Эмбрионы млекопитающих зависят от внеэмбриональных тканей, включая плаценту и висцеральный желточный мешок (VYS) и амнион, при внутриутробном росте и для жизнеспособности. Амнион является внеэмбриональной мембраной, ближайшей к эмбриону, составляет амниотическую полость и прежде всего играет защитную роль. VYS обеспечивает абсорбцию кислорода и питательных веществ из материнской среды и их доставку к эмбриону на ранних стадиях развития. Хориоаллантоисная плацента затем выполняет эту функцию, когда эмбрион становится крупнее и развивается кровеносная система. VYS является также местом инициального гематопоэза и образования кровеносных сосудов.

Развитие внеэмбриональных мембран начинается во время гаструляции, сопровождается динамичными изменениями, происходящими в эмбриональном регионе, это приводит к образованию зародышевых слоёв и формированию паттерна. Перед гаструляцией эмбрион мыши является цилиндрическим по форме с эмбриональным и внеэмбриональным регионами, расположенными вдоль проксимо-дистальной оси по отношению к мезометрию. Внутренний эпителиальный слой состоит из эмбриональной эктодермы (или эпибласта) дистально и внеэмбриональной эктодермы (ExE) проксимально, расположенных вокруг центрального просвета, известного как проамниотическая полость и окружённого наружным слоем висцеральной энтодермы (VE). На день эмбриогенеза (E) 6.5, начинается образование мезодермы в месте соединения эмбрионального и внеэмбрионального регионов между внутренней эктодермой и наружной VE, и затем распространяется дистально, чтобы сформировать первичную полоску, демаркирующую задний регион собственно эмбриона. Во внеэмбриональном регионе мезодермальные клетки из проксимальной части первичной полоски проталкивают как происходящие из ExE, так и эпибласта клетки, в проамниотическую полость, тем самым создается amniochorionic fold (ACF) и зарождающийся exocoelom (Pereira et al., 2011). Продолжающаяся экспансия ACF в конечном счете приводит к слиянию с передней эктодермой: происходящий из ExE компонент ACF сливается с передней ExE, чтобы сформировать хорион и создать ectoplacental полость; происходящие из эпибласта ACF клетки сливаются с передней частью проксимального эпибласта, давая амнион и блокируя (closing off) амниотическую полость. Эти события происходят в передней части срединной линии в позиции, наз. anterior separation point (ASP), поскольку это происходит там, где компоненты хориона и амниона ACF теряют свое соединение благодаря интеркаляции мезодермы (Ellington, 1987; Pereira et al., 2011). После разделения экзоцелом расширяется, т.к. хорион движется прочь от амниона. Это увеличивает VYS и в конечном счете элиминирует эктоплацентраную полость. Вторичный рост мезодермы от границы между эмбриональным и внеэмбриональным регионом формирует аллантоис, который растет в экзоцелом и в конец концов встречается и сливается с хорионом, чтобы сформировать хориоалантоисную плаценту.

Исследования нокаута генов у мышей продемонстрировали важную роль передачи сигналов bone morphogenetic protein (BMP) для внеэмбрионального развития (Kishigami and Mishina, 2005). BMPs секретируемые лиганды относятся к сверхсемейству transforming growth factor beta (TGF-β), которые активируют внутриклеточные эффекторные белки Smad1, Smad5 и Smad8, чтобы регулировать экспрессию генов мишеней (Massague et al.,2005). Smad1 нокаутные эмбрионы обнаруживают заметные дефекты пролиферации морфогенеза внеэмбриональных тканей, включая избыточную пролиферацию хориона в экзоцеломной полости и укорочение аллантоиса, который неспособен устанавливать соединения с плацентой (Lechleider et al., 2001; Tremblay et al., 2001). Smad5 мутанты обнаруживают дефекты в передней части амниона, который утолщен и обнаруживает характеристики первичной полоски (Chang et al., 1999; Bosman et al., 2006; Pereira et al., 2012). Эмбрионы, лишенные BMP4, обнаруживают дефекты гаструляции и в аллантоисе благодаря снижению образования мезодермы (Winnier et al., 1995). Первоначальное исследование Bmp2 мутантных эмбрионов показало, что ACF неспособна сливаться впереди, это приписывается дефициту внеэмбриональной мезодермы, приводящему к открытому проамниотическому каналу (Zhang and Bradley, 1996). Дальнейший анализ выявил более сложный, гетерогенный фенотип и предоставил доказательства роли морфогенетических событий, приводящих к отграничению эмбриона внеэмбриональными мембранами и к собственно позиционированию головы и сердца (Goldman et al., 2009; Madabhushi and Lacy, 2011).

Человеческий PAX-Interacting Protein 1-associated glutamate rich protein 1 (PAGR1; известный также как PA1 и GAS) был идентифицирован в комплексе с PAX-Interacting Protein 1 (PAXIP1; также известным как PTIP) с помощью ко-иммунопреципитации и масс спектрометрии (Cho et al., 2007). Оба белка были обнаружены в ассоциации с комплексами, содержащими MLL3/MLL4 гистоновую H3K4 метилтрансферазу (Cho et al., 2007), подтверждая роль эпигенетической регуляции генов. Кроме того, PAGR1 и PAXIP1 образуют отдельный комплекс, независимый от MLL3/MLL4, который играет роль в репарации повреждений ДНК (Gong et al., 2009). PAGR1 также действует как ко-регулятор транскрипции рецепторов эстрогена и глюкокортикоидов (Liang et al., 2009; Zhang et al., 2013), функция, скорее всего, независимая от его ассоциации с PAXIP1 или MLL3/MLL4. Т.о., PAGR1 может выполнять множественные роли в регуляции генов. Здесь мы показали, что родственный мышиных ген, Pagr1a, экспрессируется впервые в ExE и хорионе, а позднее распространяется на весь эмбрион. Анализ целенаправленной делеции зародышевой линии показал, что хотя Pagr1a^-/- эмбрионы соотв. образом специфицируют все эмбриональные и внеэмбриональные клеточные линии, выявляются выраженные дефекты роста, начиная со ст., E8.0. Наиболее заметными аномалиями являются таковые во внеэмбриональных тканях, включая накопление массы хориональной ткани в передней части срединной линии внутри амниотической полости. Наш анализ подтверждает, что Pagr1a мутантные эмбрионы обнаруживают аномальное образование ACF и разделение в месте ASP, приводящее к дефектам как хориона, так и амниона. Важно, что Pagr1a ^-/- эмбрионы обнаруживают снижение экспрессии Bmp2, указывающее на то, что Pagr1a обычно регулирует экспрессию гена Bmp2 и что Pagr1a мутантный фенотип обусловлен, по крайней мере, частично снижением передачи сигналов BMP2.

Полученные результаты подтвердили специфическую последовательность событий, приводящих к наблюдаемым дефектам образования амниона и хориона у Pagr1a мутантов. Как схематически показано на Figure 5A, обычно ASP представляет собой соединение эмбрионального и внеэмбрионального эктодермальных компонентов ACF с их родственными передними тканями (Fig. 5A, left and middle panels). Последующее подразделение ведет к тому, что амнион и хорион состоят исключительно из эмбриональной эктодермы или из ExE, соотв. (Fig. 5A, right panel). У Pagr1a ^-/- эмбрионов здесь появляется избыток или неправильное расположение компонента ExE из ACF, так, что он расширяется в эмбриональный домен (Fig. 5B, left panel, brackets). Т.о., мутантный ASP не содержит эмбриональной эктодермы, а только ExE (Fig. 5B, middle panel, arrowhead). Отделение от этого аномального соединения, по-видимому, местам неполное (Fig. 2G; Fig. 4F, right panel, arrowhead), но где это про исходит, то образуется аномальная мембрана с хориональным и амниотическим компонентом (Fig. 5B, right panel, arrow; Fig. 4D', arrow). Очень вероятно, что крупные массы Cldn3-позитивной ткани, наблюдаемые на более поздних стадиях у мутантов возникают в результате продолжающейся пролиферации хорионального компонента этой аномальной мембраны.

Figure 5. A: Schematic representation of normal amnion and chorion formation from the ACF. Yellow, embryonic ectoderm; red, ExE; blue, mesoderm; green, endoderm. PAC, proamniotic canal; EPC, ectoplacental cavity; EXC, exocoelom; AMC, amniotic cavity. B: Schematic representation of amnion and chorion formation in the mutant. There is excess ExE within the ACF (brackets) such that the ASP contains only ExE (arrowhead). Following separation there is ExE derived tissue within the amnion (arrow).

Down-regulation of BMP2 in Pagr1a^-/- Mutant Embryos

Дефекты внеэмбрионального развития это характерный признак эмбрионов с мутациями в компонентах пути передачи сигналов BMP. Дефекты, специфичные для амниона и хориона, наблюдаемые у Smad1, Smad5 и Bmp2 мутантных эмбрионов. Smad1 мутанты обнаруживают избыточную пролиферацию ExE, приводящую к избыточной укладке(folding) хориона (Lechleider et al., 2001; Tremblay et al., 2001), до некоторой степени сходную с таковой у мутантов Pagr1a. Smad5 мутанты обнаруживают агрегаты внеэмбриональной ткани, состоящие из мезодермальных и эктодермальных компонентов амниона, что частично обусловлено эктопической передачей сигналов BMP (Bosman et al., 2006). Эти агрегаты имеют сходное расположение, которое наблюдается у Pagr1a^-/- эмбрионов. Однако неясно, содержат ли они также компонент хориона, т.к. отсутствуют специфические маркеры для ExE. У Bmp2 нулевых эмбрионов образование амниона нарушено и может приводить к неспособности к закрытия PAC и росту сердца вне амниона (Zhang and Bradley,1996; Madabhushi and Lacy, 2011). Такие дефекты являются более тяжелыми, чем те, что наблюдаются у Pagr1a^-/- эмбрионов, хотя др. фенотипические признаки общие с мутантами Pagr1a, включая дефекты развития передней части и отсутствие ротации вдоль оси. Экспрессия Bmp2 обнаруживается в мезодерме амниона и хориона на LS по EB стадию у эмбрионов дикого типа (Fig. 6A, B; left panels, brackets). Интересно, что у большинства Pagr1a ^-/- эмбрионов, проанализированных на этих стадиях, мы обнаруживали или значительную редукцию экспрессии Bmp2 (Fig. 6A, right panel) или почти полное подавление (Fig. 6B, right panel). В качестве контроля мы анализировали экспрессию близко родственного гена Bmp4e, который обнаруживается во внеэмбриональной эктодерме на PS по LS стадии (Fig. 6C,D; left panels, brackets). Мы не выявили достоверных отличий в уровнях экспрессии Bmp4 на сходных стадиях у Pagr1a мутантных эмбрионов (Figs. 6C,D; right panels). Эти результаты подтверждают, что Pagr1a выполняет специфическую роль в поддержании нормальных уровней экспрессии гена Bmp2 и показывают, что мутантный Pagr1a фенотип может быть обусловлен, по крайней мере, частично снижением передачи сигналов BMP2.

Figure 6. Down-regulation of Bmp2 gene expression in Pagr1a^-/- embryos.A: Lateral views of LS/OB-stage WT and mutant littermates showing Bmp2expression in the mesoderm of the amnion and chorion (bracket) is significantly reduced in the mutant . B: Frontal views of OB/EB-stage WT and mutant littermates showing loss of Bmp2 expression in the mutant. C: Lateral views of PS/ES-stage WT and mutant littermates showing no significant difference in expression of Bmp4 in the proximal ExE (bracket). D: Lateral views of MS/LS-stage WT and mutant littermates also showing no apparent change in Bmp4 expression (bracket).

Итак, Pagr1a^-/- эмбрионы подвергаются нормальной спецификации зародышевых слоёв и формированию онтогенетических паттернов, но обнаруживают ограниченное переднее развитие и арест на ст. E8.5, подобно обусловленным, по крайней мере, частично дефектам во внеэмбриональных тканях, которые нарушают их поддерживающие функции. В соответствии с инициальной экспрессией Pagr1a, наивысшей в ExE, первые неприкрытые дефекты обнаруживаются в развивающихся хорионе и амнионе, происходящих от ExE. Pagr1a затем широко экспрессируется в эмбриональном и внеэмбриональном доменах и это может быть важным способом дальнейшего изучения с использованием ткане-специфичных обусловленных инактиваций, чтобы оценить, как потеря функции Pagr1a в каждом клоне вносит свой вклад в фенотипические дефекты и арест эмбриогенеза. Хотя полученные нами данные показывают, что потеря Pagr1a влияет на транскрипцию Bmp2, необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить является ли регуляция непосредственной. Напр., было бы интересно оценить, используется ли при этом привлечение MLL3/MLL4 комплексов на локус Bmp2 или функционируют некоторые др. транскрипционные ко-регуляторы, как это наблюдается для ER генов мишеней (Liang et al., 2009). Также возможно, что Pagr1a регулирует др., пока ещё не идентифицированные гены мишени, которые действуют параллельно с путем BMP во внеэмбриональном развитии.