A pathway to bone: signaling molecules and transcription factors involved in chondrocyte development and maturation  Development 2015 142: 817-831; doi: 10.1242/dev.105536 |
Decades of work have identified the signaling pathways that regulate the differentiation of chondrocytes during bone formation, from their initial induction from mesenchymal progenitor cells to their terminal maturation into hypertrophic chondrocytes. Here, we review how multiple signaling molecules, mechanical signals and morphological cell features are integrated to activate a set of key transcription factors that determine and regulate the genetic program that induces chondrogenesis and chondrocyte differentiation. Moreover, we describe recent findings regarding the roles of several signaling pathways in modulating the proliferation and maturation of chondrocytes in the growth plate, which is the 'engine' of bone elongation Рисунки к статье |
Детерминация мезенхимных клеток в хондрогенный клон является ключевым событием в образовании кости. Помимо костей свода черепа, части челюстей и медиальная часть ключицы [формируемые посредством внутримембранозной оссификации (Hall and Miyake, 1992; Ornitz and Marie, 2002)], скелет позвоночных формируется с помощью процесса эндохондрального образования кости. Во время этого процесса каждый скелетный элемент сначала формируется из мезенхимных предшественников и затем происходит формирование паттерна хряща, который позднее замещается костью (Fig. 1). Мезенхимные предшественники, возникающие из краниального нервного гребня, сомитов и латеральной пластинки мезодермы вносят вклад в черепно-лицевой, осевой и конечностей скелет, соотв. Конденсаты таких мезенхимных клеток экспрессируют транскрипционный фактор Sox9, который является ключевым регулятором хондрогенеза и дает хрящевые зачатки, состоящие из круглых незрелых хондроцитов, продолжающих экспрессировать Sox9 (Bi et al., 1999; Akiyama et al., 2002). Клетки, расположенные в центральных регионах хрящевых зачатков, затем подвергаются созреванию (Fig. 1). Во время этого процесса, хондроциты прекращают клеточные циклы и увеличиваются в объеме примерно в 20 раз (Cooper et al., 2013), давая клетки, наз. гипертрофическими хондроцитами. Т.к. хрящ продолжает расти в продольном направлении, постоянно откладывая гипертрофические хондроциты на своем пути. Они постепенно замещаются костью в регионе, известном как первичный центр оссификации. Продукция и созревание хондроцитов в конечном итоге ограничивается концами кости (эпифизом), структурой, наз. ростовой пластинкой. Вторичные центры оссификации затем возникают в эпифизе, деля ростовую пластинку с дистальных концов длинных костей.
 Fig. 1. Во время процесса образования эндохондральной кости, клеточные признаки и профили экспрессии хондроцитов прогрессивно меняются (Fig. 2). В ростовой пластинке небольшие круглые дистально расположенные хондроциты первоначально дают уплощенные хондроциты, которые располагаются ближе к центру хрящевого зачатка и которые пролиферируют и складываются в продольные столбцы. Эти незрелые хондроциты экспрессируют транскрипционные факторы Sox5, Sox6 и Sox9, и структурные белки коллаген, type II, α 1 (Col2a1) и aggrecan (Acan). Следующая ст. созревания в гипертрофические хондроциты маркируется экспрессией parathyroid hormone 1 receptor (Pth1r) и Indian hedgehog (Ihh). Это сопровождается созреванием в ранние гипертрофические хондроциты, которые экспрессируют коллаген, type X, α 1 (Col10a1). Отметим, что индукция Pth1r, Ihh и затем, Col10a1 коррелирует с потерей экспрессии Sox5, Sox6, Sox9, Col2a1 и Acan. Наконец, Col10a1-экспрессирующие клетки теряют экспрессию этого коллагена и превращаются в поздние гипертрофические хондроциты, экспрессирующие vascular endothelial growth factor A (VEGFA), matrix metalloproteinase 13 (Mmp13) и секретируемый phosphoprotein 1 (также известен как, osteopontin/bone sialoprotein 1; Spp1). Экспрессия VEGFA и Mmp13 предвещает инвазию эндотелиальных клеток в ростовую пластинку, остеокластов и предшественников остеобластов. Предшественники остеобластов, возникающие из надхрящницы (Maes et al., 2010) и гипертрофических хондроцитов (Yang et al., 2014), действуют вместе с остеокластами, чтобы ремоделировать матрикс ростовой пластинки к образованию трабекулярной кости.
Fig. 2. Работы последнего времени, используя системы in vitro и in vivo, идентифицировали множественные передачи сигналов и транскрипционные факторы, а также изменения в форме клеток (see Box 1), которые регулируют эти прогрессивные изменения в хондроцитах, от их инициальной индукции до окончательного созревания. Эти находки имеют значение для понимания основ биологии хряща и кости и для понимания того, как нарушения этого тонко настроенного процесса созревания хондроцитов приводят к различным патологиям скелета.
The initiation of chondrogenesis Молекулярные события, которые регулируют дифференцировку мезенхимных клеток в хондроциты всё ещё в основном неизвестны. Хотя некоторые из сигнальных молекул, необходимые для индукции этого процесса идентифицированы, наше понимание нижестоящих молекулярных путей, способствующих хондрогенезу всё ещё в разработке. Shh induces chondrogenic competence in sclerotomal cells by inducing Sox9 expression Во время развития сомиты подвергаются стереотипическому процессу дифференцировки. Вентральный регион становится мезенхимным и образует склеротом, предшественник позвонков и медиальной части ребер (Kato and Aoyama, 1998). Сигнальной молекулой, как известно, являющаяся критической для индукции склеротома, это sonic hedgehog (Shh) (Chiang et al., 1996), член семейства белков hedgehog, которые экспрессируются в хорде и нижней части нервной трубки. Взаимодействия между Shh и patched transmembrane receptors Ptch1 и Ptch2 заставляют др. трансмембранный белок, smoothened (Smo), транслоцироваться в основание первичной реснички. Это приводит к активации Gli транскрипционных факторов (Gli1, Gli2 и Gli3), которые в свою очередь регулируют экспрессию чувствительных к hedgehog генов (rev. Wilson and Chuang, 2010). Передача сигналов Shh, как было установлено, выполняет множественные роли, а формировании склеротома: способствуя выживанию сомитных клеток (Teillet et al., 1998), эпителиально-мезенхимному переходу склеротома посредством индукции Snail (Li et al., 2006) и, наконец, индукции специфичных для склеротома маркеров, таких как Pax1, Sox9 и Nkx3-2 (rev. Monsoro-Burq, 2005). Помимо Shh, noggin (Nog) (экспрессирующийся в хорде) и gremlin 1 (Grem1) (экспрессирующийся в дорсальной части нервной трубки и сомитах) кооперируют, чтобы поддерживать зону, свободную от передачи сигналов BMP, критическую для Shh-обусловленной индукции склеротома (Stafford et al., 2011). Мыши, преобразованные, чтобы лишить их Shh, неспособны формировать позвонки (Chiang et al., 1996), показывают, что передача сигналов Shh является критической для формирования хрящей позвонков. Тем не менее, последующая дифференцировка склеротома в хрящ не зависит от поддержания передачи сигналов Shh (Murtaugh et al., 1999). Вместо этого, передача сигналов Shh индуцирует экспрессию Sox9 и транскрипционный фактор Nkx3-2, который опосредованно поддерживает экспрессию Sox9 в клетках сомитов (Zeng et al., 2002). Кроме того, передача сигналов bone morphogenetic protein (BMP) поддерживает экспрессию этих генов после их инициальной индукции с помощью Shh, хотя она не может индуцировать экспрессию Sox9 или Nkx3-2 в пресомитных параксиальных мезодермальных клетках которые ещё не были подвергнуты воздействию передачи сигналов Shh (Murtaugh et al., 2001; Zeng et al., 2002). При условии присутствия передачи сигналов BMP, Sox9 может регулировать свою собственную экспрессию (Kumar and Lassar, 2009; Mead et al., 2013) и индуцировать экспрессию Nkx3-2 (Zeng et al., 2002). Nkx3-2 является BMP-зависимым репрессором транскрипции (Kim and Lassar, 2003), который блокирует экспрессию ингибиторов транскрипции Sox9 (Zeng et al., 2002). Недавно установлено, что Nkx3-2 блокирует BMP-зависимую экспрессию нескольких GATA транскрипционных факторов (Gata4, Gata5 и Gata6) в эксплантах параксиальной мезодермы и что эти GATA факторы могут, в свою очередь, блокировать Shh-зависимую индукцию экспрессии гена Sox9 (Daoud et al., 2014) (Fig. 3). Fig. 3. Chondrogenic competence in the limb bud is differentially modulated by Wnt and FGF signaling В зачатке конечности образование хряща ограничено сердцевиной мезенхимы зачатка конечности с помощью передачи сигналов от эктодермы, которые блокируют образование хряща на периферии этой ткани (Solursh, 1984). Эктопическая экспрессия Wnts, которые действуют посредством β-catenin/Lef1/Tcf блокирует образование хряща в зачатке конечности (Rudnicki and Brown, 1997; Hartmann and Tabin, 2000). В самом деле, кондиционная потеря экспрессии β-catenin в мезенхимных предшественниках любой из конечностей или головы увеличивает экспрессию Sox9 в этих клетках предшественников и индуцирует образование хондроцитов за счет остеобластов (Day et al., 2005; Hill et al., 2005). Помимо Wnts, секретируемых эктодермой зачатка конечности, FGFs, секретируемые апикальным эктодермальным краем (AER), необходимы для поддержания : (1) выростов зачатков конечностей (Niswander et al., 1993; Fallon et al., 1994; Sun et al., 2002); (2) жизнеспособности пула хондрогенных предшественников, дающего хрящевую матрицу конечности (Dudley et al., 2002; Sun et al., 2002); и (3) компетентность мезенхимных клеток зачатка конечности подвергаться хондрогенезу, когда передача сигналов Wnt устранена (ten Berge et al., 2008). Помимо передачи сигналов FGF продемонстрирована мощная экспрессия Sox9 в первичных хондроцитах посредством mitogen-associated protein kinase (MAPK)-зависимого пути (Murakami et al., 2000).
Недавно было продемонстрировано, что передача сигналов Wnt индуцирует репрессивную хроматиновую метку (H3K27me3) и метилирование ДНК промотора Sox9 и что Wnt-индуцированное необратимое молчание гена Sox9 нуждается в метилировании ДНК этого локуса, которому специфически противодействует передача сигналов FGF (Kumar and Lassar, 2014). FGF блокирует потребность в рекрутировании de novo DNA methyltransferase DNMT3A на промотор Sox9 путем индукции взаимодействия и фосфорилирования DNMT3A с помощью extracellular-regulated kinase (ERK) 1 и ERK2, и тем самым контролирует, будет ли экспрессия Sox9 необратимо или обратимо замалчиваться с помощью передачи сигналов Wnt в мезенхимных клетках зачатка конечности (Kumar and Lassar, 2014). Итак, эти находки подтверждают, что Wnts, секретируемые эктодермой, действуют посредством β-catenin-зависимого пути, чтобы блокировать экспрессию Sox9 и образование хряща в зачатке конечности мезенхимными клетками, и что передача сигналов FGF поддерживает хондрогенную компетентность этих клеток, блокируя метилирование ДНК промотора Sox9 . Хотя сигнальные центры и сигналы ими продуцируемые, чтобы регулировать формирование паттерна и рост конечностей и позвонков, идентифицированы, мы всё ещё далеки от полного понимания, как эти сигналы интерпретируются и интегрируются в генетическую программу, управляющую индукцией хондрогенеза. TGFβ signaling in chondrogenesis Роль передачи сигналов transforming growth factor β (TGFβ) в хондрогенезе довольно противоречива. Исследования избыточности функции в модельных клеточных культурах подтвердили, что TGFβ запускает хондрогенез (Carrington et al., 1991; Leonard et al., 1991; Chimal-Monroy and Diaz de Leon, 1997;Merino et al., 1998; Karamboulas et al., 2010). Однако, блокирование передачи сигналов TGFβ в мезенхиме конечности с помощью целенаправленного воздействия на экспрессии TGFβ receptor 2 (Tgfbr2) оказывало некоторый эффект на дифференцировку хондроцитов и на образование суставов в пальцах (Seo and Serra, 2007; Spagnoli et al., 2007), но, по-видимому, не затрагивало инициальные стадии хондрогенеза. Недавние находки продемонстрировали, что хрящевые зачатки длинных костей образуются модульно (modularly), из двух разных пулов клеток предшественников (Blitz et al., 2013). Первый пул, который содержит Sox9-позитивные предшественники, формирует первичную структуру хрящевого зачатка. Второй пул отличается от первого тем, что содержит предшественники, которые экспрессируют Sox9 и транскрипционный фактор scleraxis (Scx). Эти Sox9+Scx+ предшественники дают костные возвышения (Sugimoto et al., 2013): надстройки, которые необходимы для образования сочленений и для прикрепления мышечных сухожилий. Хотя ингибирование передачи сигналов TGFβ оказывает ограниченные эффекты на образование Sox9+Scx- предшественников, передача сигналов TGFβ абсолютно необходима для образования популяции Sox9+Scx+ предшественников и последующего развития костных возвышений (Blitz et al., 2013). В этой связи может быть важным то, что Smad2 и Smad3, которые обеспечивают передачу сигналов TGFβ, как было установлено, взаимодействуют с Sox9, рекрутируя транскрипционные ко-активаторы CBP/p300 на этот транскрипционный фактор и увеличивая транскрипционную активность Sox9 (Furumatsu et al., 2005). BMP and PKA signaling positively regulate the initiation of chondrogenesis, whereas RA signaling blocks this process BMPs также играют критическую роль в образовании и дифференцировке хряща. Эктопическая экспрессия BMPs или активированных рецепторов для BMP в зачатке конечности приводит к эктопическому хондрогенезу (Duprez et al., 1996; Zou et al., 1997). Напротив, ингибирование передачи сигналов BMP с помощью доминантно-негативных рецепторов для BMP или с помощью растворимого BMP антагониста Nog ингибирует образование хряща in vivo и in vitro (Kawakami et al., 1996; Zou et al., 1997; Capdevila and Johnson, 1998; Murtaugh et al., 1999). В микромассовых культурах передача сигналов BMP первоначально регулирует уплотнение мезенхимных клеток, которое необходимо для приобретения когезивного клеточного поведения (Barna and Niswander, 2007) и впоследствии необходимо для поддержания дифференцировки хондроцитов (Roark and Greer, 1994). Рецепторы для BMP, Bmpr1a и Bmpr1, выполняют перекрывающиеся функции; мыши, лишенные обоих, обнаруживают отсутствие экспрессии Sox5, Sox6 и Sox9 в предхрящевых конденсатах и означают отсутствие образования хондроцитов (Yoon et al., 2005). Кроме того, кондиционный нокаут BMP-регулируемых Smad белков (т.e. Smad1, Smad5 и Smad8) в хондроцитах приводит к тяжелой хондродисплазии (Retting et al., 2009), показывая, что передача сигналов BMP необходима не только для инициации хондрогенеза, но и также для поддержания программы дифференцировки. Недавно BMP-регулируемы Smads, как было установлено, регулируют экспрессию генов у ранних эбрионов Xenopus посредством взаимодействия с Sox5 (Nordin and Labonne, 2014). TЭто исследование продемонстрировало, что оба Sox5 и Sox6 могут соединяться с Smad1 (Nordin and Labonne, 2014), так что вполне возможно, что эти транскрипционные факторы могут также передавать сигналы BMP, чтобы активировать хондрогенную дифференцировку. Lyons с колл. отметили, что специфичный для хондроцитов нокаут Bmpr1a и Bmpr1b приводит к дефектам созревания хондроцитов, из покоящегося столбчатого пролиферативного состояния, и к неспособности гипертрофических хондроцитов завершать терминальную дифференцировку (Yoon et al., 2006). Потребность в передаче сигналов BMP, чтобы способствовать созреванию хондроцитов, согласуется с находкой, что C-терминально фосфорилированный Smad1/5 чаще всего обнаруживается в столбчатых пролиферирующих хондроцитах ростовой пластинки (Yoon et al., 2006; Retting et al., 2009).
Др. фактор, который играет важную роль в дифференцировке хондроцитов, - это protein kinase A (PKA). Фармакологическое ингибирование PKA с помощью PKA антагониста H89 эффективно блокирует хондрогенную дифференцировку зачатка конечности в micromass культурах (Lee and Chuong, 1997; Yoon et al., 2000). PKA-обеспечиваемое фосфорилирование Sox9 усиливает транскрипционную активность этого критического хондрогенного транскрипционного фактора (Huang et al., 2000), это объясняется необходимостью этого сигнального пути для инициации хондрогенеза. В противовес передаче сигналов PKA, которая способствует хондрогенезу, передача сигналов retinoic acid (RA) репрессирует индукцию этой программы дифференцировки. Ингибирование передачи сигналов, обеспечиваемой RA рецептором в первичных культурах мезенхимы зачатка конечности мыши, усиливает экспрессию Sox9 и активацию транскрипционных мишеней для Sox9 (Weston et al., 2002). Воздействие RA на мышиные эпифизарные хондроциты индуцирует экспрессию Wnt лигандов и их рецепторов и тем самым повышает экспрессию Lef/Tcf репортеров (Yasuhara et al., 2010), подтверждая, что передача сигналов RA может блокировать экспрессию Sox9 частично за счет способствования канонической передаче сигналов Wnt (Fig. 3). Hif1α is a positive regulator of chondrogenesis Во время инициальной стадии хондрогенеза, сосудистая сеть конечности подвергается процессу ремоделирования, сделать конденсирующуюся мезенхиму и развивающуюся хрящевую матрицу безсосудистой. Регрессия кровеносных сосудов в развивающемся хряще вызывает локальное снижение напряжения кислорода, образуя тем самым гипоксические ниши. Некоторые исследования идентифицировали hypoxia-inducible factor 1 α (Hif1α), основной helix-loop-helix транскрипционный фактор, который экспрессируется в таких условиях гипоксии, как позитивный регулятор хондрогенеза. Hif1α, как было установлено, способствует экспрессии Sox9 и повышению уровня экспрессии гликолитических энзимов и транспортеров глюкозы, чтобы сделать возможной дифференцировку хондроцитов и приспособленность к гипоксическим условиям (Pfander et al., 2003; Amarilio et al., 2007). Hif1α также усиливает экспрессию VEGFA в ростовой пластинке (Schipani et al., 2001; Zelzer et al., 2004), а также способствует гидроксилированию коллагена, делая возможной секрецию коллагена гипоксическими хондроцитами (Bentovim et al., 2012).
Итак, хотя мы знаем о некоторых сигнальных путях, которые управляют дифференцировкой мезенхимных клеток в хондроциты, регуляторные элементы транскрипции, расположенные ниже этих способствующих хондрогенезу сигнальных путей пока до конца не установлены. Предполагается, что идентификация регуляторных элементов, которые контролируют экспрессию Sox9 ниже этих сигнальных путей позволит установить дополнительные молекулярные игроки, передающие информацию о формировании паттерна скоординированного развития скелета. The transcriptional regulation of chondrocyte maturation В противовес нашему ограниченному знанию о механизмах, регулирующих инициальные ступени хондрогенеза, сегодня мы прекрасно понимаем транскрипционную регуляцию дифференцировки и созревания хондроцитов, как только эти клетки были детерминированы в хондрогенный клон (summarized in Fig. 4). Fig. 4. Multiple roles for Sox9 in chondrocyte differentiation and maturation Транскрипционный фактор Sox9 необходим мезенхимным клеткам, чтобы детерминировать их и заставить исполнять программу хондрогенной дифференцировки; в его отсутствие хондрогенез блокируется (Bi et al., 1999;Akiyama et al., 2002). Sox9 непосредственно активирует маркеры дифференцировки хондроцитов (Bell et al., 1997; Lefebvre et al., 1997, 1998; Ng et al., 1997; Zhou et al., 1998) и индуцирует экспрессию Sox5 и Sox6 (Akiyama et al., 2002), которые работают совместно с Sox9, чтобы активировать программу дифференцировки хондроцитов (Lefebvre et al., 1998; Smits et al., 2001). Экспрессия Sox9 также необходима для поддержания жизнеспособности хондроцитов посредством пути PI3K-AKT (Ikegami et al., 2011; Dy et al., 2012) и, как было установлено, блокирует созревание хондроцитов в гипертрофические клетки. Потеря функции Sox9 приводит к преждевременному созреванию незрелых хондроцитов в гипертрофические клетки (Bi et al., 2001; Akiyama et al., 2002). Напротив, избыточная экспрессия Sox9 или в незрелых или гипертрофических хондроцитах ростовой пластинки замедляет процесс гипертрофии хондроцитов (Akiyama et al., 2004).
Существует несколько возможных механизмов, с помощью которых Sox9 может репрессировать гипертрофию хондроцитов. Во-первых, Sox9, как было установлено, взаимодействует с β-catenin, вызывая его деградацию и тем самым блокирует каноническую передачу сигналов Wnt (Akiyama et al., 2004; Topol et al., 2009). Поскольку этот сигнальный путь способствует гипертрофии хондроцитов (Hartmann and Tabin, 2000; Enomoto-Iwamoto et al., 2002;Tamamura et al., 2005; Sp?ter et al., 2006), то Sox9-обусловленная деструкция β-catenin может тем самым нарушать процесс созревания. Во-вторых, Sox9, как было продемонстрировано, взаимодействует непосредственно с и блокирует активность транскрипционного фактора Runx2 (Runt-related transcription factor 2) (Zhou et al., 2006), который играет критическую роль в управлении созреванием хондроцитов. В-третьих, Sox9 может непосредственно репрессировать гены, которые обычно экспрессируются в гипертрофических хондроцитах, такие как Col10a1 и Vegfa (Hattori et al., 2010; Leung et al., 2011). Наконец, было показано, что Sox9 необходим для поддержания пролиферации столбчатых хондроцитов, поскольку происходит задержка экспрессии маркеров дифференцировки пре-гипертрофических хондроцитов и что поразительно предупреждается дифференцировка хондроцитов в остеобласты за счет снижения передачи сигналов β-catenin и экспрессии Runx2 (Dy et al., 2012). Кроме того, было показано, что Sox9 выполняет дополнительную роль по активации экспрессии Col10a1 особенно в ранних гипертрофических хондроцитах за счет непосредственного связывания промотора этого гена (Dy et al., 2012). Итак, эти находки подтверждают, что Sox9 блокирует созревание незрелых столбчатых хондроцитов в пре-гипертрофические, способствуя тем самым инициальной индукции Col10a1 в ранних гипертрофических хондроцитах. < Positive transcriptional regulators of chondrocyte hypertrophy in the growth plate Runx family transcription factors Транскрипционные факторы Runt семейства Runx2 и Runx3 (также известны как Cbfa1 и Cbfa3, соотв.) являются жизненно важными для гипертрофии хондроцитов. Runx2 экспрессируется в пре-гипертрофических и гипертрофических хондроцитах ростовой пластинки и в надхрящнице (Inada et al., 1999; Kim et al., 1999). Активация канонической передачи сигналов Wnt в хондроцитах кур увеличивает экспрессию Runx2 (Dong et al., 2006), это может частично объяснить, как этот путь передачи сигналов способствует гипертрофии хондроцитов. Или генетическое устранение Runx2 или экспрессия доминантно-негативного Runx2 у мышей приводят к задержке и существенному снижению гипертрофии хондроцитов (Inada et al., 1999; Kim et al., 1999;Ueta et al., 2001). Напротив, эктопическая экспрессия Runx2 в незрелых хондроцитах вызывает преждевременное созревание клеток и индуцирует экспрессию Col10a1 и др. гипертрофических маркеров in vivo (Takeda et al., 2001; Ueta et al., 2001; Stricker et al., 2002) и in vitro (Enomoto et al., 2000). Некоторые исследования показали, что Runx2 может непосредственно соединяться с регуляторной последовательностью, которая управляет экспрессией Ihh (Yoshida et al., 2004), Vegfa (Zelzer et al., 2001), Col10a1 (Drissi et al., 2003;Zheng et al., 2003) и Mmp13 (Selvamurugan et al., 2000). Runx2 также взаимодействует с регулируемыми с помощью BMP Smads (Hanai et al., 1999; Zhang et al., 2000; Javed et al., 2008) и является, скорее всего, кандидатом на роль передачи сигналов BMP, чтобы активировать экспрессию генов гипертрофических хондроцитов. Имеется перекрывание между членами семейства Runx в контроле гипертрофии хондроцитов. Генетическое устранение Runx3 у мышей приводит к лёгкой задержке как гипертрофии хондроцитов, так и к сосудистой инвазии хряща; развитие скелета новорожденных нормальное у этих животных (Yoshida et al., 2004). Напротив, Runx2;Runx3 двойные нокаутные животные обнаруживают полное отсутствие созревания хондроцитов, фенотип, которые значительно более тяжелый, чем наблюдаемый при инактивации только Runx2 (Yoshida et al., 2004). Mef2 family transcription factors Mef2c и Mef2d, члены семейства транскрипционных факторов myocyte enhancer factor 2 (Mef2), также экспрессируются в пре-гипертрофических и гипертрофических хондроцитах. Потеря функции Mef2cв хондроцитах приводит к укорочению костей, задержке гипертрофии хондроцитов и подавлению экспрессии Runx2 (Arnold et al., 2007). Напротив, эксперименты с избыточностью функции на трансгенных мышах, которые экспрессируют активированный слитый белок Mef2c-VP16 в хондроцитах, приводят к противоположному фенотипу преждевременной и избыточной эндохондральной оссификации (Arnold et al., 2007). Эти результаты показывают, что Mef2c функционирует выше Runx2, и необходим, чтобы индуцировать или поддерживать экспрессию Runx2 в гипертрофических хондроцитах. FoxA family transcription factors При избыточной экспрессии Runx2 и Mef2c могут легко активировать экспрессию генов, специфических для гипертрофических хондроцитов, таких как Col10a1 (Zheng et al., 2003; Arnold et al., 2007);, однако, они неспособны активировать экспрессию Col10a1 в фибробластах (Kempf et al., 2007; Ionescu et al., 2012), подтверждая, что они нуждаются в др. специфичных для хондроцитов ко-факторах для своей активности. Недавно члены forkhead box A (FoxA) семейства транскрипционных факторов были идентифицированы как часть транскрипционной сети, которая регулирует дифференцировку хондроцитов. Foxa3 экспрессируется в зрелых и гипертрофических хондроцитах, хотя Foxa3-нулевые животные не обнаруживают какого-либо очевидного скелетного фенотипа (Kaestner et al., 1998; Shen et al., 2001). Экспрессия Foxa2, напротив, ограничивается гипертрофическими хондроцитами (Ionescu et al., 2012). Потеря функции Foxa2 в хондроцитах у нокаутных по Foxa3 мышей приводит к снижению экспрессии гипертрофических маркеров, таких как Col10a1 и Mmp13 (Ionescu et al., 2012). Более того, скелетные дефекты в результате потери специфичного для хондроцитов Foxa2 усиливаются на Foxa3-нулевом фоне (Ionescu et al., 2012), подтверждая, что Foxa2 и Foxa3 выполняют перекрывающиеся роли в ростовой пластинке, способствуя гипертрофии хондроцитов. Negative regulators of chondrocyte hypertrophy in the growth plate Транскрипционная сеть, которая модулирует дифференцировку хондроцитов, также включает негативные регуляторы. Одним из наиболее охарактеризованных является histone deacetylase 4 (Hdac4), член класса II HDACs, как известно, репрессируют активность Runx2 и Mef2 (Vega et al., 2004;Kozhemyakina et al., 2009; Correa et al., 2010) (Fig. 5A). Hdac4 экспрессируется в пре-гипертрофических хондроцитах, это согласуется с находкой, что потеря функции Hdac4 вызывает преждевременную гипертрофию хондроцитов (Vega et al., 2004). Hdac4 может или непосредственно взаимодействовать с Runx2 и ингибировать его активность (Vega et al., 2004) или косвенно репрессировать транскрипционную активность Runx2 путем соединения с zinc-finger ко-регулятором транскрипции Zfp521, который, в свою очередь, соединяется с Runx2 и блокирует его транскрипционную активность (Correa et al., 2010). Активность класса II HDACs , в свою очередь, регулируется с помощью передачи сигналов (Fig. 5B) , которая или способствует или блокирует фосфорилирование HDAC (по S246 в Hdac4) и тем самым модулирует её взаимодействие с 14-3-3 белками (Grozinger and Schreiber, 2000; McKinsey et al., 2000b). Многие члены семейства 14-3-3 располагаются в цитоплазме, где они взаимодействуют с др. белками, содержащими фосфорилированный серин, расположенный в RXX-SXP консенсусе связывающего мотива. Поскольку S246 в Hdac4 расположен в одном из таких мотивов связывания 14-3-3, то фосфорилирование S246 приводит к взаимодействию Hdac4 с 14-3-3 белками в цитоплазме (McKinsey et al., 2000a; Wang et al., 2000). Это взаимодействие защищает Hdac4 сигнал ядерной локализации и одновременно блокирует вступление Hdac4 в ядро и стимулирует его экспорт в ядро (Wang and Yang, 2001). Как следствие, локализованные в ядре Runx и Mef2 не взаимодействуют с Hdac4, и поэтому свободны для активации своих транскрипционных мишеней.
Fig. 5. В незрелых хондроцитах, которые обнаруживаются в покоящейся и столбчатой зоне ростовой пластинки, паракринный гормон parathyroid hormone-related protein (PTHrP) вызывает активность PKA, чтобы способствовать дефосфорилированию S246 на Hdac4 с помощью protein phosphatase 2A (PP2A). Это позволяет Hdac4 транслоцироваться в ядро и ингибировать активность членов семейства Mef2 и Runx s (Kozhemyakina et al., 2009; Correa et al., 2010). По мере созревания хондроцитов, salt-inducible kinase 3 (Sik3), которая специфически экспрессируется в пре-гипертрофических и гипертрофических хондроцитах ростовой пластинки (Sasagawa et al., 2012), фосфорилирует Hdac4 [преимущественно по S246; как это делает и Sik1 (Berdeaux et al., 2007; Kozhemyakina et al., 2009)] и тем самым способствует фосфорилированию Hdac4 и взаимодействию с 14-3-3 белками в цитоплазме, с последующей активацией транскрипционной активности Mef2 (Fig. 5B). В самом деле, потеря Sik3 вызывает тяжелое подавление гипертрофии хондроцитов у мышей (Sasagawa et al., 2012). Итак, эти наблюдения подтверждают, что вызываемое Sik3 фосфорилирование Hdac4 высвобождает Mef2 и Runx от взаимодействия с Hdac4, и тем самым делает возможной индукцию генов мишеней гипертрофии хондроцитов посредством этих ключевых регуляторов. Др. транскрипционные факторы, такие как Nkx3-2 (также известен как Bapx1), также играют важную роль в ослаблении созревания столбчатых хондроцитов в ростовой пластинке (Provot et al., 2006). Multiple signaling pathways control chondrocyte maturation in the growth plate Сигналы, которые контролируют индукцию зачатков хряща и/или созревание хондроцитов в ростовой пластинке, действуют так, контролируя экспрессию и/или активность ранее рассмотренных транскрипционных факторов (summarized in Fig. 6). Fig. 6. Summary of the signaling pathways that regulate crucial transitions during chondrocyte maturation. PTHrP-mediated regulation of chondrocyte hypertrophy Паракринный гормон PTHrP и его рецептор Pth1r являются критическими регуляторами пролиферации хондроцитов и гипертрофии. PTHrP экспрессируется на высоких уровнях в околосуставных покоящихся клетках ростовой пластинки и на низких уровнях в ранних пролиферирующих гипертрофических хондроцитах (Lee et al., 1996; St-Jacques et al., 1999). Нокаут гена PTHrP (Pthlh - Mouse Genome Informatics) приводит к уменьшению пролиферации хондроцитов в ростовой пластинке, преждевременному созреванию хондроцитов и ускоренному образованию кости (Karaplis et al., 1994; Lee et al., 1996). Напротив, избыточная экспрессия PTHrP в хондроцитах мыши приводит к задержке дифференцировки хондроцитов во время раннего развития (Weir et al., 1996). Рецептор для PTHrP, Pth1r, продуцируется на низких уровнях пролиферирующими хондроцитами ростовой пластинки и на высоком уровне в гипертрофических хондроцитах (Vortkamp et al., 1996; St-Jacques et al., 1999). Нокаут Pth1r у мышей вызывает фенотип, который сходен с таковым у PTHrP-нулевых мышей, характеризующийся снижением пролиферации и преждевременной минерализацией хондроцитов в ростовой пластинке (Lanske et al., 1996).
Как передача сигналов Pth1r замедляет прогрессию хондроцитов к гипертрофии? Pth1r является с G-белком-сцепленным рецептором и его активация с помощью PTHrP приводит к стимуляции путей передачи сигналов Gs(α) и Gq(α), которые неожиданно обладают противоположным действием на гипертрофию хондроцитов (Guo et al., 2002). Стимулироание пути Gs(α) приводит к активации adenylate cyclase (AC) и к продукции цАМФ, который, в свою очередь, активирует PKA (Guo et al., 2002). Как обсуждалось выше, PTHrP-индуцированная активация PKA способствует транслокации Hdac4 в ядро, где она соединяется с и ингибирует транскрипционную активность членов семейства Mef2 (Kozhemyakina et al., 2009). Кроме того, передача сигналов PTHrP повышает экспрессию Zfp521, который, как упоминалось выше, блокирует транскрипционную активность Runx2 за счет рекрутирования Hdac4 (Correa et al., 2010). Т.о., с помощью индукции транслокации в ядро Hdac4 и усиления экспрессии Zfp521, передача сигналов Pth1r блокирует активность двух ключевых семейств транскрипционных факторов, Mef2 и Runx, которые регулируют гипертрофию хондроцитов (Fig. 5A). A PTHrP-Ihh signaling loop maintains a pool of immature chondrocyte progenitors Синтез PTHrP в ростовой пластинке контролируется с помощью Ihh (Vortkamp et al., 1996), члена Hedgehog семейства белков. В ростовой пластинке Ihh экспрессируется и секретируется ранними гипертрофическими клетками (Vortkamp et al., 1996). Денлеция Ihh у мышей вызывает уменьшение пролиферации хондроцитов, преждевременную гипертрофию хондроцитов и неспособность к развитию остеобластов в эндохондральной кости (St-Jacques et al., 1999). Сходным образом, кондиционная делеция Smo специфичным для хряща образом снижает пролиферацию хондроцитов (Long et al., 2001). Как же Ihh контролирует пролиферацию и созревание хондроцитов в ростовой пластинке? Эктопическая экспрессия Ihh у эмбрионов кур, как было установлено, вызывает экспрессию PTHrP в околосуставной надхрящнице ростовой пластинки (Vortkamp et al., 1996). Напротив, экспрессия PTHrP отсутствует в ростовой пластинке у Ihh-дефицитных мышей, которые обнаруживают фенотип, сходный с таковым у PTHrP-нулевых животных (St-Jacques et al., 1999). Хотя повышенные уровни экзогенного Ihh ингибируют гипертрофию хондроцитов в ростовой пластинке, делеция или PTHrP или Pth1r у мышей устраняет этот эффект (Lanske et al., 1996; Vortkamp et al., 1996). Заметим, что экспрессия постоянно активного Pth1r в ростовой пластинке Ihh-/- мышей отвращает от преждевременной гипертрофии хондроцитов, но неспособна восстанавливать пониженную пролиферацию хондроцитов (Karp et al., 2000). Эти находки подтвердили, что Ihh контролирует пролиферацию и созревание хондроцитов за счет PTHrP-зависимого пути, который негативно регулирует гипертрофию хондроцитов, и PTHrP-независимого пути, который позитивно регулирует пролиферацию хондроцитов (Karp et al., 2000).
Ihh способствует пролиферации хондроцитов, по крайней мере, частично за счет увеличения экспрессии cyclin D1, который регулирует ход клеточного цикла (Long et al., 2001). Кроме того, Ihh способствует переходу малых круглых хондроцитов в пролиферирующие хондроциты, независимо от экспрессии PTHrP (Kobayashi et al., 2005), путем ингибирования активности репрессора для Gli3 (т.e. Gli3R) (Koziel et al., 2005). Анализ Ihh-/-;Gli3-/- двойных нокаутных эмбрионов показал, что Gli3 является ключевым эффектором передачи сигналов Ihh в хондроцитах. Делеция Gli3 обходит потребность в Ihh, чтобы способствовать пролиферации и созреванию хондроцитов, демонстрируя, что Ihh обычно регулирует экспрессию PTHrP за счет противодействия активности рецептора Gli3R (Hilton et al., 2005; Koziel et al., 2005). Совместное поддержание экспрессии PTHrP с Ihh в пре-гипертрофических хондроцитах [который сам по себе репрессирован за счёт передачи сигналов PTHrP (Vortkamp et al., 1996)] гарантирует, что не все незрелые хондроциты будут одновременно инициированы к действию программы пре-гипертрофической и гипертрофической дифференцировки и тем самым не произойдет истощения пула хондрогенных предшественников. Т.о., Ihh-зависимая активация экспрессии PTHrP поддерживает популяцию незрелых хондроцитов в покоящейся и столбчатой зоне ростовой пластинки. Во время полового созревания у человека ростовая пластинка закрывается способом, который зависит передачи сигналов эстрогеновых рецепторов (rev. Borjesson et al., 2012), подтверждая, что эстроген иногда нарушает петлю поддержания PTHrP/Ihh. FGF signaling regulates chondrocyte proliferation and the initiation of chondrocyte hypertrophy Некоторые FGFs и соотв. им рецепторы обладают определенными доменами экспрессии в ростовой пластинке и в окружающей надхрящнице/надкостнице. Fgfr1 специфически экспрессируется в надхрящнице/надкостнице и в гипертрофических хондроцитах ростовой пластинки, в то же время он исключается из пролиферирующих хондроцитов (Jacob et al., 2006). Кондиционная делеция Fgfr1 в хондроцитах приводит к временному увеличению гипертрофической зоны, при этом не оказывает влияния на пролиферацию хондроцитов (Jacob et al., 2006). Fgfr2 первоначально экспрессируется на высоких уровнях в конденсированной мезенхиме, из которой возникают хрящ и кость и затем экспрессируется в надхрящнице/надкостнице (reviewed by Ornitz and Marie, 2002). Делеция Fgfr2 в мезенхимных клетках приводит к заметной постнатальной карликовости с уменьшенной толщиной гипертрофической зоны, с неспособностью к созреванию остеогенных предшественников и к аномальной функции зрелых остеобластов (Yu et al., 2003). Fgfr3, экспрессирующийся в пролиферативной зоне ростовой пластинки, но подавленный в гипертрофической зоне, обнаруживает паттерн экспрессии, который комплементарен таковому для Fgfr1 и Fgfr2 (Peters et al., 1993; Deng et al., 1996; Koziel et al., 2005; de Frutos et al., 2007). Fgfr3-нулевые мыши обнаруживают постнатальную элонгацию длинных костей, скоррелированную с увеличением пролиферации хондроцитов и удлинением гипертрофической зоны (Colvin et al., 1996; Deng et al., 1996). Напротив, избыточная экспрессия активированного Fgfr3 в ростовой пластинке мыши обнаруживает снижение пролиферации хондроцитов и маленькую гипертрофическую зону, приводя к карликовости (Naski et al., 1998; Chen et al., 1999;Wang et al., 1999b; Segev et al., 2000; Iwata et al., 2001). Соотв., некоторые идентифицированные мутации избыточной функции у человека в Fgfr3 вызывают спектр онтогенетических нарушений, включая achondroplasia, hypochondroplasia и thanatophoric dysplasia, каждая из которых маркируется rhizomelic укорочением конечностей (see review by Foldynova-Trantirkova et al., 2012). Следовательно, Fgfr3 играет важную роль в развитии ростовой пластинки, ингибируя скорость пролиферации хондроцитов и инициацию гипертрофии хондроцитов. Кроме того, наблюдалось, что воздействие FGF ускоряет позднюю гипертрофическую дифференцировку в культуре эксплантов хряща (Minina et al., 2002), в противоположность её ингибированию, возникает интересная возможность, что этот сигнальный путь может блокировать инициацию гипертрофии хондроцитов (в пре-гипертрофических хондроцита), но затем способствует прогрессии ранних гипертрофических хондроцитов (т.e. тех, которые экспрессируют Col10a1) в поздние гипертрофические хондроциты (т.e. те, которые экспрессируют Mmp13).
Хотя многие FGF лиганды были выявлены во время эндохондральной оссификации ( rev. Degnin et al., 2010), только Fgf9 и Fgf18 обнаружили связь с хондрогенезом in vivo (Hung et al., 2007; Liu et al., 2007). Fgf9 экспрессируется в надхрящнице и надкостнице, а Fgf9-дефицитные мыши обнаруживают непропорциональное укорочение проксимальных скелетных элементов и задержку гипертрофии хондроцитов во время ранних стадий хондрогенеза (Hung et al., 2007), фенотип, напоминающий ранний фенотип у мышей с врожденной инактивацией Fgfr1 (Jacob et al., 2006). Помимо регуляции пролиферации и гипотрофии хондроцитов непосредственно, Fgf9 регулирует также созревание хондроцитов косвенно посредством пути Ihh/PTHrP; уровни Ihh, Pth1r и Ptc1 снижены у Fgf9-нулевых мышей (Hung et al., 2007). Fgf18 др. лиганд, экспрессирующийся в надхрящнице, при этом низкий уровень экспрессии обнаруживается также в хондроцитах (Liu et al., 2002, 2007).Fgf18-/- мыши обнаруживают пониженную пролиферацию хондроцитов и задержку инициации гипертрофии хондроцитов во время их ранних ст. развития (E14.5-E15.5) (Liu et al., 2007) и тем самым фенокопируются Fgf9-нулевые мыши этой ст. развития (Hung et al., 2007). Напротив, на поздних эмбриональных стадиях (E16.5-E18.5), Fgf18-/- мыши обнаруживают усиление пролиферации и утолщение гипертрофической зоны и увеличение ростовой пластинки, указывающие на то, что на этой ст. развития передача сигналов Fgf18 негативно регулирует пролиферацию и созревание хондроцитов ростовой пластинки (Liu et al., 2002). В соответствии с этими находками активирующие мутации в Fgfr3 усиливают пролиферацию хондроцитов особенно на ст. E14-E15 у мышей, но не позднее E18 (Iwata et al., 2000). На этой более поздней ст. развития фенотип Fgf18-/- мышей сильно напоминает таковой у Fgfr3-/- мышей, которые сходным образом обнаруживают усиление пролиферации хондроцитов и удлинение гипертрофической зоны (Colvin et al., 1996; Deng et al., 1996), подтверждая, что Fgf18, скорее всего, передает сигналы посредством Fgfr3. Итак, эти находки подразумевают, что реакция хондроцитов на передачу сигналов Fgf18 у мышей является двухфазной: во время ранних стадий развития (E14-E15) этот сигнальный путь способствует пролиферации и инициации гипертрофии хондроцитов, тогда как у более старых эмбрионов (и постнатальных мышей) этот сигнальный путь действует, чтобы блокировать пролиферацию хондроцитов и задерживать инициацию гипертрофии хондроцитов (Liu et al., 2007). Неясно, что контролирует эти различающиеся реакции на передачу сигналов Fgf18 на разных стадиях развития ростовой пластинки.
Как передача сигналов Fgfr3 негативно регулирует пролиферацию хондроцитов и инициацию дифференцировки гипертрофических хондроцитов? Два принципиальных сигнальных пути - Stat1 и MAPK пути - , как известно, обеспечивают передачу сигналов Fgfr3 в хондроцитах. Роль транскрипционного фактора Stat1 в FGF-индуцированном подавлении пролиферации хондроцитов первоначально была предположена Sahni et al. (1999). Хотя вопрос, является ли Stat1 стоящим ниже передачи сигналов FGF всё ещё дебатируется (Krejci et al., 2008), делеция Stat1, как было установлено, обращает и пониженную пролиферацию и хондродиспластический фенотип в ростовой пластинке мышей с избыточной экспрессией FGF2 человека (Sahni et al., 2001). Отметим, однако, хотя Fgfr3-нулевые мыши и обнаруживают драматическую постнатальную экспансию пролиферативной и гипертрофической зоны (Colvin et al., 1996; Deng et al., 1996), ростовая пластинка Stat1-нокаутных мышей обнаруживает экспансию пролиферативной зоны только во время раннего постнатального развития, это ослабляется на взрослых стадиях (Sahni et al., 2001). Более того, устранение Stat1 у трансгенных мышей, экспрессирующих активированную форму Fgfr3, восстанавливает пролиферацию хондроцитов ростовой пластинки, но неспособно восполнить дефицит гипертрофических хондроцитов, вызванный активацией передачи сигналов Fgfr3 (Murakami et al., 2004). Итак, эти исследования подтверждают, что Fgfr3 регулирует пролиферацию хондроцитов посредством Stat1-зависимого пути, но репрессирует инициацию дифференцировки гипертрофических хондроцитов посредством разных сигнальных путей. В самом деле, Murakami et al. продемонстрировали, что трансгенные мыши, экспрессирующие постоянно активную форму MEK1 (Map2k1, mitogen-activated protein kinase kinase 1), которая является активирующей киназой в пути MAPK, в ростовой пластинке обнаруживается карликовость, сопровождаемая неполной гипертрофией хондроцитов и задержкой эндохондральной оссификации, тогда как пролиферация хондроцитов не меняется (Murakami et al., 2004). Кроме того, таже самая группа установила, что избыточная экспрессия постоянно активного MEK1в ростовой пластинке Fgfr3-нулевых мышей ингибирует рост скелета, это обычно происходит у Fgfr3-нулевых мышей. Базируясь на своих находках, Murakami et al. предположили, что передача сигналов Fgfr3 ингибирует инициацию гипертрофии хондроцитов посредством пути MAPK, однако, ослабляет пролиферацию хондроцитов посредством Stat1 (Murakami et al., 2004). Кроме того, воздействие Fgf18 на культивируемые зачатки конечностей мыши ослабляет накопление фосфорилированных-Smad1/5 (Retting et al., 2009) и тем самым репрессирует передачу сигналов BMP в ростовой пластинке. поскольку передача сигналов BMP. в свою очередь, репрессирует экспрессию cyclin-dependent kinase (CDK) ингибиторов p16, p21 и p27 в ростовой пластинке (Yoon et al., 2006), то возможно, что передача сигналов Fgfr3/MAPK также блокирует пролиферацию хондроцитов, частично ингибируя BMP-обусловленную репрессию этих CDK ингибиторов. Наконец, недавняя работа показала, что избыточная экспрессия транскрипционного репрессора Snail1в ростовой пластинке приводит к achondroplasia у мышей и показывает, что Snail1 действует ниже передачи сигналов Fgfr3 в хондроцитах (Fig. 5A) , чтобы положительно влиять на пути Stat1 и MAPK (de Frutos et al., 2007). CNP-mediated antagonism of Fgfr3 signaling modulates the onset of chondrocyte hypertrophy Natriuretic пептиды представляют семейство из трех структурно родственных пептидов: atrial natriuretic peptide, brain natriuretic peptide и C-type natriuretic peptide (CNP). Natriuretic пептиды передают свои сигналы путем активации рецепторов natriuretic пептидов: Npr1 (также известен как NPR-A или GC-A) и Npr2 (также известен как NPR-B или GC-B), оба имеют guanylate cyclase домен, и Npr3 (также известен как NPR-C), который лишен активности guanylate cyclase, как полагают, играет роль в очистке рецепторов, которые действуют, чтобы интернализовать и разрушить лиганд (rev. Kishimoto et al., 2011). CNP обладает наивысшим сродством к Npr2 и может также связывать Npr3, оба они экспрессируются в хондроцитах (Kishimoto et al., 2011). В ростовой пластинке, Npr2 преимущественно экспрессируется в пролиферирующих и пре-гипертрофических хондроцитах (Yamashita et al., 2000; Tamura et al., 2004), в тех же самых регионах, которые экспрессируют лиганд CNP (Chusho et al., 2001). Npr3 специфически экспрессируется в гипертрофических хондроцитах (Yamashita et al., 2000). Целенаправленная делеция гена, кодирующего CNP (Nppc) у мышей вызывает карликовость, при этом снижается высота пролиферативной и гипертрофической зон ростовой пластинки и снижается скорость дифференцировки в гипертрофические хондроциты (Chusho et al., 2001), фенотип, напоминающий таковой, после активации передачи сигналов Fgfr3 (Naski et al., 1998; Chen et al., 1999; Wang et al., 1999b; Segev et al., 2000; Iwata et al., 2001). Этот карликовый фенотип может быть устранен за счет избыточной экспрессии специфичного для хряща CNP (Chusho et al., 2001), показывая, что CNP действует локально в ростовой пластинке. В соответствии с этими результатами, специфичная для хряща избыточная экспрессия CNP приводит к избыточному росту кости, при этому увеличивается толщина пролиферирующей и гипертрофической зон ростовой пластинки (Yasoda et al., 2004). Более того, избыточная экспрессия CNP в хряще может предупреждать карликовость, возникающую в результате экспрессии активированного Fgfr3 в хондроцитах ростовой пластинки, показывая, что передача сигналов CNP действует антагонистически по отношению к передаче сигналов Fgfr3 (Yasoda et al., 2004). Удивительно, системное воздействие CNP или фармакологического аналога CNP значительно уменьшает фенотип карликовости и дефекты ростовой пластинки у мышей, моделирующих achondroplasia (Yasoda et al., 2009;Lorget et al., 2012).
Путем связывания со своим рецептором Npr2, CNP способствует накоплению внутриклеточного cyclic GMP (cGMP) в хондроцитах и тем самым регулирует клеточную функцию (rev. Nakao et al., 1992). В ATDC5 клеточной линии хондроцитов мыши накопление CNP или 8-bromo-cGMP строго и в зависимости от дозы ингибирует индукцию ERK/MAPK фосфорилирования с помощью Fgf2 или Fgf18, в то же время отсутствует эффект на фосфорилирование Stat1 (Ozasa et al., 2005). Было также установлено. что применение Fgf2 или Fgf18 заметно снижает CNP-зависимую внутриклеточную продукцию cGMP (Ozasa et al., 2005). Т.о., CNP и FGF активируют взаимно антагонистические сигнальные пути. Более того, в хондроцитах хондросаркомы крыс (RCS) передача сигналов CNP блокирует Fgf2-обусловленную активацию MEK1 и Raf1, но не активацию Ras онкогена (Krejci et al., 2005), демонстрируя, что CNP блокирует путь MAPK на уровне Raf1. Это и др. наблюдения, сделанные Krejci et al. предполагают, что CNP-обеспечиваемое увеличение cGMP активирует protein kinase G, которая в свою очередь, фосфорилирует Raf1 по Ser43, приводя к разобщению Ras/Raf1 взаимодействия и инактивации MAPK пути (Krejci et al., 2005). В соответствии с мнением, что передача сигналов CNP/Npr2 противодействует таковой для Fgfr3 в ростовой пластинке, мутации потери функции в Npr2 приводят к карликовости у мышей (Tamura et al., 2004; Tsuji and Kunieda, 2005) и т.о., к фенокопии мутаций с избыточной функцией в Fgfr3. Итак эти исследования установили, что антагонистические пути передачи сигналов с помощью CNP/Npr2 или Fgf18/Fgfr3 очень точно сбалансированы в ростовой пластинке, чтобы поддерживать соотв. скорость гипертрофии хондроцитов. A nexus of signaling pathways regulates initiation of the hypertrophic chondrocyte differentiation program 4 ключевых лиганда модулируют инициацию гипертрофии хондроцитов: PTHrP, Ihh, Fgf18 и CNP. Наивысшие уровни экспрессии для Fgfr3 (которые передает сигнал Fgf18 из надхрящницы) и Pth1r (который передает PTHrP сигнал от околосуставных хондроцитов) в ростовой пластинке обнаруживаются в пре-гипертрофических хондроцитах (de Frutos et al., 2007). Для обоих из этих рецепторов, использование ими соотв. лигандов блокирует прогрессию гипертрофии хондроцитов. Однако, что запускает начало гипертрофии хондроцитов? Относительный уровень передачи сигналов PTHrP в столбчатых хондроцитах контролируется с помощью как дистанции этих клеток от источника PTHrP, так и уровня секретируемого Ihh гипертрофическими хондроцитами, которые индуцируют экспрессию PTHrP в хондроцитах по соседству с суставом. Т.о., только клетки, которые расположены на достаточном расстоянии от источника PTHrP, и, следовательно, обладают как пониженной экспрессией Zfp521 так и локализованным в ядре Hdac4, могут инициировать Mef2/Runx-управляемую экспрессию генов гипертрофических хондроцитов. Как обсуждалось выше, CNP и Fgf18 активируют пути антагонистической передачи сигналов посредством Npr2 и Fgfr3, соотв., которые по-разному регулируют путь MAPK, который блокирует инициацию гипертрофии хондроцитов (возможно за счет поддержания экспрессии Snail1 и/или Sox9). Т.о., уровень активированного MAPK в пре-гипертрофических хондроцитах предопределяется относительным уровнем передачи сигналов Npr2 (который репрессирует этот путь) и передачи сигналов Fgfr3 (который активирует этот путь) в этих клетках. Хотя Fgf18 секретируется клетками надхрящницы, CNP секретируется как пролиферирующими, так и пре-гипертрофическими хондроцитами. Т. о., чем больше генерируется пролиферирующих и гипертрофических хондроцитов, больше эти незрелые хондроциты будут секретировать CNP. В конечном итоге, если передача сигналов CNP/Npr2 достаточна, чтобы преодолеть Fgfr3-управляемую активацию MAPK в пре-гипертрофических хондроцитах и способствовать гипертрофической дифференцировке этих клеток. В этом смысле действительный антагонизм между передачей сигналов CNP и Fgf18 может рассматриваться как чувствительный механизм, гарантирующий, что присутствует достаточное количество пролиферирующих и пре-гипертрофических хондроцитов, чтобы инициировать программу дифференцировки в этом субнаборе клеток, расположенных дистальнее источника сигналов PTHrP. IGF1 signaling controls the last phase of growth during chondrocyte hypertrophy Потеря передачи сигналов IGF1, как известно, сильно уменьшает рост длинных костей у мышей (Liu et al., 1993;Powell-Braxton et al., 1993) и людей (Woods et al., 1996). У мышей с искусственно вызванным отсутствием IGF1, количество и пролиферация хондроцитов нормальные в ростовой пластинке, но размер гипертрофических хондроцитов примерно на 30% меньше в направлении удлинения, чем у мышей дикого типа (Wang et al., 1999a). Недавно, Cooper с колл. расширили эти находки, показав, что гипертрофия хондроцитов осуществляется в три фазы относительно увеличения объема, при этом в финальной фазе осуществляется пропорциональное увеличение сухой массы с довольно низкой плотностью содержания клеток (Cooper et al., 2013). Эта последняя фаза увеличения хондроцитов зависит от передачи сигналов IGF1 (Cooper et al., 2013). The terminal phases of chondrocyte hypertrophy: regulation by EGFR and ROS Инициация терминальной фазы гипертрофии хондроцитов характеризуется потерей экспрессии Col10a1 , связанной с индукцией VEGFA и металлопротеиназ, Mmp9 и Mmp13. Передача сигналов VEGFA необходима для обеспечения сосудистой инвазии и последующего ремоделирования хрящевой ткани остеобластами и остеокластами (Zelzer et al., 2002, 2004). Mmp9 и Mmp13 сходным образом играют критическую роль, способствуя инвазии сосудов в гипертрофический матрикс; мыши, лишенные обеих металлопротеиназ, обнаруживают существенное увеличение зоны ростовой пластинки, содержащей Col10a1-экспрессирующие гипертрофические хондроциты (Inada et al., 2004; Stickens et al., 2004). Какие сигналы запускают эту терминальную фазу гипертрофии хондроцитов? Недавнее исследование показало, что передача сигналов посредством EGF рецептора (Egfr) играет критическую роль в регуляции этого перехода. Мыши, преобразованные, чтобы экспрессировать herstatin (растворимый Erbb2 рецептор, который действует доминантно-негативным способом, чтобы ингибировать передачу сигналов Egfr) в развивающихся зачатках конечностей, обладают расширенной гипертрофической зоной в своих конечностях (Fisher et al., 2007). Более того, Qin с коллегами продемонстрировали, что использование Egfr-специфического низкомолекулярного ингибитора, gefitinib, у 1-мес. крыс приводит к существенному росту эпифизов, толщины ростовой пластинки и к массивному накоплению ранних гипертрофических хондроцитов, экспрессирующих Col10a1 (Zhang et al., 2011). Ростовые пластинки у леченных gefitinib животных обнаруживают усиление экспрессии Col10a1 и заметное снижение экспрессии Mmp9, Mmp13 и RANK ligand (RANKL; Tnfsf11 - Mouse Genome Informatics), это поддерживает развитие остеокластов (Zhang et al., 2011). В соответствии с этими находками некоторые исследователи показали, что специфичный для хондроцитов нокаут Egfr достоверно увеличивает длину гипертрофической зоны у постнатальных мышей (Zhang et al., 2011). Два лиганда для EGF рецепторов, EGF и TGFα, экспрессируются в пре-гипертрофической и гипертрофической зонах, но не в пролиферативной зоне ростовой пластинки кур во время раннего постнатального развития (Ren et al., 1997). Важно, что Tgfa-нулевые мыши обнаруживают временную экспансию ранней гипертрофической зоны ростовой пластинки, это сопровождается снижением экспрессии Runx2, RANKL и Mmp13 в этой структуре (Usmani et al., 2012). Итак, эти находки строго подтверждают мнение, что передача сигналов Egfr (передача сигналов посредством EGF и TGFα) играет критическую роль в контроле перехода экспрессирующих Col10a1 ранних гипертрофических хондроцитов в поздние гипертрофические хондроциты, экспрессирующие Mmp9, Mmp13 и RANKL.
Как передача сигналов EGFR блокирует экспрессию Col10a1, поскольку способствует экспрессии Mmp9, Mmp13 и RANKL? Qin с колл. отметили, что хотя усиление активности Mmp9 и RANKL с помощью передачи сигналов Egfr частично обеспечивается каноническим Wnt/β-catenin путем, индуцированная с помощью Egfr экспрессия Mmp13 обеспечивается с помощью иного пути (Zhang et al., 2013). Кондиционный нокаут Erk1 и Erk2 в мезенхимных предшественниках аппендикулярного скелета приводит к заметной экспансии домена экспрессии Col10a1 внутри ростовой пластинки, что сопровождается отсутствие экспрессии поздних гипертрофических меток, таких как VEGFA и RANKL в этой ткани (Matsushita et al., 2009). Это сходно с фенотипом, наблюдаемым после потери передачи сигналов Egfr в ростовой пластинке (Zhang et al., 2011). Помимо активации ERK и p38 путей (outlined in Zhang et al., 2013), ростовые факторы, такие как EGF, как известно, стимулируют генерацию перекиси водорода путем активации NADPH оксидазы Nox1, с помощью механизма, с участием PI3K и Rac1 (Bae et al., 1997; Fan et al., 2005). Также Morita et al. установили, что реактивные виды кислорода (ROS) специфически генерируются в гипертрофической зоне ростовой пластинки (Morita et al., 2007). Более того, та же самая группа продемонстрировала, что обработка новорожденных мышей антиоксидантом (N-acetylcysteine) уменьшает длину гипертрофической зоны ростовых пластинок и что воздействие перекиси водорода на линию клеток хондроцитов вызывает сильную экспрессию Mmp13 (Morita et al., 2007). Итак, эти находки подтверждают, что передача сигналов Egfr может способствовать терминальной стадии гипертрофии хондроцитов способом, зависимым от передачи сигналов ERK и продукции
ROS. The ultimate fate of growth plate chondrocytes Известно, что апоптоз по хондро-костному фронту в ростовой пластинке (т.e. на границе между поздними гипертрофическими хондроцитами и костным матриксом) (Gibson, 1998; Shapiro et al., 2005), подтверждает, что инициация апоптической програмы клеточной гибели последняя судьба гипертрофических хондроцитов. Однако, морфология некоторых поздних гипертрофических хондроцитов также подтверждает, что некоторые из этих клеток могут подвергаться трансформации в остеобласты (rev. Roach et al., 1995). Используя мышей, у которых Cre recombinase вызывала нокаут в одном из аллелей локуса Col10a1, или тех, у которых экспрессия Cre-трансгена управлялась с помощью Col10a1 регуляторных элементов, Cheah с колл. продемнстрировали, что существенное количетсво гипертрофических хондроцитов, которые ранее экспрессировали Col10a1, в самом деле, становятся остеоцитами, расположенными на трабекулах кости (Yang et al., 2014). Параметры, которые диктуют подвергнутся ли гипертрофические хондроциты апоптозу илиначнут остеогенную дифференцировку и будут выживать в костном матриксе, непонятны. Conclusions During the past decade, excellent progress has been made in elucidating both the signaling pathways and the transcriptional regulatory networks that control the induction of chondrogenesis and the maturation of immature chondrocytes into hypertrophic chondrocytes in the growth plate. Mechanical signals (see Box 2) have also been shown to be important regulators of both chondrocyte proliferation and bone morphology. However, the details regarding how these various signals modulate either the expression and/or activity of the relevant transcription factors is only beginning to be explored. Such a detailed molecular understanding will be necessary to fully comprehend how either the initiation of chondrogenesis or growth plate expansion is regulated with such precision during vertebrate development. In addition, we anticipate that this type of knowledge could be harnessed to develop novel therapeutics that regulate the process of endochondral ossification to reverse various skeletal pathologies, including chondrodysplasias.
|
|---|