Гены Zicкодируют семейство транскрипционных факторов с цинковыми пальчиками. Домен цинковые пальчики, как известно, участвует в связывании ДНК и белка, позволяя ZIC белкам участвовать в ряде взаимодействий (rev. Ali et al. 2012; Houtmeyers et al.,2013). Напр., ZIC могут действовать как классические транскрипционные факторы, чтобы связываться с ДНК и контролировать транскрипцию (Aruga et al., 1994; Yang et al., 2000; Salero et al., 2001; Ebert et al., 2003; Mizugishi et al., 2004; Sakurada et al., 2005; Lim et al., 2010) или они могут действовать как вспомогательные факторы, чтобы связывать др. белки и влиять на транскрипцию генов без непосредственного контакта с ДНК (Koyabu et al., 2001; Mizugishi et al., 2001; Pan et al., 2011; Pourebrahim et al., 2011). ZIC белки позвоночных обычно кодируются 5 генами в трех геномных местах. Zic1 и Zic4 существуют как дивергентно транскрибируемая пара тандемных генов, ка делают это и Zic2 и Zic5, тогда как Zic3 существует в отдельности (Houtmeyers et al.,2013).

Каждая пара генов, по-видимому, обладает некоторыми общими регуляторными элементами, так что Zic1 и Zic4 имеют очень перекрывающиеся паттерны экспрессии мРНК , как и Zic2 и Zic5 (Houtmeyers et al., 2013). Более того, в некоторых случаях экспрессия всех пяти Zic генов перекрывается, как во время развития внутреннего уха у мышей и кур (Chervenak et al., 2013), возникает возможность, что Zic гены могут действовать избыточно во время развития. Мутации индивидуальных Zic генов, однако, дают отличающиеся фенотипы, указывая на частичную функциональную дивергенцию (Grinberg and Millen, 2005; Houtmeyers et al., 2013). Мультифункциональная природа ZIC белков позволяет им действовать в широком круге процессов, как показывает плейотропная природа мутантных Zic фенотипов (Grinberg and Millen, 2005; Houtmeyers et al., 2013).

Из-за перекрывания и мультифункциональных свойств активность Zic трудно изучать. Несмотря на давнишнюю доступность Zic мутантных мышей и растущий список зависимых от Zic биологических процессов (Houtmeyers et al., 2013), молекулярные основы потребности в Zic в основном неизвестны. Чтобы определить, могут ли Zic гены участвовать в развитии внутреннего уха, мы недавно охарактеризовали экспрессию Zic1-5 (у мышей) и Zic1-4 (у кур) в регионе развивающегося внутреннего уха (Chervenak et al., 2013). Каждый из Zic генов экспрессируется в дорсальной части заднего мозга и в periotic mesenchyme (POM) по соседству с развивающимся внутренним ухом, но не в развивающемся отическом эпителии у эмбрионов мышей и кур. Подобно находкам для др. регионов, где экспрессируются Zic гены (Elms et al., 2004), каждый Zic обладает уникальным паттерном пространственно-временной экспрессии во время развития внутреннего уха, но пространственно-временная экспрессия каждого индивидуального гена Zic частично перекрывается с др. (Chervenak et al., 2013). Более того, Zic гены, как полагают, взаимодействуют с путями передачи сигналов SHH, BMP и WNT (Rohr et al., 1999; Nyholm et al.,2007), каждый из которых участвует в развитии отического пузырька. Zic могут функционировать в самом нейроэпителии, контролируя продукцию паттерн-формирующих сигналов слухового пузырька или внутри POM, чтобы направлять сигналы от одного или более путей, происходящих из нейроэпителия. Альтернативно, они могут участвовать в передаче мезенхимно-эпителиальных сигналов, необходимых для развития внутреннего уха.

В данном исследовании мы использовали анализ фенотипов, чтобы определить, какой, если вообще, играет не перекрывающуюся роль Zic ген мыши во время развития внутреннего уха. Внутреннее ухо животных, гомозиготных по нулевой паре генов Zic1/Zic4 (Grinberg et al., 2004; Blank et al., 2011) было исследовано и было обнаружено, что оно не отличается от такового у животных дикого типа на всех исследованных стадиях между E11.5 и E15.5. Напротив, внутреннее ухо от любого из двух мутантных аллелей Zic2 (Nagai et al., 2000; Elms et al., 2003) обнаруживало разные структурные дефекты, включая потерю эндолимфатического проока и мешка и потерю, укорочение или морфологические уродства полукружных каналов и канала улитки. Кроме того, размер отоциста и возникающего в результате внутреннего уха значительно меньше, чем у сибсов дикого типа. Молекулярный анализ выявил, что инициальное формирование паттерна отоциста (E9.5) происходит как и ожидалось, но аномалии в уровне и/или распределении ключевых транскрипционных факторов нарушены, начиная со ст. E10.5 .

Zic гены кодируют семейство транскрипционных факторов, которое взаимодействует с разными путями передачи сигналов, включая SHH, WNT и BMP пути, которые, как известно, участвуют в развитии внутреннего уха. Каждый Zic белок экспрессируется в POM во время ранних стадий развития внутреннего уха. Мы исследовали впервые, могут ли мутации Zic генов нарушать развитие внутреннего уха. Мы установили, что комбинированная потеря генов Zic1/Zic4 не оказывает видимого эффекта на развитие внутреннего уха, но умеренная или тяжелая потеря функции Zic2 ассоциирует с дисгенезом внутреннего уха. Этот дисгенез может быть прослежен с ранних стадий отического морфогенеза, поскольку нет доказательств инициации эндолимфатического протока на ст. E10.5 и уменьшен размер развивающегося внутреннего уха со ст. E11.5. Формирование инициального паттерна эпителия отоциста, по-видимому, не зависит от функции Zic2 , при этом первые молекулярные дефекты выявляются на ст. E10.5.

Умеренная (Zic2^kd/kd) тяжелая (Zic2^Ku/Ku) потеря функции Zic2 мыши приводит к существенным дефектам морфологии внутреннего уха. Во внутреннем ухе Zic2^kd/kd и дорсальные (вестибулярные) и вентральные (улитковые) структуры тяжело затронуты на ст. E13.5. Дефекты внутреннего уха Zic2^Ku/Ku мышей обнаруживаются раньше, начиная с E11.5, и, скорее всего, они отражают дальнейшее снижение уровня функционального Zic2. У Zic2^Ku/Ku мышей внутреннее ухо обнаруживает или задержку или отсутствие роста как эндолимфатического мешка, так и эндолимфатического и кохлеарного протоков и внутреннее ухо меньше, чем в контроле вдоль A-P (~60% от размера дикого типа) и D-V осей (~50% от размера дикого типа) на E11.5 и E12.5 (Fig. 3). В средине беременности невозможно прямое сравнение Zic2^Ku/Ku и Zic2^kd/kd эмбрионов после E12.5. Поэтому остается неизвестным, действительно ли более тяжелый аллель приводит к др. эффектам в развитии внутреннего уха или ускоряет начало формирования тех же самых дефектов, что и у мышей Zic2^kd/kd. Многие др. ассоциированные с Zic2 фенотипические отклонения являются полу-доминантными (т.e., являются более тяжелыми и имеют более раннее начало в гомозиготном состоянии) (Elms et al., 2003) и возможно, что более тяжелая потеря функции у Zic2^Ku/Ku эмбрионов ускоряет начало образования дефектов.

Во время инициальных стадий развития внутреннего уха Zic2 is экспрессируется в дорсальной части заднего мозга и в мезенхиме, соседствующей с отическим эпителием (Chervenak et al., 2013). Экспрессия Zic2 в мезенхиме распространяется в виде дорсо-вентральной волны между E9.5 и E11.5, при этом экспрессия первоначально ограничена дорсальной и периотической мезенхимой на ст. E9.5 (Chervenak et al., 2013). Клетки периотической мезенхимы, экспрессирующие Zic2, полностью окружают отический эпителий с самого раннего развития, но Zic2 не экспрессируется в отческом эпителии у всех изученных видов (Chervenak et al., 2013). Следовательно, Zic2 действует клеточно неавтономно, чтобы повлиять на морфогенез внутреннего уха.

Имеются несколько возможных механизмов, с помощью которых функция Zic2 может влиять на развитие внутреннего уха. Во-первых, функция Zic2 может быть необходима в нейроэктодерме заднего мозга, чтобы управлять развитием внутреннего уха. Важность заднего уха для рахзвития внутреннего уха демонстрирует анализ мышей с мутацией Hoxa1 или Mafb (aka kreisler) (Vazquez-Echeverria et al., 2008). И Hoxa1 и Mafb являются транскрипционными факторами, которые экспрессируются в заднем мозге, но не во внутреннем ухе, но мутации обоих ассоциируют с дефектами внутреннего уха, включая отсутствие эндолимфатического протока. Аномальное развитие внутреннего уха у этих мутантов приписывается в частности дефектам ромбомера 5 (r5), региона заднего мозга, соседствующего с развивающейся отической плакодой.

Механизм, с помощью которого задний мозг управляет морфогенезом внутреннего уха, не совсем понятен, но потеря гена Gbx2 фенокопирует многие аспекты мутации Kreisler, включая неспособность образования эндолимфатического протока. Gbx2 - это транскрипционный фактор, экспрессирующийся в регионе эндолимфатического протока отоциста и является, скорее всего, ниже стоящей мишенью сигналов от заднего мозга (Lin et al., 2005). Возможность, что дисморфология внутреннего уха возникает в результате потери функции Zic2 в нейроэктодерме особенно соблазнительна в свете известного нарушения формирования паттерна головного мозга у эмбрионов Zic2^Ku/Kus, у которых размер r5 снижается (Elms et al., 2003) и того факта, что измененная экспрессия Gbx2 в отоцисте является первой молекулярной аномалией, выявляемой в развитии внутреннего уха Zic2^Ku/Ku эмбрионов (Fig 9).

Вторая возможность заключается в том, что дефекты внутреннего уха являются вторичными по отношению к дефектам нервной трубки, обнаруживаемыми у Zic2 мутантов. Дефекты закрытия нервной трубки влияют на расположение отоциста относительно заднего мозга (Fig 7), и это может изменять "регион охвата" сигналами WNT, BMP и SHH от заднего мозга к ооциту, приводя в результате формированию измененного паттерна отоциста. Мутации более 240 генов были идентифицированы, приводящие к тяжелым дефектам нервной трубки (Harris and Juriloff, 2007, 2010), но только немногие, такие как Pax2, обнаруживают дефекты нервной трубки и внутреннего уха (Puschel et al., 1992; Torres et al., 1996). Следовательно, косвенно не вытекает, что дефекты нервной трубки предотвращают морфогенез внутреннего уха. Кроме того, мутанты Zic2^kd/kd и Zic2^Ku/Ku имеют тяжелые дефекты нервной трубки (Nagai et al., 2000; Elms et al.,2003), и тяжесть дефектов внутреннего уха коррелирует со снижением функции Zic2.

Также возможно, что дефекты внутреннего уха у Zic2 мутантов (Zic2^kd/kd и Zic2^Ku/Ku) являются непосредственным результатом потери экспрессии Zic2 в периотической мезенхиме. Согласно этому сценарию, Zic2 д. действовать, или способствуя мезенхимно-эпителиальным взаимодействиям, критическим для развития внутреннего уха, или передавая секретируемые сигналы из нейроэпителия к отическому пузырьку, т.е оба управляют морфогенезом отического эпителия. Транскрипционный фактор Tbx1 экспрессируется как в отоцисте, так и POM, а делеция Tbx1 только из POM приводит к дефектам разрастания и спирализации канала улитки (Braunstein et al., 2009). Сходным образом, мыши, нулевые по Brn4, Pou доменовому транскрипционному фактору, в POM, но не в отическом пузырьке, обнаруживают снижение в количестве витков канала улитки (Phippard et al., 1999). Более того, ни экспрессия Tbx1, ни Brn4 в POM не была изменена у Zic2^Ku/Ku эмбрионов. Следовательно, если Zic2 необходим в POM для морфогенеза внутреннего уха, то он действует выше этих транскрипционных факторов. Также возможно, что происходящий и заднего мозга нервный гребень является аномальным у Zic2 мутантных эмбрионов и вносит вклад в избыток POM, наблюдаемый у некоторых мутантов. Наш предыдущий анализ развития клеток нервного гребня у Zic2^Ku/Ku эмбрионов не выявил аномалий происходящего из заднего мозга нервного гребня, что указывает на невозможность такого сценария (Elms et al., 2003). В отсутствие кондиционного аллеля Zic2 делается возможной ткане-специфическая инактивация Zic2, трудно различить, является ли экспрессия Zic2 необходима в нейроэктодерме, POM или обеих тканях.

Гибель в середине беременности Zic2^Ku/Ku эмбрионов мешает анализу слуховой и вестибулярной функции у этих животных. Имеются, однако, доказательства от др. модельных мышей, что экспериментально индуцированные альтерации морфогенеза отоциста могут влиять на функцию внутреннего уха, даже если образуются волосковые и поддерживающие клетки (Hatch et al., 2007; Nichols et al., 2008; Koo et al., 2009). Сходным образом генетические исследования на человеке подтверждают мнение, что стереотипический морфогенез отоциста необходим для нормальной слуховой и вестибулярной функции. Напр., выявляемы дисморфологии внутреннего уха у 30-40% детей приводят к нейросенсорной глухоте (Antonelli et al.,1999; Purcell et al., 2003). Работа, представленная здесь, расширяет список генов мыши, необходимых для корректного морфогенеза отоциста. Более того, ZIC2 белок высоко консервативен у мышей и человека и мутации Zic2 у мышей воспроизводят известные у человека ассоциацию болезни ZIC2 с голопрозэнцефалией (Brown et al., 1998; Warr et al., 2008). Возможно, что потеря функции ZIC2 у людей также может вызывать нарушения развития внутреннего уха и дефицит слуховой и/или вестибулярной функции.

Zic1 и Zic4, как было установлено, имеют перекрывающиеся функции в развитии головного мозга, поскольку потеря или Zic1 или Zic4 в отдельности дает умеренные фенотипические отклонения по сравнению с таковым у двойных мутантов Zic1/Zic4 (Aruga et al., 1998; Grinberg et al., 2004; Blank et al., 2011). Когда мы анализировали морфологию внутреннего уха у Zic1^-/-; Zic4^-/- эмбрионов, то мы не наблюдали каких-либо очевидных крупных морфологических дефектов в размере или форме развивающегося внутреннего уха на ст. E15.5, последней исследованной стадии. Возможно, что Zic1 и Zic4 участвуют в позднем развитии внутреннего уха, таком как развитие и созревание сенсорных участков. Скорее всего, что др. Zic гены выполняют перекрывающиеся роли и могут компенсировать потерю Zic1 и Zic4, поскольку экспрессия Zic1 и Zic4 перекрывается в дорсо-медиальной периотической мезенхиме, где экспрессируются также Zic2 и Zic3 в развивающемся внутреннем ухе кур и мышей (Chervenak et al., 2013).

Our experiments provide the first genetic evidence that the Zic genes are required for morphogenesis of the inner ear. Analysis of inner ear development in Zic2Ku/Ku mutants shows that the dysmorphology is presaged by molecular abnormality of the otic epithelium with the expression level and/or distribution of key transcription factors in the otic epithelium (Pax2 and Gbx2) being altered by Zic2 loss-of-function. Experiments that distinguish whether there is a primary requirement for Zic2 function within the POM or whether earlier neurectoderm defects associated with Zic2 function are responsible for the inner ear development defects await the generation of a Zic2 conditional allele. Given, however, that inner ear dysplasia is often associated with sensorineural hearing loss, Zic2 should be considered as a candidate gene in ongoing efforts to identify the genetic basis of human auditory defects.