Ремоделирование первичной сердечной трубки в зрелое четырехкамерное сердце нуждается в образовании ткание эндокардиальных подушек в atrioventricular canal (AVC) и outflow tract (OFT) (Markwald et al., 1975; Armstrong and Bischoff, 2004; Sakabe et al., 2005; Combs and Yutzey, 2009a; Lin et al., 2012; von Gise and Pu, 2012). Эндокардиальные клетки в этих специфических регионах подвергаются последовательным фенотипическим изменениям, наз. endothelial-mesenchymal transformation (EndMT), включая отсоединение и повторное заполение подлежащего внеклеточного матрикса, чтобы сформировать ткань подушек. Последующие морфологические события приводят к росту и ремоделированию эндокардиальных подушек, чтобы сформировать кардиальные перегородки и створки клапанов. Неспособность форировать эндокардиальные подушки вызывает разнообразные врожденные пороки сердца, такие как дефекты атрио-вентрикулярной перегородки и недостаточность клапанов.

Многочисленные факторы роста, трансмембранные рецепторы и молекулы внутриклеточных сигналов участвуют в регуляции формирования подушек (Armstrong and Bischoff, 2004; Sakabe et al., 2005; Lin et al., 2012; von Gise and Pu, 2012). Среди них transforming growth factor beta (TGFβ) и bone morphogenetic protein (BMP), которые действуют как происходящие из миокарда сигналы, чтобы индуцировать EndMT эндокардиальных клеток (Yamagishi et al., 1999; Camenisch et al., 2002; Sugi et al., 2004; Ma et al., 2005). Передача сигналов Notch в эндокардиальных клетках также необходима для развития подушек, а делеция Notch1, Rbpj или Jag1 у мышей вызывает дефекты EndMT и гипоплазию подушек (Timmerman et al., 2004; de la Pompa and Epstein, 2012; Hofmann et al., 2012). Кроме того, передача сигналов calcineurin и его нижестоящих транскрипционных факторов семейства NFATc (nuclear factor of activated T cells, cytoplasmic, calcineurin dependent) участвуют в EndMT во время раннего образования подушек, а также во время последующего образования клапанов (de la Pompa et al., 1998; Ranger et al., 1998; Crabtree and Olson,2002; Chang et al., 2004; Combs and Yutzey, 2009b; Wu et al., 2011). Однако, молекулярные механизмы регуляции EndMT изучены не до конца.

Мы недавно идентифицировали Tmem100 в качестве нового эндотелиального гена, стоящего ниже передачи сигналов BMP9/BMP10-ALK1 рецептор (Somekawa et al.,2012). Tmem100 предназначен для трансмембранного белка no. 100 и кодирует небольшой белок с двумя предполагаемыми трансмембранными доменами. Tmem100 экспрессируется в артериальных эндотелиальных клетках во время эмбрионального развития, а его целенаправленное разрушение приводит к гибели эмбрионов из-за тяжелых аномалий образования сосудов. Мы исследовали, участвует ли Tmem100 в регуляции EndMT во время морфогенеза сердца. Детальный анализ Tmem100 нулевых эмбрионов и AVC эксплантов в культуре показал, что дефицит Tmem100 вызывает выраженный дефект EndMT во время формирования AVC подушек, и позволил предположить возможное участие в нарушении супрессии экспрессии кардиального vascular endothelial growth factor (VEGF) и в аномалиях передачи сигналов эндокардиального кальция в механизмах дефектов EndMT у Tmem100 нулевых эмбрионов.

Поскольку аминокислотная последовательность Tmem100 сильно законсервирована от рыб до человека, особенно трансмембранные домены, отсутствует близко родственное семейство белков у какого-либо из видов (Somekawa et al., 2012). Tmem100 представляет ранее не охарактеризованное единство функциональных белков, но его молекулярные механизмы действия не установлены. Тем не менее его физиологическая важность четко демонстрируется тяжелыми сосудистыми аномалиями и эмбриональной гибелью Tmem100 нулевых мышей (Moon et al., 2010; Somekawa et al., 2012). Сосудистые дефекты были отсутствием дифференцировки артериального эндотелия и наблюдались также у мышей со специфичной для эндотелия делецией Tmem100, указывающие на то, что эндотелиальные клетки являются основным местом действия Tmem100 во время эмбрионального развития (Somekawa et al., 2012). Данное исследование показало, что дефицит Tmem100 вызывает также тяжелые нарушения EndMT во время формирования кардиальных подушек у эмбрионов мыши.

Экспрессия Tmem100 в культивируемых эндотелиальных клетках четко регулируется с помощью передачи сигналов ALK1 (Somekawa et al., 2012). Acvrl1/Alk1 мутантные эмбрионы обнаруживают пониженную экспрессию Tmem100 и погибают in utero из-за сосудистых дефектов, сходных с теми, что у Tmem100 нулевых эмбрионов (Oh et al., 2000; Urness et al., 2000; Moon et al., 2010; Somekawa et al., 2012), подтверждая, что Tmem100 действует в качестве одной из основных нижестоящих мишеней для передачи сигналов ALK1 в клетках сосудистого эндотелия. Однако, данное исследование подтвердило, что Tmem100 участвует в регуляции EndMT во время образования AVC подушек независимо от передачи сигналов ALK1. Поскольку Alk1-lacZ экспрессия не обнаруживается в AVC эндокардиальных клетках у эмбрионов на ст. E9.5, то эндокардиальная экспрессия Tmem100 наиболее вероятно регулируется с помощью ALK1-независимого механизма. Соответственно, имеются четкие различия в фенотипах EndMT у Tmem100 нулевых эмбрионов и у Acvrl1/Alk1 нулевых эмбрионов. Хотя Acvrl1/Alk1 нулевые эмбрионы имеют дефект EndMT во время формирования AVC подушек in vivo, но AVC ткань Acvrl1/Alk1 нулевых эмбрионов обнаруживает существенный уровень EndMT в культуре эксплантов (Sorensen et al., 2003), поэтому возникает возможность, что дефект EndMT у Acvrl1/Alk1 нулевых эмбрионов может быть вторичным из-за гемодинамических аномалий. Мы подтвердили, что экспланты от Acvrl1/Alk1 нулевых эмбрионов, помещенные в существенное количество мезенхимных клеток в нашей культуральной системе (data not shown), резко контрастируют с результатами использования Tmem100 нулевых эксплантов. Дефект EndMT, обнаруживаемый в эксплантах, собранных от Tmem100 нулевых эмбрионов, даже если мы использовали E9.25 нулевых эмбрионов, которые были фенотипически неотличимы от потомков дикого типа. Следовательно, дефицит Tmem100, скорее всего, непосредственно нарушает механизм регуляции EndMT во время формирования AVC подушек.

Среди сигнальных событий, участвующих в EndMT, TGFβ/BMP-активируемая передача сигналов Smad в эндокардиальных клетках, по-видимому, не изменена у Tmem100 нулевых эмбрионов. Аналогично, активация передачи сигналов Notch в AVC эндокардиальных клетках остается неизменной у Tmem100 нулевых эмбрионов. Мы сообщали, что передача сигналов Notch была достоверно супрессирована в сосудистых эндотелиальных клетках Tmem100 нулевых эмбрионов (Somekawa et al., 2012). Это кажущееся расхождение указывает на то, что Tmem100 не является существенным для передачи сигналов Notch и может скорее участвовать в механизмах регуляции Notch специфически в сосудистых эндотелиальных клетках. Напротив, мы установили, что Tmem100 нулевые эмбрионы обнаруживают существенные отклонения в экспрессии кардиального Vegfa и в активации эндокардиального NFATc1, оба связаны с передачей сигналов кальция.

Активация зависимой от calcium/calmodulin фосфатазы calcineurin приводит к супрессии экспрессии VEGF в AVC миокарде на ст. примерно E9.5 посредством дефосфорилирования и транслокации в ядро NFATc2/c3/c4 (Chang et al., 2004). Снижение передачи сигналов VEGF в соседних AVC эндокардиальных клетках делает возможным регион-специфический EndMT, тогда как эндокардиальные клетки др. регионов удерживают эндотелиальные фенотипы. Специфичная для кардиомиоцитов инактивация передачи сигналов calcineurin с помощью Ppp3r1 делеции вызывает избыточную экспрессию Vegfa и дефект EndMT у эмбрионов мыши (Chang et al., 2004). Tmem100 нулевые эмбрионы обнаруживают усиление экспрессии кардиального Vegfa, сравнимое с таковым у мутантных Ppp3r1 эмбрионов мыши, и активация передачи сигналов calcineurin частично, но достоверно устраняет дефект EndMT в Tmem100 нулевой AVC ткани, подтверждая, что миокардиальный путь calcineurin-NFATc-VEGF может быть нарушен у Tmem100 нулевых эмбрионов. Важно, , однако, что экспрессия Tmem100 в эмбриональном сердце ограничена эндокардиальными клетками и остается неясным, как миокардиальная экспрессия Vegfa модулируется у Tmem100 нулевых эмбрионов. Значение коммуникаций между миокардиальными и эндокардиальными клетками в регуляции EndMT подтверждено важной функцией происходящих из миокарда TGFβ/BMP факторов роста и, напротив, тем, что Wnt лиганды, секретируемые эндокардиальными клетками, индуцируют экспрессию миокардиального BMP2 (Yamagishi et al., 1999; Camenisch et al.,2002; Sugi et al., 2004; Ma et al., 2005; Wang et al., 2013). Важно прояснить возможные пути передачи сигналов между эндокардом и миокардом, участвующие в регуляции экспрессии Vegfa в миокарде, включая те, что обеспечивают секреторный фактор, происходящий из эндокардиальных клеток.

Кроме того, данное исследование четко показывает присутствие специфических для эндокарда аномалий при дефиците Tmem100. В культуре эксплантов эндокардиальные клетки от Tmem100 нулевых эмбрионов не обнаруживают EndMT в ответ на воздействие TGFβ2 и BMP2, хорошо известных индукторов EndMT, секретируемых миокардиальными клетками (Nakajima et al., 1997; Sakabe et al., 2012). Т.к. TGFβ/BMP-активруемая передача сигналов Smad в эндокардиальных клетках, по-видимому, не изменена у Tmem100 нулевых эмбрионов, то сигнальный путь, функционирующий совместно с передачей сигналов Smad,, скорее всего, дефектен в эндокардиальных клетках. В согласии с этой гипотезой, мы установили, что передача сигналов кальция может быть нарушена в Tmem100 нулевых эндокардиальных клетках. Calcineurin-зависимая транслокация NFATc1 в ядра, является прекрасным маркером собственно гомеостаза кальция в AVC эндокардиальных клетках (de la Pompa et al., 1998; Ranger et al., 1998; Crabtree and Olson, 2002), она отсутствует у Tmem100 нулевых эмбрионов. Супрессия транслокации NFATc1 в AVC эндокардиальных клетках была также описана у мышиных эмбрионов, обладающих делецией Itpr1/Itpr2, у которых нарушена регуляция гомеостаза кальция из-за отсутствия inositol 1,4,5-triphosphate receptor 1 и 2 (Uchida et al., 2010). Поскольку обработка Tmem100 нулевого сердца с помощью calcium ionophore была достаточной, чтобы вызывать транслокацию в ядро NFATc1, то вышестоящая передача сигналов кальция, но не чувствительность к calcineurin или NFATc1, нарушена, скорее всего, у Tmem100 нулевых эмбрионов.

Поскольку передача сигналов кальция участвует в эпителиально-мезенхимной трансформации в клетках рака груди (Hu et al., 2011; Davis et al., 2014), но это не проясняет, действительно ли гомеостаз кальция в эндокардиальных клетках необходим для EndMT во время ранней фазы образования кардиальных подушек. Специфичное для эндотелия нарушение передачи сигналов calcineurin с помощью делеции Ppp3r1 не единственное, вызывающее дефект EndMT (Chang et al.,2004), а Nfatc1 является необязательным для инициации EndMT (de la Pompa et al., 1998; Ranger et al., 1998; Combs and Yutzey, 2009b; Wu et al., 2011). Всё ещё возможно, что дефекты передачи сигналов calcineurin-NFATc1 в эндокардиальных клетках и избыточная экспрессия Vegfa в миокарде кумулятивно нарушают EndMT у Tmem100 нулевых эмбрионов. Однако, более вероятно, что разные зависимые от кальция сигнальные пути ответственны за дефект EndMT в Tmem100 нулевых эндокардиальных клетках. Поскольку экспрессия эндогенного Tmem100 белка в клетках эндокардиального или сосудистого эндотелия была ниже границы детекции при нашем иммуногистохимическом анализе, то Tmem100 белок, экспрессируемый трансфекционной экспрессионной плазмидой, по-видимому, в основном локализуется в эндоплазматическом ретикулуме в культивируемых эндотелиальных клетках (Somekawa et al., 2012). Можно предположить, что Tmem100 участвует в клеточных функциях, связанных с эндоплазматическим ретикулумом, особенно в регуляции гомеостаза ионов кальция в эндокардиальных клетках. Необходимы дальнейшие исследования, для выяснения молекулярной функции Tmem100 и его значения для гомеостаза внутриклеточного кальция и нижестоящих сигнальных путей.

Хотя ранняя гибель Tmem100 нулевых эмбрионов мешает анализу образования клапанов на поздних стадиях морфогенеза сердца, очень вероятно, что дефицит Tmem100 вызывает нарушения образования клапанов из-за отсутствия NFATc1-зависимой транскрипции в эндокардиальных клетках (de la Pompa et al., 1998; Ranger et al., 1998; Chang et al., 2004). Кроме того, в предыдущих исследованиях было продемонстрировано, что экспрессия Tmem100 имеет место не только в эмбриональном сердце и сосудистой сети, но и во взрослых легких, простате, почках и энтерических нейронах у человека и мыши (van der Heul-Nieuwenhuijsen et al., 2006; Georgas et al., 2009; Moon et al., 2010; Somekawa et al., 2012; Eisenman et al., 2013). Изучение действия Tmem100 в разных органах смогут помочь найти новый модуль клеточной передачи сигналов не толь ко при сердечно-сосудистом развитии, но и в др. биологических процессах.