Клетки у взрослых высших организмов или детерминированы к выполнению высоко специализированных целей или располагаются в пулах стволовых клеток у взрослых с ограниченным потенциалом; хотя они обладают одной и той же генетической информацией, каждый тип клеток определяется по специализированному паттерну экспрессии генов. Во время развития предшественники этих клеток реализуют свои судьбы с помощью поэтапного процесса дифференцировки, который управляется с помощью многих входящих импульсов (позиции, передачи сигналов и т. д.) и сопровождается эпигенетическими мерами, подкрепляющими выбранное решение. Эти эпигенетические изменения формируют барьеры, гарантирующие, что спецификация типов клеток является улицей с односторонним движением. Такие эпигенетические модификации являются стабильными и наследуемыми с помощью митозов, что делает возможным правильный и направленный процесс дифференцировки и распространение клон-специфичных профилей транскрипции в течение многих клеточных делений.

Однако, эти эпигенетические барьеры также ставят главное препятствие половому воспроизведению, при котором подготовка к следующему поколению нуждается в перестройке эпигенома в базовое тотипотентное состояние. В частности, млекопитающие (где зародышевые клетки не предопределены при оплодотворении, а скорее возникают в поздней эмбриональной ткани), перестройка эпигенома имеет огромное значение (Hayashi et al. 2007; Strome and Lehmann 2007). Подготовка к половому воспроизведению - это трехступенчатый процесс, состоящий из (в хронологической последовательности) стирания соматических сигнатур в предшественниках зародышевых клеток (primordial germ cells [PGCs]) посредством всеобъемлющего процесса репрограммирования, становления пол-специфических и специфических для зародышевых клеток эпигенетических сигнатур и профилей транскрипции, это делает возможными чрезвычайно сложные и специализированные процессы мейотического созревания и оплодотворения и, наконец, удаление после оплодотворения этих сигнатур, чтобы запустить программу эмбрионального развития и начало нового жизненного цикла.

Хотя основные принципы эпигенетического репрограммирования у эмбрионов и в зародышевых клетках известны и изучаются многие годы, главные аспекты, включая динамику этих процессов, остаются загадочными. В последние годы, однако, два основных успеха позволили быстро продвинуться в этой области. Секвенирование следующего поколения сделало возможным эпигенетический анализ всего генома, предоставив беспрецедентную информацию о эпигенетических состояниях зародышевых клеток и ранних эмбрионов на многих стадиях (Borgel et al. 2010; Popp et al. 2010; Smallwood et al. 2011; Smith et al. 2012; Seisenberger et al. 2012;Hackett et al. 2013; Kobayashi et al. 2013). Более того, открыты ранее ускользающие энзиматические активности, инициирующие активное стирание метилирования ДНК в зародышевых клетках и эмбрионах (Ito et al. 2010; He et al. 2011; Inoue and Zhang 2011; Inoue et al. 2011).

В настоящее время наши знания об эпигенетическом репрограммировании пополняются головокружительными темпами.

The fifth base - 5-methylcytosine (5mC) and its functions

Метилирование пяти углеродов цитозина продуцирует 5mC, часто обозначаемый как "пятое основание" кода ДНК. Метилирование ДНК является обычным у эукариот от грибов до позвоночных, хотя его значение и функция у этих организмов сильно отличаются. Не обнаруживаемое у некоторых дрожжей, нематод и мух, метилирование ДНК является жизненно важным для развития млекопитающих и гомеостаза у взрослых. У них метилирование ДНК наиболее часто обнаруживается в контексте симметричных CpG context, и хотя происходит редкое non-CpG (CpH) метилирование, его функция остается неясной (Ramsahoye et al. 2000; Smallwood et al. 2011; Ziller et al. 2011). Первые глобальные метиломы показали, что метилирование CpG следует бимодальному распределению (Fig. 1A). В то время как "одиночные" CpGs обычно гиперметилированы (60%-90%, в зависимости от типа клеток), островки CpG (CGIs; регионы в 500- до 2000-оснований в длину с повышенной плотностью CpG ) остаются преимущественно гипометилированными (Deaton and Bird 2011). Принимая во внимание нестабильность 5mC из-за его склонности к деаминированию в тимидин, это бимодальное распределение может объяснить эволюционную недостаточную представленность CpGs в геноме млекопитающих вне CGIs и, напротив, их многочисленность внутри не метилированных CGIs (Weber et al. 2007; Cohen et al. 2011).

Figure 1. DNA methylation in the mammalian genome. (A) Genomic CpG distribution: CGIs are generally hypomethylated and found at promoters or intergenic regions (orphan CpG). Non-CGI CpGs are generally hypermethylated. (B) Three categories of gene promoters according to CpG density respond differently to methylation. (LCP) Low CpG density promoter; (ICP) intermediate CpG density promoter; (HCP) high CpG density promoter. (C) Retrotransposons are repressed by DNA methylation. Derepression can result in coactivation of neighboring genes. (D) Basal transcription of centromeric repeats interferes with chromosome alignment and is repressed by DNA methylation. (E) DNA methylation reinforces gene silencing on the inactivated X chromosome. Transcribed genes on the active X chromosome (and globally) display gene body methylation, possibly repressing spurious expression from cryptic transcription start sites or aiding RNA processing. (F) Genomic imprinting drives allele-specific gene expression. DNA methylation at imprinting control regions (ICRs) regulates binding of insulator proteins or expression of cis-acting, noncoding RNAs.

Role of DNA methylation in transcriptional control

Promoters

CGIs часто ассоциированы с промоторами генов, особенно связанных с генами развития и домашнего хозяйства, где они остаются гипометилированными даже, если локус транскрипционно неактивен (Weber et al. 2007; Meissner et al. 2008;Deaton and Bird 2011). Внутригенные или межгенные CGIs ведут себя подобно CGIs промоторов, пока их функция в геноме не понятна до конца (Fig. 1A). Гипометилированное состояние CGIs промоторов ассоциировано со связыванием транскрипционного фактора (которое предупреждает аппарат метилирования ДНК от нападения на эти регионы) (Brandeis et al. 1994; Lienert et al. 2011; Meissner 2011; Stadler et al. 2011), также как и с их специализированным состоянием histone 3 Lys4 триметилированием (H3K4me3)-heavy chromatin (Erfurth et al. 2008; Thomson et al. 2010; Smith and Meissner 2013).

Исторически метилирование ДНК было связано с репрессией транскрипции. Однако, детальный анализ CGI-ассоциированных промоторов и их эффекта на транскрипционную активность позволил классифицировать их на три категории, базируясь на содержании CpG и длине последовательности (Fig. 1B; Weber et al. 2007; Meissner et al. 2008). High CpG density promoters (HCPs) являются редко метилированной ДНК, которая подтверждает традиционное мнение, что метилирование ДНК репрессирует транскрипцию. Фактически, редкое метилирование HCPs приводит к эффективному замалчиванию гена. Сходным образом, intermediate CpG density promoters (ICPs) являются неактивными будучи метилированными (Meissner et al. 2008; Borgel et al. 2010). Однако, ICPs более часто приобретают зависимое от дифференцировки гиперметилирование; т.e., на промоторах генов плюрипотентности, где метилирование ДНК, как полагают, действует как предохранительный механизм для усиления молчания во время дифференцировки, также, как и на промоторах генов, специфичных для зародышевых клеток (Maatouk et al. 2006; Weber et al. 2007; Farthing et al. 2008; Meissner et al. 2008; Borgel et al. 2010). Напротив, low CpG density promoters (LCPs), которые обычно гиперметилированы, остаются транскрипционно активными независимо от их состояния метилирования (Weber et al. 2007; Meissner et al. 2008).

Enhancers

Транскрипционные энхансеры физически взаимодействуют с промоторами генов и поддерживают ткане-специфическую дифференцировку. Подобно промоторам, энхансеры обладают характерными паттернами метилирования ДНК (Stadler et al. 2011), а гипометилирование коррелирует с активной экспрессией генов (Carone et al. 2010; Sandovici et al. 2011). Удивительно, подобное метилирование энхансера, как было установлено, более тесно ассоциирует с изменениями экспрессии генов в раковых клетках, чем метилирование промоторов само по себе (Aran et al. 2013).

Role of DNA methylation in controlling specialized regions

Transposons

Метилирование ДНК законсервировано в ходе эволюции, чтобы репрессировать эндогенные мобильные элементы, которые представляют примерно 40% генома млекопитающих и тем самым вносят существенный вклад в общее состояние гиперметилирования генома (Lander et al. 2001; Mouse Genome Sequencing Consortium 2002). В частности, LINEs (long interspersed nuclear elements) и LTR (long terminal repeat)-элементы несут сильные, в общем гиперметилированнные промоторы (Fig. 1C). Потеря метилирования может вызывать массивную активацию транскрипции и потенциально ретротранспозицию (Walsh et al. 1998). Дерепрессия ретротранспозонов также связана с одновременной активацией соседних генов или химерных транскриптов, состоящих из ретротранспозиционных элементов и эндогенных генов (Peaston et al. 2004). В частности, в ооцитах и у двух-клеточных эмбрионов, эта косвенная обусловленная ретратранспозонами регуляция генов может быть критической для успешности развития (Peaston et al. 2004; Macfarlan et al. 2012).

Pericentromeric repeats

Эти элементы обнаруживают латентную транскрипционную активность, которая репрессируется с помощью метилирования ДНК, чтобы достичь соотв. расположения и сегрегации хромосом (Fig. 1D). Важность этой репрессии доказывается в редкими случаями синдрома immunodeficiency, centromeric instability, and facial anomaly (ICF), который вызывается миссенс мутацией в гене DNA метилтрасферазы DNMT3B. Продолжающаяся транскрипция перицентромерных повторов вызывает перестройки вблизи центромер, скорее всего, возникающие из-за неправильного расположения хромосом во время митозов (Okano et al. 1999; Xu et al. 1999; Bestor 2000; Chen and Li 2004; Jin et al. 2008; Gopalakrishnan et al. 2009).

X-chromosome inactivation

Метилирование ДНК обеспечивает контроль за дозой гена путем инактивации второй X хромосомы у самок (Fig. 1E). В случае инактивации X-хромосомы, метилирование ДНК является конечным результатом каскада событий, начинающихся с активации цис-действующей не кодирующей РНК, Xist, которая покрывает Х хромосому и тем самым запускает смещения транскрипционных факторов, изменения хроматина и в конечном итоге метилирование CpG в CGIs промоторов. Потеря метилирования, однако, оказывает лишь умеренные эффекты на инактивацию Х, подтверждая, что оно действует как долгосрочный страховщик скорее, чем инициатор инактивации Х. Исследования метилирования ДНК при инактивации Х привели к интересному наблюдению, что активные гены обладают более высокими уровнями метилирования тел генов, это д. указывать на репрессию транскрипции со скрытых промоторов или просто на более значительную доступность активно транскрибируемой ДНК для аппарата метилирования (Fig. 1E; Hellman and Chess 2007). Альтернативно, метилирование ДНК внутригенных регионов может коррелировать с процессингом РНК и альтернативным сплайсингом, при этом паттерны метилирования могут маркировать границы интрог-экзон (Hodges et al. 2009; Anastasiadou et al. 2011).

Imprinted genes

Метилирование ДНК является жизненно важным, чтобы контролировать экспрессию импринтируемых генов (Fig. 1F;Bartolomei 2009; Ferguson-Smith 2011). Характерная особенность импринтируемых генов является их зависимая от родительского происхождения экспрессия, которая координируется с помощью дифференциального метилирования ДНК (на отцовском или материнском аллеле) в imprinting control regions (ICRs). Метилирование ICR контролирует регион-специфические нижестоящие механизмы, такие как связывание инсуляторного белка или экспрессия анти-смысловых не кодирующих РНК. Это приводит к аллель-специфичной экспрессии кластеров генов, в которых гены или репрессированы, или активированы. Метилирование зависимой от родителя ДНК привносится во время дифференцировки гамет и поддерживается в течение всей жизни. Геномный импринтинг, следовательно, вызывает огромные осложнения эпигенетического репрограммирования в цикле жизни млекопитающих, т.к. их паттерны метилирования д. стираться в первую очередь в PGCs, восстанавливаться аллель-специфическим способом в гаметах и затем сохраняться во время эмбрионального репрограммирования. Паттерны геномного импринтинга играют существенную роль в развитии и росте, а нарушение их регуляции воздействует тяжело на эмбриональный фенотип и может быть основной причиной дефектов у мутантов, дефектных по метилированию.

The machinery

ДНК methylation

ДНК метилтрансферазы катализируют перенос метильной группы с S-adenosyl-l-methionine в пятую позицию цитозинового остатка в ДНК (Chen and Li 2004). Предпочтительное расположение 5mC в симметричном CpG контексте привело прежде всего к предположению о наследовании ДНК метилирования с помощью полуконсервативной репликации ДНК, которая подразумевает два самостоятельных способа метилирования ДНК: поддержание метилирования и de novo метилирование (Holliday and Pugh 1975; Riggs 1975).

Methylation maintenance

Необходимым реквизитом механизма поддержания является высокое сродство в отношении полуметилированных CpGs (т.e., метилирование палиндромных CpG только на одной нити). Первый эукариотический энзим с активностью ДНК метилтрансферазы (DNMT1) (Bestor 1988) обладает подобной предполагаемой функцией (Ruchirawat et al. 1987; Hitt et al. 1988; Yoder et al. 1997; Pradhan et al. 1999). Экспрессия Dnmt1 активируется с помощью зависимых от клеточного цикла транскрипционных факторов в S фазе и поэтому экспрессируется на высоком уровне в большинстве митотических клеток (Kishikawa et al. 2003). Привлекаемый с помощью своего proliferating cell nuclear antigen (PCNA)-взаимодействующего партнера по связыванию, NP95, DNMT1 располагается в фокусах репликации, где он восстанавливает полуметилированные CpGs до полного метилирования (Leonhardt et al. 1992; Arand et al. 2012). NP95 специфически привлекает DNMT1 на родительскую метилируемую нить, ориентируя энзим и его активность на вновь синтезированную нить (Bostick et al. 2007; Sharif et al. 2007).

У мышей локус Dnmt1 кодируется двумя функционально идентичными изоформами: соматической (Dnmt1s) и ооцит-специфичной (т.е. экспрессируемой только матерински) изоформой (Dnmt1o) (Rouleau et al. 1992; Gaudet et al. 1998; Mertineit et al. 1998; Ding and Chaillet 2002). Делеция Dnmt1 у мышей, летальная во время и после гаструляции, результат существенной, глобальной потери метилирования ДНК (Ruchirawat et al. 1987; Hitt et al. 1988; Lei et al. 1996; Yoder et al. 1997; Kurihara et al. 2008; Arand et al. 2012). Потеря NP95 вызывает сходные дефекты (Sharif et al. 2007).

De novo methylation

Делеция Dnmt1 в мышиных эмбриональных стволовых клетках (mESCs) вызывает драматическое гипометилирование ДНК, но не полную потерю, предсказывая присутствие дополнительных энзимов с метилтрансферазной активностью. Два дополнительных энзима, DNMT3A и DNMT3B, были идентифицированы и было показано, что действуют как de novo ДНК метилтрансферазы (Okano et al. 1998a). Dnmt3a продуцируется матерински и преобладает в ооцитах и ранних предимплантационных эмбрионах. DNMT3A обеспечивает паттерны дифференциального метилирования ДНК в ICRs в гаметах самцов и самок (Kaneda et al. 2004; Kato et al. 2007). Dnmt3b транскрибируется после zygotic gene activation (ZGA) и мощно экспрессируется на ст. бластоциста, в это время её присутствие примущественно ограничено клоном эпибласта (Watanabe et al. 2002). Делеция Dnmt3b вызывает эмбриональную летальность, тогда как нокауты Dnmt3a частично жизнеспособны (Okano et al. 1999). Комбинированная генетическая делеция приводит к ранней эмбриональной летальности, указывая, что, по крайней мере, частично существует функциональное перекрывание двух энзимов (Okano et al. 1999).

Третья de novo ДНК метилтрансфераза, DNMT3L, лишена характерного N-терминального каталитического домена, но нем не менее необходима для метилирования ДНК, устанавливая преимущественно метилирование ICR в гаметах (Bourc'his et al. 2001;Bourc'his and Bestor 2004). DNMT3L является критическим активирующим ко-фактором для DNMT3A/B, это объясняет её эффекты на метилирование, несмотря на отсутствие прирожденной каталитической активности (Chedin et al. 2002; Gowher et al. 2005; Jia et al. 2007). Dnmt3l нокаутные мыши жизнеспособны, но лишены de novo метилирования в зародышевой линии, что вызывает стерильность у самцов и эмбриональную летальность материнского происхождения нулевых эмбрионов (Bourc'his et al. 2001;Bourc'his and Bestor 2004).

Наконец, DNMT2 отличается структурно от ДНК метилтрансфераз, а нокаутные мыши не обнаруживают фенотипических отклонений (Okano et al. 1998b). На самом деле, DNMT2 является неправильным названием, т.к. она обнаруживает активность метилирования в отношении РНК (Goll et al. 2006).

ДНК demethylation

В противоположность энзиматически контролируемому механизму прямого метилирования, непосредственная ДНК деметилаза, способная разрушать углерод-углеродные мостики, пока не обнаружена. Вместо этого, предположено несколько альтернативных, активных механизмов деметилирования, которые пассивно и косвенно были продемонстрированы (Wu and Zhang 2014, 2010).

Passive, replication-dependent dilution

Потеря 5mC в митотических клетках может быть достигнуто с помощью подавления или исключения поддержки аппарата метилирования ДНК (DNMT1 или рекрутируемых ею факторов, таких как NP95) из ядра (Fig. 2A). Хотя это делает возможным глобальное деметилирование ДНК, пассивный механизм зависит от повторяющейся репликации ДНК и поэтому не может объяснить быструю потерю метилирования ДНК у медленно или не делящихся клеток. Более того, этот механизм не является локус-специфическим, а лишь глобальным удалением меток метилирования ДНК.

Figure 2. ДНК methylation and demethylation mechanisms. (A) The palindromic nature of the CpG ДНК replication creates hemimethylated ДНК. DNMT1 restores hemimethylated ДНК to full methylation. Absence of the DNMT1 machinery produces unmethylated ДНК after a subsequent round of cell division. (Black filled circles) Methylated CpG; (white filled circles) unmethylated CpG. (B) Possible active demethylation pathways: A direct demethylase converting 5mC to cytosine is, to date, speculative. TET enzymes oxidize 5mC to 5hmC, 5fC, and 5caC. Deamination of 5mC and 5hmC, potentially by AID, produces thymidine or hydroxymethyluracil, respectively. The base excision repair (BER) mechanism may target AID deamination products and possibly 5fC and 5caC directly. Direct deformylation or decarboxylation of 5fC and 5caC has been proposed but remains speculative.

Active demethylation

Косвенный, катализируемый энзимами механизм деметилирования может использовать деаминирование 5mC до тимидина с помощью activation-induced deaminase (AID) или apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide 1 (APOBEC1) (Fig. 2B). Деаминирование 5mC создает T:G несоответствия, распознаваемые с помощью thymine-ДНК glycosylase (TDG) или methyl-CpG-binding domain protein 4 (MBD4), которые катализируют удаление основания тимидина. Место, лишенное основания, затем запускает аппарат base pair excision repair (BER) , чтобы восстановить не модифицированный цитозин, эффективно приводя к удалению метильной метки (Fig. 2B; Morgan et al. 2004). Степень необходимости AID-запускаемого механизма деметилирования ДНК для репрограммирования в PGCs и у ранних эмбрионов всё ещё спорна рассматривается ниже.

The existence of a 'sixth base'

5-hydroxymethylcytosine (5hmC) и недавнее открытие семейства ten-eleven translocation (TET) диоксигеназ (Tahiliani et al. 2009) предполагает новые возможности активного деметилирования ДНК. TET энзимы катализируют повторяющееся окисление 5mC в 5hmC и далее в 5-formylcytosine (5fC) и 5-carboxycytosine (5caC) (Fig. 2B; He et al. 2011; Inoue et al. 2011; Ito et al. 2011). Все три производных обнаруживаются в клетках, обладающих TET активностью, пока их биологическое значение остается неясным. Принимая во внимание существование decarboxylating энзима на пути утилизации отходов метаболизма пиримидина, сходного энзима, неуловимого, кстати, может прямо восстанавливать цитозин из 5caC (Ito et al. 2010). Альтернативно, TDG, MBD4, или пока не выявленные гликозилазы могут удалять окисленные производные метил-цитозина, образуя при этом места без оснований, запускающих BER. Недавние наблюдения подтвердили, что TDG оказывает непосредственное воздействие на 5fC и 5caC без необходимости в предварительной ступени деаминирования (Fig. 2B; He et al. 2011; Shen et al. 2013).

5hmC может также быть целью пассивного деметилирования даже в присутствии DNMT1, которая сама по себе обладает низким сродством к 5hmC полуметилированной ДНК (Valinluck and Sowers 2007). Напротив, NP95 взаимодействует с 5mC и 5hmC. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить этот специфический механизм. Наблюдаемое дивергентное сродство большинства партнеров по взаимодействию с 5mC и 5hmC (Valinluck and Sowers 2007; Liu et al. 2012) может указывать на др. функции 5hmC; т.e., изменение локального окружения хроматина путем рекрутирования и/или смещения зависимого от метилирования и гидроксиметилирования связывания белков.

TET-катализируемое превращение 5mC в 5hmC является правдоподобным механизмом, позволяющим независимое от клеточного цикла удаление метилирования ДНК. У мышей семейство TET представлено тремя членами (Tet1-3), которые по-разному экспрессируются во время развития и во взрослых тканях (Tahiliani et al. 2009). Tet1 и Tet2 обнаруживаются в ESCs и PGCs. Экспрессия Tet2 важна для гематопоэтических клеток; нокауты жизнеспособны, но обнаруживают тяжелые, летальные гематопоэтические злокачественные опухоли в возрасте 4-6 мес. (Li et al. 2011;Moran-Crusio et al. 2011; Quivoron et al. 2011; Koh and Rao 2013). Tet1 нокаутные мыши жизнеспособны, обнаруживают несколько меньший размер тела, подтверждающий потенциальную задержку развития и самцы, и самки обнаруживают пониженную плодовитость (Dawlaty et al. 2011; Yamaguchi et al. 2012, 2014). Учитывая частичное перекрывание их паттернов экспрессии, предполагается определенная степень функционального перекрывания Tet1 и Tet2. Действительно, двойные нокаутные эмбрионы обнаруживают более выраженные онтогенетические дефекты, правда потеря Tet1 и Tet2 всё ещё может быть совместима с нормальным развитием (Dawlaty et al. 2013). Паттерн экспрессии Tet3 обнаруживает незначительное перекрывание с экспрессией Tet1/2 и, как было установлено, экспрессируется на высоком уровне в ооцитах, сперматозоидах и на ранних предимплантационных стадиях. Материнская потеря Tet3 может вызывать арест развития у ряда эмбрионов (Gu et al. 2011).

Epigenetic reprogramming in PGCs: the true blank slate

PGCs предопределяются или с помощью наследуемой зародышевой плазмы в ооцитах (мухи, нематоды, лягушки и рыбы) или происходят из соматических предшественников в эмбрионах за счет инструктивных сигналов (млекопитающие) (Fig. 3; Strome and Lehmann 2007; Saitou and Yamaji 2012). У мышей, небольшая группа PGCs возникает из проксимальной части эмбриональной эктодермы на день эмбриогенеза 6.5-7.5 (E6.5-E7.5) после получения инструктивных сигналов (самой ранней является передача сигналов BMP4) от висцеральной энтодермы и самой окружающей эмбриональной эктодермы (McLaren and Lawson 2005;Hayashi et al. 2007; Seki et al. 2007; Saitou and Yamaji 2012). Т.к. эпибласт быстро приобретает соматические эпигенетические признаки после имплантации, то уровни метилирования ДНК и паттерны эмбриональной эктодермы у E6.5 эмбрионов мыши очень тесно связаны с соматическими тканями, чем с внутренней клеточной массой бластоциста (Borgel et al. 2010; Popp et al. 2010). В частности, гены плюрипотентности (т.e., Oct4 и Nanog) и ассоциированные с CGI, специфичные для зародышевой линии гены, накрепко репрессируются с помощью метилирования ДНК, предупреждая любой вредный эффект, который мог бы возникнуть, если бы они были эктопически активированы (Maatouk et al. 2006; Shen et al. 2007; Weber et al. 2007;Straussman et al. 2009; Borgel et al. 2010; Arand et al. 2012; Seisenberger et al. 2012; ). Т.о., PGCs согласно этой точке зрения обладают профилями транскрипции, модификациями хроматина и уровнями метилирования ДНК и паттернами, характерными для их соматического источника (Ohinata et al. 2005; Maatouk et al. 2006; Hajkova et al. 2010; Popp et al. 2010; Seisenberger et al. 2012).

Figure 3. Biphasic demethylation dynamics in mouse PGCs. PGCs are derived from the embryonic ectoderm of the E6.5 embryo and display high (somatic) 5mC levels (green lines) and low 5hmC levels (red lines). Upon migration, PGCs proliferate, and 5mC levels are passively diluted. Coincidently, hemimethylated ДНК strands accumulate transiently and are subsequently lost (purple dashed line). Post-migratory PGCs enter a phase of active ДНК demethylation, resulting in an almost complete loss of 5mC and a transient enrichment of 5hmC. At E13.5, both 5mC and 5hmC levels are low.

Основной целью эпигенетического репрограммирования к тотипотентности, которое происходит у ранних PGCs, является закладка тщательно разработанных программ транскрипции, направляющих PGCs прочь от дифференцировки и форсирование интимно сцепленной повторной экспрессии ключевых маркеров плюрипотентности (rev. Hayashi et al. 2007; Saitou and Yamaji 2012). Во время этого процесса, PGCs пролиферируют и мигрируют из проксимальной части эпибласта вдоль задней кишки в генитальные гребни, где их геномы обнаруживают очень низкие уровни глобального метилирования ДНК (E12.5-E13.5) (Fig. 3; Popp et al. 2010;Guibert and Weber 2012; Seisenberger et al. 2012). Этот процесс репрограммирования также обращает и др. соматические эпигенетические признаки: родительские импринты стираются (Hajkova et al. 2002; Sasaki and Matsui 2008), и замалчиваемая Х хромосома реактивируется в PGCs самок эмбрионов мышей (Chuva de Sousa Lopes et al. 2008).

ДНК demethylation mechanisms in PGCs

Первоначально было предположено, что скорость пролиферации PGCs недостаточна, чтобы сделать возможной пассивное деметилирование (Fig. 2A), а все активные механизмы деметилирования ДНК (Fig. 2B) доступны и используются. Однако, надёжное, мощное, геномное удаление почти всех 5mCs с помощью активных способов, по-видимому, энергетически маловероятно и принимая во внимание участие необходимых разрывов двойной нити (if BER-mediated), очень рискованно. В самом деле, недавние исследования показали, что пассивное устранение метилирования может быть достаточно существенным для глобального деметилирования, являясь энергетически более подходящим, мощным механизмом. С помощью методов анализа генома, приложимым к небольшим количествам клеток, комбинированный, довольно последовательный и вообще контекст-зависимый процесс активного и пассивного деметилирования ДНК возникает (Fig. 3).

Passive ДНК demethylation in PGCs

Замалчивание ключевых генов аппарата метилирования ДНК в PGCs д. облегчать пассивное деметилирование ДНК. На ст. E9.5, de novo метилтрансферазы (Dnmt3a/b) репрессированы и остаются фактически отсутствующими в ходе всего периода репрограммирования (Seki et al. 2005; Yabuta et al. 2006; Kurimoto et al. 2008;Seisenberger et al. 2012; Kagiwada et al. 2013). Кроме того, хотя метилтрансфераза Dnmt1 продолжает экспрессироваться и белок обнаруживается в большом количестве, её важный ко-фактор, Np95, репрессирован на ст. E9.5, и белок NP95 исключен из ядра (Kurimoto et al. 2008; Seisenberger et al. 2012;Kagiwada et al. 2013). Соотв., DNMT1 окрашивание сильно снижено в фокусах репликации в S-фазе, подтверждая слабое поддержание метилирования в PGCs. Только после ст. E12.5 уровни белка NP95 слегка увеличиваются и медленно восстанавливается локализация DNMT1 в фокусах репликации (Kagiwada et al. 2013).

Большинство PGCs арестовано в фазе G2 клеточного цикла, в то время как они мигрируют в направлении задней кишки (E7.5-E8.5), но быстро наступает пролиферация на ст. E9.5 (Fig. 3; Seki et al. 2007). В противоположность ранним данным, подтверждающим 16-ч клеточный цикл в PGCs (Tam and Snow 1981) недавние эксперименты с пульс-чейз BrdU описали более быструю (~12 ч на цикл), экспоненциальную пролиферацию вплоть до ст. E12.5, это существенно повышает шансы пассивного деметилирования (Kagiwada et al. 2013). Такое зависимое от репликации ДНК деметилирование создает гипометилированные нити ДНК (Fig. 2A), которые, в самом деле, могут управляться с помощью hairpin bisulfite sequencing (Arand et al. 2012), при этом его показатель увеличивается в E9.5-10.5 PGCs (Fig. 3, pink dashed line;Seisenberger et al. 2012).

Bisulfite conversion (BSC) и секвенирование происходящей из PGC ДНК выявили, что деметилирование, в самом деле, влияет на весть геном, включая промоторы, CGIs, интроны, экзоны и межгенные регионы. Однако, ряд событий, включая импринтируемые гены, промоторы генов, необходимых для формирования зародышевых клеток и мейоза, и CGIs из неактивной Х хромосомы самок, по-видимому, следуют более медленной кинетике и становятся полностью гипометилированными только после второй волны деметилирования (Fig. 3; Seisenberger et al. 2012). Наблюдаемое позднее репрограммирование differentially methylated regions (DMRs) в PGCs находится в согласии с некоторыми исследованиями, показавшими стирание импринтов после E11.5, когда PGCs проникают в гонады (Hajkova et al. 2002; Guibert and Weber 2012), пока находится в противоречии с др. исследованиями, показавшими ранее деметилирование DMR с кинетиками, параллельными глобальному деметилированию (Lee et al. 2002; Kagiwada et al. 2013).

Active ДНК demethylation in PGCs

Двухфазный процесс деметилирования в PGCs (Guibert and Weber 2012;Seisenberger et al. 2012; Hackett et al. 2013; Yamaguchi et al. 2013) ставит вопрос, какие молекулярные механизмы участвуют в этом разграничении. Существует, скорее всего, специфические последовательности, защищенные от пассивного деметилирования в ранних PGCs, но затем деметилируются пассивно, активно или комбинированно на более поздних стадиях. Преобладание экспрессии и присутствие в ядре DNMT1, но снижение и исключение из ядра NP95, могут указывать на неканонических механизм поддержания метилирования ДНК, возможно параллельный защите от метилирования импринтируемых генных локусов у ранних эмбрионов (see below).

Ранние предположения о более быстрой кинетике пролиферации PGC привели к интенсивным исследованиям механизмов активного деметилирования ДНК в этих клетках (Hajkova et al. 2008, 2010; Feng et al. 2010; Popp et al. 2010; Wu and Zhang 2010; Cortellino et al. 2011; Dawlaty et al. 2011, 2013; Yamaguchi et al. 2012, 2013, 2014;Hackett et al. 2013; Vincent et al. 2013). AID экспрессируется в E12.5 PGCs (Morgan et al. 2004) и связан с активным деметилированием ДНК. Aid-дефицитные E13.5 PGCs обнаруживают очень умеренное увеличение уровней метилирования ДНК по сравнению с их аналогами дикого типа; , однако, они также безусловно подвергаются глобальному деметилированию ДНК между E8.5 и E13.5 (Popp et al. 2010). Генеральный процесс деметилирования в PGCs является т.о., или AID-независимым или компенсируется за счет др. деаминаз, возможно белков APOBEC. Однако, потеря или APOBEC1, APOBEC2/3 или AID не сказывается тяжело на плодовитости (Muramatsu et al. 2000; Mikl et al. 2005; Popp et al. 2010). Влияние AID на 5mC также значительно меньше, чем на не метилированный цитозин in vitro (Neuberger and Rada 2007), а экспрессия Aid и Apobec1, по-видимому, очень низкая или отсутствует в течение всего периода репрограммирования PGC (Kagiwada et al. 2013), возникает вопрос, действительно ли и до какой степени AID и/или др. деаминазы участвуют в репрограммировании PGC. Локус-специфическое повторное исследование Aid-дефицитных PGCs, особенно импринтируемых локусов с использованием утонченных методов анализа д. устранить подобные неопределенности.

Судя по уровням экспрессии мРНК, Tdg экспрессируется в PGCs (Kagiwada et al. 2013). Однако, белок не был обнаружен с помощью иммунофлюоресценции (IF) (E10.5-13.5) (Hajkova 2010). Биаллельное метилирование импринтируемого региона Igf2r может быть обнаружено в Tdg мутантных PGCs, подтверждая, что активность TDG, по крайней мере, необходима для поддержания не метилируемого аллеля в этом локусе. Однако, скорее всего, что гиперметилирование происходит до спецификации PGC, поскольку de novo метилирование ДНК репрессировано в PGCs (Cortellino et al. 2011). Компоненты пути BER также были обнаружены в PGCs (Hajkova et al. 2002), вообще-то как доказательство репарации ДНК после активности AID/TDG или даже TET.

Учитывая сомнительность экспрессии Aid, но продолжающуюся экспрессию Tet энзимов и Tdg, последовательное окисление 5mC в 5fC или 5caC, которые могут быть непосредственными мишенями TDG, по-видимому, наиболее вероятный сценарий механизма активного деметилирования в PGCs. Предварительные усилия оказались неспособны выявить коренные изменения уровней 5fC/5caC в течение всего периода репрограммирования с помощью IF (Hackett et al. 2013;Yamaguchi et al. 2013).

Два недавних исследования были адресованы распределению и динамике 5hmC в PGCs, увеличивая сложность нашего понимания процесса деметилирования (Hackett et al. 2013; Yamaguchi et al. 2013). Эти находки показали временное увеличение 5hmC в E9.5/E10.5 PGCs, сопровождаемое снижением уровней 5mCи затем снижением уровней 5hmC на ст. E11.5/E12.5 (Fig. 3, red and green lines). Комбинированный нокдаун Tet1 и Tet2 выявил слегка повышенные уровни 5mC in vitro, генерируемые PGC-подобными клетками, хотя in vitro спецификация самих PGC оказывалась незатронутой (Hackett et al. 2013).

Детальный анализ Tet1 нокаутной линии мышей выявил уменьшение зародышевых клетках самок и размера яичников. Этот фенотип, скорее всего, является следствием снижения экспрессии генов, ответственных за мейоз, которые сохраняют необычно высокие уровни метилирования промоторов у мутантных гамет (Yamaguchi et al. 2012). Недавно, была также обнаружена потребность в TET1 для эффективного стирания импринтов в отцовской зародышевой линии (Yamaguchi et al. 2014). Однако, низкая пенетрантность фенотипа указывает на перекрываемость функции и частичное восстановление фенотипа с помощью TET2. С двойным Tet1/2 нокаутом PGCs полностью лишены 5hmC (определено с помощью IF). Интересно, что глобальные уровни 5mC не повышены в этих клетках (также определяемых с помощью IF), а потеря TET1/2 может быть совместима с развитием, при этом мутантные самцы и самки сохраняют фертильность (Dawlaty et al. 2013). Однако, большинство Tet1/2-нулевых мутантов погибает во время эмбриогенеза или вскоре после рождения из-за различных и варьирующих аномалий развития (Dawlaty et al. 2013). Важно, что потомство Tet1/2-нулевых самцов и самок обнаруживает гиперметилирование по некоторым импринтируемым генам, подтверждая роль удаления 5hmC импринтов в PGCs, возможно во время второй волны деметилирования (Fig. 3). Однако, эти дефекты вариабельны и даже в отсутствие TET1/2, обычное стирание импринтов может происходить у части потомства (Dawlaty et al. 2013), скорее всего, за счет пассивных способов (Lee et al. 2002; Kagiwada et al. 2013). Предостережением для таких исследований является то, что они осуществляются на смешанных генетических фонах, что само по себе может объяснить наблюдаемую фенотипическую вариабельность (Dawlaty et al. 2013).

Germ cell specialization and sex-specific remethylation

Пол-специфическая дифференцировка эмбрионов мышей предопределена со ст. E12.5 и далее (McLaren 1984; Saitou and Yamaji 2012). Становление специфических для зародышевых клеток меток метилирования после репрограммирования PGC происходит в разное время и в разном клеточном окружении у самцов и самок, приводя в конечном итоге к паттернам, специфичным для спермиев и ооцитов (Sasaki and Matsui 2008; Saitou and Yamaji 2012). В зародышевых клетках самок уровни метилирования ДНК остаются низкими на ст. E16.5. Напротив, в то же самое время, PGCs самцов уже достигают 50% глобального метилирования ДНК, поскольку повторное метилирование начинается самое раннее на ст. E14.5 в будущих сперматогониях, которые оказываются арестованными в G1 фазе митоза (Kota and Feil 2010). Паттерны метилирования в зародышевых клетках самцов полностью сформированы к рождению (день 19-21) и затем поддерживаются в ходе множества циклов митотических делений до вступления клеток в мейоз (Davis et al. 2000; Henckel et al. 2009). Шансы накопления ошибок метилирования ДНК и распространение мутаций, возникающих в результате спонтанного деаминирования 5hmC во время этого продолжительного периода репликаций и клеточных делений значительно выше у самцов, чем у самок. У самок возобновление метилирования гамет начинается только при рождении во время фазы роста ооцита, тогда как яйца арестовываются в профазе мейоза I (Kota and Feil 2010).

Несмотря на дивергентное развитие и динамику реметилирования, DNMT3L и DNMT3A необходимы для становления пол-специфических импринтов (Bourc'his et al. 2001;Hata et al. 2002; Bourc'his and Bestor 2004; Kaneda et al. 2004; Kato et al. 2007). Потеря DNMT3A или DNMT3L у самоцов вызывает катастрофический мейотический арест сперматогоний, активацию IAPs и LINE элементов и апоптическую потерю сперматоцитов (Walsh et al. 1998; Bourc'his and Bestor 2004). С др. стороны, ооциты с нарушениями de novo метилирования могут давать эмбрионов, погибающих на ст. E10.5 из-за отсутствия контроля импринтинга (Bourc'his et al. 2001).

Хотя идентифицированы центральные игроки метилирования ICR в дифференцирующихся зародышевых клетках, всё ещё неясно, как они находят импринтируемые регионы. Несколько предположений, такие как специфичность последовательностей, подлежащая структура хроматина и гистоновые модификации или traversing транскрипция, были выдвинуты и проанализированы (Smallwood and Kelsey 2012;Strogantsev and Ferguson-Smith 2012; Kelsey and Feil 2013). Недавние усилия по расшифровке ооцит-специфического, спермий-специфического и специфического для ранних эмбрионов метиломов, однако, пролили иной свет на специфичные для импринтинга механизмы целенаправленного нахождения метилирования ДНК (Smallwood et al. 2011). Помимо ICRs в материнской зародышевой линии, которые структурно являются CGIs, более тысячи не импринтированных CGIs также оказываются дифференциально метилированными в ооцитах по сравнению со спермиями (see below), менее 15% из них действительно сохраняют свои (дифференциальные) паттерны метилирования ДНК, включая все матерински импринтированные регионы (Smallwood et al. 2011). Поэтому новая концепция предполагает, что матерински метилированные CGIs не являются результатом подлежащих последовательностей, а скорее возникают в результате гистоновых модификаций, определяемых активной транскрипцией, и делающих возможным доступ к метилированию de novo (Kelsey and Feil 2013).

Epigenetic reprogramming in preimplantation embryos: selective ДНК methylation maintenance

Вторая волна глобального эпигенетического репрограммирования происходит во время раннего эмбриогенеза и является критической для становления плюрипотентности. Вновь формируемый эмбрион подвергается глобальному массивному деметилированию ДНК, когда достигается стадия раннего бластоциста (32-64 клеток) уровни метилирования оказываются наинизшими (Fig. 4A). Однако, процесс у эмбрионов отличается от такового в PGCs. Во-первых, деметилирование является близким к абсолютному в PGCs, за исключением немногих устойчивых ретроэлементов, поскольку метилирование ДНК регионов импринтируемых генов сохраняется у эмбрионов, делая возможной экспрессию специфичных для родительского происхождения генов позднее в тканях. Также импринтированная инактивация отцовской X, обнаруживаемая у ранних мышиных эмбрионов, не подвергается реверсии вплоть до поздней стадии эпибласта. Во-вторых, геном зиготы (который содержит гаплоидные вклады из геномов ооцита и спермия, каждый со своими собственными специфическими свойствами хроматина) следует разным кинетикам деметилирования ДНК после оплодотворения (Fig. 4A; Mayer et al. 2000; Oswald et al. 2000; Santos et al. 2002;Santos and Dean 2004).

Figure 4. ДНК demethylation dynamics and imprinting maintenance in preimplantation embryos. (A) Distinct characteristics of maternal and paternal genomes impose an epigenetic asymmetry in the zygote. The maternal genome (red pronucleus; red line) undergoes passive ДНК demethylation throughout several rounds of ДНК replication. The paternal genome (blue pronucleus; blue lines) undergoes active demethylation before ДНК replication in the zygote ensues. Concomitant with global loss of paternal 5mC, 5hmC (blue dotted line) and the further oxidation derivatives (5fC and 5caC; blue dashed line) are enriched. Although selected loci are restored to unmodified cytosines, the bulk of paternal 5hmC is passively diluted, paralleling demethylation of the maternal genome. (B) In the zygote, STELLA prevents TET3-dependent oxidation of 5mC through binding to H3K9me2-marked chromatin (maternal genome and paternally imprinted regions) and subsequent active restoration of cytosine by BER (or other pathways). (C) Throughout early cleavage stages, DNMT1 is largely excluded from the nucleus and requires noncanonical targeting to imprinted regions by the ZFP57/TRIM28 complex binding to its methylated consensus sequence found at most ICRs. Nonimprinted regions are efficiently demethylated through replication, while ICRs are maintained by DNMT1 and DNMT3A/B. (D) At later stages of embryogenesis and in adult tissues, high DNMT1/NP95 levels during replication maintain ДНК methylation by targeting hemimethylated ДНК in a canonical fashion.

Active ДНК demethylation of the paternal genome

Геном зрелого спермия обнаруживает 80%-90% метилирования всех CpG, уровень наивысшего глобального метилирования ДНК из всех клеток мыши (Popp et al. 2010), всё же отцовский геном кажется полностью деметилированным вскоре после формирования зиготы (Fig. 4A, blue line; Mayer et al. 2000; Oswald et al. 2000). Эта потеря д. быть обусловлена механизмом деметилирования, т.к. это завершается до начала репликации ДНК на pronuclear stage 3 (PN3). Напротив, материнский геном обнаруживает низкие уровни глобального метилирования (~40%) и подвергается зависимому от репликации деметилированию (Fig. 4A, red line), тем самым устанавливается существенная эпигенетическая асимметрия у ранних эмбрионов (Fig. 4; Mayer et al. 2000; Oswald et al. 2000; Santos et al. 2002).

Противоречивые наблюдения сделаны с помощью анализа IF в зиготах, а секвенирование ДНК после BSC задает загадку относительно деметилирования ДНК и репрограммирования. Поскольку потеря 5mC в отцовском пронуклеусе доказывается с помощью IF, BSC анализ не подкрепляет целиком это наблюдение (Hajkova et al. 2008; Wossidlo et al. 2010). Только после описания 5hmC, продукта окисления 5mC с помощью энзима TET, получено объяснение (Gu et al. 2011; Iqbal et al. 2011; Wossidlo et al. 2011). BSC не может различать между 5mC и 5hmC, тогда как окисление 5mC удаляет эпитоп, распознаваемый с помощью IF.

Действительно, TET3 специфически локализуется в отцовском пронуклеусе (Gu et al. 2011), где он, как было установлено, отвечает за превращение 5mC в 5hmC (Fig. 4A, dotted blue line). В его отсутствие 5hmC необнаружим (Gu et al. 2011; Wossidlo et al. 2011), т.о. исключается функциональное перекрывание с др. TET белками в зиготе. Отсутствие TET3 может приводить к задержке активации отцовских аллелей генов, необходимых для эмбрионального развития и становления плюрипотентного эпибласта (напр., Nanog и Oct4), потенциально вызывая снижение плодовитости и частичное нарушение развития материнских TET3-нулевых потомков (Gu et al. 2011).

The fate of paternal 5hmC

Большое количество 5mCs в отцовском геноме гидроксилируется в поздней зиготе, но только немногие регионы были обнаружены полностью обращенными к не модифицированному цитозину до первого деления дробления. Активность BER может объяснить эту потерю 5mC и гипометилирование промоторов Nanog и Oct4 (Gu et al. 2011). Некоторые компоненты пути BER специфически располагаются в отцовском пронуклеусе; так, XRCC1 (X-ray repair cross-complementing protein 1) тесно связан с отцовской, но не материнской ДНК (Hajkova et al. 2010; Wossidlo et al. 2010). Одновременно с 5hmC присутствуют в зиготе продукты сильного окисления 5mC (5fC и 5caC), которые могут быть непосредственными мишенями для пути TDG/BER (He et al. 2011; Maiti and Drohat 2011),(Fig. 4A, dotted/dashed blue lines; Inoue et al. 2011). Однако, пути деметилирования нуждаются в дальнейшем исследовании, поскольку TDG не обнаруживается у зигот (Hajkova 2010). Определенно, др. энзимы со сходной активностью могут осуществлять гликозилирование. Альтернативно прямое декарбоксилирование 5caC было описано в др. системах (Schiesser et al. 2012).

Однако, имеются неотразимые доказательства, что отцовские 5mC активно превращаются в 5hmC (и возможно далее в 5fC и 5caC), которые затем подвергаются зависимому от репликации разбавлению вследствие клеточных делений (Fig. 4A, dotted/dashed blue lines; Inoue and Zhang 2011; Inoue et al. 2011). Соответственно поддержание метилтрансферазы DNMT1 обнаруживает очень ограниченное сродство к окисленным производным 5mC (Hashimoto et al. 2012) и обычно исключается из ядер предимплантационных эмбрионов (Howell et al. 2001; Hirasawa et al. 2008).

Distinction of parental pronuclei

Как TET3 воздействует на отцовский геном, не затрагивая материнского? До описания динамики 5hmC в зиготе, белок STELLA (Payer et al. 2003), как было установлено, наделяет специфичностью и затем неуловимо активирует аппарат деметилирования у ранних зигот (Fig. 4B; Nakamura et al. 2006). В его отсутствие, наблюдается потеря 5mC в обоих пронуклеусах, сопровождаемая накоплением 5hmC в материнском пронуклеусе (Wossidlo et al. 2011). Т.о., дивергентная динамика деметилирования в материнском и отцовском геноме зиготы является следствием специфической защиты материнского генома от TET3-обеспечиваемого окисления 5mC с помощью STELLA. Хотя STELLA, по-видимому, располагается в обоих пронуклеусах зиготы, его связь с отцовским геномом слабая (Nakamura et al. 2012). Защитная функция специфически обеспечивается взаимодействием STELLA's с хроматином, с Lys9-маркированным диметилированным гистоном H3 (H3K9me2), которым обогащен материнский, но не отцовский пронуклеус (Santos et al. 2005). Это взаимодействие STELLA и H3K9me2 нуклеосом изменяет конфигурацию хроматина, предотвращая связывание и активность TET3 (Nakamura et al. 2012). Помимо своей глобальной функции в материнском геноме, STELLA также защищает, по крайней мере, два отцовски метилированных импринтированных генных локуса (Rasgrf1 и H19, но не IG-DMR) от аберрантного деметилирования (Nakamura et al. 2006). Эти локусы сохраняют H3K9me2-меченный хроматин во время сперматогенеза и замену на протамины, что обеспечивает их защиту после оплодотворения (Nakamura et al. 2012). Однако, не все отцовски и матерински импринтированные регионы затрагиваются равным образом и возможны др. механизмы (описываются ниже), действующие частично перекрываясь со STELLA (Messerschmidt 2012). Удивительно, в отсутствие STELLA, потеря метилирования ДНК в импринтируемых генных локусах в зиготе заканчивается (Nakamura et al. 2006). Т.о.,, по крайней мере, регионы импринтируемых генов подвергаются активному удалению 5hmC или быстро повторяющимся окислениям в 5caC с помощью TET3 (Wu and Zhang 2010). Интересно, что BER компонент XRCC1, который обычно локализуется исключительно на отцовском геноме, обнаруживается в обоих пронуклеусах у мутантов STELLA (Hajkova 2010).

Эмбрионы, лишенные STELLA, обладают несколькими фенотипами, редко возникающими после стадии 4-х клеток, при этом лишь немногие эмбрионы доживают до рождения. Удивительно STELLA-дефицитные ооциты не обнаруживают дефектов ни метилирования, ни развития до оплодотворения (Nakamura et al. 2006). Это особенно интересно, поскольку TET3 присутствует в ооцитах, но затрагивает только (в отсутствие STELLA) материнский геном после оплодотворения в условиях зиготы (Nakamura et al. 2006; Gu et al. 2011). Взаимодействие этих двух антагонистических факторов д. быть исследовано более детально, чтобы определить, действительно ли TET3 в основном не способен действовать на материнский геном или он д. быть молекулярно нацелен на свой отцовский субстрат.

Is active ДНК demethylation of the paternal genome required?

Бесспорно, что глобальное деметилирование у ранних эмбрионов мыши необходимо, чтобы придать открытое, тотипотентное или плюрипотентное состояние формирующемуся эпибласту. Однако, неясно, почему только отцовский геном подвергается активному деметилированию или действительно активное деметилирование необходимо всем. Хотя TET3-обеспечиваемое деметилирование промоторов Nanog и Oct4 оказалось сцепленным с жизнеспособностью эмбрионов, потеря TET3 тем не менее совместима с нормальным развитием (Gu et al. 2011). Фактически, эмбрионы, происходящие из ооцитов, которым ввели округлые сперматиды (содержащие связанную с гистонами отцовскую ДНК, которая не деметилируется активно в зиготе), могут развиваться в жизнеспособное потомство (Polanski et al. 2008). У др. видов млекопитающих активное деметилирование отцовского генома сопровождается непосредственно de novo повторным метилированием до того, как произойдет параллельное пассивное деметилирование материнского и отцовского геномов (Fulka et al. 2004; Park et al. 2007; Abdalla et al. 2009). Т.о., поскольку активное деметилирование отцовского генома является выгодным, то может быть оно просто предоставляет дополнительное измерение, чтобы гарантировать эффективность репрограммирования. Др. гипотеза заключается в том, что ооцит запрограммирован к удалению отличающихся отцовских эпигенетических признаков, это может обеспечивать онтогенетические преимущества любому индивидуальному эмбриону. Это "в интересах матери" распределить ресурсы поровну среди её потомков, требующее удаления любой уникальной отцовской эпигенетической метки, которая бы давала бы преимущества определенному эмбриону (Moore and Haig 1991). Более детальные исследования, адресованные 5hmC и локус-специфическому деметилированию в округлых сперамтидах, связанные с разрешением динамики 5mC и продуктов его окисления, необходимы для углубления нашего понимания этих процессов.

Passive ДНК demethylation and maintenance of parental imprints

Материнский геном является, по крайней мере, глобально устойчивым к гидроксилированию с помощью TET3, но несмотря на это происходит потеря большой массы специфичного для ооцитов паттерна метилирования ДНК за счет обусловленного репликациями разбавления 5mC во время предимплантационного развития (Fig. 4A, red line). Здесь, пассивная потеря 5mC достигается с помощью исключения из ядра DNMT1 (Howell et al. 2001; Ratnam et al. 2002; Branco et al. 2008; Hirasawa et al. 2008) скорее, чем подавления NP95, как это предполагается для PGCs (Kagiwada et al. 2013).

Исключение из ядра DNMT1, однако, ставит проблему для необходимого поддержания геномных импринтов и др. последовательностей, которые могут сохранять свои паттерны метилирования ДНК в ходе развития. Хотя зиготическая делеция DNMT1, как известно, вызывает массивную потерю метилирования ДНК как глобальных, так и импринтированных генетических локусов и приводит к гибели эмбрионов (Li et al. 1992, 1993), роль DNMT1 у ранних предимплантационных эмбрионов была установлена лишь недавно. Специфичная для ооцитов форма DNMT1 (DNMT1o), как было установлено, необходима для поддержания импринтов только во время одного клеточного цикла на стадии 8 клеток, при этом DNMT1o обнаруживается временно транслоцированной в ядро (Carlson et al. 1992; Howell et al. 2001; Ratnam et al. 2002). Поскольку соматическая форма DNMT1 (DNMT1s) не обнаруживается вплоть до ст. бластоциста, поддержание импринтов во время ранних делений дробления приписывается не идентифицированным ДНК метилтрансферазам. Повторные проверки экспрессии и функции DNMT3A, DNMT3B и DNMT1o/s, наконец, разрешили вопрос с помощью прежде всего исключения de novo ДНК метилтрансфераз от общего поддержания импринтинга у эмбрионов (Hirasawa et al. 2008). Полный (материнский и зиготический) нокаут DNMT1, однако, полностью устраняет метилирование ДНК на всех импринтируемых генных локусах (Cirio et al. 2008; Hirasawa et al. 2008; Kurihara et al. 2008). Т.о., DNMT1o и DNMT1s вносят вклад в поддержание метилирования ДНК импринтируемых регионов даже когда огромное количество белка исключено из ядра (Branco et al. 2008).

Noncanonical targeting of DNMT1 to imprinted regions in preimplantation embryos

DNMT1 необходим для поддержания импринтов, хотя в то же самое время уровни его белка в ядре сильно редуцированы, что делает возможной глобальное деметилирование. Как DNMT1 нацеливается на импринтируемые генные локусы? STELLA необходим для поддержания импринтинга. Однако, глобальное связывание STELLA's с и защита всего материнского генома от активного деметилирования делает его маловероятным кандидатом на роль поддержания метилирования ДНК в специфических локусах. ZFP57, Krueppel-associated box (KRAB) доменовый белок с цинковыми пальчиками, также оказывается ассоциированным с поддержанием импринтинга (Fig. 4C;Li et al. 2008; Mackay et al. 2008). Потеря ZFP57 у эмбрионов мыши и в ESCs приводит к гипометилированию отцовских и материнских ICRs и к нарушению регуляции импринтированных генов (Li et al. 2008; Quenneville et al. 2011; Zuo et al. 2012). Эта функция ZFP57 эволюционно законсервирована; у людей мутации потери функции также приводят к гипометилированию ICR, приводя в конечном итоге к временному диабету новорожденных (Mackay et al. 2006, 2008).

KRAB белки с цинковыми пальчиками часто действуют как эпигенетические репрессоры благодаря своему взаимодействию с TRIM28. TRIM28 является компетентным мультифункциональным репрессорным комплексом, представленным, по крайней мере, в данном примере, nucleosome remodeling and histone deacetylation (NuRD) комплексом, H3K9me3-катализирующей гистон метилтрансферазой SETDB1, гетерохроматиновым белком 1 (HP1) и ДНК метилтрансферазами DNMT1, DNMT3A и DNMT3B (Fig. 4C; Schultz et al. 2001,2002; Iyengar and Farnham 2011; Quenneville et al. 2011; Zuo et al. 2012). Поскольку дефекты поддержания метилирования ДНК менее выражены у зиготических ZFP57 мутантов, а отсутствие материнского ZFP57 восстанавливается за счет экспрессии отцовского Zfp57 (Li et al. 2008), потеря материнского Trim28 в отдельности приводит к гибели эмбрионов (Messerschmidt et al. 2012). Время гибели и эмбриональные фенотипы материнских Trim28 мутантов сильно варьируют, как и возникновение гипометилирования в некоторых материнских и отцовских ICRs (Messerschmidt et al. 2012). Анализ метилирования ДНК индивидуальных бластомеров подтверждает, что дефекты стохастического, случайного метилирование (и фенотипические отклонения) базируются на мозаичном составе ранних Trim28 материнских нулевых эмбрионов, несущих обычно нормально и аберрантно импринтированные генетические локусы (Messerschmidt 2012; Messerschmidt et al. 2012; Lorthongpanich et al. 2013).

Связывание обоих белков и присутствие H3K9me3, продукта комплекса TRIM28 , были выявлены в импринтируемых локусах эмбрионов (Messerschmidt et al. 2012) и в mESCs (Quenneville et al. 2011). Будучи ДНК-связываемым транскрипционным фактором, ZFP57 локализация на ICRs открывает волнующую перспективу сиквенс-специфического распознавания и поддержания импринтируемых локусов. Действительно, анализ последовательностей локусов, обогащенных H3K9me3, TRIM28, ZFP57, как показывает chromatin immunoprecipitation (ChIP) в комбинации с глубоким секвенированием (ChIP-seq) в mESCs, выявил консенсус из 6 нуклеотидов сайта распознавания ZFP57 (TGCCGC), который высоко законсервирован в 81 из 91 идентифицированных (H3K9me3/TRIM28/ZFP57) сайтов (Quenneville et al. 2011). Удивительно, связывание TRIM28 с гипометилированными сайтами устранялось у Trim28 материнских нулевых эмбрионов и не восстанавливалось с помощью возобновления экспрессии TRIM28 с отцовского аллеля у эмбрионов на ст. 2- и 4- клеток, указывая на зависимое от метилирования ДНК связывание комплекса ZFP57/TRIM28. Фактически, ZFP57 обладает значительно более высоким сродством к метилируемому консенсусу сайта связывания in vitro (Quenneville et al. 2011; Liu et al. 2012). Будучи потерянным метилирование ДНК не может быть восстановлено посредством комплекса ZFP57/TRIM28 in vivo (Messerschmidt et al. 2012) эктопической повторной экспрессии ZFP57 в Zfp57-дефицитных ESCs (Zuo et al. 2012). Чтобы подчеркнуть взаимодействие TRIM28 с DNMT1/NP95 предположено неканоническое, ZFP57-обусловленное воздействие аппарата поддержания метилирования ДНК на ICRs у предимплантационных эмбрионов (Fig. 4C). Подобный способ воздействия д. быть компенсирован для резкого снижения ядерной DNMT1 во время ранних делений дробления и тем самым позволять поддержание метилирования ДНК импринтируемых регионов (Messerschmidt 2012). Только на более поздних стадиях эмбриогенеза уровни DNMT1 достоверно увеличиваются в ядрах, гарантируя каноническое поддержание метилирования ДНК (Fig. 4D).

Сохранение метилирования импринтируемых регионов у предимплантационных эмбрионов, как полагают, является очень мощным до тех пор, пока анализ геномного метилирования не покажет, что даже ICRs частично деметилированы, особенно в периферических регионах (Tomizawa et al. 2011; Kobayashi et al. 2012). Такая потеря, однако, оказывает незначительное или не оказывает воздействия до тех пор, пока сайт связывания ZFP57 сам остается метилированным и подвергается воздействию комплекса ZFP57/TRIM28. Энзимы метилирования de novo DNMT3A и DNMT3B, которые также обнаруживаются в комплексе ZFP57/TRIM28 (Quenneville et al. 2011; Zuo et al. 2012), могут объяснить восстановление метилирования ДНК в этих периферических регионах на более поздних ст. развития (Tomizawa et al. 2011; Kobayashi et al. 2012).

Наконец, принимая во внимание, что механизмы деметилирования ДНК действуют во время раннего эмбрионального развития, резкое снижение уровней метилирования ожидается и фактически обнаруживается на поздних стадиях перед имплантацией. Неожиданно, помимо импринтируемых генов и ретротранспозонов, существенные количества по-разному метилированых CGIs в специфичных для ооцита и в субнаборе специфичных для спермиев метилированных регионов сохраняют метилирование ДНК на значительно более высоких уровнях, чем ожидается, если имеет место беспрепятственное пассивное деметилирование (Smallwood et al. 2011; Kobayashi et al. 2012). Остается посмотреть, действительно ли эти CGIs, как это было показано для ICRs, подвергаются целенаправленному воздействию и защищены с помощью ZFP57/TRIM28, других KRAB белков с цинковыми пальчиками, или за счет совершенно иных механизмов.

Concluding remarks

Данные по метилированию генома и информация о эпигенетическом репрограммировании эмбрионов и PGCs позволяют рассмотреть этот процесс под новым углом. Сегодня ясно, что пассивное деметилирование ДНК наиболее экономичный механизм в PGCs и предимплантационных эмбрионах и по этой причине вполне достаточен. Более того, точное время и концентрация генных продуктов в специфических местах генома сегодня ясны. Несмотря на это, эта новая информация также подчеркивает ограниченность нашего сегодняшнего понимания процесса репрограммирования. Хотя пути глобального, геномного метилирования и деметилирования идентифицированы, их разрушение дает эмбрионов с менее, чем полностью пенетрантными фенотипами, приводя к смешанным и запутанным интерпретациям (Li et al. 2008; Popp et al. 2010; Dawlaty et al. 2011, 2013; Gu et al. 2011; Messerschmidt et al. 2012; Yamaguchi et al. 2012). LПотеря TET3 у ранних эмбрионов, напр., вызывает арест развития только у части эмбрионов, это, скорее всего, результат задержки активации отцовских генов плюрипотентности (Gu et al. 2011). Тем не менее у эмбрионов дикого типа, огромная масса отцовских 5mC подвергается превращению в 5hmC, которые затем пассивно удаляются в ходе последующих делений дробления. Однако, TET3-независимое пассивное деметилирование также происходит и в материнском геноме, в результате возникает вопрос о значении превращения глобального отцовского генома. Сходным образом, TET1/2-обусловленное окисление в PGCs может иметь более широкий геномный диапазон, чем проста гарантия надежного деметилирования мейотических и импринтированных генов. Поэтому благоразумно не принимать активной реверсии к не модифицированному цитозину, если происходит TET-обеспечиваемое окисление; следует также учитывать расходящиеся биологические функции и роль 5mC и 5hmC.

Мы всё ещё далеки от понимания активного де метилирования ДНК. Прямое удаление 5mC или его деаминирование посредством AID/APOBECs всё ещё спорно для in vivo. TET-зависимое деметилирование может возникать благодаря множественным, взаимосвязанным путям (Wu and Zhang 2010, 2014). Однако, даже в отсутствие TETs, AID, APOBECs и т.д., PGCs и ранние эмбрионы могут давать функциональные гаметы или давать живых детенышей, хотя часто неэффективно. Долговременные, через поколения эффекты эпигенетических дефектов у этих выживших детенышей всё ещё не изучены. Следовательно, возможно что несколько перекрывающихся, само-контролируемых механизмов проверки участвует параллель, чтобы гарантировать выраженное стирание эпигенетических меток.

С новыми экспериментальными данными проявляется больше параллелей между репрограммированием PGC и эмбрионов. Защита импринтируемых регионов у эмбрионов продемонстрирована и в PGCs, где импринтируемые и мейотические гены, по-видимому, специфически подвергаются целенаправленному воздействию для деметилирования после волны пассивного деметилирования. Важно, что деметилирование импринтируемых регионов следует той же самой кинетике, что и основная часть генома (Kagiwada et al. 2013), и даже в отсутствие TET энзимов мейотические и импринтируемые гены в конечном итоге репрограммируются (Dawlaty et al. 2013). Это находится в резком контрасте со случаями ранних эмбрионов, где жизненно важно, чтобы сохранение метилирования ДНК импринтов не было преодолено.

Новая концепция поддержания неканонического метилирования ДНК в ходе репрограммирования сегодня хорошо известна во время предимплантационного развития. ZFP57/TRIM28-обеспечиваемая целенаправленная доставка редкого ядерного белка DNMT1 в регионы импринтируемых генов гарантирует их устойчивое сохранение (Messerschmidt 2012). Экспрессируются ли гены, такие как Trim28 и Zfp57 в PGCs, и оказывают ли они влияние на динамику деметилирования этих регионов? Предварительные находки подтверждают, что сайты связывания ZFP57 присутствуют в больших количествах в "поздно деметилируемых" геномных регионах (Seisenberger et al. 2012). Также и у предимплантационных эмбрионов поддержание метилирования ДНК может осуществляться и помимо импринтинга. Многие др., дифференциально метилированные регионы обнаруживаются в ооцитах, защищенные на стадии бластоциста (Smallwood et al. 2011; Kobayashi et al. 2012; Smith et al. 2012). FБолее того, ChIP-seq в mESCs выявило многочисленные дополнительные мишени для ZFP57 помимо известных импринтируемых регионов. Эти находки открывают волнующие перспективы для более тщательного исследования (Quenneville et al. 2011). Хотя ZFP57 является единственным TRIM28-взаимодействующим KRAB белком цинковые пальчики, отвечающим за зависимое от метилирования связывание ДНК, вполне возможно, что и др. члены семейства KRAB со сходными свойствами обладают аналогичными функциями на др. сайтах мишенях.

Остаются общие вопросы: почему млекопитающие обладают столь сложными процессами эпигенетического репрограммирования? Является ли целью тотипотентность, которая влечет за собой такую онтогенетическую гибкость, взамен отсутствия ведущих онтогенетических детерминант, обнаруживаемых у лягушек, мух, рыб или червей? Развиваются ли эти процессы, чтобы дать возможность и закрепить геномный импринтинг в качестве важного механизма развития млекопитающих? Эпигенетическое репрограммирование отличается в деталях у разных видов млекопитающих, подтверждая, что деметилирование-метилирование в PGCs и впоследствии деметилирование-метилирование у эмбрионов являются новыми механизмами и что мы наблюдаем один из оптимальных эволюционный отбор.

DNA methylation dynamics during epigenetic reprogramming in the germline and preimplantation embryos Daniel M. Messerschmidt, Barbara B. Knowles and Davor Solter Genes & Dev. 2014. 28: 812-828

DNA methylation dynamics during epigenetic reprogramming in the germline and preimplantation embryos
Daniel M. Messerschmidt, Barbara B. Knowles and Davor Solter
Genes & Dev. 2014. 28: 812-828