Посещений: 
ФОРМИРОВАНИЕ ПОЧЕК
Роль стромальных клеток
|
|
Developmental origins and functions of stromal cells in the normal and diseased mammalian kidney Winny Li, Sunny Hartwig and Norman D. Rosenblum
 Developmental Dynamics Volume 243, Issue 7, pages 853-863, July 2014
|
The kidney is a model developmental paradigm of vertebrate organogenesis. As in many other organs, kidney development involves reciprocal inductive tissue interactions between multiple cell lineages. The most well defined of these interactions occurs between the ureteric bud and the nephrogenic mesenchyme. A population of mesenchymal cells distinct from nephrogenic precursors and termed stromal cells, have been relatively understudied. Yet existing knowledge indicates that stromal cells are critical regulators in the normal and diseased kidney. This commentary reviews current knowledge regarding the origin and functional roles of the stromal cell population during kidney development. Gaps in our current understanding of renal stromal cells and future directions needed to advance this expanding field of study are highlighted. Developmental Dynamics 243:853-863, 2014. © 2014 Wiley Periodicals, Inc.
|
Metanephros: Cellular Compartments and Development
Почки млекопитающих развиваются в три стадии: пронефросы, мезонефросы и метанефросы. В своей зрелой форме почки состоят примерно из 300,000-1.8 миллионов нефронов (Hinchliffe et al., 1991; Nyengaard and Bendtsen, 1992; Hughson et al., 2003) (~7,000-11,000 нефронов у мыши) (Cebri? n et al., 2004; Hoppe et al., 2007). Каждый нефрон состоит из гломерулы, проксимального канальца, петли Генле и и дистального извилистого канальца. Терминальный домен дистального канальца соединен с собирающим канальцем. Каждый собирающий каналец заканчивается в почечной чашевидной полости (calyx), посредством которой моча экскретируется в центральную почечную лоханку и мочеточник. Каждый клубочек (glomerulus) занят афферентными и эфферентными артериолами и располагающимся между ними пучком капилляров, с помощью которых кровь циркулирует по клубочку. Нефроны происходят из метанефрической мезенхимы (бластемы), промежуточного мезодермального производного. Собирающие канальцы происходят из мочеточникового зачатка, также производного промежуточной мезодермы. Эмбриональные почки организованы в дискретные зоны (Fig. 1A). Наиболее наружный слой называется почечной капсулой, которая состоит из стромальных клеток. Происхождение и функция этих клеток будут рассмотрены ниже. Почечная кора лежит под капсулой и состоит из наружной нефрогенной зоны, где инициируется образование нефронов, и внутренней зоны, где располагаются созревающие нефроны. Мозговое вещество располагается ниже кортекса и содержит удлиняющиеся проксимальные канальцы, петли Генле и собирающие канальцы.
Figure 1. Structural organization of the embryonic kidney. A: The developing metanephros consists of discrete compartments. The renal capsule envelops the kidney and contains capsular stromal cells. The outer cortex (nephrogenic zone) beneath the capsule is the site where nephrogenesis is initiated. The inner cortex consists of maturing nephrons. The medulla lies interior to the cortex and contains developing tubules that penetrate deep into the kidney tissue. B: Higher resolution images of the cortical nephrogenic zone, underlying cortex and renal medulla. Nephron elements within these zones are highlighted in the adjacent schematic. Метанефрические (постоянные) почки развиваются посредством серии повторяющихся ветвлений и индуктивных событий между зачатком мочеточника и соседней метанефрической мезенхимой. Развитие метанефросов начинается приблизительно на день эмбриогенеза (E) 10.5 у мышей, тогда как мочеточниковый зачаток (ureteric bud), каудальный эпителиальный вырост из Вольфовых протоков, проникает в окружающую метанефрическую мезенхиму (Grobstein, 1956). Повторные раунды морфогенеза ветвления и индукции нефронов происходят внутри нефрогенной зоны (Fig. 1B). Три основных клеточных компартмента присутствуют в нефрогенной зоне: (i) зарождающиеся ureteric кончики, которые подвергаются последовательным раундам ветвления, элонгации и дифференцировки, чтобы сформировать собирающие канальцы; (ii) мультипотентные, само-обновляющиеся нефрогенные предшественники из Six2+;Cited1+ клеточной популяции (Rothenpieler and Dressler, 1993; Kobayashi et al., 2008) (cap мезенхима) которые вызывают уплотнения вдоль поверхности уретрических кончиков, подвергаются мезенхимно-эпителиальному переходу (MET) и формируют эпителий нефронов; и (iii) и наружный слой мезенхимных стромальных и интерстициальных клеток, которые вносят вклад в почечную капсулу и интерстиций. Последовательные волны индукции нефронов в нефрогенной зоне умножают центробежный рост и экспансию почек, смещая внутрь более старые генерации уретрических кончиков, почечных пузырьков и стромальных предшественников, они завершаются на 36 неделе. Более того, нет доказательств, подтверждающих, что новые нефроны могут формироваться после этого времени.
Пионерская эмбриологическая работа Clifford Grobstein продемонстрировала необходимость реципрокных индуктивных взаимодействий между метанефрической мезенхимой и уретрическим зачатком (Grobstein, 1956). Получено множество информации об этих взаимодействиях и молекулярных механизмах, необходимых для развития мочеточников и нефронов. Напротив, меньше известно о регуляторных сетях, управляющих развитием и функцией стромальных клеток. Интерстициальные клетки взрослых почек исторически рассматривались как просто популяция поддерживающих клеток. Однако, исследования по генному таргеттингу на мышах продемонстрировали незаменимую регуляторную роль стромальных клеток во время развития почек, репарации почек взрослых и для патобиологии фиброза почек. Кстати, идентифицировано очень мало маркеров, характеризующих предшественников стромальных клеток и дифференцированных дочерних клеток. Молекулярные пути, участвующие в развитии и функции стромальных клеток, также, как и временные и молекулярные сигналы, специфицирующие судьбу стромальных клеток, в основном неизвестны. Более того, типы и функциональные роли производных стромальных клеток только начинают выявляться в норме и при болезни. Увеличиваются знания, связанные с этими вопросами.
Development and Organization of the Renal Stroma
Клетки стромальных предшественников могут быть идентифицированы в метанефрической мезенхиме вскоре после инвазии уретрического зачатка в виде популяции, продуцирующих матрикс, веретенообразных мезенхимных клеток, окружающих метанефрическую мезенхиму (Fig. 2A) (Hatini et al., 1994, 1996). Foxd1, член семейства forkhead транскрипционных факторов является самым ранним из известных специфических маркеров стромальных клеток (Hatini et al., 1996). Foxd1 слабо экспрессируется в метанефросах самое раннее с E10.5 и сильно экспрессируется в стромальных предшественниках со ст. E11.5 (Fig. 2B) (Hatini et al.,1996; Bohnenpoll et al., 2013). По мере развития почек Foxd1 + клетки стромальных предшественников интегрируются на периферии нефрогенной зоны (Fig. 2C), этот процесс регулируется с помощью Hox10 (Yallowitz et al., 2011), и они также наблюдаются внутри нефрогенной зоны, занимая пространства между веточками уретрического зачатка и индуцируемым нефронами. На ст. E14.5, когда извилистые канальцы нефронов развиваются в наружном кортексе и петли Генле распространяются в медуллу, то могут быть идентифицированы самостоятельные капсулярные, кортикальные и медуллярные стромальные популяции (Fig. 2D) (Levinson et al., 2005).
Figure 2. Development of the renal stroma. A: At E10.5, the ureteric bud (purple) invades the surrounding metanephric mesenchyme (pink), inducing the mesenchyme to aggregate (violet cells). Peripheral to the metanephric mesenchyme is a domain of Foxd1+ stromal progenitor cells (yellow cells). B:At E11.5, the metanephric mesenchyme induces the ureteric bud to bifurcate. Concomitantly, the ureteric bud induces the surrounding mesenchyme to survive, proliferate, and condense around ureteric tips, forming caps of nephron progenitor cells that will differentiate into nephrons. C: As branching morphogenesis of the ureteric tree proceeds (E12.5-E13.5), stromal progenitors are found in the outer nephrogenic zone (pink) as well as surrounding ureteric bud branches and induced nephrons (orange). D: By E14.5, three distinct stromal populations are established: the capsular stroma (beige) of the renal capsule that envelops the kidney, cortical stroma (yellow) intercalating between nephrogenic structures and ureteric tips, and medullary stromal cells (red). Stromal progenitor cells remain in the nephrogenic zone (pink).
Стромальные клетки капсулы почки покрывают почку в виде непрерывного слоя уплощенных клеток и экспрессируют на высоком уровне Sfrp1 (secreted frizzled-related protein), который противодействует передаче сигналов Wnt4 (Yoshino et al., 2001; Levinson et al., 2005). Непосредственно под капсулой почки располагается кортикальная строма, которая интеркалирует и окружает индуцируемые нефрогенные структуры. И капсулярные и кортикальные стромальные клетки экспрессируют Foxd1 и Raldh2 в раннем развитии почек (Mendelsohn et al., 1994; Hatini et al., 1996; Levinson et al., 2005).
Медуллярные стромальные клетки экспрессируют Ffg7, Bmp4 и tenascin-C (Mendelsohn et al., 1999; Levinson and Mendelsohn, 2003; He et al., 2013). Pod1 и Pbx1 экспрессируются как в кортикальной, так и медуллярной строме (Cui et al., 2003; Schnabel et al., 2003a). Молекулярные различия между кортикальными и медуллярными стромальными клетками подтверждают, что эти стромальные популяции могут иметь разное происхождение (см. ниже). Клетки медуллярной стромы дают зрелые интерстициальные клетки, гладкомышечные сосудистые клетки и перициты (Humphreys et al., 2010). Субпопуляция медуллярных стромальных клеток подвергается апоптозу во время поздней гаструляции, что совпадает со спуском петель Генле в направлении сосочка (Vize et al., 2003), т.е. потенциально способствует удлинению петель Генле или собирающих протоков по мере их проникновения в мозговой слой (medulla).
Нефрогенез прекращается в раннем постнатальном периоде у мыши, ускоряется постепенное снижение в размере и скорости пролиферации популяции предшественников нефронов (Rumballe et al., 2011) и потеря экспрессии маркеров предшественников нефронов, включая Six2, Cited1, Meox2 и Eya1 а также маркеров уретрических зачатков Wnt11 и Ret на ст. P4 (Hartman et al., 2007). Компартмент стромальных предшественников также теряется во время раннего постнатального периода, на это указывает снижение экспрессии Foxd1 до почти не обнаружимого уровня к стадии P3, подтверждая завершение дифференцировки стромальных клеток с принятием окончательной судьбы.
Developmental Origins of the Renal Stroma
Эмбриологическое происхождение почечной стромы недостаточно определено. Эксперименты по картированию судеб на мышах с использованием индуцибельной системы Osr1CreERt2, продемонстрировало, что большинство типов клеток почек, включая уретрические зачатки, предшественники нефронов (Six2+), стромальные предшественники (Foxd1+), сосудистые и гладкие мышцы, все они происходят из общей Osr1+ популяции клеток метанефрических предшественников (Fig. 3) (Mugford et al., 2008). Osr-1 экспрессируется в мезодерме до её подразделения на параксиальный и промежуточный домены и в последствии в промежуточной мезодерме и латеральной пластинке (Wang et al., 2005; James et al., 2006). Перед началом метанефрического развития существуют молекулярно отличающиеся по Six2+ и Foxd1+ популяции внутри Osr1+ популяции (Mugford et al., 2008). Если Osr1 необходим для образования предшественников Six2+ нефронов, то молекулярные сигналы, которые инструктируют образование Foxd1+ стромальных клеток в основном остаются неизвестными. Вполне вероятно, что подобно лицевой мезенхиме, Foxd1 в строме почки находится под позитивной регуляцией передачи сигналов Hedgehog (Jeong et al., 2004). Действуют ли морфогены hedgehog прирожденно в строме почки для собственно её поддержания и жизнеспособности ещё предстоит выявить на эмбриональных почках.
Figure 3. Developmental origins of the renal stroma. The renal stroma has been proposed to originate from several embryonic tissue sources, including the intermediate mesoderm and paraxial mesoderm. In the early metanephric field, Osr1+ progenitors of the intermediate mesoderm give rise to Six2+,Tbx18+, and Foxd1+ lineages. Uncommitted Tbx18+ cells near the ureteric stalk lose expression of Tbx18 and give rise to Foxd1+ medullary stroma. A subset of Foxd1+ cells derived from Osr1+ progenitors later give rise to the cortical and medullary stroma. The paraxial mesoderm is a principle source of renal stroma in chick embryos.
Эксперименты по прямому картированию судеб у эмбрионов кур подтвердили, что промежуточная мезодерма является источником эпителия нефронов. Очевидно, что параксиальная мезодерма идентифицируется как принципиальный источник почечной стромы у развивающихся эмбрионов кур, поскольку клоны меченных клеток, происходящие от параксиальной мезодермы локализуются в зонах Foxd1+ стромы развивающихся почек (Guillaume et al., 2009). Клоны меченных клеток также обнаруживают паттерны экспрессии, соответствующие сосудистым гладкомышечным клеткам, миофибробластам, перицитам и мезангиальным клеткам, все они, как известно, производные Foxd1+ стромальных клеток (Guillaume et al., 2009; Humphreys et al., 2010). Источник почечных стромальных клеток у др. модельных организмов в основном неизвестен. Foxd1 гомологи были идентифицированы в параксиальной мезодерме и развивающихся почках камбалы (Zhang et al., 2012), и в параксиальной мезодерме рыбок данио (Odenthal and N? sslein-Volhard, 1998; G? mez-Skarmeta et al., 1999; Zhang et al., 2012). Однако эксперименты по отслеживанию клонов и функциональные исследования необходимы для выяснения вклада этих клеток в развивающиеся почки.
Экспрессия гена Tbox транскрипционного фактора Tbx18 предопределяет определенную субпопуляцию клеток внутри раннего Osr1+ метанефрического поля (Airik et al., 2006). Впервые выявляемая в полоске мезенхимы между метанефросами и Вольфовыми протоками на ст. E10.5, экспрессия Tbx18 впоследствии становится ограниченной популяцией недетерминированной мезенхимы по бокам от стебля мочеточника (ureter stalk) и мезенхимными клетками мочеточников во время почечного развития. Недетерминированные мезенхимные клетки теряют экспрессию Tbx18 и вносят вклад в Foxd1+ стромальные, мезангиальные и гладкомышечные клетки в медиальном регионе почек (Bohnenpoll et al., 2013).
Differentiated Cell Types Derived from the Renal Stroma
Популяция Foxd1+ стромальных предшественников дает разнообразные не эпителиальные клетки взрослых почек, включая предшественники сосудистого эндотелия и постоянно присутствующие фибробласты (Fig. 4).
Figure 4. Differentiated cell types derived from the renal stroma. Foxd1+stromal progenitors give rise to multiple cell types within the kidney, including vascular progenitors, mural cells, and resident fibroblasts.
Vascular progenitors
Ангиогенез и васкулогенез являются критическими процессами во время формирования почечных кровеносных сосудов (Robert et al., 1996; Lancrin et al.,2010; Sequeira Lopez and Gomez, 2011). Ангиогенез врастания, а именно, образование новых сосудов от уже существующих, играет важную роль в образовании основных почечных сосудов и капилляров клубочков, а также в элонгации сосудистой сети во время позднего развития почек (rev. Sequeira Lopez and Gomez, 2011). Напротив, васкулогенез, а именно, дифференцировка Flk1+ клеток предшественников гемангиобластов (Chung et al., 2002), по-видимому, играет более важную роль в ранних эмбриональных почках. Источник почечных гемангиобластов давно служит предметом споров. Отслеживание клонов Osr1+ клеток предоставило доказательства, что Osr1+ клетки в ранней промежуточно мезодерме дают Flk1+ сосудистые эндотелиальные клетки в почках (Mugford et al., 2008). Используя комбинацию анализа FACS и иммунофлюоресценцию одновременно метки Foxd1+ стромальных клеток и эндотелиальных маркеров у эмбриональных и после рождения мышей, был идентифицирован Foxd1+ стромальный клон в качестве источника околоканальцевых клеток капиллярного эндотелия почек (Sims-Lucas et al., 2013). Выделение стромальных клеток почек, формирующих подобные эндотелиальным трубочки и экспрессирующие PECAM in vitro, и способные к эндоцитозу Ac-LDL, что характеризует функцию специфических эндотелиальных клеток. Эксперименты по отслеживанию клонов у Foxd1Cre репортерных мышей продемонстрировали, что стромальные клетки вносят вклад в образование капилляров около канальцев, но не участвуют в формировании клубочковых и крупных почечных сосудов, показывая гетерогенность клонов эндотелиальных клеток (Sims-Lucas et al., 2013).
Механизмы, с помощью которых происходящий из Foxd1 эндотелий взаимодействует с др. эндотелиальными предшественниками и ангиогенными сосудами, чтобы сформировать сложную сосудистую систему почек, остаются неизвестными. Почечные болезни разной этиологии ассоциируют с порчей почечной микроваскулатуры. Поэтому выявление механизмов, которые регулируют дифференцировку Foxd1+ эндотелиальных предшественников и образование сосудистой сети, важно не только для нашего понимания почечного органогенеза, но и также это новый путь сохранения структуры почечных сосудов и может привести к разработке лечения врожденных и приобретенных сосудистых почечных болезней.
Vascular support: Mural cells
Humphreys et al. (2010) предприняли элегантный клональный анализ у мышей с использованием Six2Cre, HoxB7Cre и Foxd1Cre репортерных линий, чтобы пометить нестираемой и наследуемой меткой все эндотелиальные клетки нефронов или все стромальные клетки во взрослых почках мышей, а также у двух моделей почечного фиброза. Эти исследования четко продемонстрировали, что Foxd1+ стромальные предшественники дают сосудистый гладкомышечные клетки, перициты и клубочковые мезангиальные клетки во время нормального развития почек и идентифицировали Foxd1+ интерстициальные перициты в качестве принципиального источника миофибробластов при болезнях почечного фиброза (см. ниже).
Передача сигналов Notch в стромальных предшественниках важна для образования мезангиальных клеток в развивающихся клубочках мышей. Foxd1Cre -зависимая делеция RBPjk, который кодирует широко распространенный ДНК-связывающий партнер всех активных Notch рецепторов, приводит к аневризме клубочков и перинатальной гибели из-за отсутствия мезангиальных клеток в клубочках. Очевидно, что эмбриональные RBPjk -мутантные почки не экспрессируют молекулярные маркеры клеток мезангиальных предшественников, указывая на невозможность образования мезангиальных клеток скорее, чем на неспособность миграции в сосудистый расщеп (cleft) S-образных тел (Boyle et al., 2014).
Foxd1+ предшественники могут дифференцироваться, чтобы сформировать renin-позитивные клетки околоклубочкового аппарата, который модулирует давление крови и гомеостаз жидкости-электролита в зрелых почках (Berg et al., 2013; Sequeira Lopez et al., 2001). Доказательства, получаемые при исследовании эмбриональных почек мышей, показывают, что клетки с renin генетически родственны перицитам, которые являются Foxd1+ производными (Brunskill et al., 2011). Почечные интерстициальные перициты, как было установлено, синтезируют renin во время нормального развития плода и в ранней постнатальной жизни, указывая тем самым на тесную ассоциацию этих двух типов клеток (Berg et al., 2013). Более того, определении профиля транскриптома renin+ клеток, выделенных от Ren1c-YFP мышей, выявило мРНК, которые также экспрессируются в артериальных и интерстициальных перицитах (Brunskill et al., 2011). Итак, эти данные подтверждают потенциальные клональные и/или функциональные взаимоотношения между renin+ клетками и перицитами.
Interstitial fibroblasts and roles in the adult kidney
Интерстициальный фибробласты определяются как не эпителиальные, не сосудистые и не воспалительные клетки интерстициума и являются принципиальным клеточным составляющим интерстициума (Strutz and Zeisberg, 2006). Фибробласты ответственны за синтез коллагена, из которого формируется фибриллярный внеклеточный матрикс соединительной ткани. Во взрослых почках фибробласты могут обнаруживаться в регионах около канальцев и сосудов с варьирующей ассоциацией с капиллярами и капиллярными базальными мембранами (Kaissling et al., 1996).
При болезненных состояниях почек, таких как фиброз, было предположено, что эпителиальные клетки подвергаются эпителиально-мезенхимному переходу (EMT), чтобы сформировать миофибробласты, принципиальный патогенный тип клеток при почечном фиброзе (Lin et al., 2008; Humphreys et al., 2010). Исследования на мышах с использованием маркирования генетических судеб эпителиального и стромального компартментов в двух моделях фиброза (UUO и ischemia-reperfusion injury), противоречат этой превалирующей модели (Lin et al., 2008; Humphreys et al., 2010). В ответ на UUO или ишемию из-за повторных перфузий повреждений отслеживание клонов продемонстрировало, что огромное большинство миофибробластов во время фиброза возникает из Foxd1+ перицитов и околососудистых фибробластов in vivo? которые дифференцируются в миофибробласты и подвергаются пролиферативной экспансии во время фиброза (Lin et al., 2008; Humphreys et al., 2010). Важным значением этих находок является то, что пертурбации в эндотелии могут быть ранним инициирующим событием фиброза. Околососудистые фибробласты и перициты играют роль в стабилизации соседних эндотелиальных клеток и тем самым в формировании микроциркуляторного сосудистого ложа. Поскольку эндотелиальные клетки и перициты контактируют др. с др. в почечном интерстиции, то эндотелиальные факторы, такие как PDGF, могут представлять собой первую ступень в обеспечении дифференцировки перицитов в клетки миофибробластов. Кроме того, перициты и эндотелиальные клетки обнаруживают интимные пространственные и физические взаимоотношения с присутствующими постоянно и мигрирующими клетками иммунной системы, чтобы модулировать стабильность и репарацию сосудов. Патофизиологическое взаимодействие между всеми этими сигнальными путями может в принципе вносить вклад в прогрессирование болезни и фиброз ткани и нуждается в дальнейшем изучении.
В здоровых взрослых почках кортикальные фибробласты экспрессируют связанный с мембраной энзим ecto-5'-nucle-otidase (5'NT). 5'NT катализирует превращение 5'-AMP во внеклеточный аденозин, который модулирует микроциркуляцию, регулируя локальную гемодинамику (Le Hir and Kaissling, 1993). 5'NT+ кортикальные фибробласты также являются источником почечного erythropoietin (EPO), главного регулятора эритропоэза (Bachmann et al., 1993; Maxwell et al., 1993). В результате пациенты, страдающие от хронических болезней почек (CKD) часто имеют анемию из-за уменьшения или потри EPO-продуцирующих клеток или потери ими способности продуцировать EPO (Asada et al., 2011). Понимание клонального происхождения EPO-продуцирующих клеток может быть пригодно для генерации EPO-продуцирующих клеток из стволовых клеток и поэтому целью наших усилий является идентификация лежащих в основе молекулярных механизмов, ответственных за продукцию дефектного EPO у пациентов с CKD.
Локализация медуллярных фибробластов вокруг регионов, где происходит обмен жидкости и растворов, а именно, собирающих канальцев, петель Генле и vasa recta, связана с выполнением потенциальной роли этих клеток в регуляции локальной гемодинамики, концентрации и экскреции мочи. Медуллярные интерстициальные клетки, как было установлено, экспрессируют множественные рецепторы влияющих на сосуды пептидов и являются основным местом синтеза и секреции агентов, подавляющих сосуды, таких как medullipins и prostaglandins (Zhuo, 2000). Медуллярные фибробласты реагируют на вазоактивные субстанции и пептиды разными клеточными реакциями, включая сокращения, синтез prostaglandin и/или синтез ECM in vitro (Zhuo, 2000). Однако роль медуллярных фибробластов в качестве паракринных мишеней для различных вазоактивных соединений в регуляции функции медуллярной части почек и в гомеостазе кровяного давления всё ещё исследуется in vivo.
Functional Roles of the Renal Stroma During Kidney Development
Первоначально считалось, что строма выполняет чисто поддерживающую функцию во время морфогенеза почек, но недавние генетические исследования на мышах продемонстрировали важную роль предшественников почечной стромы в формировании капсулы почек, нефрогенезе, морфогенезе уретрического ветвления и формировании гладкомышечных клеток во время развития почек (Table 1).
Table 1. Stromal Gene Mutations Resulting in Renal Defects in Mice
Renal capsule formation
Идентификация Foxd1 в качестве маркера стромальных клеток почек и получение Foxd1 нокаутных мышей (Hatini et al., 1994, 1996) стало основой нашего понимания функции стромальных клеток во время развития почек. Гомозиготные делеции Foxd1 вызывают дефекты капсулы почек, характеризующиеся утолщением, гистологически аномальной капсулой почек и снижение экспрессии маркеров стромы и капсулы Raldh2 и Sfrp1 (Hatini et al., 1996; Levinson et al., 2005). Напоминающие Foxd1 нулевых мышей, Hox10 тройные паралогичные мутанты обнаруживают сходное отсутствие образование капсулы, как это подтверждается отсутствием экспрессии Sfrp1 и tenascin-C на периферии почек (Levinson et al., 2005; Yallowitz et al., 2011). Hox10, однако не регулирует инициальное образование стромальных клеток, но способствует собственно интеграции Foxd1 -экспрессирующих клеток в почках (Yallowitz et al., 2011). Аномальное образование капсулы почек в обеих нокаутных моделях не только нарушает созревание капсулы, но и также нарушает формирование пространственного паттерна подлежащей нефрогенной зоны (Levinson et al., 2005; Yallowitz et al., 2011). Состоящие из раздельных частей зоны индукции (нефрогенная зона) и дифференцировки (juxtamedullary регион) неспособны формироваться у мутантов Foxd1, задерживая тем самым дифференцировку нефронов (Levinson et al., 2005). Эктопическая экспрессия Bmp4 в капсуле как Foxd1- , так и Hox10-дефицитных мышей подтверждает, что аномальная передача сигналов Bmp4 в расположенную ниже нефрогенную зону нарушает морфогенез ветвления и ингибирует дифференцировку нефронов в мутантных почках (Levinson et al., 2005; Yallowitz et al.,2011).
Nephrogenesis: Nephron progenitor differentiation
Становление полного набора нефронов зависит от баланса между самообновлением и дифференцировкой предшественников нефронов. Предыдущее исследование показало, что экспрессируемый Wnt9b в уретрическом зачатке передает сигналы посредством β -catenin клеткам предшественников нефронов с помощью двух молекулярно и пространственно различающихся программ (i) способствует обновлению и пролиферации предшественников и (ii) индуцирует дифференцировку претубулярных агрегатов (PTA) (Karner et al., 2011). В отсутствие Wnt9b, домен предшественников специфицируется, но не способен расширяться, в то же время не происходит индукции PTA и почечных пузырьков (Carroll et al., 2005; Karner et al., 2011). Как Wnt9b способствует судя по виду двум противоположным процессам, непонятно. Fat4, атипичный cadherin, экспрессирующийся в строме, как было установлено, кооперирует с Wnt9b, чтобы противодействовать обновлению предшественников нефронов и способствовать дифференцировке нефрогенных предшественников (Das et al., 2013). Fat4 способствует дифференцировке предшественников путем усиления экспорта в ядро Yap/Taz внутри клеток предшественников. Ядерные Yap/Taz кооперируют с β -catenin, чтобы активировать Wnt9b ген мишень для дифференцировки нефронов, тогда как потеря ядерного Yap/Taz активирует Wnt9b гены мишени для обновления предшественников нефронов. Подобно находкам, наблюдаемым у Foxd1 -дефицитных мышей, инактивация Fat4 или генетическое устранение Foxd1+ стромальных клеток с помощью Cre-обеспечиваемой экспрессии дифтерийного токсина приводят к накоплению клеток недифференцированных предшественников нефронов (Hatini et al., 1996; Levinson et al., 2005; Das et al., 2013; Hum et al., 2014). Принимая во внимание, что устранение Foxd1+ клеток по большей части воспроизводит фенотип, обнаруживаемый при генетическом нокауте Foxd1 (Hum et al., 2014), это подтверждает, что потеря Foxd1, а не самих клеток, является причиной возникающего фенотипического отклонения Более того, это также указывает на то, что Foxd1-зависимые сигналы являются критическими в обеспечении коммуникаций между стромальными и нефрогенными популяциями.
Клетки предшественники нефронов становятся сенсибилизированными к индуктивным эффектам передачи сигналов Wnt в результате потери экспрессии Cited1, переход, который регулируется с помощью активности Bmp-Smad (Brown et al., 2013). На ст. E15.5 в Foxd1-/- почках большинство клеток предшественников нефронов аномально сохраняет экспрессию Cited1, указывая на неспособность инициальной ступени дифференцировки предшественников нефронов у Foxd1-/- мутантов (Fetting et al., 2014). Decorin (Dcn), который кодирует малый протеогликан, который действует, чтобы противодействовать передаче сигналов Bmp-Smad, был идентифицирован в качестве транскрипционной мишени для Foxd1 в кортикальных интестициальных клетках. Обычно репрессированный с помощью Foxd1 в кортикальной строме, Dcn эктопически экспрессируется в Foxd1 -нулевых почках; компаундные Foxd1-Dcn мутантные почки обнаруживают частичное восстановление дифференцировки клеток предшественников нефронов in vivo. Итак, эти исследования охарактеризовали важную роль стромальных клеток в регуляции дифференцировки клеток предшественников нефронов in vivo.
Ureteric branching morphogenesis
Стромальные клетки экспрессируют факторы, которые регулируют ветвление уретрического зачатка и нефрогенез. Ретиноевая кислота (RA), активная форма витамина A, является критическим модулятором уретрического ветвления и необходима для поддержания экспрессии Ret в клетках кончика уретрического зачатка (Mendelsohn et al.,1999). Ret кодирует рецепторную тирозин киназу, чьим лигандом является Gdnf и чьей нижестоящей мишенью является Wnt11 в уретрических кончиках. Передача сигналов Gdnf-Ret необходима как для образования уретрического зачатка, так и для продолжающегося его ветвления (Schuchardt et al., 1996). Raldh2, экспрессирующийся в кортикальных стромальных клетках (Niederreither et al., 1999) является принципиальным энзимом, ответственным за синтез RA в почках (Rosselot et al., 2009), тогда как рецепторы ретиноевой кислоты α и β2 (RARα и RARβ2) экспрессируются как в почечной строме (Mendelsohn et al., 1999; Batourina et al., 2001), так и в уретрическом зачатке (Schmidt-Ott et al., 2006). Анализ мутантных мышей, экспрессирующих доминантно негативные RARs в уретрических зачатках показал, что RARs в уретрическом зачатке (но не в строме) являются главными медиаторами RA-зависимой экспрессии Ret в уретрическом зачатке (Rosselot et al., 2009). Эти результаты подтверждают присутствие оси передачи сигналов строма-уретрический зачаток, вдоль которой RA синтезируется с помощью Raldh2 в кортикальной строме, действуя на RARs в соседних уретрических клетках, индуцируя экспрессию Ret и способствуя морфогенезу ветвления in vivo .
Недавно получение профиля экспрессии гена Foxd1+ в клетках, выделенных из Foxd1eGFPCre почек, культивируемых в присутствии или отсутствии RA, выявило новую стромальную мишень, регулируемую с помощью RA, секретирующую Extracellular matrix 1 (Ecm1) (Paroly et al., 2013). Ecm1 избирательно экспрессируется в кортикальной строме, которая только при непосредственном контакте с уретрическим зачатком в cleft домене, где обычно происходит бифуркация - месте, где экспрессия Ret обычно подавляется. Блокирование активности Ecm1 с помощью специальных для Ecm1 блокирующих антител в эксплантах эмбриональных почек приводит к эктопической экспрессии Ret во всех уретрических кончиках, включая cleft домен ex vivo. Уретрическое ветвление и общий размер почек значительно редуцируются в этих эксплантах. Эти результаты подтверждают, что передача сигналов ретиноидов в строме активирует Ecm1, который, в свою очередь, действует апокринным способом, чтобы подавлять экспрессию Ret в уретрическом расщеплении (cleft), тем самым ограничивая Ret уретрическими кончиками и потенциально облегчая бифуркации в уретрическом зачатке во время морфогенеза ветвления in vivo (Paroly et al., 2013).
Помимо Ecm1, строма также секретирует др. сигналы, модулирующие дифференцировку соседних эпителиальных клеток in vitro. дин такой сигнал, placental growth factor (Pigf) был идентифицирован как нижестоящая транскрипционная мишень для Foxd1 (Zhang et al., 2003). Pigf экспрессируется совместно с Foxd1 в строме на ст. E12.5 и не обнаружим в почках, нулевых по Foxd1. Добавление рекомбинантного PIGF к культивируемым рудиментам почек стимулирует морфогенез ветвления ex vivo (Zhang et al., 2003). Принимая во внимание, что Pigf нулевые мыши не обнаруживают видимых дефектов почек (Carmeliet et al., 2001), подозревается участие дополнительных, ещё не идентифицированных стромальных секретируемых факторов, совместно регулирующих уретрическое ветвление in vivo.
Развивающиеся почки экспрессируют все компоненты renin-angiotensin system (RAS). Генетическая активация RAS элементов (ATG, renin, AT1 и ACE инактивация) у мышей приводит к врожденным аномалиям почек и мочевых путей (congenital anomalies of the kidney and urinary tract (CAKUT)), характеризующихся гипоплазией почечного медуллярного слоя и гидронефрозом (Esther et al., 1996; Nagata et al., 1996; Oliverio et al., 1998). Вместе с исследованиями in vitro эти находки подтверждают роль RAS в регуляции морфогенеза ветвления in vivo (rev. Yosypiv, 2004, 2011). В RAS, renin расщепляет angiotensinogen (ATG), чтобы создать angiotensin (ANG) I, который затем превращается в ANG II с помощью фермента angiotensin-converting enzyme (ACE). ANG II является принципиальной эффекторной молекулой для RAS, который действует посредством двух рецепторов AT1 и AT2, которые экспрессируются на высоком уровне в уретрическом зачатке in vivo и в меньшей степени в окружающей строме во время развития почек (Yosypiv et al., 2006; Song et al., 2010a). Т.к. строма почек экспрессирует и AGT и renin (Sequeira Lopez et al., 2001; Iosipiv and Schroeder, 2003), то локализация RAS медиаторов с уретрическом зачатке и окружающей строме открывает возможность, что ANG II генерируется локально в строме, действуя паракринным способом на возникающие уретрические зачатки, экспрессирующие AT рецепторы, чтобы регулировать морфогенез ветвления. Воздействие на уретрические зачатки в трехмерном коллагеновом геле с помощью ANG II стимулирует ветвление уретрического зачатка in vitro в виде реакции, зависимой от дозы, которая может быть блокирована предварительным воздействием антагониста AT1 рецептора candesartan (Iosipiv and Schroeder,2003). Сходным образом, воздействие на экспланты E11.5 эмбриональных почек ANG II стимулирует ветвление уретрического зачатка ex vivo, тогда как воздействие candesartan ингибирует ветвление (Yosypiv et al., 2006). ANG II индуцирует экспрессию Gdnf, Ret и Wnt11 в эксплантах почек ex vivo, подтверждая, что RAS может стимулировать ось Gdnf-Ret-Wnt11 in vivo. Foxd1 может действовать как вышестоящий регулятор RAS и стимулировать продукцию AGT или renin в строме или уретрическом зачатке, чтобы способствовать ветвлению. Исследования с условным удалением, которые вызывали бы нокаут стромальных или уретрических компонентов RAS, необходимы для завершения имеющихся доказательств in vitro? чтобы выявить роль RAS во время развития почек in vivo. Эти исследования особенно цены для изучения и лечения случаев CAKUT у человека, обусловленных RAS генными мутациями.
Pod1 и Pbx1 транскрипционные факторы, экспрессирующиеся в строме почек и др. клетках во время развития почек, являются важными медиаторами морфогенеза ветвления уретрического зачатка, MET и гломерулогенеза (Quaggin et al., 1999; Cui et al., 2003; Schnabel et al., 2003a). Дефекты почек у Pod1 нокаутных мышей напоминают те, что наблюдаются у Foxd1 нокаутных мышей (Quaggin et al., 1999; Cui et al., 2003; Schnabel et al.,2003a). Подобно Foxd1 -нулевым мышам, Pod1-дефицитные почки обнаруживают расширенные домены предшественников нефронов, эктопическую экспрессию Ret в мочеточниковых стеблях, а также дефекты уретрического ветвления. Pod1 -нулевые почки обнаруживают арест образования клубочков на стадии развития капиллярных петель. Анализ химер с использованием Pod1 нулевых мутантных эмбриональных стволовых клеток с клетками дикого типа показал, что Pod1 необходим в Foxd1+ популяции стромальных клеток, но не в клетках предшественниках нефронов, чтобы способствовать дифференцировке предшественников нефронов. Pod1 также действует клеточно автономным способом, чтобы способствовать дифференцировке мезенхимных клеток в интерстициальные и перицитарные клоны клеток in vivo (Cui et al., 2003).
Pbx1 нокаутные мыши обнаруживают односторонний агенез почек и др. аномалии почек. Наименее тяжело затронутые Pbx1-нулевые почки обнаруживают дефекты уретрического ветвления, которые очень похожи на таковые в Foxd1 и Pod1 мутантных почках, включая расширенный домен предшественников нефронов и задержку нефрогенеза. Заметим, что экспрессия Foxd1 не нарушена ни у Pod1 ни у Pbx1 мутантов, это подтверждает, что Pod1 и Pbx1 функционируют параллельно или ниже Foxd1. Генерация Pod1Cre драйве линии могло бы помочь понять генетическое взаимодействие между Pod1, Pbx1 и Foxd1 in vivo (Maezawa et al., 2012).
Smooth muscle differentiation
Wnt4, экспрессируемый в PTAs, играет важную роль в MET во время нефрогенеза (Stark et al., 1994; Kispert et al., 1998). Wnt4 также выявляется в медуллярной строме вокруг зачатка мочеточников на ст. E14.5 (It? ranta et al., 2006). Wnt4- дефицитные эмбриональные почки характеризуются потерей экспрессии Bmp4 в околоуретрических медуллярных стромальных клетках и неспособностью стромальных клеток подвергаться дифференцировке в гладкомышечные клетки, определяемой по полному отсутствию экспрессии α -SMA (Itaranta et al., 2006). Экзогенный Bmp4 способен восстанавливать дифференцировку α-SMA+ клеток в Wnt4-дефицитных почечных эксплантах. Сходным образом, передача сигналов Wnt4 восстанавливает экспрессию Bmp4 и индукцию α -SMA in vitro (Itaranta et al.,2006). Итак, эти результаты подтверждают, что Wnt4 индуцирует экспрессию Bmp4 в околоуретрических медуллярных стромальных клетках, способствуя дифференцировке гладкомышечных клеток in vivo.
Functional Contribution of Stromal Cells to Renal Disease
Failure of normal renal positioning
Во время эмбриогенеза почки поднимаются из таза, чтобы принять окончательное положение справа и слева в renal fossa, соотв. Анализ Foxd1-дефицитных мышей предоставил информацию о механизмах, которые могут лежать в основе перемещения почек (Hatini et al., 1996; Levinson et al., 2005). У Foxd1 -нулевых мышей почки неспособны подниматься полностью и сливаются. Неспособность к восхождению почек происходит у людей с т. наз. "подковообразной почкой", когда почки слиты на нижнем полюсе, образуют "U" или в виде лошадиной подковы почку и в случает т. наз. "тазовой почкой", когда почки неспособны подниматься из таза. Поскольку механизмы, лежащие в основе этого не определены, то возможно, что аномальное развитие стромы играет патогенетическую роль. Присутствие дисплазии в некоторых тазовых почках ещё больше подтверждает эту возможность, поскольку стромальные клетки являются критическими для нормального развития собирающей системы и нефрогенных структур у мышей.
Renal fibrosis in chronic kidney disease
Прогрессивные формы хронической болезни почек (CKD) характеризуются экспансией миофибробластов и обширным отложением внеклеточного матрикса (ECM) приводящим к образованию рубцов. Почечные интерстициальные миофибробласты рассматриваются как основные продуценты белков ECM при фиброзе и, следовательно, играют центральную роль в его патогенезе. Характерным признаком миофибробластов является экспрессия ими актиновых волокон, α smooth muscle actin (α SMA). Клеточный источник миофибробластов служит предметом споров (see Liu, 2010; Zeisberg and Duffield,2010; Grgic et al., 2011; Kriz et al., 2011). Рассматриваются три основных клеточных источника: костный мозг, эпителиальные клетки канальцев и интерстициальные перициты. У мышиных моделей трансплантации трансгенного костного мозга с использованием R26 плацентарной щелочной фосфотазы человека и α SMA-RFP мыши, клетки bone marrow-derived cells (BMDC), как было установлено, вносят вклад в ~30% пула миофибробластов после повреждения (Broekema et al., 2007; LeBleu et al., 2013). Напротив, эксперименты по трансплантации BM с использованием Collagen-1α1 и Collagen-1α2 репортерных химер не выявляют существенного вклада BMD предшественников в популяцию почечных миофибробластов (Roufosse, 2006; Lin et al., 2008). Учитывая эти расходящиеся результаты, дальнейшее отслеживание клонов д. четко определить роль BMD клеток в качестве предшественников миофибробластов, а также идентифицировать участвующие типы клеток костного мозга.
Клетки эпителия канальцев являются вторым предполагаемым источником почечных миофибробластов во время повреждений почек. После повреждения почек клетки эпителия канальцев, как полагают, пересекают базальную мембрану канальцев и трансдифференцируются, чтобы стать миофибробластами посредством EMT. Первичные эпителиальные клетки in vitro могут быть стимулированы с помощью profibrotic цитокинов, чтобы сгенерировать фибриллярные коллагены и активировать гены, которые являются характеристиками миофибробластов (Okada et al., 1997; Fan et al., 1999; Zavadil and B?ttinger, 2005). Иммуногистологическое окрашивание для совместно локализации эпителиальных и мезенхимных маркеров в поврежденных почках подтверждают EMT в качестве источника миофибробластов почек (Ng et al., 1998; Iwano et al.,2002; Zeisberg et al., 2003). Однако интерпретация этих находок требует осторожности. Многие из маркеров, ассоциированные с миофибробластами, не являются исключительными для этой популяции клеток. Более того, гистологически снимки процесса активной миграции клеток не могут предоставить убедительные клональные взаимоотношения. Напротив, эксперимент ы по отслеживанию судеб с использованием почечных эпителиальных Cre драйверов не предоставили доказательств в пользу эпителиальных клеток кроме проникновения через клеточную мембрану после повреждения почек (Humphreys et al., 2010). Некоторые недавние морфологические и экспериментальные исследования по отслеживанию клонов проведенных in vivo предоставили дополнительные доказательства против EMT в качестве источника почечных миофибробластов (rev. Boor and Floege, 2012).
Данные, полученные по отслеживанию клонов и in vivo репортерных исследований, предоставляют неотразимые доказательства, что Foxd1 -производные перициты являются основными предшественниками миофибробластов, вносящих вклад в фиброз почек (Humphreys et al., 2010). В ответ на повреждения вся когорта Foxd1 -меченных происходящих из стромы перицитов приобретает экспрессию α SMA и подвергается пролиферативной экспансии. Принимая во внимание баланс доказательств в литературе, работа Humphreys et al. (2010) предоставляет четкие доказательства генетического картирования судеб, согласно которым Foxd1 предшественники являются главными вкладчиками в популяцию миофибробластов при фиброзе.
Повреждения во взрослых почках вызывают эктопическую активацию Wnt4 в пролиферирующих интерстициальных медуллярных миофибробластах, подтверждая воспроизведение онтогенетических сигнальных механизмов, способных обеспечить репарацию (DiRocco et al., 2013). Постоянная активация пути Wnt/β -catenin в отсутствие повреждений приводит к спонтанной дифференцировке миофибробластов. Однако обусловленная делеция Wnt4 в интерстициальных клетках не снижает пролиферации миофибробластов во время фиброза, возможно благодаря компенсации за счет др. Wnt лигандов. Эти результаты подтверждают роль передачи сигналов Wnt/β -catenin при фиброзе, это согласуется с д. сообщениями (Lam and Gottardi, 2011; Akhmetshina et al., 2012). Общей проблемой всех представленных выше исследований является отсутствие недвусмысленных маркеров специфичных для фибробластов и перицитов, с помощью которых можно четко идентифицировать индивидуальные типы клеток почечного интерстициума (Armulik et al., 2011). Имеющиеся маркеры, используемые для идентификации фибробластов/перицитов являются динамичными в своей экспрессии и могут по-разному регулироваться в зависимости от онтогенетического и патогенетического состояния и условий культивирования. Особое внимание д. быть уделено строгой классификации маркеров, которые отличают перициты, околососудиствые фибробласты и BMDC. Дальнейшее понимание происхождения и путей дифференцировки миофибробластов может быть критическим для разработки клинически эффективной терапии фиброза.
Conclusions
In recent years, we have seen tremendous advances in our knowledge of the renal stroma during renal development. The classical view of the stroma as an inert supportive network has evolved to recognize stromal cells as active regulators of kidney patterning, ureteric branching morphogenesis and nephrogenesis. Yet we are clearly far from understanding the molecular stromal pathways that control the development and maintenance of this complex organ. It is unknown whether the stroma is derived solely from Osr1+ cells, or whetherOsr1? cells of the metanephric mesenchyme are also capable of giving rise to stromal progenitors. While the Foxd1+ stromal progenitor population generates diverse cell types within the kidney, the local molecular and cellular processes that control cell fate decisions of stromal progenitors is unknown. Understanding the molecular cues for progenitor differentiation and cellular crosstalk are fundamental biological questions with implications for multiple renal disease processes. Future approaches must incorporate genomic tools that allow large-scale transcriptome profiling and analyses. Large-scale microarray screening and large consortia (the Genitourinary Development Molecular Anatomy Project [GuDMAP] and the European Renal Genome Project [EuRegene]) have already had significant impacts on our understanding and are expected to continue to lead us to novel targets and genes in painting a holistic picture of kidney development.
|