Роговица обладает важными свойствами, которые необходимы для нормальной остроты зрения, включая прозрачность, рефракцию и защиту внутренних компонентов глаз от внешне-средовых факторов. Зрелая роговица состоит из 3-х слоёв клеток, в 6-7 клеток толщиной эпителия роговицы, представляющего наружную поверхность, монослоя эндотелия, формирующего внутреннюю поверхность и стромального слоя между эпителием и эндотелием, состоящего из упорядоченно расположенных ламелл из кератоцитов и специализированных пучков коллагена (Chow and Lang, 2001; Cvekl and Tamm, 2004). Эпителий роговицы возникает из поверхностной эктодермы во время развития, тогда как эндотелий и строма формируются из мезенхимы, которая в зависимости от вида в основном или полностью происходит из нервного гребня (Gage et al., 2005; Le Douarin, 1980; Le Lievre and Le Douarin, 1975). Понимание того, как внутренние и внешние факторы образуют сети, чтобы контролировать выбор клетками судеб и генную экспрессию в каждом клеточном слое во время развития.

Нормальное зрение также нуждается в полном отсутствии кровеносных и лимфатических сосудов в роговице (angiogenic privilege). Потеря ангиогенной привилегии вследствие аномалий развития или постнатального инсульта приводит к неоваскуляризации роговицы, угрожающему зрению состоянию. Следовательно, детальное понимание, как устанавливается ангиогенная привилегия во время развития и затем сохраняется во взрослой роговице, важно для понимания развития роговицы и идентификации более эффективной терапии.

Начало развития роговицы морфологически различимо, когда из нервного гребня мезенхима начинает мигрировать между вновь сформированным хрусталиковым пузырьком и лежащей поверх эктодермой (Cvekl and Tamm, 2004). Эндотелий является первым дифференцированным слоем роговицы и он возникает из мезенхимных клеток, контактирующих с передним эпителием хрусталика. Затем мезенхимные клетки между вновь сформированным эндотелием и лежащей поверх глазной поверхностной эктодермой становятся компактными и принимают упорядоченное ламеллярное расположение, чтобы сформировать строму роговицы. Кровеносные сосуды никогда не возникают в развивающейся роговице, указывая тем самым, что ангиогенная привилегия устанавливается рано во время развития роговицы. Передача клеточных сигналов от клеток передней части хрусталикового пузырька и и дистального края глазного бокала действует непосредственно на мезенхиму во время раннего развития роговицы, чтобы индуцировать экспрессию генов транскрипционных факторов, которые необходимы для нормального развития переднего сегмента глаз, включая Foxc1 и Pitx2 (Matt et al., 2005; Molotkov et al., 2006). Из них только Foxc1 установлен, как ген, специфицирующий клеточные судьбы и ангиогенную привилегию в развивающейся роговице (Kidson et al., 1999; Seo et al., 2012). В противоположность развитию эндотелия и стромы лежащая поверх глазная эктодерма специфицируется как роговица под действием передачи сигналов от подлежащих мезенхимных клеток (Pearton et al., 2005).

Глазная поверхностная эктодерма и подлежащая мезенхима также дают конъюнктиву, которая располагается между роговицей и задним краем век. Клеточные компоненты конъюнктивы сильно отличаются от таковых роговицы и мезенхима конъюнктивы сильно васкуляризована. Механизмы, лежащие в основе сегрегации мультипотентной глазной поверхностной эктодермы и мезенхимы в роговицу в противовес выбора судьбы конъюнктивы, неизвестны.

Учитывая её фундаментальную роль в управлении развитием раннего переднего сегмента (Evans and Gage, 2005a; Gage et al., 1999), мы предположили, что Pitx2 также необходим для спецификации клеточных клонов и становления ангиогенной привилегии в развитии роговицы. Pitx2 кодирует paired-like гомеодоменовый транскрипционный фактор, важный для развития и возникновения болезни. Гетерозиготные мутации PITX2 у человека являются одной из генетических причин Axenfeld-Rieger Syndrome (ARS), с признаками дисгенезии структур переднего сегмента глаз и высоким риском глаукомы (Semina et al., 1996). ARS пациенты с PITX2 мутациями, также и гетерозиготные по Pitx2 мыши, обнаруживают уменьшение central corneal thickness (CCT), чт о согласуется с потенциальной ролью PITX2 в развитии роговицы (Asai-Coakwell et al.,2006). Глобальное или специфичное для нервного гребня устранение Pitx2 приводит к аресту развития переднего сегмента на стадии перед инициацией развития роговицы (Evans and Gage,2005a; Gage et al., 1999). Чтобы обойти эту блокаду мы разработали подход временного нокаута гена. Мы продемонстрировали, что PITX2 необходим для спецификации клонов и становления ангиогенной привилегии в развивающейся роговице. В отсутствие PITX2, поверхностная эктодерма и мезенхима приобретают паттерны экспрессии генов, более соответствующие судьбе конъюнктивы, при этом экспрессия Dkk2 не поддерживается в мезенхиме роговицы, а активность канонической передачи сигналов Wnt становится повышенной в развивающейся роговице. Поддержание нормальной канонической передачи сигналов Wnt посредством его нижестоящей мишени Dkk2, по-видимому, является важным механизмом, с помощью которого PITX2 контролирует нормальную спецификацию эпителия роговицы.

Discussion

Мы использовали временный нокаут, чтобы установить потребность в гомеодоменовом транскрипционном факторе PITX2 на некоторых ступнях развития роговицы. В отсутствие PITX2, морфогенез роговицы и спецификация судеб клеток внутри поверхностной эктодермы и мезенхимного примордия нарушены. PITX2 также необходим для становления ангиогенной привилегии в развивающейся роговице. Контроль уровней активности канонической передачи сигналов Wnt в результате активации нижестоящей мишени Dkk2 в подлежащей мезенхиме, по-видимому, является ключевым механизмом, с помощью которого PITX2 управляет корректной спецификацией центральной глазной поверхности, чтобы детерминировать судьбу эпителия роговицы. Напротив, корректная спецификация клеток подлежащей мезенхимы в выборе судьбы роговицы и становление ангиогенной привилегии, по-видимому, менее чувствительны к потере активности DKK2. Мы идентифицировали несколько транскрипционных факторов, чьи паттерны у мутантов Pitx2 и Dkk2 подтверждают, что они могут участвовать в спецификации судеб клеток и становлении ангиогенной привилегии в презумптивной мезенхиме роговицы, но вряд ли играют роль в спецификации клеточных судеб эктодермы роговицы.

Normal Corneal Development Requires a Set of Transcription Factors in the Neural Crest Mesenchyme

Данная работа расширяет наше понимание транскрипционного кода, необходимого для нормального развития роговицы. LMX1b кодирует гомеодоменовый транскрипционный фактор, экспрессирующийся в глазном нервном гребне, начиная с раннего развития глаз, и ассоциированный с Nail-Patella Syndrome (Mcintosh et al., 1998; Pressman et al., 2000; Vollrath et al., 1998). Хотя неизвестны пациенты с дефектами роговицы, нокаутные Lmx1b мыши обнаруживают дефекты развития стромы роговицы (Pressman et al., 2000). Гетерозиготные мутации FOXC1, кодирующего forkhead транскрипционный фактор, являются второй причиной Axenfeld-Rieger Syndrome (Lehmann et al., 2000). Подобно Pitx2, экспрессия Foxc1 в мезенхиме глазного нервного гребня зависит от передачи сигналов ретиноевой кислоты. Развитие стромы роговицы и эндотелия нарушено у нокаутных по Foxc1 мышей (Kidson et al., 1999). Кроме того, Foxc1 необходим как для становления, так и поддержания ангиогенной привилегии в роговице (Seo et al., 2012).

Поразительным признаком этих трех транскрипционных факторов является то, что ни один из них не ограничен мезенхимой роговицы во время развития глаз. В самом деле, все три также совместно экспрессируются в клетках нервного гребня, предназначенных стать дополнительными тканями, такими как мезенхима конъюнктивы, склеры и структуры радужка-роговичного угла. Следовательно, хотя каждый необходим, но способность специфицировать судьбы роговицы не кодируется уникально ни одним из этих трех факторов или их комбинацией. Возникает возможность, что они кооперируются с одним или несколькими дополнительными транскрипционными факторами, которые сами по себе специфичны для мезенхимы роговицы. Альтернативно, могут быть и др. транскрипционные факторы, чьи паттерны экспрессии заключают в себя не только роговицу, но при этом мезенхима роговицы является уникальным местом, где они экспрессируются вместе с FOXC1, LMX1B и PITX2.

Surface Ectoderm Is More Sensitive to Increases in Canonical Wnt Signaling Activity Levels

Наши данные предоставляют новую информацию относительно чувствительности поверхностной эктодермы и подлежащей мезенхимы в презумптивной роговице к экспрессии Dkk2 и возникающей в результате супрессии уровней активности передачи канонических сигналов Wnt. Устранения Dkk2 достаточно, чтобы вызвать явный сдвиг с выбора судьбы роговицы к выбору судьбы конъюнктивы в поверхностной эктодерме, что демонстрируется отсутствием маркера зрелой роговицы, keratin 12, и присутствием маркера зрелой конъюнктивы, keratin 4. Напротив, ни один из исследованных маркеров мезенхимы не меняется в презумптивной роговице мутантных Dkk2 мышей, а ангиогенная привилегия затронута лишь частично по сравнению с мутантной роговицей Pitx2.

Различия в чувствительности к изменениям в уровнях активности канонической передачи сигналов Wnt между поверхностной эктодермой и мезенхимой в презумптивной роговице отражают паттерны экспрессии Wnt лигандов и рецепторов. Минимум 4 гена, кодирующих Frizzled рецепторные белки, экспрессируются в поверхностной эктодерме развивающейся роговицы, означая, что этот слой, скорее всего, высоко компетентен реагировать на доступные Wnt лиганды (Liu et al., 2003). Напротив, только Frizzled 7, по-видимому, экспрессируется в подлежащей мезенхиме во время развития роговицы, подтверждая, что эти клетки могут быть менее чувствительными к Wnt лиганду (Liu et al., 2003). Поверхностная эктодерма является также главным источником доступного Wnt лиганда в этом регионе (Liu et al., 2003). Напротив, подлежащая мезенхима нервного гребня является источником DKK2 (Gage et al., 2008). Итак, эти наблюдения указывают, что во время нормального развития роговицы паракринное подавление с помощью DKK2, продуцируемое в нервном гребне, необходимо для супрессии аутокринного эффекта Wnt лиганда на поверхностную эктодерму.

Механизмы возникновения более широкого фенотипа в отсутствие PITX2 по отношению к DKK2 на сегодня неясны и нуждаются в дальнейших исследованиях. Недавно, мы получили предварительные данные, подтверждающие, что экспрессия Dkk1 также драматически снижается в отсутствие PITX2 (Chen et al., preliminary results). Это подтверждает возможность, что уровни активности передачи канонических сигналов Wnt более высокие у Pitx2 мутантов, т.к. реакция д. быть суммой от потери DKK1 и DKK2. Если это так, наивысшие уровни активности могут быть достаточны для изменения выбора судьбы мезенхимой и для изменения становления ангиогенной привилегии способом, в котором, по-видимому, уровни меньшей активности в мутантной Dkk2 роговице не действуют. Дополнительная возможность заключается в том, что не является взаимно исключающим то, что детерминация судьбы в мезенхиме и становление ангиогенной привилегии могут зависеть от сигналов др. сигнальных путей, таких как Nodal, FGF, TGFβ, и BMP, все они активны в развивающемся переднем сегмента глаза (Govindarajan et al., 2000; Saika et al., 2001; Zhao et al., 2002).

Early Transcription Factor Markers Could Play Role in Specification of Corneal Mesenchyme or Establishing Angiogenic Privilege

Мы идентифицировали несколько маркеров, чья экспрессия в поверхностной эктодерме и мезенхиме отличается в избранной судьбе роговицы и конъюнктивы во время раннего разделения этих двух тканей. Эти маркеры представляют собой важные новые инструменты для анализа судеб, особенно на ранних стадиях процесса, когда эти паттерны белков экспрессируются дифференциально. Т.к. каждый из этих генов кодирует транскрипционный фактор, то возникает вопрос, действительно ли их регионализованная экспрессия может быть функционально важной для разделения поверхностной эктодермы или мезенхимы при выборе судьбы роговицы или конъюнктивы, Напр., исключение обычной специфичной для конъюнктивы экспрессии FOXC2, PITX1 и BARX2 действительно необходимо для нормального развития эктодермы и мезенхимы роговицы и для становления ангиогенной привилегии? Экспансия экспрессии FOXC2 на роговицу особенно интересно в отношении становления ангиогенной привилегии, поскольку этот транскрипционный фактор, как известно, способствует ангиогенезу при нормальных и патологических условиях, включая рак. Интересно, что альтерации функциональных уровней у близко родственных членов семьи FOXC1, как было установлено, способствует потере ангиогенной привилегии в роговице (Seo et al., 2012).

Pitx2 Function in Later Developing Tissues and Mature Structures

Шлеммов канал и трабекулярная сеть в радужка-роговичном углу начинают дифференцироваться в конце развития роговицы, а врожденные дефекты у Pitx2-зависимых Axenfeld-Rieger пациентов подвтерждают вероятность того, что PITX2 необходим для развития этих структур помимо роговицы. Pitx2 экспрессируется на высоком уровне в этих структурах во время развития глаз, подтверждая его функциональное значение (data not shown). Долговременная экспрессия в зрелой строме роговицы и эндотелии, Шлеммовом канале и трабекулярной сети также открывает возможность, что PITX2 может играть важную роль в поддержании клеточной судьбы и в обновлении этих структур.

The homeodomain transcription factor PITX2 is required for specifying correct cell fates and establishing angiogenic privilege in the developing cornea Philip J. Gage, Chen Kuang and Amanda L. Zacharias Developmental Dynamics Volume 243, Issue 11, pages 1391-1400, November 2014

The homeodomain transcription factor PITX2 is required for specifying correct cell fates and establishing angiogenic privilege in the developing cornea
Philip J. Gage, Chen Kuang and Amanda L. Zacharias
Developmental Dynamics Volume 243, Issue 11, pages 1391-1400, November 2014