Посещений: 
ФОРМИРОВАНИЕ ПАТТЕРНА СПИННОГО МОЗГА
Передача сигналов WNTLESS на WNT1/3A
|
|
Concentration-dependent effects of WNTLESS on WNT1/3A signaling Lisa M. Galli,
Linda A. Szabo, Lydia Li, Yin Min Htaik, Ouma Onguka and Laura W. Burrus
 Developmental Dynamics
Volume 243, Issue 9, pages 1095–1105, September 2014
|
WNTLESS (WLS) is a multi-transmembrane protein that transports Wnt ligands from the Golgi to the cell surface. Although WLS loss-of-function experiments in the developing central nervous system reveal phenotypes consistent with defects in WNT1 and WNT3A signaling, data from complementary gain-of-function experiments have not yet been reported. Here, we report the phenotypic consequences of WLS overexpression in cultured cells and in the developing chick spinal cord. Results: Overexpression of small amounts of WLS along with either WNT1 or WNT3A promotes the Wnt/β-catenin pathway in HEK293T cells, while overexpression of higher levels of WLS inhibits the Wnt/β-catenin pathway in these cells. Similarly, overexpressed WLS inhibits the Wnt/β-catenin pathway in the developing spinal cord, as assessed by cell proliferation and specification. These effects appear to be Wnt-specific as overexpression of WLS inhibits the expression of FZD10, a target of β-catenin-dependent transcription. Conclusions: Our results show that overexpression of WLS inhibits Wnt/β-catenin signaling in the spinal cord. As the activation of the Wnt/β-catenin pathway in the spinal cord requires WNT1 or WNT3A, our results are consistent with a model in which the relative concentration of WLS to Wnt regulates WNT1/3A signaling in the developing spinal cord. Developmental Dynamics 243:1095–1105, 2014. © 2014 Wiley Periodicals, Inc.
Подписи к рисункам
|
Необходимые отростки и формирование паттерна развивающегося спинного мозга контролируются по большей части с помощью морфогенов Wnt. По крайней мере, 8 членов семейства Wnt экспрессируются в развивающемся спинном мозге эмбрионов кур. На ст. Hamburger and Hamilton 19-21, WNT1/3A экспрессируются исключительно в дорсальной пластинке нервной трубки (Fokina and Frolova, 2006; Hamburger and Hamilton, 1951; Hollyday et al., 1995). Домен экспрессии WNT3 также включает дорсальную пластинку, распространяется чуть вентральнее (Robertson et al., 2004). WNT4 транскрипты обнаруживаются в дорсальной половине спинного мозга, исключая дорсальную пластинку нервной трубки, и в P3 клетках предшественниках (Agalliu et al., 2009; Hollyday et al., 1995). WNT5A/5B транскрипты обнаруживаются в вентральной пластинке нервной трубки, тогда как WNT7A/7B экспрессируются в вентрикулярном эпителии (Agalliu et al., 2009; Fokina and Frolova, 2006; Hollyday et al., 1995).
Wnts передают свои сигналы посредством, по крайней мере, трех взаимосвязанных путей (β -catenin-зависимого пути, пути планарной клеточной полярности и Ca2+ пути), которые иногда ингибируют один др. (Cadigan and Peifer, 2009; Chien et al., 2009; Clevers, 2006; Coombs et al., 2008; Macdonald et al., 2009; Minami et al., 2010; Axelrod, 2009; Kuhl et al., 2000, 2001; Bernard et al., 2008; Forrester et al., 2004; Green et al., 2008; Ishitani et al., 2003; Mikels and Nusse, 2006; Topol et al., 2003). Дорсо-вентральный градиент активности WNT1/3A контролирует пролиферацию и спецификацию дорсальных промежуточных нейронов посредством зависимого от β-catenin пути (Alvarez-Medina et al., 2008; Bonner et al., 2008; Chesnutt et al., 2004; Dickinson et al., 1994; Ikeya et al., 1997; Ille et al., 2007; Megason and Mcmahon, 2002; Muroyama et al., 2002; Takeda et al., 2000; Zechner et al., 2003). Пролиферативные эффекты WNT1 и WNT3A не могут быть воспроизведены с помощью WNT3, WNT4, WNT7A, WNT7B (Megason and Mcmahon, 2002). В соответствии с этим наблюдением, далее было показано, что WNT4 не использует зависимый от β-catenin путь в спинном мозге (Alvarez-Medina et al., 2008).
Хотя нижестоящие компоненты различных Wnt сигнальных каскадов были тщательно охарактеризованы, многие вопросы остались о вышестоящих компонентах, необходимых для процессинга, секреции и формирования градиентов Wnt в тканях мишенях. Современные данные подтверждают, что секреция и формирование градиента Wnt нуждаются в высоко специализированных пост-трансляционных модификациях, включая palmiteoylation и гликозилирование (Harterink and Korswagen, 2011; Komekado et al., 2007; Port and Basler, 2010; Smolich et al., 1993; Janda et al., 2012; Kurayoshi et al., 2007; Takada et al., 2006; Willert et al., 2003; Chen et al., 2009; Gao et al., 2011; Rios-Esteves and Resh, 2013). Пока мало известно о том, как модифицированные липидами морфогены, такие как Wnt, высвобождаются с клеточной поверхности и/или транспортируются в соседние клетки. К счастью, изучение вышестоящих регуляторов липидных модификаций Wnt предоставило молекулярный подход к механизмам секреции Wnt позвоночных.
WLS является вышестоящим регулятором секреции и формирования градиента Wnt, необходимым всем Wnts человека, чтобы передавать сигналы посредством зависимого и не зависимого от β -catenin пути (Proffitt and Virshup, 2012; Najdi et al., 2012). WLS, как полагают, облегчает транспортировку Wnt из Гольджи на клеточную поверхность посредством механизма, нуждающегося в PORCN-зависимой palmiteoylation по законсервированному сериновому остатку (Banziger et al., 2006; Bartscherer et al., 2006; Coombs et al., 2010; Goodman et al., 2006; Herr and Basler, 2012; Rios-Esteves and Resh, 2013; Takada et al.,2006). В некоторых случаях, WLS далее облегчает секрецию Wnt в экзосомы (Gross et al., 2012; Korkut et al., 2009).
Исследования потери функции на мышах выявили сходные роли в развитии для Wnt1, Wnt3A и Wls (Fu et al., 2009, 2011; Ikeya et al., 1997). Целенаправленные делеции WLS у мышей приводят к ранней эмбриональной гибели на стадии, когда в передаче сигналов Wnt впервые возникает потребность, подтверждая, что Wls необходим для всех передач сигналов Wnt (Liu et al., 1999; Fu et al., 2009). Фенотип мышей, несущих обусловленный нокаут Wls в клетках, экспрессирующих Wnt1, согласуется с ролью Wls в регуляции активности Wnt1 и Wnt3a (Fu et al., 2011). У Xenopus, XWls специфически необходим для секреции Wnt4 (Kim et al., 2009). Исследования по избыточности функции у Drosophila выявили новую роль Evi/Wls в транспортировке Wg/Wnt1 через синапсы (Korkut et al., 2009). Эффекты избыточной экспрессии WLS у амниот менее охарактеризованы.
В данном исследовании мы использовали эксперименты с избыточностью функции, чтобы исследовать клеточные и онтогенетические роли WLS в культивируемых клетках и в развивающемся спинном мозге эмбрионов кур. Избыточная экспрессия WLS в низких концентрациях способствовала передаче сигналов WNT1 и WNT3A в HEK293T клетках, тогда как высокие концентрации WLS ингибировали передачу сигналов WNT1 в этих клетках. Сходным образом, анализ пролиферации и формирования паттерна показал, что избыточная экспрессия WLS ингибирует β-catenin-зависимую передачу сигналов WNT1/3A в развивающемся спинном мозге.
Results and Discussion
Overexpression of WLS Promotes WNT1 and WNT3A Signaling Via the β-Catenin-Dependent Pathway in HEK293T Cells
Исследования потери функции показали, что WLS необходим для передачи сигналов Wnt/β-catenin в культивируемых клетках; но параллельно не проводились исследования избыточности функции (Banziger et al., 2006, Bartscherer et al., 2006). Совместная трансфекция WLS вместе или с WNT1 или WNT3A вызывала значительное увеличение сигнальной активности (Fig. 1; P <0.02 for both WNT1 and WNT3A), т.е. β-catenin-зависимому пути в HEK293T клетках.
WLS Expression in the Developing Spinal Cord Is Dynamic
Фенотип головного мозга у WLS обусловленных нокаутных мышей с Wnt1-Cre драйвером сильно напоминает таковой у двойных WNT1/3A нокаутных мышей (Fu et al., 2011; Ikeya et al., 1997). Мы сравнивали профиль экспрессии WLS в развивающемся спинном мозге эмбрионов кур с помощью гибридизации in situ с ранее описанными паттернами экспрессии WNT1 и WNT3A (Galli et al., 2014).
Полученные данные показали, что экспрессия WLS в спинном мозге почти повсеместна и очень динамична. Так что, скорее всего, низкие уровни WLS доступны для взаимодействия со всеми Wnts, экспрессируемыми в спинном, включая WNT1 и WNT3A.
На ст. HH 13 у эмбрионов WLS наиболее заметно экспрессируется в вентральной части спинного мозга передних секций (Fig. 2A-D). У эмбрионов на ст. 18 WLS транскрипты обнаруживаются по вентральной части всего спинного мозга на всех на всех уровнях оси, с наибольшей экспрессией в вентральной пластинке нервной трубки. WLS экспрессируется также в дорсальной части спинного мозга в более передних секциях, при этом наивысшие уровни экспрессии обнаруживаются в вентрикулярной зоне (Fig. 2E-I). У эмбрионов ст. 22 WLS транскрипты продолжают обнаруживаться в вентрикулярной зоне дорсальной части спинного мозга. Наиболее интенсивное окрашивание обнаруживается в вентральной пластинке, где экспрессируется WNT5A (Agalliu et al., 2009). Интересно, что наблюдается отсутствие экспрессии WLS на границе между дорсальной и вентральной частью спинного мозга на ст. 22 (Fig. 2J-N).
Эти данные согласуются с наблюдениями, что WLS широко экспрессируется в головном и спинном мозге лягушек, мышей и рыбок данио (Jin et al., 2010; Kim et al., 2009, Yu et al., 2010). Однако мы не выявили чёткого дорсо-вентрального градиента, наблюдаемого Yu с колл. (Yu et al., 2010). Мы установили, что экспрессия WLS регулируется во времени и пространстве в развивающемся спинном мозге эмбрионов кур (Fig. 2). Остается возможность, что уровни WLS булка существенно варьируют в ходе развития спинного мозга. s
WLS Overexpression Inhibits Proliferation in the Dorsal Spinal Cord
WNT1 и WNT3A управляют выростами (отростками) из спинного мозга посредством дорсо-вентрального градиента пролиферации (Megason and Mcmahon, 2002). Как и ожидалось электропортация только pCIG оказывала незначительный эффект на количества клеток (1= no effect; Fig. 3C). Неожиданно, избыточная экспрессия WLS вызвала 10.6 ± 1% снижение количества клеток в спинном мозге по сравнению с эмбрионами, которым электропортировали только pCIG (Fig. 3C; P <1x10-9).
Это снижение количества клеток может отражать или усиление апоптоза или снижение пролиферации. Оказалось, что избыточная экспрессия WLS вызывает снижение процента пролиферативных клеток в наиболее дорсальных частях с 3.9 ± 0.3% на контрольной стороне до 2.9 ± 0.3% на экспериментальной стороне (P <0.01), но влияние на пролиферацию недостоверно в др. 4-х quintiles (Fig. 4D). Следовательно, избыточная экспрессия WLS ингибирует передачу сигналов WNT1/3A, нарушая дорсо-вентральный градиент пролиферации за счет снижения пролиферации специфически в наиболее дорсальном quintile (Fig. 4D). Вполне возможно, что WLS может действовать, способствуя активности др. Wnt лигандов, которые передают сигналы посредством путей, которые противодействуют WNT1 и WNT3A, хотя было показано, что ни WNT3, WNT4, WNT7A, ни WNT7B не ингибируют пролиферацию при избыточной экспрессии в спинном мозге (Megason and Mcmahon, 2002). Т.о., наши данные в основном согласуются с моделью, согласно которой WLS ингибирует передачу сигналов WNT1 и WNT3A.
Интересно отметить, что избыточная экспрессия PORCN, др. вышестоящего регулятора секреции Wnt, обнаруживает противоположный эффект на Wnt градиент пролиферации (Galli et al., 2007). В частности, избыточная экспрессия PORCN вызывает увеличение пролиферации в двух наиболее дорсальных quintiles (Galli et al., 2007). Т.о., наблюдаемое ингибирование не просто неспецифический результат, связанный с экспрессией какого-либо мульти-трансмембранного белка в системе внутренних мембран.
WLS Overexpression Disrupts the Proper Specification of Neuronal Progenitors and Differentiated Subtypes in the Developing Spinal Cord
Множественные члены семейства Wnt, включая WNT1, WNT3A, WNT4, WNT5A, и WNT5B, участвуют в спецификации подтипов нейронов (Agalliu et al., 2009; Alvarez-Medina et al., 2008; Ikeya et al., 1997; Muroyama et al., 2002). Оценивали эффекты избыточной экспрессии WLS на спецификацию нейронов в развивающемся спинном мозге (Figs. 5E, 6E).
У кур избыточная экспрессия WNT1 и/или WNT3A способствует спецификации дорсальных предшественников за счет вентральных предшественников (Alvarez-Medina et al., 2008; Muroyama et al., 2002). В частности, избыточная экспрессия WNT1 и/или WNT3A вызывает экспансию Pax7 + дорсальных предшественников и уменьшение NKX2.2+ вентральных предшественников (Alvarez-Medina et al., 2008). На исследуемых здесь ст. развития, мы наблюдали лишь лёгкое снижение процента Pax7 + дорсальных предшественников благодаря избыточной экспрессии WLS (2.6%; Fig. 5A, B, E), хотя более крупное снижение наблюдалось у эмбрионов на ст. 18, спустя 24 ч после электропортации (data not shown). Это согласуется с сообщение, что маркеры нервных предшественников существенно уменьшаются спустя 24 ч после элекропортации активированного рецептора Activin, но возвращаются к нормальному уровню экспрессии спустя 40 ч после электропортации (Timmer et al., 2005). Мы также наблюдали 15.2% увеличение NKX2.2 + вентральных предшественников у эмбрионов после электропортации WLS (Fig. 5C, D, E; P?WNT1 и WNT3A ингибируются.
WNT1 и 3A также способствуют спецификации дорсальных промежуточных нейронов (DI2-DI4) за счет вентральных промежуточных нейронов (DI6-V1) и двигательных нейронов (MNs) (Alvarez-Medina et al., 2008). У эмбрионов электропортированных с помощью pCIG.WLS, соотношение между экспериментальной и контрольной стороной для DI3 и DI4 снижалось. Избыточная экспрессия WLS также вызывала небольшое статистически недостоверное увеличение моторных нейронов.
Эти наблюдения подтверждают модель, согласно которой WLS ингибирует активность WNT1/3A в развивающемся спинном мозге. Однако наблюдаемое уменьшение промежуточных нейронов DI6-V1 и отсутствие каких-либо изменений в промежуточных нейронах DI2 не согласуется с этой моделью. Это может отражать тот факт, что поскольку только WNT1/3A управляют пролиферацией в дорсальной части спинного мозга (Dickinson et al., 1994; Megason and Mcmahon, 2002), множественные Wnts экспрессируются в спинном мозге и также могут играть важную роль в формировании паттерна спинного мозга (Agalliu et al., 2009; Fokina and Frolova, 2006; Hollyday et al., 1995; Robertson et al., 2004). Кроме того, WNT1/3A скоординировано регулируют спецификацию клеток вместе с BMP в дорсальной части спинного мозга, а SHH в вентральной части спинного мозга (Chesnutt et al., 2004; Ulloa and Marti, 2010; Wilson and Stoeckli, 2012; Zechner et al., 2007). Возможно, что эти сложные взаимодействия осложняют фенотип.
WLS Overexpression Inhibits The Transcription of FZD10, a β-Catenin-Dependent Target Gene
Мы оценивали также эффект избыточной экспрессии WLS на экспрессию FZD10, нижестоящей мишени для WNT1 и WNT3A (Fig. 7). Предыдущие эксперименты в нашей лаб. показали, что домен экспрессии FZD10 в спинном мозге эмбрионов кур почти в точности перекрывает регион активности WNT1/3A (Galli et al., 2014). Экспрессия FZD10 в спинном мозге слегка расширялась после избыточной экспрессии WNT1 (Fig. 7A) или WNT3A (data not shown). Эмбрионы, которым электропортировали постоянно активную форму β -catenin, обнаруживали чёткую экспансию экспрессии FZD10 вдоль дорсо-вентральной оси (Fig. 7B), тогда как эмбрионы, которым электропортировали dnTCF, обнаруживали явственное снижение экспрессии FZD10 (Fig. 7C). Хотя это не устанавливает, что FZD10 является непосредственной мишенью β-catenin/TCF, наши результаты указывают на то, что экспрессия FZD10 чётко считывает данные передачи сигналов Wnt/β-catenin. В соответствии с идеей, что избыточная экспрессия WLS ингибирует передачу сигналов WNT1/3A, электропортация WLS вызывает снижение экспрессии FZD10 в спинном мозге (Fig. 7D). Т.о., наиболее подходящим механизмом, с помощью которого избыточная экспрессия WLS регулирует пролиферацию, является ингибирование передачи сигналов Wnt/β-catenin. Для исследований спецификации судеб клеток очень возможно, что избыточная экспрессия WLS ингибирует дополнительные Wnts, которые необходимы для собственно спецификации подтипов моторных нейронов. Хотя WNT4, WNT5A и WNT5B совместно контролируют спецификацию подтипов двигательных нейронов, они не регулируют общее количество двигательных нейронов (Agalliu et al., 2009). Тем не менее, мы не можем исключить возможность того, что WLS способствует передаче сигналов др. Wnts посредством альтернативных путей, которые противодействуют зависимой от β-catenin передаче сигналов Wnt (Bernard et al., 2008; Forrester et al.,2004; Green et al., 2008; Ishitani et al., 2003; Kuhl et al., 2001;, Mikels and Nusse, 2006; Topol et al., 2003). Напр., показано, что WLS преимущественно способствует секреции WNT4 (Kim et al., 2009) и что WNT4 не передает сигналы посредством β-catenin в спинном мозге эмбрионов кур (Alvarez-Medina et al., 2008). По этому сценарию увеличение передачи сигналов WNT4 посредством альтернативного пути д. противодействовать передаче сигналов, зависимой от β-catenin. Однако эта модель не согласуется с данными, показывающими, что избыточная экспрессия WNT4 не оказывает подавляющего эффекта на пролиферацию (Megason and Mcmahon, 2002) спецификацию дорсальных промежуточных нейронов (Alvarez-Medina et al., 2008).
The Relative Concentration of WLS to WNT1 Regulates Signaling Output
Мы наблюдали, что WLS способствует активности Wnt в культуре клеток, тогда как ингибирует её in vivo. Это явное различие между нашей культурой клеток и исследованиями in vivo связано с соотношением WLS к Wnt белку (Galli et al., 2007). Для тестирования этой гипотезы мы смешивали трансфицированные HEK293T клетки с L/SL клетками, чтобы использовать метод TopFlash Luciferase (Mikels and Nusse, 2006). Мы впервые показали, что 10 ng это самое небольшое количество конструкции для экспрессии WNT1, которое может быть трансфицировано в HEK293T клетки и всё ещё способное вызывать зависимую от β-catenin передачу сигналов при совместном культивировании с L/SL клетками (data not shown). Полученные данные показали, что поскольку WLS способствует активности WNT1 при низком соотношении в HEK293T клетках (Fig. 1), то увеличение соотношения WLS: WNT1 до 9.5 в самом деле будет ингибировать активность WNT1 (Fig. 8).
Итак эти данные подтверждают интересную возможность, что разные уровни экспрессии WLS будут врносить вклад, способствуя или подавляя передачу сигналов Wnt.
|