Figure 1
Initiation of the Differentiation Program in Pluripotent Stem Cells Is Coupled to Cell Cycle Progression. (A) Stem cells exposed to cell fate-specification cues differentiate as an asynchronous wave. (B) The asynchronous differentiation program can be accounted for by the activation of developmental genes in G1 phase of the cell cycle. Cells in G1 respond rapidly to differentiation cues, whereas cells in S, G2, and M phase experience a delay, indicated by the kinetics of transcriptional activation.
Individual Stem Cells Respond to Differentiation Cues with Asynchronous Kinetics
Когда PSCs подвергаются действию сигналов, вызывающих дифференцировку, то индивидуальные клетки активируют онтогенетические пути с асинхронной кинетикой (Figure 1A) . Хотя этот феномен приложим ко всем мультипотентным клеткам, понимание этого феномена на молекулярном уровне не поддается. Объясняется это тем, что локальные различия в плотности клеток создают вариации в концентрациях факторов, которые, в свою очередь, поддерживают дифференцировку и самообновление в разной степени. Однако, недавняя работа показала, что асинхронная дифференцировка и инициация выбора клетками судьбы связаны с клеточным циклом. Центральным наблюдением, подкрепляющим эту концепцию, является то, что G1реагируют на сигналы спецификации более быстро, чем клетки во время др. состояний клеточного цикла. Это объясняет способность G1 клеток активировать программы дифференцировки почти непосредственно после стимуляции [1-3] и проявляется в S-, G2- и M-фазе клеточного цикла, активируя программы дифференцировки с замедленной кинетикой. Такая задержка непосредственно связана со временем перехода к G1 фазе, если онтогенетические программы активированы. Модель, предсказывающая это, была подтверждена с помощью Fluorescence Ubiquitin Cell Cycle Indicator (Fucci) системы [2], используя кинетики активации онтогенетических генов для считывания (read-out) (Figure 1B). Молекулярный механизм, контролирующий фазо-специфическое предопределение судьбы клеток, не совсем ясен (see Outstanding Questions).
Идея, что клетки начинают выбор судьбы в G1 фазе, не является новой концепцией. Напр., клетки могут принимать решения вступать или выходить из клеточного цикла во время каждого раунда клеточного деления с помощью механизма, известного как 'restriction point' (R-point) контроль [4]. R-point служит в качестве молекулярного переключателя, контролирующего 'решения' клеток, связанные с продолжением делений или вступлением в состояние покоя (Go). Этот путь использует интеграцию внеклеточных митогенных сигналов с аппаратом клеточного цикла, сходящуюся на активности cyclin-dependent kinase (CDK), семейства retinoblastoma protein (RB) и E2F генов мишеней [5]. Др. примерами, где выбор клеточной судьбы связан с переходом к G1, включают переключение типов спаривания у почкующихся дрожжей [6], механизмы выбора точки источника репликации [7] и контроля размера [8]. В большинстве этих случаев, общей темой является то, что внеклеточные сигналы активируют сигнальные пути внутри клетки, приводя к объединению зависимых от клеточного цикла транскрипционных реакций для выбора клеточной судьбы.
Figure 2.
Chromatin Resets in G1 Phase to Open a Window of Opportunity for Cell Fate Commitment. In the S, G2, and M phases, stem cells are refractory to differentiation signals. Upon entry into G1, cells become permissive for cell fate specification, respond to extracellular signals and activate developmental genes required for progression towards one of the three embryonic germ layers. This 'window', or 'primed state', occurs when topologically associating domains (TADs) reform after M phase, when potentially active genes become proximal to the nuclear periphery and conceivably coincides with formation of promoter-enhancer loops structures. Transition through G1 also coincides with activation of G1 cyclin-dependent kinase activities (CDK2/4) and the recruitment of transcription factors (TF) to developmental genes. The 'window of opportunity' for activation of developmental genes in G1 is shown ('commitment window'). From S phase to the end of M phase, TFs disengage from target genes and close the developmental window ('unprimed state'). Adapted from [14].
Прочему же выбор судьбы осуществляется клетками в G1 фазе (see Outstanding Questions)? Хотя и умозрительно, но вполне осуществимо, что транскрипционные программы, связанные с предопределением качественных особенностей клеток, могут быть быстро перестроены после выхода из M фазы. Переход от M фазы к G1 связан с драматическими изменениями в архитектуре ядра [9], включая преобразование ядерной оболочки, деконденсацию хромосом и существенное перемещение хромосом в 3D пространстве [10, 11]. В присутствии сигналов. способствующих дифференцировке, G1 фаза должна потенциально устанавливать благоприятное эпигенетическое и ядерное архитектурное окружение, позволяющее действовать программам развития (Figure 2). Эта общая идея подтверждается многочисленными наблюдениями. Напр., потенциал для гена быть активированным после M фазы зависит от его перемещения на периферию ядра в G1 [12]. В контексте выбора клеточной судьбы, клон-специфические гены д. быть реорганизованы и помещены на ядерную ламину с помощью механизма, зависящего от передачи сигналов во времени (temporal signaling environment). Это, скорее всего, связано с динамической природой организации хроматина в клетках в начале ст. G1 и его постоянным усовершенствованием во время перехода к S фазе [13]. Это согласуется с наблюдениями, что устанавливаются topologically associating domains (TADs) и promoter-enhancer петли в G1 [14]. В этом сценарии сигналы спецификации судьбы клетки и аппарат клеточного цикла д. действовать на подготовленный хроматин в G1, чтобы обеспечить выбор клеточной судьбы.
Эти наблюдения говорят в пользу ряда общих принципов, которые делают G1 фазу пригодной для выбора клетками судьбы (Figure 2). Во-первых, они показывают, что G1 представляет собой фазу, разрешающую выбор клетками судьбы посредством контроля 'decision' генов на транскрипционном уровне. Во-вторых, они указывают, что клетки, не чувствительны к индуктивным сигналам вне G1 фазы. Активация mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-related kinase (MAPK/ERK), phosphoinositide 3-kinase (PI3K)/AKT, transforming growth factor beta/bone morphogenetic protein (TGFβ/BMP) и WNT, по-видимому, не является регулируемой клеточным циклом в плюрипотентных клетках [15] и если это так, то вряд ли периодичность путей передачи сигналов может объяснить специфичные для G1 эффекты. Почему гены мишени менее чувствительны к онтогенетическим сигналам вне G1, остается неясным. Почему же выбор клетками судеб ограничивается G1 фазой?
Cell Cycle Regulation in PSCs
Чтобы понять, как PSCs инициируют выбор клетками судьбы в G1, сначала необходимо понять, как клеточный цикл отличается у PSCs и у дифференцированных соматических типов клеток. PSCs на стадии имплантации у эмбрионов млекопитающих подвергаются быстрым клеточным делениям, которые управляют объемом эмбриона и количеством клеток во время этой стадии развития. Путем подсчета количества клеток во время предимплантационной стадии и ранней пост-имплантационной стадии развития, было установлено, что время генерации PSCs в эмбриональном эпибласте мыши соответствует приблизительно 4.4 ч [16]. Затем по мере продвижения гаструляции и раннего выбора клетками судеб, длина клеточного цикла увеличивается до 16 ч или более [16, 17]. Эта общая склонность тщательно описана в животном царстве и особенно хорошо задокументирована на мухах, рыбах и лягушках, где где быстрые клеточные и/или ядерные деления генерируют свойства популяций недетерминированных клеток во время ранней стадии эмбриогенеза [18-22]. Недавняя работа предоставила некую механистическую информацию о том, как длина клеточного цикла увеличивается во время mid-blastula transition (MBT) у эмбрионов Xenopus, при этом изменения в соотношении ядро:цитоплазма влияет на концентрацию факторов, необходимых для репликации ДНК [23]. Возникающий в результате эффект разведения задерживает начало S фазы за счет расширения фазы G1. Изменения в соотношении объема ядра и цитоплазмы уже давно подозревались, что являю во время раннего развития и что это является важным наблюдением. Действует ли этот механизм и у эмбрионов млекопитающих, предстоит определить. Др. ключевой вопрос, действительно ли быстрые деления являются подходящим механизмом для быстрого увеличения количества эмбриональных клеток перед гаструляцией, или нечто, что наследуется с помощью механизмов, связанных с плюрипотентным состоянием. Несколько лаб. исследовали этот вопрос, используя культивируемые PSCs в качестве модели. Очевидно, что быстрая пролиферация клеток не является абсолютным обязательным условием для поддержания плюрипотентности [24, 25].
Анализ с помощью жидкостной цитометрии клеток из эпибласта мыши выявил необычную структуру клеточного цикла, которая намекает на то, почему PSCs обнаруживают столь быстрые клеточные циклы [22]. Приблизительно 60% плюрипотентных клеток в эпибласте эмбриона имеют активно реплицирующуюся ДНК (S фаза), тогда как только небольшая пропорция находится в G1 и G2. Следовательно, механизм, связанный в быстрыми клеточными делениями у ранних эмбрионов млекопитающих, по-видимому, связан с быстрым переходом через фазы G1 и G2. Высокая пропорция клеток, активно реплицирующих ДНК может неправильно указывать, что S фаза необычно длинная, но фактически она сравнима с таковой соматических клеток. Вместо этого промежуточные фазы значительно укорочены относительно дифференцированных клеток. В большинстве типов соматических клеток промежуточные фазы представляют большую фракцию продолжительности клеточного цикла и важно, что это периоды, когда клетка принимает решение остановиться или пролиферировать. Напротив, плюрипотентные клетки эмбриона лишены полностью сформированной G1 фазы и быстро переходят в S фазу после завершения M фазы. Продолжительность клеточного цикла изменяется драматически примерно во время гаструляции, когда плюрипотентные клетки становятся детерминированными стать одним из трех зародышевых слоёв (мезодермой, эктодермой или энтодермой). Во время этой ст. развития промежуточные фазы расширяются, это объясняет повышенное время клеточного деления. Это совпадение между быстрой пролиферацией и обширной дифференцировкой снова подтверждает механистическую связь между промежуточными фазами клеточного цикла и механизмами детерминации судьбы клеток.
Figure 3.
Key Figure: Multiple Cell Cycle-Regulated Mechanisms Contribute to the Cell Cycle-Dependent Activation of Developmental Genes
(A-C) Potential mechanisms for G1-dependent 'priming'. (A) Cell cycle-regulated binding of transcription factors to developmental genes. This is suggested from work in pluripotent [2] and neural stem cells 41 and 42, and indicates the engagement of transcription factors with developmental genes in G1 phase. The green square and orange oval shapes represents G1-specific binding factors at developmental genes [e.g., SMAD Family Member (SMAD) 2,3 or Neurogenin 2 (NGN2)]. Other factors (red circles) may bind throughout the cell cycle and serve to recruit cell cycle-regulated DNA-binding factors. (B) Cell cycle-dependent changes in the epigenetic landscape around developmental genes. This could include histone modifications or DNA methylation changes. One example is the conversion of 5-methyl cytosine (5mC) to 5-hydroxymethyl cytosine (5hmC) at developmental genes in G1 [15]. (C) Changes in chromosome architecture around developmental genes. One scenario could be the recruitment of enhancers to proximal promoter regions by DNA looping. Some or all of these changes are likely to be orchestrated by the activity of cyclin-dependent protein kinases and their transcription factor targets. (D) Cell cycle phases corresponding to features above (A-C) and below (E-I). (E-I) Temporal activity of factors that potentially impact G1-specific cell fate commitment. (E) Window of time when conditions are suitable for activation of developmental genes ('commitment window'). (F) Time in the cell cycle when transcription factors bind and activate developmental genes. (G) Period of the cell cycle when chromatin is broadly permissive for developmental decisions. (H). Periodicity of cyclin-dependent protein kinase (CD) activity responsible for the recruitment of transcription factors to cell fate genes in G1. (I) It is hypothesized that an inhibitory signal or inactivation of CDK2/4 is required for decommissioning of developmental genes as cells transition through early S phase.
В момент имплантации эмбрионы млекопитающих трудны для исследований по многим причинам, так что выяснение механизмов, связанных с реструктуированием клеточного цикла во время раннего развития затруднительно. О эта проблема облегчается использованием культивируемых PSCs, которые имеют сходный способ регуляции клеточного цикла, что и их аналоги in vivo. Модели, которые были использованы для понимания связи между контролем клеточного цикла и плюрипотентностью, включали клетки эмбриональной карциномы (ECCs), эмбриональные стволовые клетки (ESCs), индуцированные PSCs (iPSCs) и эпибласт-подобные стволовые клетки (EpiSCs). Подобно их аналогу in vivo культивируемые PSCs обнаруживают высокую пропорцию клеток в S фазе и низкую пропорцию в G1 [22], последнее указывает на укороченную промежуточную фазу. Сходства в свойствах клеточного цикла между плюрипотентными клетками in vivo и in vitro указывают на то, что ECCs, ESCs, iPSCs и EpiSCs являются пригодными моделями для изучения связи с клеточным циклом эмбриональных событий.
Как обсуждалось выше, изменения в скорости пролиферации, происходящие на ранних стадиях детерминации клеточных судеб, могут быть объяснены увеличением времени, затрачиваемого на прохождение ст. G1. Это ставит многочисленные вопросы, почему короткая G1 фаза является наследуемым признаком плюрипотентности, особенно из-за того, что PSCs, как известно, начинают выбор клеточной судьбы отсюда [1, 26-28]. Если PSCs чувствительны к сигналам дифференцировки в G1, то отсюда следует, что укорочение этой промежуточной фазы д. уменьшать склонность к дифференцировке. Многочисленные исследования установили молекулярные изменения, лежащие в основе ремоделирования клеточного цикла во время дифференцировки. Первоначальные сообщения были сфокусированы на мышиных ESCs (mESCs), они показали, что retinoblastoma tumor suppressor (RB) инактивирован и затем, после дифференцировки, этот критический регулятор пролиферации активируется зависимым от клеточного цикла образом [22, 29]. Эти клетки в чем то сходны с PSCs из inner cell mass (ICM) эмбрионов ст. преимплантации, но обнаруживают некоторые отличия. В отличие от соматических клеток, cyclin-dependent kinases (CDKs) в mESCs не обнаруживают зависимой от фаз активности [22]. Вместо этого они постоянно активны в ходе всего клеточного цикла. Единственная CDK, которая обнаруживает некую периодичность в mESCs это митотический осциллятор CDK1/cyclin B; все др. CDK-cyclin комплексы обнаруживают необычайно высокую конституитивную активность [22]. Это наблюдение объясняет неактивность RB пути, постоянную активность нижестоящих E2F-регулируемых генов мишеней и почему клеточные деления mESCs не зависят от митогена. Вместо этого RB ген, будучи мутантным, как это часто встречается в опухолевых клетках, то активность RB биохимически инактивируется с помощью устойчивого CDK-зависимого фосфорилирования в mESCs. CDK inhibitory molecules (CDKIs) отсутствуют в mESCs, это также вносит вклад в быстрые клеточные деления и необузданную активность CDK [30, 31]. Итак, эти находки показывают, что mESCs умножаются посредством неограниченных клеточных делений и объясняют, почему они устойчивы к внешним модулирующим рост сигналам, таким как контактное ингибирование и истощение факторов роста. Это напоминает опухолевые клетки, где контроль клеточного цикла часто не связан с внешними митогенными сигналами.
Как показано выше, первоначальные исследования регуляции клеточного цикла в PSCs были сконцентрированы на mESCs, поддерживаемых на fetal calf serum (FCS) и leukemia inhibitory factor (LIF). Поскольку эти исследования не принимали во внимание, что существуют множественные формы PSCs во время периода имплантации и что контроль клеточного цикла д. отличаться между альтернативными плюрипотентными состояниями. Благодаря этому недавно интерес был сдвинут в направлении характеризации разных стадий плюрипотентности, таких как представляющих примитивную эктодерму, плюрипотентные клетки от эмбрионов ранней пост-имплантационной стадии. В мышиной системе эти клетки обозначаются как EpiSCs [32, 33] или чаще 'primed' PSCs. Human ESCs (hESCs) относятся к категории 'primed' PSC и сходны с EpiSCs [34], являются онтогенетически эквивалентными примитивной эктодерме. Третий подтип плюрипотентных клеток, обозначаемый как naïve или 'ground-state' PSCs, был выделен из человеческих и мышиных источников и очень сильно напоминает PSCs из ICM [34]. В этой связи структура клеточного цикла PSCs, 'primed' клеток имеет короткую промежуточную (gap) фазу и большую часть времени проводит в S фазе. После дифференцировки клеточный цикл реструктуируется так, что промежуточные фазы увеличиваются и скорость делений замедляется. Хотя все изученные PSCs обладают этим общим свойством клеточного цикла, независимо от источника, молекулярные механизмы, управляющие аппаратом клеточного цикла, по-видимому, варьируют [35]. Это контрастирует с FCS- и/или LIF-поддерживаемыми mESCs, hESCs обнаруживают зависимую от фазы активность CDK, CDKIs экспрессируются на более высоких уровнях и RB белок фосфорилируется зависимым от клеточного цикла образом [35], подтверждая, что 'primed' клетки имеют интактный R-point путь. Анализ клеточного цикла na've и/или ground-state PSCs неожиданно ограничен, но это и ожидалось, что они будут иметь структуру клеточного цикла, сходную, той что и у др. PSCs. Итак, разные классы PSC имеют сходную структуру клеточного цикла, представленную короткими промежуточными фазами, но детали её молекулярной регуляции несколько отличаются. Имеющаяся информация подтверждает, что активация зависимой от клеточного цикла активности CDK и контрольные механизмы нормального роста инициируются, когда устанавливается 'primed' плюрипотентное состояние. Связь между клеточным циклом и детерминацией клеточной судьбы в первую очередь базируется на исследованиях 'primed' клеток, но было бы интересно установить, действительно ли переход 'naïve' к 'primed' состоянию также связан с переходом к G1.
Signaling Pathways Connect the Cell Cycle to Developmental Genes in G1 Phase
Несколько сообщений описывают процесс, с помощью которого PSCs инициируют программу дифференцировки с G1 фазы [1, 27, 28], но два недавних сообщения [2, 15] адресованы молекулярному механизму. Оба эти сообщения используют систему Fucci с тем, чтобы избежать проблем, связанных с использованием синхронизации лекарств и центрифужной промывки (elutriation). Одно из сообщений [2] описывает, как SMAD Family Member (SMAD) 2,3 способствует дифференцировке путем рекрутирования онтогенетических генов во время G1 фазы (Figure 2, Figure 3). По мере прохождения через G1, SMAD2,3 удаляется с генов мишеней и транслоцируется в цитоплазму посредством зависимого от циклина D механизма. Это помещает регулируемые с помощью клеточного цикла биохимические активности в центр активации онтогенетических генов в PSCs. Более того, G1 разделен так, что детерминация мезодермы и энтодермы происходит в начале G1, когда SMAD2,3 находится ещё в ядре, тогда как детерминация эктодермы происходит в поздней G1 фазе, совпадая с исключен ием из ядра SMAD2,3. Эта модель показывает, что клоны мезодермы и энтодермы детерминируются по времени отдельно от дифференцировки эктодермы. Такое подразделение G1 на периоды предпочтительной детерминации разных зародышевых слоёв, довольно неожиданное и указывает на элегантный путь инициации выбора клеточных судеб, базирующийся на положении в клеточном цикле.
Во второй работе использован др. подход путем оценки уровней транскриптов онтогенетических генов в клеточном цикле PSCs. Большинство онтогенетических генов является 'bivalent', это означает, что они маркированы с помощью перекрывающих доменов H3K4 и H3K27 триметилирования вблизи своих соотв. мест старта транскрипции [36]. Неожиданно, второе сообщение показало, что высокая пропорция онтогенетических генов слабо транскрибируется во время G1 в hPSCs [15]. Это наблюдение противоречит интуиции, поскольку онтогенетические гены оказываются молчащими в PSCs за счет механизма, зависящего от polycomb [36], но это исследование показало, что транскрипционная ' протечка (leakiness)' происходит во время G1. Это подразумевает, что онтогенетические гены являются транскрипционно готовыми (primed) в G1 и что эта фаза представляет собой 'окно возможности' для дифференцировки (Figure 2, Figure 3). Когда сети передачи сигналов переключаются с поддержки самообновления на дифференцировку, то периодичность транскрипции для онтогенетических генов умножается, при этом сохраняется некоторая периодичность, зависимая от клеточного цикла. Кроме того, 5-hydroxymethylation цитозина (5hmC) усиливается параллельно увеличению транскрипции во время G1, подтверждая связь между статусом метилирования цитозина и активацией онтогенетических генов во время клеточного цикла. Эти сообщения предоставляют важную информацию о механизмах, управляющих зависимым от клеточного цикла выбором клеточной судьбы в PSCs. Связь внешних сигналов с аппаратом клеточного деления и выбором клетками судьбы напоминает др. выборы клеточных судеб в G1; R-point является прекрасным примером. G1-специфическое связывание SMAD2,3 онтогенетическими генами в G1 [2], их временная активация транскрипции [15], и совпадение с эпигенетическими изменениями [15] могут быть обусловлены реорганизацией генома, которая происходит после M фазы и/или активации специфических CDK, ассоциированных с ходом G1 (Figure 2). Даже если хроматин может продолжать оставаться пермиссивным для активации генов в S и G2 фазах, удаление транскрипционных факторов с онтогенетических генов в S фазе устраняет их активность вне G1 и, следовательно, объясняет регуляцию ими клеточного цикла. Благодаря этой информации понимание G1-специфического выбора клетками судеб оказывается в пределах видимости.
G1 Length and Cell Fate Decisions in Other Stem Cell Populations
Общая идея, что продолжительность G1 связана с состоянием самообновления, повторена исследованиями на нейральных стволовых клетках. Во время нейрогенеза вентрикулярной зоны, напр., длина G1 увеличивается с 3 ч до 13 ч и это окзывало соотв. влияние на общую длину клеточного цикла [37]. Укорочение продолжительности G1 за счет эктопического подъема активности CDK задерживает нейральную детерминацию, тогда как обратное также верно, когда активность CDK снижена [38]. Во время нейрогенеза длина G1, следовательно, контролирует баланс между самообновлением и дифференцировкой [39,40]. Пройдем по параллели между нервными стволовыми клетками и PSCs на одну ступень дальше, ранние нейрогенные гены, такие как Neurogenin 2 (NGN2), специфически экспрессируются в поздней G1 [41, 42]. Это напоминает результаты у PSCs, где гены развития и ассоциированные транскрипционные факторы преимущественно активируются в G1 фазе [2, 15]. Также общим с PSCs являются CDK4/cyclin D комплексы, также участвующие в G1-специфической детерминации судьбы нервных стволовых клеток [2, 39]. Это указывает на общий механизм, который связан с G чтобы клетки выбрали свою судьбу в разных популяциях стволовых клеток. Проводится исследование, характеризующее клеточные циклы др. стволовых клеток и клеток предшественников, таких как гематопоэтические и поджелудочные стволовые клетки и клетки предшественники [43-45], но пока неясно, действительно ли длина G1 связана с механизмами дифференцировки (see Outstanding Questions).
Concluding Remarks
Several examples have been used to explain how signaling pathways converge on the cell cycle machinery to regulate developmental genes and execute cell fate decisions. The lower part of (Figure 3, Key Figure) illustrates how different cell cycle-dependent mechanisms could serve to activate and restrict the activation of developmental genes to G1. The 'commitment window' (Figure 2,Figure 3) indicates the time when cells are responsive to extracellular signals that impact cell fate determination. The activity of transcription factors and chromatin-remodeling enzymes that target developmental genes would overlap with this period. Both of these seem to be important in PSCs and neural stem cells. A permissive chromatin state can be envisaged to persist from early G1 through to mitosis, the former of which is associated with chromosome decondensation and remodeling, and increased transcriptional activity [46]. G1 CDK2/4 activity starts in early-mid G1 phase and persists through G1 into early S phase. Although the details have yet to be determined, this implies that an inhibitory step could close the window of potential for developmental gene activation when cells enter S phase. This loss of potential also involves the inactivation of CDK activity. Clearly, all of these mechanisms must be tightly coordinated to ensure a robust mechanism for control of cell fate. This returns us to the question of why developmental decisions are mechanistically tied to a specific phase of the cell cycle. Once an understanding of all facets of regulation depicted in Figure 3 is obtained, we may be in a position to fully answer this question.
