T Wis спонтанная мутация
T, которая представлена инсерцией транспозон-подобного элемента в 3' конец 7-го экзона. Инсерция создает мутантный сплайс-сайт, который приводит к потере
Т мРНК дикого типа.
T Wis продуцирует транскрипты, которые обходят мутантный сплайс-сайт экзона 7, но содержат T-box связывающий домен. Мутантные белки, как полагают, конкурируют с дикого типа T за места связывания в ДНК и тем самым продуцируют доминантно негативный фенотип, сходный с таковым при нулевом аллеле, но более экстремальный (Shedlovsky et al., 1986; Herrmann et al., 1990; Goldin and Papaioannou, 2003).
T Wis гетерозиготные мыши имеют более сильное укорочение хвоста, чем
T гетерозиготы;
T Wis гомозиготные мутантные эмбрионы подобно
T гомозиготам лишены хорды и не имеют различимых сомитов (Shedlovsky et al., 1988). У
TWis гомозиготных мутантов предшественники хорды присутствуют, как это видно при двойном мечении с помощью T антител и зонда на Shh. Однако, клетки предшественники не выживают и не образуют хорды. Отсутствие хорды приводит к дефектам нервной трубки, и мутанты
T Wis /
TWis погибают в середине беременности (Shedlovsky et al., 1988; Conlon et al., 1995). Развитие сердца и формирование лево-правостороннего паттерна ранее не было описано у
T Wis/
TWis мутантов. В данной работе мы исследовали фенотип лево-правосторонней асимметрии у этих мутантов, чтобы определить степень нарушения петлеобразования и морфологии сердца, а также морфологии узелка и ресничек узелка. Мы также исследовали экспрессию left/right специфичных генов у мутантов
TWis/
T Wis, а также компоненты путей передачи сигналов Wnt и Notch. В соответствие с предыдущими исследованиями
T локуса наши результаты показали нарушения детерминации лево-правосторонней оси и морфологии узелка и расширили предыдущие наблюдения, показав гетеротопию (heterotaxia) петлеобразования сердца и поворота эмбриона. Мы также детализировали эффект на морфологию узелка, включая реснички узелка и задокументировали нарушения дополнительных молекулярных маркеров сигнального каскада, участвующего в детерминации лево-правосторонней асимметрии.
Discussion
Участие Brachyury в инвагинации эндомезодермального слоя функционально законсервировано в эволюции метазоа и его роль в спецификации и дифференцировке хорды является признаком развития хордовых (Satoh et al., 2013). Мутантные фенотипы, ассоциированные с T мутантным аллелем у мышей, хорошо известно, что затрагивают образование задней мезодермы, приводящее к потере сомитов, дефектам аллантоиса и укорочению или отсутствию хвоста, а также затрагивают жизнеспособность хорды (Showell et al., 2004; Naiche et al., 2005; Inman and Downs, 2006). Менее известно о др. признаках T мутантов, нарушении детерминации лево-правосторонней оси, наблюдаемое у T мутантных мышей, а также у мутантов по ортологическому гену ntl у рыбок данио и эктопической экспрессии ортологичного гена XBra у Xenopus (King et al., 1998; Kitaguchi et al., 2002; Amack and Yost, 2004).
В данном исследовании аллель TWis Brachyury был использован, чтобы исследовать природу и степень дефектов лево-правосторонней асимметрии у мыши. Подобно T аллелю, аллель T Wis не оказывает эффекта на детерминацию оси у гетерозигот, но вызывает нарушения асимметрии в гомозиготном состоянии. Диапазон фенотипов в морфогенезе сердца у гомозиготных мутантов сходен с таковым для двух аллелей, включая высокий показатель вентрального петлеобразования хотя в терминах situs, имеется более высокий показатель обратного петлеобразования сердца у мутантов T Wis/TWis (72%) по сравнению с T/T мутантами (50%) (King et al., 1998). Эти различия могут быть обусловлены линейными различиями или вероятностью малых размеров выборок ранних исследований. Направление поворота эмбриона (turning) или осевой ротации, как было установлено, также происходит в обратном направлении у большинства TWis/TWis мутантных эмбрионов. Однако, направление поворота не является конкордатным с направлением петлеобразования сердца у 39% эмбрионов. Процесс осевой ротации начинается приблизительно в то же самое время, что и петлеобразование сердца. Два морфогенетических движения происходят одновременно и тонко скоррелированы у нормальных эмбрионов. Хотя всё ещё плохо понятый процесс осевой ротации, как полагают, управляется асимметричной пролиферацией клеток в латеральной стенке тела и кишке, которые каким-то образом сцеплены с висцеральной асимметрией (Miller and White, 1998). Однако, имеется несколько ситуаций у мутантов детерминации оси или при экспериментальных пертурбациях эмбрионов, у которых направление осевой ротации и петлеобразования сердца происходят в разных направлениях (Hadjantonakis et al., 2008; Gardner, 2010). Т.о., направление поворота эмбриона отделимо от детерминации лево-правосторонней оси в узелке.
Как происходит такое аномальное формирование лево-правостороннего паттерна? Первоначальное изменение билатеральной симметрии у мышей, как полагают, происходит благодаря однонаправленному нодальному току, создаваемому колебаниями подвижных ресничек в ямке узелка (Nonaka et al., 1998). Реснички в короне клеток, окружающих узелок, ощущают направление тока, который инициирует каскад асимметричной передачи сигналов Ca2+ и экспрессии генов (Yoshiba et al., 2012). Сигнальная молекула Nodal экспрессируется сильнее в левой области около узелка, тогда как его антагонист, Cer2, который реагирует непосредственно на ток около узелка (nodal) экспрессируется сильнее справа. Экспрессия около узелка Nodal агониста, Gdf1, важна для переноса perinodal сигнала Nodal налево LPM, где его мишень, Pitx2, управляет асимметричным развитием сердца (Tanaka et al., 2007).
У эмбрионов с мутацией в T, обнаруживаются крупные морфологические аномалии в узелке и срединной линии, аномальной формы узелок T/T эмбрионов, как полагают, является фактором, вносящим вклад в дефекты асимметрии (laterality) (King et al., 1998). Мы расширили эти наблюдения с помощью светового микроскопа узелка, использовав конфокальную и сканирующую электронную микроскопии и установили, что TWis/TWis мутанты имеют варьирующие дефекты узелка в пределах от отсутствия обычного двухслойного узелка с четкими границами до небольшого узелка с уплощенной поверхностью. Реснички пузырька присутствуют и кажутся нормальными, но значительно менее многочисленны в узелке мутантов T Wis/TWis, хотя небольшое количество ресничек вряд ли является важным фактором, поскольку даже две подвижные реснички, как было установлено, обеспечивают каскад асимметричной экспрессии генов (Shinohara et al.,2012).
На ст. ранней первичной полоски и T и Foxa2 экспрессируются в предшественниках организатора мыши. Foxa2 гомозиготные мутанты не способны формировать узелок или хорду, хотя мутанты экспрессируют T в ограниченном регионе первичной полоски (Beddington et al., 1992; Ang and Rossant, 1994; Kinder et al., 2001). Foxa2 регулирует также экспрессию Shh в хорде и вентральной пластинке нервной трубки (Jeong and Epstein, 2003). У мутантов TWis/TWis экспрессия Shh полностью теряется в соответствии с предыдущей работой (Conlon et al., 1995), а экспрессия Foxa2 снижается в узелке и отсутствует в проспективной вентральной пластинке нервной трубки. Это может указывать на то, что T регулирует Foxa2 или на то, что эти ткани изменены у TWis/TWis мутантов и имеется просто меньше ткани узелка и хорды. Предыдущее исследование подтвердило, что клетки предшественники узелка не затрагиваются у TWis гомозиготных мутантов, поскольку экспрессия Gsc нормальная на стадии ранней полоски (E6.25-E6.75) (Conlon et al.,1995). Gsc нулевые мутанты не имеют дефектов узелка (Rivera-Perez et al., 1995), поэтому вряд ли ген является мишенью для T и более низкие уровни Gsc мы наблюдали у TWis/TWis мутантов на ст. E8.0, это скорее всего отражает недостаточное развитие узелка.
Наши результаты находятся в согласии с исследованиями на рыбках данио, у которых ntl экспрессируется в дорсальных клетках предшественниках, предшественниках реснитчатых клеток Kupffer's пузырька, который является структурным аналогом узелка у мыши. Нокдаун ntl специфически в дорсальных клетках предшественниках показал, что ntl функционирует клеточно автономно в этих клетках. В отсутствие ntl, реснитчатые клетки присутствуют, но дезорганизованы и Kupffer's пузырьки неспособны формироваться, приводя к нарушению детерминации лево-правосторонней оси (Amack and Yost, 2004; Amack et al., 2007).
T/T эмбрионы не обнаруживают экспрессии Nodal вокруг узелка и не обнаруживают экспрессии ни Nodal, ни Lefty2 в левой LPM (King et al., 1998). В данном исследовании мы расширили это наблюдение, исследовав факторы как выше, так и ниже perinodal передачи сигналов Nodal. Мы показали, что помимо отсутствия экспрессии Nodal и возникающей в результате потери экспрессии Pitx2 в левой LPM и тракте оттока сердца, эмбрионы TWis/TWis обнаруживают нарушения экспрессии генов, регулирующих Nodal в регионе около узелка, а именно, Cer2 и Gdf1. Затем мы исследовали экспрессию генов, участвующих в путях, участвующих в передаче клеточных сигналов, чтобы регулировать около узелка экспрессируемые гены. Экспрессия первичной полоской канонического пути передачи сигналов Wnt гена, Wnt3a, не изменялась у T Wis/TWis мутантов в соответствии с предыдущей работой, показавшей, что Wnt3a действует выше T (Hofmann et al., 2004). Экспрессия Dll1, лиганда для Notch сигнального пути отсутствовала в первичной полоске, заднем конце эмбриона и узелке у мутантов TWis/TWis. Это наблюдение согласуется с регуляцией Dll1 с помощью канонической передачи сигналов Wnt совместно с T и Tbx6 (Hofmann et al., 2004). Dll1 гомозиготные мутантны эмбрионы не обнаруживают экспрессии Nodal в регионе около узелка и обнаруживают дефекты узелка и хорды и неправильное формирование паттерна вентральной пластинки нервной трубки. Дефекты узелка и срединной линии у мутантных эмбрионовDll1, как полагают, являются причиной наблюдаемого фенотипического отклонения в лево-правосторонней асимметрии (Przemeck et al.,2003). Более того, экспрессия около узелка Gdf1 и Cer2 , находящаяся под контролем передачи сигналов Notch (Kitajima et al., 2013), потенциально предоставляет общую причину морфологических и молекулярных дефектов, наблюдаемых у мутантов TWis/TWis.
King et al. (1998) пришли к выводу, что наиболее правильным (parsimonious) объяснением дефектов лево-правосторонней оси у T/T мутантов - с двусторонней экспрессией Lefty1 в регионе срединной линии и отсутствием экспрессии Lefty2 в левой LPM - было аномальное испускание сигналов от узелка, обусловленное аномальной морфологией узелка. Наши результаты подтверждают эту идею, выявив специфические морфологические дефекты в узелке, включая малое количество ресничек в узелке. Мутация гомеобоксного гена Noto, который действует ниже и T и Foxa2 (Abdelkhalek et al., 2004), вызывает очень сходные фенотипические отклонения узелка и ресничек (Beckers et al., 2007). Транскрипционный фактор Zic3, известная мишень для T, который контролирует лево-правостороннюю асимметрию у Xenopus (Kitaguchi et al., 2002), ещё один кандидат на роль мишени для внесения вклада в дефекты узелка у мутантов TWis/TWis, поскольку Zic3 участвует в регуляции морфогенеза узелка специфически в ткани первичной полоски, экспрессирующей T (Jiang et al., 2013; Sutherland et al., 2013). Кроме того, мы далее прояснили фенотип, обнаруживающий дефекты в передаче сигналов Notch, стоящей выше передачи сигналов в регионе около узелка, которая д. находиться в основе как морфологических, так и молекулярных дефектов, вызываемых мутациями в локусеT .
