Для того, чтобы понять in vivo роль ассоциированных с GLI2 CNEs, мы использовали временную экспрессию репортерного гена у эмбрионов рыбок данио путем использования стратегии совместной инъекции, используя минимальный β-globin промотор, и во-вторых, прямое клонирование в aTol2 векторе с c-fos промотором (Woolfe et al., 2005; Abbasi et al., 2007; Pauls et al., 2012). Эти подходы, используя прозрачность и быстрое развитие эмбрионов рыбок данио, показали свой потенциал функционального тестирования энхансерных элементов среди законсервированных не кодирующих регионов (Woolfe et al., 2005; Fisher et al., 2006). Усиление активности GFP наблюдается соотв. при подходе с совместной инъекцией, однако, техника является трудоёмкой инъецировать и проверить сотни эмбрионов для выяснения паттерна экспрессии репортёра (Woolfe et al., 2005). Более того, неспособность выявить экспрессию репортера при совместной инъекции для некоторых GLI2-ассоциированных CNEs в плавнике, подчеркивает тот факт, что эта стратегия непригодна для детекции активности специфичных для конечностей регуляторов. По сравнению с этим конструкция Tol2 транспозона, инъецируемая с мРНК transposase, интегрируется в геном соматических клеток с высокой эффективностью и ткане-специфичная экспрессия GFP может легко наблюдаться благодаря не мозаичному паттерну репортера. Т.о., это более чувствительная стратегия для небольших доменов, подобных плавнику (Fisher et al., 2006; Birnbaum et al., 2012). Наши результаты с двумя разными подходами показали, что многие эволюционно законсервированные ассоциированные с GLI2 цис-регуляторы у человека контролируют высоко скоординированную экспрессию репортерного гена GFP у временно трансгенных рыбок данио, воспроизводя субнабор известного репертуара экспрессии эндогенного гена gli2 (Table 2 and 3) (Du and Dienhart, 2001; Ke et al., 2005; Thisse and Thisse,2005; Ke et al., 2008; Wang et al., 2013).

Table 3. Reported endogenous expression pattern of Gli2 and gli2a/gli2b in vertebrates CNE2, CNE3, and CNE5 induce reporter expression that coincides with known sites of GLI2 activity in neural tube

Gene        Endogenous expression        Source
1.        This table provides information of already reported endogenous expression of Gli2
in mice and its co-orthologs (gli2a/gli2b) in zebrafish. The last column provides the source
of literature that addresses the function and endogenous expression pattern of Gli2/gli2.
GLI2/gli2a        Forebrain        (Hui et al., 1994)

         Midbrain        (Magdaleno et al., 2006), (Ke et al., 2005)

         Hindbrain        (Ke et al., 2008), (Thisse and Thisse, 2005), (Hui et al., 1994)

         Spinal cord        (Sasaki H, 1999), (Lee et al., 1997)

         Notochord        (Ding et al., 1998)

         Limb/Pectoral fin        (Mo et al., 1997), (Karlstrom et al., 2003)

         Muscle cells        (Du and Dienhart, 2001)

         Otic vesicle        (Hui et al., 1994)

gli2b        Forebrain        (Thisse and Thisse, 2005)

         Midbrain        (Ke et al., 2005)

         Hindbrain        (Ke et al., 2008)

         Spinal cord        (Thisse and Thisse, 2005)

         Notochord        (Thisse and Thisse, 2005)

         Pectoral fin        Needs to be investigated
         Muscle cells        (Wang et al. 2013)

         Otic vesicle        (Ke et al., 2005)    

Gli2 играет роль активатора в формировании паттерна заднего мозга и спинного мозга; исследования Gli2^-/- мышей показали разные дефекты вентрального паттерна в заднем и спинном мозге с тяжелыми нарушениями в floor plate (FP) и в промежуточных нейронах (Ding et al., 1998; Lebel et al., 2007). Наши данные показали, что экспрессия репортера управляется субнабором идентифицированных в GLI2 интронных энхансеров (CNE2, CNE3 и CNE5) в основном ограниченных задним мозгом рыбок данио (Fig. 4A-4C) и нейронами дорсальной части спинного мозга (Fig. 4D-4F), отражая сложную роль gli2 в развитии нервной трубки (Table 3). Эти in vivo данные выявили перекрывание вклада CNE2, CNE3 и CNE5 в формирование точного паттерна нервной трубки. Более того, анализ in silico CNE2, CNE3 и CNE5 предсказал законсервированные сайты связывания у человека и фугу для ряда важных для развития транскрипционных факторов, которые, как известно, экспрессируются совместно с Gli2 во время формирования нервной трубки (Table 1).

Паттерны экспрессии Gli2 в формирующихся зачатках конечностей высоко динамичные и контекст-зависимые. Становление переднезадних позиционных характеристик в конечностях нуждается в интеграции пространственного распределения, времени и дозы экспрессии GLI2 (Bowers et al., 2012). Исследования РНК in situ у эмбрионов мыши показали, что на ст. E10.5, Gli2 и Gli3 широко экспрессируются в недифференцированной мезенхиме формирующихся зачатков конечностей, за исключением задней части мезенхимы, где генетический антагонизм между Gli2 и Shh приводит к снижению экспрессии Gli2 (Mo et al., 1997; Bai and Joyner, 2001). Gli2^-/- мыши обнаруживают снижение оссификации в разных костях конечностей, включая; stylopod (плечевая и бедренная кость), zeugopod (радиальная, локтевая, тибиальная и малоберцовая кость) также как и укорочение autopod (limb) (Mo et al., 1997). У Gli3 мутантных мышей, Gli2 является жизненно важной для формирования паттерна переднего и заднего регионов autopod (Bowers et al., 2012). Более того, исследования рыб данио показало, что экспрессия gli2a в зачатках плавников происходит на ст. 30 hpf (Table 3) (Thisse and Thisse, 2005), а на ст.36 hpf экспрессируется униформно по всей мезенхиме развивающегося грудного плавника (Karlstrom et al., 2003). Кроме того, деформации конечностей, сходные с преаксиальной и постаксиальной полидактилией хорошо документированы при мутациях GLI2 (Roessler et al., 2003; Roessler et al., 2005; Bertolacini et al., 2012).

В соотв. с ролью gli2a в плавниках, мы нашли, что CNE2 и CNE5 управляют воспроизводимой экспрессией репортера в развивающихся грудных плавниках (Fig. 5A and 5B). Изначальная экспансия парных плавников у костистых рыб поразительно параллельна таковой для зачатков конечностей тетрапод и контролируется с помощью сходного механизма (Zhang et al., 2010). Эволюция цис-действующих элементов, как полагают, является ключевым регулятором в развитии и структуировании каркаса у позвоночных скелета плавников/конечностей. Shh и Gli семейства являются ключевыми путями передачи сигналов, влияющих на морфологию плавников и конечностей (Mo et al., 1997; Abbasi, 2011).

Перекрывание активности двух независимых энхансеров в плавниках указывает на то, что GLI2 обладает множественными цис-регуляторными модулями, необходимыми для нормального развития конечностей. Более того, роли CNE2 и CNE5 в грудных плавниках отражают присутствие сайтов связывания для многочисленных укоренившихся транскрипционных факторов, которые, как известно, экспрессируются совместно с Gli2 в развивающихся конечностях (Table 1). Пространственную и временную активность этих энхансеров необходимо исследовать дальше у модельных животных тетрапод, таких как мыши, чтобы полностью расшифровать механизм Gli2 в становлении переднезадней полярности конечностей и чтобы определить границы паттерна экспрессии, управляемых ассоциированными с GLI2 элементами CNEs.

Сравнительный анализ последовательностей выявил две копии (co-orthologs) человеческого CNE2 у рыб данио. Одна копия (CNE2a) оказалась расположенной в интроне 2 гена gli2a в то время как др. копия (CNE2b) располагалась ниже гена gli2b. CNE2a (119bp) и CNE2b (117bp) обладают существенным сходством последовательностей (75%), а также с человеческими GLI2-CNE2 (117bp), т.e. 68% и 65% соотв. (Fig. 6A). Мы проанализировали каждый из этих элементов независимо у рыб данио и сравнили экспрессию репортерного гена, индуцируемую этими элементами др. с др. Тщательное исследование полученных данных показало очевидное перекрывание экспрессии репортера, контролируемой CNE2a и CNE2b в заднем мозге рыб данио (Fig. 7A-7D) и развивающихся плавниках (Fig. 7E и 7F), там, где эндогенная экспрессия генов gli2a/gli2b комплементарным способом уже была описана (Table 3) (Thisse and Thisse, 2005; Ke et al., 2008). Чтобы расшифровать причину этого перекрывания экспрессии дуплицированных CNEs, и получить какие-либо указания расхождения функций, важных для этого процесса, необходимы более точные подходы. Эти находки отражают, что комбинированная активность gli2a/gli2b цис-регионов существенна для нормального развития заднего мозга и плавников рыбок данио.

In this study, we have used deep evolutionary constraint as an indicator to pinpoint the cis-regulatory catalogue of the developmentally important human GLI2 gene. Our data demonstrate that like its evolutionary counterpart GLI3, the cis-regulatory repertoire of GLI2 resides within its intronic intervals and has remained conserved since the divergence of the tetrapod-teleost lineages. We have shown that this ancient catalogue of intronic enhancers regulates reporter expression in a diverse set of embryonic domains where GLI2 is known to be expressed endogenously. Furthermore, GLI2 enhancers depict considerable overlap in their expression territories during zebrafish development. Elucidation of the GLI2-associated cis-regulatory network offers a novel perspective for understanding the genetic mechanisms by which the downstream effectors of Hh signaling cascade might be regulated during embryogenesis. In addition, these cis-regulatory sequences are strong candidates for mutational studies of GLI2-associated human birth defects, which cannot be attributed to any exonic mutation.