье (Christoffels and Moorman, 2009; Fig. 5A). Клональный анализ, базирующийся на мечении и отслеживании Cx40+ клеток, подтвердил это предположение (Miquerol et al., 2010, 2013). Когда Cx40+ клетки метились необратимо пульсовой меткой на ст. E10.5, когда всё ещё тонкая трабекулярная стенка левого желудочка была полностью позитивной по Cx40 , а стенка правого желудочка лишь частично, то меченные производные обнаруживались в волокнах Пуркинье и в компактной стенке. Однако, когда клетки метили на ст. E16.5, когда Cx40-негативная компактная стенка уже была сформирована и Cx40+ трабекулярная зона становилась относительно небольшим компонентом, то производные Cx40+ клеток обнаруживались только в сети Пуркинье, показывая, что клоны работающего миокарда и волокон Пуркинье уже разделились на ст. E16.5.
Molecular programming of the VCS
Информация о молекулярных механизмах, лежащих в основе трабекулярного развития, проливает свет на механизмы развития, контролирующие формирование VCS, продукт трабекулярного миокарда. 4 ключевых сигнальных фактора участвуют в развитии трабекул: Notch, Nrg1/ErbB (Egfr), ephrin B2/EphB4 и Bmp10 (rev. de la Pompa and Epstein, 2012;Fig. 5B). Предложена модель, согласно которой Notch-обеспечиваемые взаимодействия между эндокардом и миокардом способствуют переходу раннего эмбрионального вентрикулярного миокарда к трабекулярному миокарду зависимым от ephrin B2 и Nrg1 способом; согласно этой модели, пролиферация трабекулярных кардиомиоцитов поддерживается с помощью Bmp10. Соотв. воздействие Nrg1 на культивируемые эмбриональные сердца, изолированные от от CCS-lacZ репортерной линии, в которой ранний трабекулярный миокард в эмбриональном сердце и затем VCS в зрелом сердце маркируются экспрессией β-galactosidase, приводя к стимуляции экспрессии lacZ. Более того, паттерн активации в желудочках культивируемых эмбрионов изменяется (Rentschler et al., 2002). Итак, эти данные подтверждают, что Nrg1 стимулирует характеристики проведения трабекулярного миокарда. Сходным образом, активация Notch в эмбриональном миокарде желудочков вызывает стимуляцию характеристик проведения у взрослых, т.е. индукцию экспрессии Cntn2, Hcn1, Scn5a и CCS-lacZ и изменения в клеточном потенциале действия в направлении клеток волокон Пуркинье (Rentschler et al., 2012). Кроме того, временная активация Notch в неонатальных вентрикулярных миоцитах с использованием вирусной трансдукции, вызывает индукцию характерную для Пуркинье генетическую программу и электрофизиологию.
Сосудистый цитокин endothelin также участвует в развитии VCS. Во время развития сердца птиц endothelin 1 регулирует функциональное созревание VCS и активацию Cx40, и было предположено, что этого достаточно для превращения вентрикулярных кардиомиоцитов в клетки волокон Пуркинье (Gourdie et al., 1998; Kanzawa et al., 2002). Однако, мыши, обладающие делецией Ednra и Ednrb (кодирующие два рецептора эндотелина у мыши) жизнеспособны и обнаруживают неизмененную экспрессию гена CCS и отсутствие очевидного влияния на функцию CCS (Hua et al., 2014). Кроме того, применение endothelin 1 к CCS-lacZ репортерным мышам не меняет экспрессии CCS-lacZ у мышей (Rentschler et al., 2002). Мнение, что endothelin 1-обусловленное превращение вентрикулярных миоцитов в клетки волокон Пуркинье у эмбрионов кур также трудно примирить с моделью, описанной выше, согласно которой Cx40+ миоциты эмбрионального трабекулярного желудочка дают Cx40+ клетки волокон Пуркинье и Cx40- вентрикулярные миоциты компактной стенки. Т.о., хотя передача сигналов endothelin 1 может стимулировать экспрессию Cx40 у эмбрионов кур, её недостаточно, чтобы вызывать превращение или спецификацию клона для сети волокон Пуркинье (Christoffels and Moorman, 2009). В дополнение к сети волокон Пуркинье под эндокардом, сердца птиц обладают сетью Cx40+ волокон Пуркинье вокруг коронарных артерий (periarterial), которая может лежать в основе разных интерпретаций относительно передачи сигналов endothelin и дифференцировки VCS.
В то время как сигнальные факторы, описанные выше, участвуют в контроле образования VCS в целом, транскрипционная сеть с вовлечением Nkx2-5, Tbx5, Tbx3, Irx3, Hopx и Id2, по-видимому, контролирует развитие и гомеостаз AVB и BB (Fig. 5C). Базируясь на данных от мутантных мышей, может быть сформулирована простая модель. Tbx3 также экспрессируется специфически с самых ранних стадий в зачатках AVB и BB, и он непосредственно супрессирует генетическую программу работающего миокарда (включая Cx40 и Cx43) и (косвенно) стимулирует генетическую программу ритмоводителя (напр. Hcn4). Tbx5 экспрессируется более широко в желудочках, но в AVB и BB он стимулирует генетическую программу быстрой проводимости, включая Cx40 и Scn5a (Moskowitz et al., 2004; Arnolds et al., 2012). Здесь он успешно конкурирует с Tbx3 за захват сайтов связывания 'генов проводимости', таких как Cx40 и Scn5a. Это приводит к строгой экспрессии Scn5a в AVB и BB сначала (Remme et al., 2009), и к индукции экспрессии Cx40 в AVB во время плодного периода, это, по-видимому, коррелирует с возникновением AVB функции прежде всего для проведения импульсов. У эмбрионов, дефицитных по bHLH транскрипционному фактору Hey2, внутристеночная экспрессия Tbx5, Cx40 и Scn5a, которые встречаются на высоком уровне в трабекулярном компоненте развивающихся желудочков, расширяется на компактный миокард (Xin et al., 2007; Koibuchi and Chin, 2007; Fischer et al., 2005; Bezzina et al., 2013). Hey2 является репрессором транскрипции, подтверждая, что он супрессирует экспрессию этих генов в компактной стенке, внося тем самым вклад в образование сети волокон Пуркинье. Nkx2-5 выполняет более сложную роль, т.к. он кооперирует с Tbx3 и Tbx5 и др. факторами. Гетерозиготные мутантные мыши по Nkx2-5 обнаруживают удлинение продолжительности QRS и низкую амплитуду деполяризации AVB (Jay et al., 2004; Moskowitz et al., 2007). Более того, Nkx2-5 гаплонедостаточность у мышей приводит к тяжелой гипоплазии волокон Пуркинье и стимуляции Bmp10. Интересно, что, хотя трабекулярный миокард у таких мутантов выглядит нормальным во время развития, но нормальные уровни Nkx2-5 необходимы для клеточно автономного способа около и постнатального созревания волокон Пуркинье (Meysen et al., 2007). Гипоплазия волокон Пуркинье у Nkx2-5 мутантов может быть устранена с помощью гаплонедостаточности Prox1 (Risebro et al., 2012). У Tbx5/Nkx2-5 компаундных гетерозиготных мутантов AVB и BB не развиваются, и Id2 не активируется. Соответственно, гомозиготные Id2 мутанты неспособны формировать AVB (Moskowitz et al., 2007). Принимая во внимание его функцию в др. контекстах, Id2 может также участвовать в супрессии программы дифференцировки работающего миокарда в AVB и BB.
Ряд дополнительных факторов участвует в развитии VCS. Гомеобокный транскрипционный фактор Irx3 экспрессируется в трабекулярном вентрикулярном миокарде и его экспрессия оказывается ограниченной VCS (Christoffels et al., 2000; Zhang et al., 2011). Здесь, Irx3 непосредственно супрессирует Cx43 и (косвенно) активирует Cx40 и Scn5a (Zhang et al., 2011; Koizumi et al., 2015). Irx3 мутантные мыши обнаруживают задержанную вентрикулярную активацию и аномальное проведение (Zhang et al., 2011) и аритмию в желудочках (Koizumi et al., 2015). У людей, анализ последовательностей экзонов IRX3 у 130 пробандов с idiopathic ventricular fibrillation выявил две новые мутации IRX3 (Koizumi et al., 2015). Родственный фактор Irx5 экспрессируется в эндокарде и субэндокардиальных миоцитах (включая слой, который д. сформировать волокна Пуркинье), где он репрессирует среди прочих transient outward potassium current (Ito) (Costantini et al., 2005). Гомеобоксный белок Hopx также, по-видимому, играет роль. У Hopx мутантных мышей, Cx40 экспрессия снижается в AVB и BB. Такие мыши обнаруживают дефекты проводимости после AVN, включая более широкий QRS комплекс, более длинный QT интервал и более широкая P волна (Ismat et al., 2005). Более того, Hf1b (Sp4) мутанты обнаруживают внезапную кардиальную гибель, вызываемую дефектами проводимости и вентрикулярным arrhythmogenesis, ассоциированными с нарушенной экспрессией Cx40 и Cx43 (Nguyen-Tran et al., 2000; Hewett et al., 2005).
Regulatory elements in the CCS transcriptional network
Идентификация элементов регуляторной ДНК, регулирующих активность генов в CCS предоставила дальнейшую информацию о транскрипционных механизмах, лежащих в основе развития и функции CCS. Напр., характеристика промоторного региона Nppa in vivo привела и идентификации обеспечиваемого с помощью Tbx2/Tbx3 репрессивного механизма в AVC (Habets et al., 2002). Экспрессия кардиального Tbx3 управляется с помощью двух синергично действующих дистальных энхансеров, которые физически контактируют с промотором Tbx3 у эмбрионов мышей (van Weerd et al., 2014). Один из этих энхансеров, расположенный ~90 kb выше Tbx3, строго управляет экспрессией lacZ репортера в вентральной, правой и дорсальной пропорциях AVC. Др. энхансер управляет экспрессией пан-кардиального репортера без специфической пространственной информации. В комбинации оба энхансера управлояют мощной экспрессией по всему AVC и в межжелудочковом кольце, указывая на механизм, с помощью которого синергичное действие двух регуляторных модулей регулирует экспрессию Tbx3 в предшественниках atrioventricular conduction system (AVCS) (van Weerd et al., 2014).
Tbx2 экспрессия в AVC обеспечивается посредством прямой активации с помощью передачи сигналов Bmp2/Smad. Регион выше на 6 kb непосредственно Tbx2 обогащен Smad-связывающими элементами и он содержит регуляторные последовательности, которые активируются с помощью стоящей ниже Smads обусловленной с помощью Bmp2 передачи сигналов и достаточны для воспроизведения экспрессии Tbx2 в AVC и OFT (Kokubo et al., 2007; Shirai et al., 2009; Singh et al., 2009). В миокарде камер Bmp2-обеспечиваемая активация этих последовательностей нарушается с помощью Tbx20, который физически взаимодействует с и секвестрирует Smad1 и Smad5 (Singh et al., 2009). Более того, Hey1 и Hey2 супрессируют Bmp2-обеспечиваемую активацию этих энхансеров, определяя тем самым далее четкую границу между предсердием и AVC (Hey1) и желудочком и AVC (Hey2) (Kokubo et al., 2007). Активация Cx30.2 с помощью Gata4 и Tbx5 в AVCS также обеспечивается с помощью непосредственного связывания дистального энхансера (Munshi et al., 2009). Напротив, Gata4 непосредственно взаимодействует с MyoR, чтобы связывать и супрессировать этот энхансер, модулируя тем самым регуляторный циркуит, который обеспечивает AV задержку (Harris et al., 2015).
Первый идентифицированный регуляторный элемент, который постоянно управляет CCS-специфической экспрессией генов, это куриный Gata6 (cGata6)-энхансер, который у трансгенных мышей активен в клоне AVCS (т.e.в AVC, AVB), начиная с ранних эмбриональных стадий (Davis et al., 2001). Внутри энхансера стержневой единицы в 47 пн достаточно, чтобы ограничивать экспрессию репортерного гена в AVCS (Adamo et al., 2004). Интересно, что стержневой энхансер активен во всей кардиальной трубке, но во время дифференцировки камер оказывается ограниченным не камерным миокардом, включая AVC (Christoffels et al., 2004b), подтверждая, что он супрессирован в дифференцированном миокарде камер. В самом деле, активность cGata6, но также AVC энхансеров Tbx2 и Cx30.2 и специфического для AVC фрагмента промотора Tnni3 (Di Lisi et al., 2000; Habets et al., 2002), зависит от GATA-связывающих сайтов в энхансерах в случает оккупации с помощью Gata4 (Stefanovic et al., 2014). Эти энхансеры действуют как переключатели (или 'двойные модули';Fig. 6A), активирующие транскрипцию в AVC и супрессирующие её в миокарде камер. Благодаря синергичному действию с передачей сигналов Bmp/Smad , Gata4 рекрутирует histone acetylases (HATs) на эти энхансеры, чтобы ацетилировать H3K27 специфически в AVC, в то же время он взаимодействует с histone deacetylases (HDACs) и специфичными для камер репрессорами транскрипции Hey1 и Hey2, чтобы деацетилировать и репрессировать функцию энхансеров в камерах (Stefanovic et al., 2014; Fig. 6B,C).
Fig. 6.
Regulatory elements and histone modifications involved in CCS development.
В развивающейся VCS, Id2 кооперативно регулируется с помощью связывания Nkx2-5 и Tbx5 с фрагментом в 1052-пн промотора Id2. Мутации в сайте связывания Tbx5 в этом регионе промотора полностью устраняют специфичную для CCS экспрессию генов, тогда как экспрессия вне сердца не затрагивается, иллюстрируя специфичность этого транскрипционного механизма (Moskowitz et al., 2007). Энхансеры были также идентифицированы в локусе Scn5a/Scn10a; они управляют специфичной для VCS экспрессией генов и контролируются с помощью Tbx5, Tbx3, Nkx2-5 и Gata4 (Arnolds et al., 2012; van den Boogaard et al., 2012).
HATs и HDACs, которые выполняют ключевые роли в регуляции экспрессии генов, путем контроля доступности ДНК (Backs and Olson, 2006; Bruneau, 2010; Han et al., 2011; Chang and Bruneau, 2012), участвуют в развитии и функции CCS. Напр., Hdac3, член Class I HDAC семейства, влияет на развитие и гомеостаз сердца (Montgomery et al., 2008; Singh et al., 2011), действуя путем репрессии экспрессии Tbx5 в раннем развитии (Lewandowski et al., 2014). Во время развития она экспрессируется на высоком уровне в SAN (Wu et al., 2014), AVN и волокнах Пуркинье (Risebro et al., 2012). Белок prospero-related homeobox protein 1 (Prox1) рекрутирует Hdac3 в AVN и волокна Пуркинье, чтобы репрессировать Nkx2.5 непосредственно посредством проксимального вышестоящего энхансера, контролируя тем самым электрофизиологический гомеостаз во взрослом сердце (Risebro et al., 2012). В SAN, также Hdac3 участвует в репрессии Nkx2-5. С помощью непосредственного взаимодействия Tbx3 и Baf250a (Arid1a), ключевого компонента семейства SWI/SNF комплекса ремоделирования хроматина, динамическое равновесие ацетилирования и деацетилирования на промоторе Nkx2-5 приводит к репрессии транскрипции в SAN (Wu et al., 2014). Напротив, регуляторные последовательности выше Baf250a совместно оккупируются Nkx2-5, Shox2 и Tbx5, подтверждая механизм, согласно которому эти факторы обеспечивают экспрессию Baf250a в SAN (Ye et al., 2015).
Hdac1 и Hdac2, др. члены Class I HDACs, выполняют перекрывающиеся роли в морфогенезе и росте сердца. Как упоминалось выше они взаимодействуют с Gata4, чтобы регулировать состояние ацетилирования специфичных для AVC энхансеров, выполняя тем самым критическую роль в специфичной для AVC экспрессии и дифференцировке AVC в противовес работающему миокарду (Stefanovic et al., 2014). Их критическая роль в развитии CCS далее была подчеркнута наблюдением, что специфичная для миокарда делеция Hdac1 и Hdac2, но не каждой из них в отдельности, приводит к стимуляции генов кальциевых каналов, включая Cacna1h и Cacna2d2 (Montgomery et al., 2007). Cacna1h (известен также как Cav3.2) является T-type кальциевым каналом, экспрессирующимся в эмбриональном сердце, но подавляемым после рождения (Yasui et al., 2005). Cacna2d2, L-type кальциевого канала субъединица α2δ2, специфически экспрессируется в ткани узелка эмбрионального и взрослого сердца (Marionneau et al., 2005; Singh et al., 2012). HDAC активность, т.о., пространственно ограничивает активность этих генов путем наложения супрессивной гистоновой модификации на эти гены в клетках не-CCS, по-видимому, используя механизм переключения энхансеров AVC, описанный выше (Stefanovic et al., 2014). Class IIa HDACs также обеспечивает функцию интронного прилегающего региона геномной ДНК внутри Hcn4, который действует как энхансер и активен в эмбриональном AVC и порции VCS домена экспрессии Hcn4. Во взрослом сердце, этот энхансер активен в компактном AVN и AVB. Ингибирование активности HDAC с помощью trichostatin A (TSA) приводит к экспансии домена активности энхансера на всё сердце (Vedantham et al., 2013), это согласуется с моделью обеспечиваемой с помощью HDAC супрессии CCS-специфических энхансеров в миокарде камер.
Genomic variation affects CCS function
У людей гаплонедостаточность для кардиальных стержневых транскрипционных факторов, включая TBX5 и NKX2-5, вызывает выраженную дисфункцию и аритмию CCS (Basson et al., 1997; Li et al., 1997; Schott et al., 1998). Анализ мышей, мутантных по гипоморфному и кондиционному Tbx3 с варьирующими уровнями экспрессии Tbx3 внутри сердца показал, что функция и гомеостаз CCS чрезвычайно чувствительны к дозе Tbx3 (Frank et al., 2011). Небольшие нарушения в регуляторной сети CCS могут т.о., влиять на развитие или функцию CCS и приводить к предрасположенности к дисфункции CCS.
Несколько genome-wide association studies (GWAS) было проведено в последнюю декаду, открыв общераспространенные варианты в популяции людей, которые были ассоциированы с признаками, затрагивающими функцию CCS, включая нарушения PR интервала, продолжительность QRS и QT интервал. Локусы, идентифицированные в этих исследованиях, касались генов, кодирующих хорошо известные кардиальные транскрипционные факторы, такие как TBX3, TBX5, TBX20, NKX2-5, MEIS1 и HEY2, и гены, кодирующие ионные каналы, такие как SCN5A, SCN10A, KCNQ1, KCNH2 и HCN4 (Holm et al., 2010; Pfeufer et al., 2010; Sotoodehnia et al., 2010; Bezzina et al., 2013; den Hoed et al., 2013; Verweij et al., 2014; Table 1). Интересно, что многие гены участвуют в сети регуляторных генов CCS. Эти находки подтвердили, что транскрипционная сеть очень чувствительная к генетическим вариациям, которые влияют на баланс этих факторов. Кроме того, большинство ассоциированных вариантов располагаются в некодирующих геномных регионах, подтверждая, что они влияют на регуляторные последовательности, участвующие в контроле уровня и паттерна экспрессии генов мишеней внутри различных локусов (Maurano et al., 2012; Sakabe et al., 2012). Хотя эффект ассоциированных вариантов в целом относительно мал, они могут оказывать существенное влияние на функцию CCS и приводить к предрасположенности к различным нарушениям. Напр., не-кодирующие варианты локуса SCN5A-SCN10A и близкие к HEY2, были ассоциированы с синдромом Brugada, нарушениями ритма с высоким риском внезапной сердечной гибели (Bezzina et al., 2013). Необходимо идентифицировать функциональные элементы в сопричастных к риску локусах, чтобы установить, как они влияют на нормальную функцию своих генов мишеней.
Table 1.
Loci harbouring GWAS variants associated with ECG parameters
Необходимо отметить, что полиморфизмы, идентифицированные с помощью GWAS редко представляют функциональный вариант, они маркируют гаплоблоки совместно сегрегирующие с single nucleotide polymorphisms (SNPs), которые обладают причинным SNP. Поскольку регуляторные последовательности физически контактируют с промоторами своих генов мишеней, чтобы регулировать транскрипцию, трехмерная (3D) архитектура хромосом была распознана как важный регуляторный слой (de Laat and Duboule, 2013). Недавние исследования показали, что геном участвует в т.наз. topologically associating domains (TADs), которые являются доменами взаимодействий хроматина размером в megabase пар, которые консервативны среди типов клеток и видов и последовательности которых преимущественно контактируют др. с др., чтобы регулировать транскрипцию генов (Lieberman-Aiden et al., 2009; Dixon et al., 2012). Следовательно, структура 3D хроматина и TAD организация предоставляют важную информацию относительно регуляции генов. Итак, принимая во внимание эти факторы, мы начинаем понимать, как определенные варианты могут влиять на функцию CCS.
Варианты в локусе SCN5A-SCN10A, напр., ассоциируют с модуляцией PR интервала (Chambers et al., 2010; Holm et al., 2010; Pfeufer et al., 2010; Smith et al., 2011), QRS продожительности (Holm et al., 2010; Sotoodehnia et al., 2010) и QT интервала (Newton-Cheh et al., 2009; Pfeufer et al., 2010;Sotoodehnia et al., 2010), которые обеспечивают предрасположенность к нарушениям проведения и реполяризации. Однако, хотя роль SCN5A в проведении и аритмии твердо установлена, роль SCN10A в кардиальном проведении оказалась неожиданной и стала предметом некоторых противоречий (Verkerk et al., 2012; Yang et al., 2012). Scn5a и Scn10a, как было установлено, являются мишенями для Tbx3 и Tbx5 in vivo (van den Boogaard et al., 2012; Fig. 7A). Один из основных вариантов риска в локусе SCN5A-SCN10A это общий SNP rs6801957, который, как было установлено, затрагивает законсервированный T-box консенсус сайта связывания в интронном энхансере в SCN10A, который оккупируется TBX3 и TBX5 и который управляет активностью в VCS (van den Boogaard et al., 2014). Недавний circular chromosome conformation capture sequencing (4C-seq) анализ выявил, что интронный энхансер контактирует с промоторами Scn5a и Scn10a (Fig. 7B). Трансгенный анализ у мышей показал, что энхансер регулирует ген Scn5a при этом SNP стого снижает активность энхансера и экспрессию Scn5a. Более того, индивиды, несущие аллель риска экспрессируют пониженные уровни SCN5A (van den Boogaard et al., 2014;Fig. 7C). Дополнительным нижестоящим энхансером для SCN5A является неравновесное сцепление (linkage disequilibrium (LD)) с SCN5A-SCN10A локусом риска и зависит от Tbx5-обусловленной активации, чтобы управлять специфичной для VCS экспрессией генов (Arnolds et al., 2012). Локусы TBX5 и SCN5A ассоциированы также с PR интервалом и QRS продолжительностью, указывая на иерархию в GWAS локусах человека для функции VCS. Такие исследования не только предоставляют информацию относительно эффекта изменчивости на функцию, но и также нацелены на понимание транскрипционной регуляции генов, участвующих в функционировании CCS и четко выявляют серьезность кажущихся минорными вариаций.
Fig. 7.
Regulation of the SCN5A-SCN10A locus: insights from GWAS- and chromatin-based analyses.
Такой базирующийся на GWAS анализ предоставляет также информацию о том, как Tbx гены регулируются в CCS. Гены, кодирующие Tbx3 и Tbx5 организованы в эволюционно законесервированный кластер (Agulnik et al., 1996) и их паттерны перекрывающейся экспрессии и функции во время развития подтверждают совместные регуляторные механизмы их транскрипционного контроля (Hoogaars et al., 2004). Варианты в гене desert, фланкирующие кластер, оказались ассоциированы с удлиненным интервалом PR и продолжительностью QRS (Holm et al., 2010; Pfeufer et al., 2010; Sotoodehnia et al., 2010; Verweij et al., 2014), но функциональное описание этих вариантов еще предстоит установить. Однако, 4C-seq исследования сердец эмбрионов мышей выявили, что оба локуса организованы в отдельные TADs и образуют индивидуальные хроматиновые петли, физически отделяющие тем самым Tbx3 петлю от таковой Tbx5 (Fig. 8A) и присутствие энхансера, общего для обоих генов, маловероятно (van Weerd et al., 2014). Это противоречит транскрипционной регуляции хорошо изученных Irx и Hox кластеров онтогенетических генов, для которых общие энхансеры появляются широко, возможно лежат в основе консервации их геномной организации во время эволюции (Duboule, 1998; Tena et al., 2011). Hi-C в клетках человека, зондирующие профили контактов на геномном уровне, подтвердили, что раздельная доменовая организация TBX3-TBX5 локуса законсервирована у мышей и человека (Jin et al., 2013). Такое знание облегчает предназначение функции вариации, т.к. это может привести к заключению, что регуляторные последовательности, затрагиваемые с помощью ассоциированных с признаками вариантами, располагающиеся внутри TBX3 петли регулируют исключительно TBX3, но не TBX5, и vice versa.
Fig. 8.
Regulation of the Tbx3-Tbx5 locus.
Conclusions
Our understanding of the developmental processes that drive CCS formation has greatly improved over the last decade. Key factors have been identified, unravelling the transcriptional networks underlying the formation of distinct CCS components. The numerous GWAS-based approaches that have recently been conducted on rhythm, conduction and repolarization parameters underlines the sensitive nature of the mechanisms governing CCS development, as they link common variants affecting factors crucial for CCS development and function to conduction traits. Although individual variants generally exert a relatively mild effect, they can affect sensitive regulatory pathways and lead to dysregulation of key factors in CCS development and function, and hence to a predisposition to conduction system disorders and arrhythmias. The main challenge that we are facing now is to link the associated variants with functional modules and investigate how their misregulation affects cardiac conduction. The emergence of novel techniques for assessing genome-wide transcription factor occupancy (ChIP-seq), chromatin topology (3/4/5/Hi-C-seq), chromatin accessibility (DNase-seq, ATAC-seq) and transcriptomes (RNA-seq) in specific cell types will no doubt provide indispensable insight.
