Развитие глаз позвоночных сложный процесс, состоящий из серии высоко скоординированных событий, использующих взаимодействия клеток нейральной эктодермой, поверхностной эктодермой и внеглазной мезенхимы. Каждая фаза развития глаз зависит как от индуктивных сигнальных путей, так и точной экспрессии во времени присущих клеткам внутренних факторов. Нарушения этих клеточных сигналов или мутации глазных генов приводят к разнообразным нарушениям глаз. Следовательно, лучшее понимание аномалий структуры и функции глаз важно для идентификации ключевых молекулярных игроков на каждой ступени формирования глаз.

Development of the Vertebrate Eye Field

Во время гаструляции передняя часть нервной пластинки специфицируется в домен, который в конечном счете сформирует глазное поле, телэнцефалон, диэнцефалон и гипоталамус. Критические индуктивные события подготавливают презумптивное глазное поле, присутствующее в передней части нервной пластинки, которое в конечном итоге мигрирует и интегрируется с соседними тканями. Клетки глазного поля окружены рострально и с боков предшественниками телэнцефалона, а медиально клетками, которые в будущем сформируют гипоталамус. Должен быть механизм разделения этих тканей головного мозга.

Образование и спецификация нативных недетерминированных клеток в организованный домен глазного поля нуждается во вкладе многих сигнальных путей и транскрипционных факторов (TFs). Пути fibroblast growth factor (FGF), bone morphogenetic protein (BMP) и Wingless (Wnt) направляют перемещения клеток в глазное поле и также помогают поддерживать территорию глазного поля (Esteve and Bovolenta, 2006). Кроме того, как канонические, так и не канонические Wnt сигнальные пути взаимодействуют др. с др., чтобы отделить территорию глазного поля от диэнцефалона и телэнцефалона (Wilson and Houart, 2004; Cavodeassi et al., 2005; Esteve and Bovolenta, 2006). Баланс между BMP и передачей неканонических сигналов Wnt (Wnt5, Wnt11) закладывает паттерн переднезадней оси нервной пластинки и инициирует морфогенетические перемещения клеток в передней части нервной пластинки (Wilson and Houart, 2004; Cavodeassi et al., 2005). Одновременное ингибирование передачи канонических сигналов Wnt также необходимо для супрессии в глазном поле маркеров судьбы диэнцефалона, поскольку эктопическая экспрессия Wnt8b приводит к неправильному выстраивании границ между диэнцефалоном и глазным полем, а мутации в Gsk3 связывающем домене в Axin1 приводят к превращению предшественников телэнцефалона и глазного поля в диэнцефалон в результате конститутивной активации пути Wnt/β-catenin (Heisenberg et al., 2001; Kim et al., 2002; Wilson and Houart, 2004; Cavodeassi et al., 2005; Esteve and Bovolenta, 2006; Adler and Canto-Soler, 2007). FGF модуляция фосфорилирования ephrinB1 также играет роль в понуждении проспективных предшественников мигрировать, соединяться и собирать себя самих в глазное поле (Chong et al., 2000; Moore et al., 2004).

Помимо получения критических сигналов от окружающих тканей переднего мозга, предшественники глазного поля сами по себе экспрессируют eye field transcription factors (EFTFs) Rx1/Rax, Pax6, Lhx2, Six3, Otx2, ET, tll и Hes1 (Fig. 1; Chow and Lang, 2001). Six3, Pax6, Otx2 и Rx1 специфицирую клетки предшественники в клон сетчатки и также регулируют морфогенетические перемещения клеток, которые приводят клетки презумптивного глазного поля в правильное географическое местоположение (Kenyon et al., 2001; Moore et al., 2004). Lhx2 необходим для поддержания качественных особенностей глазного пузыря и супрессии альтернативных судеб (Roy et al., 2013). Мутации потери функции в EFTFs приводят не только к отсутствию глазного бокала, но и также вызывают тяжелые аномалии нейрального развития разнообразные у разных животных, таких как мыши, цыплята, рыбки данио и человек (Porter et al., 1997; Winkler et al., 2000; Chow and Lang, 2001; Tucker et al., 2001; Stigloher et al., 2006; Lequeux et al., 2008). Имеются также TFs (e.g., Hes1 и Otx2), которые экспрессируются вне глазного поля, но которые влияют на его образование. Otx2 не экспрессируется внутри Rx позитивного региона глазного поля, однако, Otx2 необходим для поддержания экспрессии Six3 и Hes1 в передней части нервной пластинки (Simeone et al., 1993; Rhinn et al., 1998; Andreazzoli et al., 1999). Hes1 влияет на развитие глаз, контролируя образование переднего мозга. HESX1 мутации у человека приводят к разнообразным дефектам, включая гипоплазию зрительного нерва, а у мышей с Hes1 нулевой мутацией наблюдается анофталмия и микрофталмия (Dattani et al., 1998; Chow and Lang, 2001).

Figure 1. Vertebrate ocular morphogenesis. A schematic representation of the major stages of eye development is shown, with the presumptive telencephalon (T, red), eye field (EF, yellow), hypothalamus (H, green), and diencephalon (D, purple) indicated within the anterior neural plate. The transcription factors (TFs) associated with each stage of eye development are indicated in blue boxes on the left of the figure. OV, optic vesicle; L, lens; NR, neural retina; RPE, retinal pigmented epithelium; CF, choroid fissure; A, anterior; P, posterior; N, nasal; T, temporal.

From One Eye Field to Two Optic Vesicles

Клетки глазного поля подвергаются клеточной пролиферации во время гаструляции и в конечном итоге расщепляются на два билатеральных домена в ответ на секретируемые факторы, возникающие в вентральной срединной линии. Исследования с высоким разрешением динамического картирования судеб выявили существенные структурные изменения, которые происходят, чтобы перемещать зачатки вентральной части диэнцефалона в переднюю вентральную позицию, приводя в результате к разделению на две части глазного поля (см. Varga et al., 1999; England et al., 2006). Процесс разделения глазного поля нуждается в аксиальной передаче сигналов Nodal/TGF-β и Hedgehog (Hh), которая в свою очередь устанавливает границы глазных пузырьков и формирует паттерн проксимо-дистальной и вентро-назальной осей глазных пузырьков путем модуляции экспрессии TFs, таких как Pax2, Pax6, Vax1 и Vax2 (Nornes et al., 1990; Barth and Wilson, 1995; Ekker et al., 1995; Hyatt et al., 1996; Barbieri et al., 1999; Dressler and Woolf, 1999; Muller et al., 2000; Schulte and Cepko, 2000). Потеря белков, родственных Nodal, таких как Squint, Cyclops или One-eyed pinhead приводит к циклопии и голопрозэнцефалии, подчеркивая важность передачи сигналов TGFβ/Nodal для разделения глазного поля (Zhang et al., 1998; Pei and Feldman, 2009). Сходным образом, мутации Hh сигнального лиганда SHH приводят к голопрозэнцефалии и циклопии у людей и мышей (Belloni et al., 1996; Chiang et al., 1996; Roessler et al., 1996).

From a Flat Optic Vesicle to a Spherical Optic Cup

Следующей фазой развития глаз: симметричные парные глазные пузырьки (OVs) эвагинируют от вентральной части диэнцефалона и расширяются во внеглазную мезенхиму в направлении поверхностной эктодермы (Kessler and Melton, 1994; Li et al., 1997; Vogel-H?pker et al., 2000; Fuhrmann, 2010). Эта ступень эвагинации критически зависит от передачи сигналов паракринной retinoic acid (RA), происходящей из височной (temporal) мезенхимы (Adler and Canto-Soler, 2007; Cvekl and Wang, 2009). После физического контакта с покрывающей головной поверхностной эктодермой происходит серия пространственных и временных сложных структурных изменений. Поверхностная эктодерма в месте контакта утолщается и образует хрусталиковую плакоду, которая продолжает инвагинировать, образуя в конечном счете хрусталиковый пузырек и отсоединяется от поверхностной эктодермы. Одновременно дистальная часть OV удлиняется латерально и подвергается инвагинации, чтобы сформировать двухслойный глазной бокал (OC), который остается соединенным с диэнцефалоном посредством глазного стебелька (optic stalk) (for a detailed description, see Fuhrmann, 2010). Динамическое миграторное поведение клеток, присутствующих в глазном пузырьке является критическим для морфогенеза глаз (Kwan et al., 2012; Ivanovitch et al., 2013). Формирование глазного бокала является важным фундаментом, от которого зависит развитие радужки, цилиарного тела и сетчатки, и пигментного эпителия сетчатки (RPE). Нейральная сетчатка происходит из внутреннего слоя глазного бокала, тогда как наружный слой глазного бокала дифференцируется в RPE. Временный канал, наз. хороидной щелью (choroid fissure) идет вдоль вентральной стороны глазного бокала и глазного стебелька. Это отверстие делает возможным проникновение окологлазных мезенхимных клеток (происходящих из нервного гребня), которые позднее образуют кровеносные сосуды, которые предоставляют питание растущему глазу; оно также позволяет аксонам ганглиолярных клеток покидать глаз и соединяться с головным мозгом.

По мере морфогенеза глазного бокала и индукции хрусталика перекрывающиеся наборы TFs маркируют спецификацию клонов разных глазных тканей. Презумптивный хрусталик экспрессирует Pax6, IGF-2, Prox-1, Six3, Sox1 и Sox2; зарождающаяся нейральная сетчатка экспрессирует Pax6, Pax2, Rx, Lhx2, Chx10 и Optx2; развивающийся RPE экспрессирует Mitf и Otx2; а глазной стебелек экспрессирует Pax2, Vax1, Vax2 и Six3 (Jean et al., 1999; Chow and Lang, 2001). В дополнение к установившейся компетентности клеток предшественников для специфических клонов, TFs взаимодействуют др. с др., чтобы установить границы внутри и между индивидуальными глазными тканями. Внутри развивающегося глазного пузырька Pax6 и Tbx5 формируют паттерн дорсо-вентральной оси, а BF-1/Foxg1 и BF-2/Foxd2 формируют паттерн переднезадней оси. Вдоль медиально-латеральной оси Pax2, Pax6, sox4, sox11 и Vax регулируют формирование проксимо-дистального паттерна из глазного пузырька в противовес территории глазного стебелька (Fig. 1) (Hatini et al., 1994; Schwarz et al.,2000; Horsford et al., 2005; Adler and Canto-Soler, 2007).

Optic Cup Morphogenesis

The anterior segment: lens, cornea, iris, and ciliary body

Все сенсорные плакоды обладают способностью формировать хрусталик прежде чем они приобретут уникальные качественные особенности (reviewed extensively by Streit, 2007). Преплакодный регион формирует паттерн вдоль переднезадней оси, а предшественники хрусталиковой плакоды располагаются в переднем регионе поверхностной эктодермы. Экспрессия Pax6 является критической для образования хрусталика на ранней преплакодной фазе, а его экспрессия контролируется на разных стадиях развития хрусталика с помощью разных путей. Передача сигналов BMP и FGF регулирует экспрессию Pax6 во время образования плакоды; члены семейств Six3 и Meis регулируют активность Pax6 в эктодерме презумптивного хрусталика. Кроме того, Pax6 регулирует критическую экспрессию Sox2 в презумптивном эпителии хрусталика, а когда образуется плакода обнаруживается у него противоположная роль и Pax6 контролирует экспрессию Six3 (Kamachi et al., 1998; Wawersik et al., 1999; Liu et al., 2006; Streit, 2007; Zhao et al., 2008). Последняя стадия образования хрусталика приводит к индуктивным событиям в результате чего образуются энтодерма роговицы, радужка и строма цилиарного тела. Вскоре после того, как хрусталик отделяется от лежащей поверх эктодермы, клетки окологлазной мезенхимы, возникающие из нервного гребня, проникают в пространство между хрусталиком и поверхностной эктодермой. Мезенхимные клетки дифференцируются и вносят вклад в формирование роговицы, радужки и цилиарного тела (Piatigorsky, 2001; Graw, 2010).

1 The RPE and retina

одновременно с развитием хрусталика происходят выраженные изменения в двухслойном глазном бокале. Как упоминалось выше, наружный слой глазного бокала формирует RPE, а внутренний слой формирует нейральную сетчатку. Клетки внутреннего слоя пролиферируют (это сопровождается определенным прореживанием с помощью запрограммированной клеточной гибели) чтобы сформировать 6 классов нейронов сетчатки и одного типа глиальных клеток: retinal ganglion cells (RGCs), amacrine cells, horizontal cells, bipolar cells, cone photoreceptors, rod photoreceptors, и Мюллеровская глия (for more extensive reviews on retinal development, see Livesey and Cepko, 2001; Fadool and Dowling, 2008; Bassett and Wallace, 2012; He et al., 2012; Gregory-Evans et al., 2013). RGCs находятся в ganglion cell layer (GCL), промежуточные нейроны (amacrine, horizontal и bipolar клетки) и клеточные тела Мюллеровской глии присутствуют во inner nuclear layer (INL), а фоторецепторы присутствуют в наружном ядерном слое (outer nuclear layer (ONL)). Образование разных типов клеток сетчатки происходит в закрепленном временном порядке, но в зависимом от вида пространственном порядке. В целом RGCs появляются первыми в нейральной сетчатке, за ними следуют amacrine, horizontal клетки и фоторецепторы колбочки. Последним типом клеток сетчатки являются биполярные клетки, палочковидные фоторецепторы и Мюллерова глия. Важно, что у млекопитающих нейрогенез сетчатки происходит только во время эмбрионального и перинатального развития; однако, у холоднокровных позвоночных, таких как костистые рыбы и некоторые амфибии ассоциированный с ростом опыт нейрогенеза сетчатки происходит в течение всей жизни. Клетки ретинальных предшественников(RPCs) достигают компетентности становиться RGCs благодаря экспрессии bHLH TF, наз. ath5. Кроме того, передача сигналов Hh и FGF, необходимы для соотв. временной экспрессии ath5 и образования RGCs (Martinez-Morales et al., 2005; Masai et al., 2005). Амакринные, горизонтальные и биполярные клетки образуются благодаря перекрывающейся сети TFs, таких как Prox1, Math5, NeuroD, Math3, Ptf1, Pax6, Six3, Mash1 и Foxn4 (for an extensive review see Tomita et al., 2000; Dyer et al., 2003; Ohsawa and Kageyama, 2008; Demb and Singer, 2012). Фоторецепторы формируются из пула Crx- и Otx2-позитивных клеток, которые позднее приобретают компетентность формировать или колбочковидные или палочковидные фоторецепторы благодаря экспрессии TFs TRβ 2 и RXRγ для колбочек или Nrl, Nr2e3 и Ascl1 для палочек (for a more detailed review, see Swaroop et al., 2010).

RPE характеризуется присутствием меланосом, которые продуцируют и сохраняют пигмент меланин. RPE располагается между нейральной сетчаткой и сосудистой оболочкой глаза и чувствителен к сигналам, исходящим от соседней окологлазной мезенхимы. RPE очень важен для функционирования сетчатки. Он формирует гематоретинальный барьер, облегчает адгезию между нейральной сетчаткой и окружающей сосудистой сетью, отлавливает свободные радикалы, абсорбирует фоновое освещение, является критическим для метаболизма ретиноидов и фагоцитирует использованные кончики наружных сегментов фоторецепторов (Boulton and Dayhaw-Barker, 2001; Martinez-Morales et al., 2005). Неожиданно, только горстка TFs была идентифицирована, которые необходимы для развития и дифференцировки RPE. Сюда входят Mitf, Otx1/Otx2 и Pax6 (Goding, 2000; Baumer et al.,2003; Martinez-Morales et al., 2005; Bharti et al., 2012; Raviv et al., 2014). TGFβ FGF, BMP и Hh сигналы от окружающей мезенхимы также помогают индуцировать судьбу RPE во время развития (Dohrmann et al., 1993; Feijen et al., 1994; Zhang and Yang, 2001; M?ller et al., 2007; Fuhrmann et al., 2014).

2 Ocular vasculature and optic nerve

Зрелые глаза обнаруживают наивысшую потребность в кислороде на единицу веса по сравнению с остальными тканями человека (Saint-Geniez and D'Amore, 2004). Вначале развивающиеся глаза подпитываются с помощью внутриглазной сосудистой сети, генерируемой с помощью гиалоидной системы и хороидных сосудов. Гиалоидная артерия вступает в глазной бокал через хороидную щель и пересекает примитивное стекловидное тело, чтобы остановиться на задней части развивающегося хрусталика. Гиалоидные артерии быстро распространяются и формируют плотную капиллярную сеть и соединяются с венозной системой в передней части глазного бокала. Венозная система обеспечивается с помощью хороидальной сосудистой сети, происходящей из окологлазной мезенхимы. Как только гиалоидная система и хороидная сосудистая оболочка глаза сливаются, то формируется гиалоидная сосудистая сеть и она предоставляет все необходимые питательные вещества и метаболиты растущему глазу. Примерно в то же самое время начинается образование более постоянной сосудистой сети сетчатки и у млекопитающих гиалоидная сосудистая сеть начинает регрессировать (for excellent description see Saint-Geniez and D'Amore, 2004).

Собственно соединение между артериальной и венозной сетью является критическим для функциональной циркуляции питательных веществ и кислорода в глазных тканях (Haigh et al., 2003; Bussmann et al., 2011). Развитие и созревание хороидальных кровеносных сосудов зависит от экспрессии ангиогенных факторов VEGF, bFGF, PDGF и PEDF, испускаемых RPE, а нейтрализация bFGF и VEGF в RPE приводит к неполному образованию хороидальных сосудов глаз (Rousseau et al., 2003; Le et al., 2010). Эктопическая экспрессия FGFR1 приводит к образованию незрелой хороидальной сосудистой сети, а мутация в VEGF вызывая тяжелы сосудистые дефекты (Carmeliet et al., 1996; Ferrara et al., 1996). Передача сигналов Notch важна для формирования капиллярного ложа у мышей, человека и рыбок данио. VEGF и Delta-like 4 (DII4) взаимодействуют динамически, чтобы регулировать формирование паттерна сосудистой сети (Shawber and Kitajewski, 2004; Hellstrom et al., 2007). Наконец, генетические исследования на рыбках данио подтвердили, что передача сигналов Hh специфицирует судьбы эндотелиальных клеток, чтобы непосредственно регулировать артериальную дифференцировку (Williams et al., 2010).

Итак, органогенез глаз является консервативным процессом, который управляется с помощью сложных взаимодействий между поверхностной эктодермой, нейроэпителием и внеглазной мезенхимой (Chow and Lang, 2001; Fuhrmann, 2010). Поскольку события морфогенеза глаз широко законсервированы у позвоночных, но разные стадии обнаруживают видоспецифические различия. Напр., у рыбок данио развитие хрусталика не проходит стадию полого хрусталикового пузырька как у млекопитающих (Greiling et al., 2010). Кроме того, в отличие от млекопитающих развитие сосудистой сети сетчатки у рыбок данио не сопровождается регрессией галоидных сосудов (Alvarez et al., 2007). Несмотря на эти небольшие различия информация, получаемая от разных модельных позвоночных обогащает наше понимание ключевых молекулярных игроков и сигнальных путей в эмбриональном развитии глаз.

3 Congenital ocular malformations

Подсчеты распространенности врожденных глазных дефектов варьируют от региона и метода оценки, но в целом находятся в диапазоне от 1 до 10 случаев на 10,000 родов (Royal National Institute of Blind People, RNIB; Gregory-Evans et al., 2004). Ненадлежащее исполнение любой стадии раннего развития глаз приводит к угрожающим зрению глазным аномалиям. Напр., аномальная передача сигналов от срединной линии (вызываемая дефектами в передаче сигналов Shh, Nodal и RA или мутациями в Six3) может вызывать неспособность глазного поля сегрегировать на два билатеральных домена, приводя к гипотелоризму глаз или циклопии в экстремальных случаях, а также к голопрозэнцефалии (Belloni et al., 1996; Roessler et al.,1996). Др. группа глазных дефектов ассоциирует с аномальным морфогенезом, включая микрофталмию (маленькие глаза), анофталмию (отсутствие глаз) и колобому (неспособность закрытия хороидной щели), коллективно называемых MAC. Мутации или отклонения от дозы гена некоторых TFs и сигнальных молекул, активных во время раннего развития глаз, таких как VAX, SOX10, OTX2, RAX, SOX2, PAX2, PAX6, SIX3 и SHH могут приводит к фенотипическим отклонениям типа MAC у человека (Bondurand et al., 1999; Dressler and Woolf, 1999; Lequeux et al., 2008). Хотя генетические факторы вносят существенный вклад в этиологию MAC, причинные мутации идентифицируются, кстати, менее чем в 20% всех случаев (Gregory-Evans et al., 2004). Необходима дальнейшая идентификация новых вызывающих MAC генов.

Дефекты глазного морфогенеза могут также вызывать дисплазию переднего сегмента, приводя к уродствам хрусталика, радужки, роговицы или циалиарного тела. Мутации PAX2 и PAX6 могут вызывать аниридию (отсутствие радужки), изолированные катаракты и аномалии Петерса (сохранение связи между роговицей и хрусталиком) (Glaser et al., 1992; Hill et al., 1992; Otteson et al., 1998; Abouzeid et al., 2009; Bower et al., 2012). Мутации в членах семейств PITX, FOX и MAF вызывают катаракты, дисгенез мезенхимы переднего сегмента и тяжелые аномалии радужки (Blixt et al., 2000; Semina et al., 2001; Komatireddy et al., 2003; Cheong et al., 2007; Shaham et al., 2009). Врожденные катаракты также широко распространены у пациентов, несущих мутации белков внутренней мембраны хрусталика, белков щелевых соединений мембранных каналов и кристаллинов (Shiels and Bassnett, 1996; Berry et al., 2000; Graw, 2003).

Наконец, глазные аномалии часто ассоциируют с более обширными синдромами, которые характеризуются дефектами в развитии сердца, нервной системы, скелета или др. тканей. Некоторыми из примеров являютсяe CHARGE синдром (coloboma, heart anomaly, choanal atresia, retardation, genital and ear anomalies), anophthalmia-esophageal-genital (AEG) синдром и Coffin-Siris синдром (systemic abnormalities like skeletal defects, neurologic defects, cardiac malformations, renal and genital defects) (Onwochei et al., 2000; Hornby et al., 2003; Gregory-Evans et al., 2004; Kelberman et al., 2006).

SOXC Proteins

SOX Subfamilies in Vertebrates

SOX белки являются транскрипционными факторами, названные по общему мотиву, наз. SRY box, ДНК связывающему домену high-mobility-group (HMG), гомологичному ДНК-связывающему домену sex determining region on the Y chromosome (SRY) млекопитающих. SOX белки обнаруживаются широко по всему животному царству, включая нематод, членистоногих, птиц, рыб, рептилий, амфибий и млекопитающих (Bowles et al., 2000). У позвоночных идентифицировано приблизительно 30 SOX генов, которые подразделяются на 8 подгрупп (A-H) на базе сходства последовательностей и геномного расположения (Bowles et al., 2000; Schepers et al., 2002). Две новые подгруппы I и J были внесены, чтобы включать Xenopus sox31 и новый C. elegans sox ген. Бокс HMG позволяет SOX белкам распознавать специфическую линейную последовательность ДНК 5'-(A/T) (A/T) CAA(A/T)G-3' в малой борозде спирали ДНК, и он также помогает белкам SOX связывать крестовидные (four-way) соединения ДНК без какой-либо специфичности последовательностей (Ferrari et al., 1992). Связывание ДНК вызывает расширение малой борозды и также вызывает, по-видимому, разборку (unstacking) пар оснований.

Путем регуляции транскрипции генов мишеней или пост-трансляционных модификаций белки SOX участвуют во многих онтогенетических процессах (Wegner, 2010), включая эмбриональное развитие глаз. Мутации SOX2, которые принадлежат подсемейству SOXB, вызывают анофталмию или микрофталмию (Faivre et al., 2006). Sox2 также необходим для индукции первого хрусталикового специфического гена δ -crystallin (Kamachi et al., 2001). Sox9, член семейства SOXE, необходим для экспрессии нескольких генов сетчатки (таких как calb2a, calb2b, crx, neurod, rx1, sox4a, и vsx1) и для дифференцировки Мюллеровой глии и фоторецепторов (Yokoi et al., 2009). Кроме того, Sox9 может также регулировать экспрессию генов зрительного цикла в RPE (Masuda et al., 2014), а недавнее исследование Sox9-/- мышей продемонстрировало, что Sox9 и Sox10 необходимы для образования слёзных желез (Chen et al., 2014).

SOXC Proteins and Their Known Target Genes

Недавно была установлена роль белков SOXC в регуляции развития глаз. Семейство SOXC у видов беспозвоночных животных состоит из единственного члена (Cremazy et al., 2001). У большинства позвоночных SOXC семейство включает 3 не содержащих интроны гена: SOX4 [MIM: 184430], SOX11 [MIM: 600898] и SOX12 [MIM: 601947] (Penzo-Mendez, 2010). SOXC белки известны как активаторы. Не говоря уже о HMG домене на N-конце, трансактивационный домен (TAD) на C-конце присутствует у членов SOXC. Подобно др. членам SOX домен HMG у SOX4, SOX11 и SOX12 крупнее на 50% соотв. домена SRY, как на нуклеотидном, так и аминокислотном уровне. Внутри подгруппы SOXC белки обладают высокой степенью сходства внутри домена HMG box, а также и фланкирующих последовательностей и в TAD домене (Koopman et al., 1991; Bhattaram et al., 2010), и они сильно законсервированы у видов позвоночных. Среди SOXC белков, SOX4 наиболее эффективен по связыванию ДНК из-за отсутствия кислого домена, а SOX11 обладает наивысшей трансактивационной активностью из-за своей непрерывной α -спиральной структуры (van de Wetering et al., 1993; Wiebe et al., 2003; Dy et al., 2008; Hoser et al., 2008; Penzo-Mendez, 2010).

Хотя они важны и выполняют множественные роли в эмбриональном развитии и тканевой дифференцировке, идентифицированы очень немногие гены мишени для SOXC. Одним известным геном мишенью является класса III β -tubulin (известен как Tubb3 или Tuj1). Это экспрессирующийся во всех нейронах ген, специфичный для нервной системы и критический для нейрогенеза (Memberg and Hall, 1995). Sox4 и Sox11 могут трансактивировать lacZ репортер, управляемый с помощью Tubb3 промотора и непосредственно взаимодействовать с последовательностью, стоящей выше Tubb3 при DNA-binding gel shift пробе (Bergsland et al., 2006). Sox12 также может соединяться с Tubb3, но с относительно более низкой трансактивационной активностью (Hoser et al., 2008). Др. геном мишенью для SoxC является Tead2, нижестоящий медиатор сигнального пути Hippo. Несколько SoxC связывающих мотивов присутствуют в промоторном регионе и первом экзоне Tead2, и непосредственное связывание было выявлено in vitro и in vivo с помощью EMSA и chromatin immunoprecipitation assay (ChIP) (Bhattaram et al., 2010). Кроме того, Sox4 может соединяться с T-клеточным специфическим энхансером на 3' конце гена CD2 и трансактивировать CD2 (Wotton et al., 1995). Более того, белки SoxC также участвуют в стабильности генов мишеней. Напр., в ответ на повреждение ДНК Sox4 может непосредственно соединяться с p53 и усиливать его ацетилирование, ингибируя тем самым Mdm2-обеспечиваемое убиквитирнирование p53 (Pan et al., 2009).

Члены семейства SOXC экспрессируются экстенсивно в развивающейся нервной системе позвоночных и, как известно, регулируют жизнеспособность нейрональных и мезенхимных предшественников, детерминацию судеб и дифференцировку нейрональных клеток очень избыточным способом (Dy et al., 2008; Bhattaram et al., 2010; Bergsland et al., 2011). Экспрессия SoxC сильная в вентрикулярном регионе головного мозга, особенно в клетках, которые не обладают клеточным циклом, но ещё не дифференцированы в зрелые нейроны (Bhattaram et al., 2010). По ходу дальнейшего развития экспрессия SoxC ограничивается передним мозгом и каудальной частью спинного мозга, указывая тем самым, что экспрессия SoxC подавляется по мере созревания нервной системы (Jankowski et al., 2006).

SOXC Proteins and Their Functions During Vertebrate Eye Development

SOXC Expression in the Developing Vertebrate Eye

В эмбриональном глазу позвоночных гены SoxC экспрессируются в виде частично перекрывающегося паттерна во времени и пространстве (Maschhoff et al.,2003; Dy et al., 2008; Cizelsky et al., 2013; Pillai-Kastoori et al., 2014; Uy et al., 2014) (W. Wen, unpublished data, 2014). Они экспрессируются в нейроэпителии глазного бокала. в клетках поверхностной эктодермы и хрусталиковой плакоде, а также в окружающих мезенхимных клетках, происходящих из нервного гребня (Table 1). Их экспрессия инициируется в сетчатке в первой группе клеток, которые выходят из клеточного цикла, чтобы дифференцироваться в RGCs. Их экспрессия впоследствии распространяется на весь слой ганглиолярных клеток и во внутренний ядерный слой по мере дифференцировки клеток сетчатки (Cizelsky et al., 2013; Jiang et al., 2013; Usui et al., 2013; Pillai-Kastoori et al., 2014). Экспрессия Sox4 и Sox11 совпадает с началом экспрессии маркера ганглиолярных клеток Brn3b и маркера амакринных клеток Islet1(Jiang et al., 2013; Usui et al., 2013) (W. Wen, unpublished data, 2014). Кроме того, sox11 также экспрессируется в развивающемся хрусталике (Pillai-Kastoori et al., 2014). По мере прогрессирования нейрогенеза сетчатки экспрессия SoxC подавляется в зрелых нейронах сетчатки. Очень незначительная экспрессия обнаруживается во взрослых глазах млекопитающих. У позвоночных, обладающих непрерывным нейрогенезом сетчатки, таких как Xenopus и рыбки данио, sox4 и sox11 продолжают экспрессироваться в нише клеток ретинальных предшественников, наз. ciliary marginal zone (CMZ) в ходе всего взрослого периода (Cizelsky et al., 2013; Pillai-Kastoori et al., 2014) (W. Wen, unpublished data, 2014).

Table 1. SoxC Expression in the Developing Vertebrate Eye

1. GCL: ganglion cell layer; INL: inner nuclear layer; ONL: outter nuclear layer; CMZ: ciliary marginal zone; POM: periocular mesenchyme; ND: not described.

Functional Studies of SOXC Proteins in Animal Models

У мышей глобальный нокаут Sox11 и/или Sox4 является летальным из-за распространенных дефектов в камерах желудочков сердца. Однако, нокаут Sox12 не нарушает жизнеспособности и плодовитости (Schilham et al., 1996; Dy et al., 2008; Hoser et al., 2008). Компаундные Sox11+/-; Sox4+/- гетерозиготы также погибают при рождении, указывая, что оптимальная доза гена Sox4 и Sox11 является критической для развития сердца.

Sox11-/- гомозиготные мутантные эмбрионы мыши обнаруживают ряд глазных аномалий, включая аномалию Петерса, открытые глаза, микрофталмию и колобому (Sock et al., 2004; Wurm et al., 2008). Не обнаружено глазных дефектов у Sox4-/- мутантных мышей, однако это может быть обусловлено ранней эмбриональной летальностью этой модели. Morpholino-опосредованный нокдаун sox4 и/или sox11 у рыбок данио также вызывал глазную колобому, указывая на консервативную роль soxC белков в регуляции раннего морфогенеза глаз. Эксперименты на рыбках данио выявили, что глазные отклонения у Sox4 - и Sox11 -дефицитных эмбрионов вызываются усилением передачи сигналов Hedgehog и далее продемонстрировали, что Sox4 и Sox11 необходимы, чтобы негативно регулировать экспрессию пути Hh лигандов shha и ihhb (Pillai-Kastoori et al., 2014) (W. Wen, unpublished data, 2014).

Персистенция хрусталиковой ножки и задержка созревания хрусталика также наблюдались у SoxC нокаутных мышей, а также у soxC морфантов у рыбок данио и ксенопус (Wurm et al., 2008; Cizelsky et al., 2013; Pillai-Kastoori et al., 2014) (W. Wen, unpublished data, 2014). Иммуногистохимический анализ Sox11-/- эмбрионов выявил пониженные митотические профили в хрусталиковой плакоде во время инвагинации хрусталика, подтверждая, что Sox11 необходим для отделения хрусталикового пузырька от поверхностной эктодермы (Wurm et al., 2008). Недавнее исследование с использованием специфичных для хрусталика Pax6 условных нокаутных мышей, подтвердило, что по мере развитие хрусталика Pax6 необходим, чтобы супрессировать экспрессию Sox11 в хрусталике посредством miR-204 (Shaham et al., 2013).

Помимо дефектов морфогенеза глаз и хрусталика нарушен также нейрогенез сетчатки у SoxC -дефицитных животных. Jiang с сотр. создали Sox4, Sox11 и Sox4/Sox11 обусловленных нокаутных мышей, используя Six3-Cre линию, таким образом удаляли Sox4 и/или Sox11 из глазного поля и вентральной части переднего мозга со стадии E9 и дальше. Они наблюдали слабое уменьшение RGCs у одиночных нокаутов и полую потерю RGCs, а также существенное уменьшение др. нейронов сетчатки в Sox4/Sox11-нулевой сетчатке (Jiang et al., 2013). Потеря функции Sox4 и Sox11 у мышей также приводила к уменьшению показателя ацетилирования гистона H3 в способствующих нейрогенезу генах, таких как NeuroD, подтверждая, что Sox4 и Sox11 могут влиять на компетентность и дифференцировку клеток ретинальных предшественников путём создания специфического эпигенетического состояния. Экспрессия RGC маркера pouf4f1 отсутствовала в сетчатке и Sox4- и Sox11-дефицитных эмбрионов Xenopus, указывая на дефект дифференцировки RGC (Cizelsky et al., 2013). Апоптоз был также достоверно увеличен в сетчатке Sox4- и Sox11-дефицитных Xenopus, указывая на потенциальную причину фенотипа малых глаз и дезорганизации у этих животных (Cizelsky et al., 2013). Неожиданно, Sox4- и Sox11-дефицитные эмбрионы рыбок данио не обнаруживали существенных изменений в нейрогенезе RGCs у рыбок данио, хотя наблюдалась пролиферация эктопических клеток ретинальных предшественников в GCL (Pillai-Kastoori et al., 2014) (W. Wen, unpublished data, 2014).

Sox4 и sox11 оба усиливают активность у модельных рыбок данио хроническую дегенерацию и регенерацию палочковидных фоторецепторов (Morris et al.,2011), подтверждая их потенциальное участие в дифференцировке фоторецепторов палочек. Sox4- и Sox11-дефицитные рыбки данио также обнаруживают уменьшение зрелых палочковидных фоторецепторов в развивающееся сетчатке, подтверждая роль SoxC факторов в дифференцировке фоторецепторов (Pillai-Kastoori et al., 2014). Напротив, исследования избыточности функции с использованием мышиных эксплантов сетчатки продемонстрировали, что избыточная экспрессия факторов SoxC мешает созреванию и терминальной дифференцировке палочек и колбочек (а также Мюллеровой глии), подтверждая, что SoxC факторы ингибируют дифференцировку фоторецепторов (Usui et al., 2013). Это может быть связано с тем, что SoxC факторы выполняют видо-специфические функции в развитии фоторецепторов или что предшественники фоторецепторов чрезвычайно чувствительны к уровням экспрессии SoxC, так что слишком много или слишком мало существенно мешают терминальной дифференцировке.

SOXC and Human Ocular Defects

В соответствии с данными животных моделей, имеются доказательства на влияние SOXC факторов на болезни человека, затрагивающие развитие глаз. При скрининге последовательностей 79 пациентов с MAC фенотипами мы обнаружили две колобомы у пациентов с новой гетерозиготной мутацией в кодирующем регионе SOX11 (G145C миссенс мутация и in-frame дупликация 4-х аминокислот S351-354). Мы также установили небольшую сегментную делецию, внутри которой SOX11 был единственным белок кодирующим локусом у пациента с микрофталмией и агенезом зрительного нерва (Lo-Castro et al., 2009; Pillai-Kastoori et al., 2014). Tsurusaki et al. осуществили секвенирование всего экзома в выборках ДНК от 92 пациентов с Coffin-Siris синдромом, нарушением, характеризующимся аномалиями, связанными с задержкой развития пальцев и/или пальцев ног и аномальными лицевыми признаками). У двух пациентов были идентифицированы две новые de novo гетерозиготные мутации в HMG домене SOX11. Один из пациентов обнаруживал дефекты зрения вместе с нескольким др. клиническими признаками Coffin-Siris синдрома (Tsurusaki et al., 2014).

Одним из наиболее распространенных синдромов среди пациентов с колобомой является синдром CHARGE. Идентифицированы мутации в Chromatin remodeler chromodomain-helicase-DNA-binding protein 7 (CHD7) у 65% пациентов с CHARGE синдромом (Vissers et al., 2004; Chang et al., 2006). CHD7 регулирует нейрогенез, эпигенетически изменяя структуру хроматина генов мишеней и модифицируя их транскрипционную активность (Kim and Roberts, 2013). Потеря CHD7 в мышиных нейральных стволовых клетках приводит к достоверной редукции нейрогенеза, а также к потере экспрессии SoxC генов (Feng et al., 2013). Компьютерный анализ профиля экспрессии гена из Cancer Genome Atlas Project (TCGA) выявил, что SOX4 и SOX11 обнаруживают очень строгую корреляцию с экспрессией CHD7 (Feng et al., 2013). Несколько линий доказательств указывают на то, что SOX4 и SOX11 являются непосредственными мишенями для CHD7. Учитывая. что фенотип колобомы присутствует у Sox11 мутантных мышей и Sox4/11-дефицитных рыбок данио, то можно предположить, что измененная экспрессия SOX4 и SOX11 также лежит в основе колобомы, наблюдаемой у пациентов с синдромом CHARGE.

Conclusions and Perspectives

Extensive work across several vertebrate models has begun to unravel the intricacies of ocular morphogenesis. One thing that we have learned from these studies is that a handful of signaling pathways control various aspects of oculogenesis and they are deployed re-iteratively throughout the course of embryonic eye development. These signaling pathways regulate the expression of several key TFs to pattern the developing eye into tissue-specific domains, and to control the precise and timely specification of progenitor cells for differing fates. SOX family members are critical regulators of embryonic development, and the SOXC family has been recently implicated in eye development in a variety of animal models. Although it is clear that mutation or loss of SOXC proteins results in defects in ocular morphogenesis, lens development, and retinal neurogenesis, we do not know all of the transcriptional targets of SOXC proteins in the eye. The future lies in the investigation and identification of SOXC target genes, and in understanding their mechanism of action during ocular development.

Keeping an eye on SOXC proteins Lakshmi Pillai-Kastoori, Wen Wen and Ann C. Morris Developmental Dynamics Special Issue: Organogenesis Volume 244, Issue 3, pages 367-376, March 2015

Keeping an eye on SOXC proteins
Lakshmi Pillai-Kastoori, Wen Wen and Ann C. Morris
Developmental Dynamics Special Issue: Organogenesis Volume 244, Issue 3, pages 367-376, March 2015