Врожденные дефекты сердца встречаются у 5% новорожденных и большинство из этих дефектов обусловлено нарушениями клапанов сердца (Hoffman and Kaplan, 2002; Pierpont et al., 2007). Сердце - это первый орган, развивающийся в эмбрионе и действующий для снабжения кислородом и питательными веществами, как только возникает собственно кровоток. Во время развития сердца линейное трубчатое сердце образует петли направо на день эмбриогенеза (E) 8.5 мыши, чтобы инициировать становление четырехкамерного сердца (E9.0-9.5), состоящего из парных левого и правого предсердий и желудочков. Эти структуры затем подразделяются с помощью сужений в атриовентрикулярный канал (AVC) и тракт оттока (OFT). Вздутия, состоящие из внеклеточного матрикса в AVC и OFT, обозначаются как кардиальные подушки, они заселяются мезенхимными клетками, происходящими из лежащего поверх эндокарда посредством эндотелиально-мезанхимного перехода (EMT). EMT начинается на ст. E9.5 в AVC и на ст. E10.5 в OFT, когда эндотелиальные клетки (ECs) отсоединяются от монослоя и проникают в подлежащий матрикс (Camenisch et al., 2002). После инвазии в кардиальные подушки мезенхимные клетки подвергаются пролиферации, дифференцировке и ремоделированию, а подушки сливаются, чтобы дать створки клапанов и структуры перегородки зрелого сердца (Eisenberg and Markwald, 1995; Niessen et al., 2008; de la Pompa and Epstein, 2012). Несколько сигнальных путей скоординированы, чтобы инициировать и поддержать EMT (Armstrong and Bischoff, 2004; Garside et al., 2013).

Путь Notch действует как критический игрок в кардиальном EMT, и имеются ключевые взаимодействия с путем передачи сигналов transforming growth factor beta (TGFβ ) во время этого процесса (Timmerman et al., 2004; Niessen et al., 2008; Fu et al., 2009, 2011; Chang et al., 2011). Notch белки являются семейством трансмембранных рецепторов (Notch1-4 у млекопитающих), которые активируются после соединения с несколькими лигандами. Связанные с лигандами Notch рецепторы подвергаются конформационным изменениям, приводящим к двум протеолитическим расщеплениям, вызывающим высвобождение внутриклеточного домена Notch (NICD) от связи с мембраной. NICD транслоцируется в ядро, соединяется с ДНК-связывающим корепрессором RBPJ (recombination signal-binding protein for immunoglobulin k J region), рекрутирует коактиватор транскрипции MAML1 (Mastermind-like 1), и этот третичный комплекс индуцирует транскрипцию ниже расположенных генов мишеней, таких как smooth muscle actin (ACTA2), snail homolog 2 (SNAI2), hairy and enhancer of split (HES) и Hairy/E(spl)-родственный с YRPW мотивом (HEY) (Iso et al., 2003; Noseda et al., 2006; Niessen et al., 2008).

Мутации NOTCH1 у человека ассоциированы с двухстворчатым аортальным клапаном, а также с более тяжелыми аномалиями сердца человека (Garg et al., 2005). Notch1 - или Rbpj-дефицитные мыши погибают на ст. E10.5 в результате пороков сердца, частично обусловленных дефектами развития кардиальных подушек (Timmerman et al., 2004). Более того, мыши с делецией Hey2 или с двойной делецией Hey1 и Hey2 или Hey1 и HeyL, обнаруживают различные врожденные пороки сердца, включая дефекты кардиальных подушек (Donovan et al., 2002; Fischer et al., 2004; Fischer et al., 2007). Мутации Notch лиганда JAG1 также характеризуются кардиальными дефектами, синдромом Alagille (Li et al., 1997; Oda et al., 1997; Eldadah et al., 2001).

Хотя ключевые сигнальные пути, управляющие началом EMT, участвуют в развитии клапанов, мало известно о том, какие нижестоящие мишени вносят вклад в EMT, созревание кардиальных подушек и формирование клапанов. Ранее, используя профилирование экспрессии генов сильно секвенированных транскриптомов AVC, мы идентифицировали временные (temporal) кластеры генов, которые избыточно представлены в виде Notch мишеней (Vrljicak et al., 2010). Мы идентифицировали кластеры, обогащенные по пути передачи сигналов Notch и генами мишенями с временным паттерном экспрессии с пиком на ст. E9.5 (соответствующим EMT), с дополнительным пиком на ст. E11.5, указывающим на вторую волну активации Notch после E9.5.

В данном исследовании мы проверяли роль, которую играет активация Notch в AVC после ст. E9.5. Т.к. делеция Notch1 или Rbpj приводят к эмбриональной гибели на ст. E10.5 или раньше, то мы использовали уникальный бинарный трансгенный подход, чтобы блокировать передачу сигналов Notch специфическим для EC способом, используя Tet-индуцибельный dominant-negative (dn)-MAML под контролем промотора VE-cadherin, чтобы определить мишени для Notch в эндотелии AVC на ст. E11.5 (Timmerman et al., 2004; Niessen et al., 2008; Fu et al., 2009, 2011; Chang et al., 2011). Наши находки подтвердили, что активация Notch в AVC EC необходима для мезенхимной трансдифференцировки EC на ст. E11.5, также, как и на ст. E9.5 посредством индукции общих TFs, но функциональный результат этой трансдифференцировки различен на ст. E9.5 и E11.5.

Discussion

Передача сигналов Notch, как было установлено, важна для развития кардиальных подушек в атриовентрикулярном канале (Timmerman et al., 2004; Restivo et al., 2006; Garside et al., 2013). Хотя молекулярная регуляция подушек атриовентрикулярного канала и тракта оттока может быть разной, интересно, что индивиды с двухстворчатыми аортальными клапанами, которые часто возникают в результате кальцификации клапанов, как было установлено, несут мутации в NOTCH1 (Garg et al., 2005). Наша предыдущая работа идентифицировала новые мишени для Notch, которые частично ответственны за индуцированный с помощью Notch E9.5 EMT в развивающемся AVC и наши предыдущие усилия генетического профилирования подтвердили второй раунд активации Notch на ст. E11.5 в AVC EC (Niessen et al., 2008; Fu et al., 2009, 2011; Vrljicak et al., 2010; Chang et al., 2011). Здесь мы продемонстрировали функционально, что E11.5 AVC EC обладают EMT потенциалом и этот EMT потенциал также зависит от Notch (Fig. 1A-C).

Чтобы лучше понять генетическую сеть, которая активируется с помощью Notch в AVC EC на ст. E11.5, мы использовали профилирование транскриптома, чтобы идентифицировать транскрипционную сеть, расположенную ниже Notch. Наш метод выявляет потерю характеристик EMT в EC, экспрессирующих dnMAML-GFP, и присутствие известных мишеней для Notch, таких как Hes1, Hey2 и Snai2 среди 124 экспрессирующихся по-разному транскрипционных факторов, которые были идентифицированы (Table S6). Наши данные подтвердили, что в EC активация Notch индуцирует экспрессию Hif1α Msx1, Sox9 и Stat4 в эндокарде на ст. E11.5, подвергающегося EMT (Figs. 5, 6). Функционально мы показали с помощью эксплантатов ex vivo, что Hif1α, Msx1, Sox9 и Stat4 важны и на ст. E9.5 для EMT. Интересно, что нокдаун Hif1α и Stat4 существенно блокирует потенциал E11.5 EMT в нашей экспериментальной модели, но нокдаун Msx1 и Sox9 не оказывает эффекта, в противовес E9.5. Эти находки подтверждают, что Msx1 и Sox9 играют роль в E9.5 EMT, но могут иметь др. функциональную роль в трансформируемой мезенхиме и не участвуют в E11.5 EMT.

Во время развития AVC трансформированные мезенхимные клетки, как полагают, пролиферируют (E10.5-E12.5), дифференцируются (E12.5-E16.5) и созревают (E15.5-E18.5), чтобы сформировать створки клапанов и структуры перегородки сердца (Vesely, 1998; Hinton et al., 2006; Butcher and Markwald,2007). Sox9 участвует в регуляции как пролиферации, так и дифференцировки мезенхимы в развивающемся AVC. EC-специфический дефицит Sox9 приводит к нарушению экспансии мезенхимы и организации внеклеточного матрикса (Lincoln et al., 2007). Недавнее исследование, проверяющее мутации NOTCH1 у пациентов, страдающих от кальцифкации двухстворчатого клапана подтвердило, что SOX9 действует ниже Notch, чтобы ингибировать кальцификацию клапанов. Пациенты с NOTCH1 мутацией обнаруживали пониженную экспрессию SOX9 и снятие супрессии пути кальцификации (Acharya et al., 2011). Наши находки здесь предоставили прямое доказательство, что Sox9 является непосредственной мишенью для Notch (Figs. 5, 6, но это контрастирует с его ролью на ст. E9.5 (Akiyama et al., 2004), Sox9, по-видимому, не нужен для EMT на ст. E11.5 (Fig. 7F).

Предыдущая работа по нейрональному развитию подтвердила, что в циклической сигнальной петле с помощью Bmp2 индуцированные Msx1/2 ингибируют нейрональную дифференцировку с помощью задействования пути Notch-Delta, но активация Notch может также индуцировать экспрессию Bmp2 (Aruga et al., 2002). Хотя ни Msx1 -дефицитные, ни Msx2-дефицитные мыши не обнаруживают кардиальных нарушений, животных с потерей и Msx1 и Msx2 обнаруживают гипоплазию AVC и снижение экспрессии транскриптов Notch1 (Chen et al., 2008). Существует ли циклическая сигнальная петля между Notch и Msx1 в развивающемся AVC ещё предстоит определить.

Notch участвует в усилении Hif1α -обеспечиваемой трансактивации генов, индуцируемых гипоксией при туморогенезе и клеточной дифференцировке (Sahlgren et al., 2008; Zheng et al., 2008). Напротив, Hif1α как было установлено, усиливает передачу сигналов Notch путем привлечения p300/CBP (Gustafsson et al., 2005) и стабилизации расщепленного эндосомами Notch у Drosophila (Mukherjee et al., 2011). Интересно, что несмотря на потерю в EC активации Notch, ведущей к снижению у мышей Hif1α мРНК и белка, мы не выявили связывания RBPJ с промотором человеческого HIF1α. Эти результаты подтверждают возможность, что Notch может повышать уровни Hif1α за счет стабилизации мРНК и вообще увеличения продолжительности экспрессии белка за счет физических взаимодействий, как это было описано ранее (Gustafsson et al., 2005).

Итак, мы оказались способны идентифицировать иерархию TF, которая существует ниже эндотелиального Notch в кардиальных подушках. Некоторые, но не все из этих TFs необходимы для EMT на ст. E11.5, тогда как разные, но перекрывающиеся субнаборы управляют EMT на ст. E9.5.