The liver is a central regulator of metabolism, and liver failure thus constitutes a major health burden. Understanding how this complex organ develops during embryogenesis will yield insights into how liver regeneration can be promoted and how functional liver replacement tissue can be engineered. Recent studies of animal models have identified key signaling pathways and complex tissue interactions that progressively generate liver progenitor cells, differentiated lineages and functional tissues. In addition, progress in understanding how these cells interact, and how transcriptional and signaling programs precisely coordinate liver development, has begun to elucidate the molecular mechanisms underlying this complexity. Here, we review the lineage relationships, signaling pathways and transcriptional programs that orchestrate hepatogenesis.
Печень контролирует гликолитический и мочевины метаболизм, детоксификацию крови и уровни холестерола, поддерживая также гематопоэтическую и пищеварительную системы. Принимая во внимание, что это самый крупный и наиболее подверженный действию токсинов орган тела, неудивительно, что болезни печени, включая фиброз, цирроз, гепатит и гепатокарциномы, является основным источником болезней и смертности. Гистология печени имеет сложную и высоко организованную архитектуру (Fig. 1), включая многочисленные типы клеток и тканевые взаимодействия, которые контролируются с самых ранних стадий органогенеза. В самом деле, изучение животных моделей идентифицировало ключевые сигнальные пути и тканевые взаимодействия, которые постепенно генерируют предшественники, клоны и функциональные ткани печени (Si-Tayeb et al., 2010; Zorn and Wells, 2007). Как таковые, многие клеточные составляющие, сигнальные пути и регуляторы транскрипции, необходимые для построения функциональной печени во время эмбриогенеза, пока неизвестны. Недавний прогресс с использованием кондиционной генетики, новых стратегий получения изображений и геномной биоинформатики продвинули наше понимание того, как эти разные передачи сигналов, транскрипционные и эпигенетические программы координируют развитие печени.
Fig. 1.
Liver structure and cell types. (A) The liver is organized from many lobules, which constitute its functional units. Each lobule is composed of a central vein (CV), from which hepatocyte cords radiate towards portal triads. The portal triad consists of a portal vein, hepatic artery and biliary duct. Hepatocyte cords are single-cell sheets of hepatocytes separated by sinusoids that carry blood from the portal triads to the central vein. (B) Within each lobule are a number of sinusoids, which are discontinuous vessels built from specialized fenestrated endothelial cells of the liver. Stellate (or Ito) cells are located in the space of Disse between the hepatocyte cords and sinusoids. Kupffer cells, which are the specialized macrophages of the liver, also reside in sinusoids. Hepatocytes secrete bile salts into the bile canaliculi that lead to the bile duct. Cholangiocytes are the epithelial cells lining the bile ducts.
Наиболее важной темой является, как осуществляется прогрессивная детерминация бипотентных предшественников, заканчивающаяся выбором одной или др. судьбы во время развития печени (Fig. 2), часто с использованием одних и тех же сигнальных путей, но на разных стадиях развития или в разных клеточных контекстах. Эта упрощенная концепция может помочь прояснить механистические детали того, как клеточные клоны и архитектура ткани в целом скоординированы.
Fig. 2.
Bipotential progenitors progressively generate hepatic lineages. Four key transition points (A-D) during fetal liver development are highlighted. (A) Bipotential mesendoderm cells segregate into brachyury (BRY)+ mesoderm and definitive endoderm (DE). The prospective foregut endoderm maintains expression of the pioneer transcription factors FOXA2 and GATA4/6 (denoted GATA). (B) Studies of ESC cultures suggest that the DE includes a subset of KDR+ progenitors that generate and support the development of hepatic cells; they can also give rise to CD31 (PECAM1)+ endothelial cells. (C) Foregut DE generates a bipotential hepato-pancreatic progenitor (SOX17+, HHEX+, GATA+) that produces both PDX1+pancreatic progenitors and HNF1?+, HNF4?+, PDX1- hepatoblasts. It is not known how closely the hepatic cells derived from KDR+ endoderm are related to this cell (question mark). (D) Finally, the hepatoblast is a bipotential progenitor for both cholangiocytes (bile duct cells; HNF6+, SOX9+, HNF1?+) and hepatocytes (PROX1+, HNF4?+). Note that the figure only indicates when factors initially function for transitions; in many cases (such as for FoxA and GATA factors) they continue to be expressed and also function at later stages.
An overview of liver lineages, development and morphogenesis
Зрелая печень состоит из долей (четырех у человека), содержащих множественные типы клеток, включая гепатоциты, холангиоциты, эндотелиальные клетки, звездачтые клетки и Kupffer клетки. Функциональной гистологической единицей печени является печеночная долька, которая состоит их полигонального тяжа печеночных клеток, расположенных вокруг центральной вены, которая является конечной ветвью печеночной вены. Веточки портальной вены, печеночной артерии и желчного древа расположены по периферии центральной вены (Fig. 1). Гепатоциты являются основными паренхимными клетками печени, составляя ~80% массы. Они кубовидные и секретируют сывороточный альбумин, желчь и критические факторы свертывания крови. Эпителиальные клетки, выстилающие желчные протоки наз. холангиоцитами. Здесь мы будем называть так в основном внутрипеченочные желчные протоки, хотя следует отметить, что холангиоциты функционируют по всему желчному древу. Ниже мы представим обзор печеночных спецификаций, развитие зачатка печени и образование гепатобластов, которые действуют как общие предшественники гепатоцитов и холангиоцитов. Дальнейшие детали, связанные со звездчатыми клетками и Kupffer клетками представлены в Boxes 1 и 2, соотв.
Box 1. Stellate cells
Stellate cells located in the space of Disse constitute the major mesenchymal component of the liver. When quiescent, they are the main reservoir of vitamin A. When activated by injury or infection, they differentiate into ?SMA-expressing myofibroblast-like cells capable of depositing ECM and directing temporary fibrotic scar formation (Puche et al., 2013). One source of stellate cells during development is the septum transversum-derived mesothelium (reviewed by Yin et al., 2013). However, stellate cells express markers from all three germ layers and are closely associated with sinusoidal endothelium, so they might be derived from additional sources. In zebrafish, stellate cells are marked by a hand2:EGFP transgenic reporter, consistent with either a mesodermal or neural crest origin (Yin et al., 2012). They associate with the liver surface at ?64 hpf, entering after sinusoidal endothelial cells invade, and the two cell types closely associate. However, their development and migration are independent of vascular cells, as shown in clochemutants. Subsequently, stellate cells regulate hepatic vascular development, functioning as a pericyte in the quiescent state. Both Wt1 and Lhx2 are expressed in quiescent stellate cells. Wt1and Lhx2 knockout embryos develop stellate cells but exhibit an ectopic activation state with ECM deposition, fibrosis and a smaller liver due to hepatoblast proliferation defects, perhaps owing to aberrant levels of cytokines, including HGF and FGF10. Quiescence in stellate cells is also dependent on the Wnt pathway; mesenchymal knockout of ?-catenin generates a liver phenotype with activated ?SMA-expressing stellate cells and dilated sinusoids (Berg et al., 2010; Kordes et al., 2008). Stellate cells also express Jag1, which is essential for biliary cell development and can stimulate the differentiation and maturation of hepatocytes in vitro (Nagai et al., 2002). Finally, stellate cells express SDF1 (CXCL12), a cytokine that is required for vascular integrity and for recruiting CXCR4-expressing hematopoietic progenitors into the fetal liver.
Box 2. Kupffer cells
Kupffer cells (KCs) are liver macrophages that reside in the sinusoids, constituting 15% of liver cells (Naito et al., 2004). KCs originate from fetal yolk sac precursors and self-renew dependent on GM-CSF and M-CSF (Schulz et al., 2012; Yona et al., 2013). Although there is no direct evidence for KCs regulating hepatogenesis, they are likely to impact fetal liver erythropoiesis. During chronic injury, Wnt ligands released by KCs during phagocytosis can direct bipotential progenitors to the hepatocyte fate (Boulter et al., 2012). Furthermore, KCs play an important role in liver regeneration by influencing the invasive behavior of liver progenitor cells (Van Hul et al., 2011).
Endoderm specification
Два главных типа клеток печени, а именно гепатоциты и холангиоциты, происходят из энтодермы, которая возникает из передней части первичной полоски гаструлирующего эмбриона и идентифицируется в виде щитка (shield) на ст. 6 h post fertilization (hpf) у рыб данио и на день эмбриогенеза (E) 7.5 у мышей, и на третей неделе беременности у человека (Table 1). Изучение ESC моделей показало, что эти клетки мигрируют в направлении передней части эмбриона, они отделяются от бипотентной мезэнтодермы, чтобы сформировать definitive endoderm (DE), один слой клеток на вентральной стороне развивающегося эмбриона. DE затем образует трубку, т.к. эмбрион мыши ротирует вдоль переднезадней (AP) оси и превращается в три домена предшественников, которые у млекопитающих представляют переднюю, среднюю и заднюю кишку. Энтодерма передней кишки дает печень вместе с вентральной частью поджелудочной железы, желудком, легкими и щитовидной железой (Tremblay and Zaret, 2005).
Table 1.
Interspecies comparison of the timeline of liver development
Liver diverticulum formation and budding
Процесс органогенеза печеночного дивертикула (зачатка печени) удивительно хорошо законсервирован у видов позвоночных. На ст. E9.0 у мышей возникает вентральный домен передней кишки по соседству с кардиальной мезодермой и утолщением поперечной перегородки (septum transversum), чтобы сформировать печеночный дивертикул (Fig. 3A,B). Затем (Fig. 3C,D), дивертикул утолщается и из монослоя кубовидных энтодермальных клеток превращается во многие слои псевдостатифицированных клеток, наз. гепатобластами, которые отслаиваются, пролиферируют и проникают в окружающую поперечную перегородку, чтобы сформировать зачаток печени (Bort et al., 2006). Гепатобласты маркированы экспрессией транскриптов и белков alpha-fetoprotein (AFP) и albumin (ALB) (Cascio and Zaret, 1991; Nava et al., 2005; Schmid and Schulz, 1990; Shiojiri, 1981).
Fig. 3.
Liver diverticulum and bud formation in mouse. (A) Sagittal section of the cephalic portion of the E8.25 mouse prospective hepatic endoderm (HE, green). The convergence of the cardiac mesoderm (blue) and septum transversum (ST, purple) is required for hepatic specification. (B-D) Transverse sections of the mouse liver diverticulum progressing to the liver bud stage. (B) At E8.75, endothelial cells (ECs, orange) are found surrounding the thickened hepatic endoderm, which initiates a budding process into the septum transversum. Endothelial cells contribute to hepatic specification. (C) At E9, the hepatic endoderm transitions from a columnar to a pseudostratified epithelium. (D) At E10, hepatic endoderm cells, identified as hepatoblasts, proliferate and migrate into the septum transversum to form the liver bud. Endothelial cells are also required for liver bud formation. Hematopoietic progenitor cells now start to migrate into the bud to establish liver fetal hematopoiesis.
У рыб данио на ст. 24 hpf клетки энтодермы образуют солидный тяж из клеток срединной линии, наз. кишечным стержнем (rod) (Field et al., 2003). Морфогенез печени инициируется затем за счет утолщения эпителиальной структуры, которая выпячивается прочь от вентральной стороны кишечной полосы приблизительно на уровне первого сомита скорее, чем за счет миграторной инвазии. На ст. 28 hpf, становятся видимы два домена утолщенной энтодермы; наиболее задний домен вносит вклад в поджелудочную железу, а передний домен в печень. У людей первые печеночные клетки видимы в печеночной пластинке, которая располагается вблизи каудальной части сердца с 23 дня беременности (Hutchins and Moore, 1988; Severn, 1971).
The role of endothelial cells during liver morphogenesis
Исследование эксплантов показало, что печеночная спецификация нуждается в окружающей её кардиальной мезодерме (Gualdi et al., 1996; Le Douarin, 1975), septum transversum (Rossi et al., 2001) и (у млекопитающих) в эндотелии. Эндотелиальные клетки образуют ожерелье вокруг и по соседству с печеночным дивертикулом на ст. E9.0, а устранение эндотелиальных клеток (как это происходит у VEGF receptor-дефицитных эмбрионов мыши) блокирует отпочкование печени (Matsumoto et al., 2001). Эндотелиальные клетки также важны для спецификации печени из энтодермальных мышиных клеток и для увеличения гепатобластов из ESC-происходящих или из эмбриональных энтодермальных клеток (Han et al., 2011). Некоторые эндотелиальные клетки происходят из субнабора бипотентных KDR (FLK1, VEGFR2)+ энтодермальных клеток (Goldman et al., 2014). Необходимо отметить, что зачаток формируется у мутантных рыб данио cloche, которые лишены эндотелиальных клеток, предполагается, что инициальная ступень формирования зачатка печени у рыб данио не зависит от кровоснабжения и, по-видимому, не использует бипотентные печеночно-сосудистые предшественники (Field et al., 2003). Независимо от этого, печень рыб данио также зависит от сосудистой системы, которая проникает в печеночную ткань, начиная со ст. ~66 hpf и оказывается критической для формирования паттерна печеночной архитектуры, включая желчные протоки и поляризацию гепатоцитов (Sakaguchi et al., 2008).
From hepatoblast to hepatocyte
После своей спецификации и миграции в поперечную перегородку, гепатобласты подвергаются пролиферации и дифференцируются в гепатоциты и холангиоциты. Этот процесс изучен на эмбрионах мышей и рыб данио и in vitro, используя изолированные гепатобласты. Эти исследования показали, что ряд факторов маркирует гепатобласты и предоставляет информацию о том, как эта популяция клеток расширяется и переходит к функциональные гепатоциты.
Hepatoblast markers and purification
Бипотентные гепатобласты экспрессируют AFP , также как и маркеры, характерные для гепатоцитов [ALB, HNF4α, keratin 18 (CK18 или KRT18)] и холангиоцитов (CK19). Во время выделения гепатобластов из печени плодов мыши, гематопоэтические клетки, которые позитивны по CD45 (PTPRC; лейкоциты) или TER119 (LY76; эритроциты), были исключены. CD45-, TER119-, cKIT-, CD29 (ITGβ1)+, CD49f (ITGα6)+ популяция клеток содержит печеночные hepatic colony-forming unit (H-CFU-C), которые способны дифференцироваться в гепатоциты и холангиоциты (Suzuki et al., 2000), и были описаны связанные с этим альтеранативные сортинг-стратегии (Kakinuma et al., 2009; Kamiya et al., 2009; Minguet et al., 2003; Suzuki et al., 2003). Параллельно описаны, специфические для гепатобластов маркеры, включая Dlk1 (Pref1) (Tanimizu et al., 2003), E-cadherin (cadherin 1) (Nierhoff et al., 2005; Nitou et al., 2002), Liv2 (Watanabe et al., 2002), CD24a, Nope (Igdcc4) (Nierhoff et al., 2007) и EpCAM (Tanaka et al., 2009). Очищенные гепатобласты могут дифференцироваться в гепатоциты in vivo после трансплантации в печень грызунов (Miyajima et al., 2014). Гепатобласты и клетки печеночных предшественников были также найдены в развивающейся печени плода человека во время первых двух триместров беременности и было показано, что они экспрессируют различные факторы (Table 2), включая ALB, AFP, CK14, CK18, CK19, DLK1, E-cadherin, EpCAM, CD133 (PROM1) и hepatocyte-specific antigen HepPar1 (Haruna et al., 1996; Terrace et al., 2007; Wauthier et al., 2008).
Table 2.
Characterization of human hepatic progenitor cells
Fetal hepatic stem cells
В пуле гепатобластов человека находится субнабор клеток, обладающих признаками, характерными для стволовых клеток (Wauthier et al., 2008). Эти печеночные стволовые клетки располагаются вдоль плодной печеночной ductal пластинки и во время культивирования in vitro обнаруживают способность к самообновлению с более 150 удвоениями популяции и способностью генерировать гепатобласты (Schmelzer et al., 2007). В отличие от гепатобластов они не содержат или содержат очень низкие количества AFP и ALB; вместо этого они экспрессируют маркеры стволовых клеток, включая CD133, CD34 и cKIT (Nava et al., 2005). Они обладают также некоторые маркерами гепатобластов, такими как EpCAM, но отличаются по экспрессии NCAM1 и claudin 3. Фенотип мезенхимных стволовых клеток подтверждается экспрессией ими CD90 (THY1) и vimentin и их способностью дифференцироваться в жир, кость, хрящ и эндотелиальные клетки. Способность этих стволовых клеток дифференцироваться в гепатоциты in vivo была показана с использованием Rag2-/-;Il2ry-/- (Dan et al., 2006), GalN-treated (Nowak et al., 2005), NOD/SCID (Schmelzer et al., 2007) или мышей nude (Liu et al., 2008), хотя исследования по отслеживанию клонов in vivo не нашли доказательства, что клетки ductal пластинки превращаются посредством предшественников гепатобластов (Carpentier et al., 2011).
Похожие клетки были также идентифицированы в плодной печени мышей, они экспрессируют DLK1, постоянно само-обновляются и дифференцируются в гепатоциты и холангиоциты (Tanimizu et al., 2003). Линия печеночных стволовых клеток, происходящая из диссоциированной плодной печени может персистировать длительное время in vitro и вносит вклад в клоны гепатоцитов и холангиоцитов после трансплантации мышиным моделям albumin-urokinase plasminogen activator/severe combined immunodeficiency (Strick-Marchand et al., 2004) или carbon tetrachloride-injured (Tsuchiya et al., 2005). Хотя их онтогенез неясен, гетерогенная популяция бипотентных предшественников была первоначально идентифицирована в печени взрослых грызунов (Farber, 1956) они благодаря форме их ядер были обозначены как 'овальные' клетки. Происхождение и функция таких предполагаемых 'стволовых клеток' в печени противоречиво, см. Box 3.
Box 3. Liver stem/progenitor cells
A number of other cell types have long been considered candidates for facultative stem or progenitor cells for liver homeostasis and regeneration, when hepatocyte proliferation is compromised. Ductal plate cells, for example, are Sox9+ embryonic biliary precursors. They are remodeled into intrahepatic bile ducts and can generate periportal hepatocytes and oval cells (Carpentier et al., 2011). Hepatoblasts are specified embryonic liver cells that are bipotential for hepatocytes and cholangiocytes. A subset of hepatoblasts that express markers found in stem cells, such as CD133 and cKIT, have been referred to as hepatic stem cells. They are proliferative, bipotential and can generate hepatocytes when transplanted. In contrast to these embryonic/fetal progenitors, oval cells arise from the biliary tree in the adult liver following damage. This regeneration following injury is often referred to as a 'ductal reaction'. The oval cells are identified by the cell surface markers MIC1-1C3 (Dorrell et al., 2008), EpCAM or TROP2 (TACSTD2) (Okabe et al., 2009), CD133 (Kamiya et al., 2009; Rountree et al., 2007; Suzuki et al., 2008), CD24 (Qiu et al., 2011) and by the transcription factors SOX9 (Dorrell et al., 2011; Furuyama et al., 2011), FOXL1 (Shin et al., 2011) and LGR5 (Huch et al., 2013). A few studies have shown some contribution of oval cells to the hepatocyte lineage following transplantation in liver-deficient mouse models. However, recent murine lineage-tracing studies failed to find any significant contribution of hepatocytes derived from any cells other than hepatocytes themselves, following commonly used injury-induced regeneration (Rodrigo-Torres et al., 2014;Schaub et al., 2014; Tarlow et al., 2014; Yanger et al., 2014). The establishment of novel animal models with liver deficiency that closely recapitulate human liver diseases might be needed to reveal evidence of functional adult liver stem cell populations, if indeed they do exist (Grompe, 2014).
Hepatoblast proliferation and expansion
Печень плода является главным переходным местом гематопоэза млекопитающих (Golub and Cumano, 2013). Поэтому гепатобласты и гематопоэтические предшественники развиваются вместе с момента формирования зачатка печени у мыши, на ст. E10 у мышей или на 5-й неделе беременности у женщин (Migliaccio et al., 1986). Экспансия и пролиферация гепатобластов испытывает влияние со стороны этих и др. преходящих клеток. Напр., член семейства interleukin-6 oncostatin M (OSM), который секретируется мышиными гематопоэтическими предшественниками, может индуцировать in vitro пролиферацию гепатобластов (Kamiya et al., 1999) и регулирует адгезию гомофильных клеток путем индукции базирующихся на E-cadherin слипчивых соединений (Matsui et al., 2002). Поскольку OSM несущественен для развития нормальной печени, д. существовать перекрывание для передачи сигналов рецепторов, напр., с помощью IL6 (Nakamura et al., 2004). Печень рыб данио не является гематопоэтическим органом, так что онтогенетические сигналы, которые предоставляются кровяными клетками плодов млекопитающих д. происходить из другого источника у рыб данио. По мере увеличения зачатка печени монослой незрелых мезотелиальных клеток, экспрессирующий высокие уровни podocalyxin-like protein 1 (PCLP1 или PODXL), появляется на ст. E10.5, устилая развивающиеся печеночные дольки мыши. Эксперименты по совместному культивированию показали, что они способствуют экспансии гепатобластов паракринным способом, до тех пор, пока не приобретут более зрелый фенотип с экспрессией mesothelin и потерей PCLP1 (Onitsuka et al., 2010). Наконец, используя человеческие ESC (hESC), культивируемые для дифференцировки, было показано, что KDR-экспрессирующие предшественники для клеток похожих на гепатобласты (hepatic cells) возникают одновременно с детерминированными печеночными клетками и способствуют их спецификации (как показывает экспрессия AFP ) и созреванию (как показывает экспрессия ALB), и эта функция может быть блокирована путем ингибирования активности KDR (Goldman et al., 2013). Более того, KDR+ предшественники могут генерировать как печеночные клетки, так и функциональный эндотелий (Goldman et al., 2014).
Hepatoblast differentiation: the generation of hepatocytes and cholangiocytes
Гепатобласты начинают дифференцироваться в гепатоциты и холангиоциты на ст. ~E13.5 у мышей, 24 hpf у рыб данио и на 56-58 день беременности у человека (Table 1). У людей предшественники холангиоцитов генерируются на ductal пластинке из монослоя гепатобластов, окружающих портальные вены (Ruebner et al., 1990), тогда как гепатобласты, распложенный на удалении от портальных вен, дифференцируются в гепатоциты (Fig. 4A-D). Предшественники холангиоцитов экспрессируют более высокие уровни CK19, чем соседние гепатобласты, становятся кубовидными или столбчатыми и формируют двойной слой CK19+ клеток (Fig. 4B,C). Впоследствии экспрессия CK19 ограничивается холангиоцитами, которые в конечном итоге от отпочковываются от ductal пластинки, чтобы сформировать трубочки на ~14 неделе беременности у людей (Haruna et al., 1996) и на E17.5 у мышей (Fig. 4C). Во время этого процесса ремоделирования оставшаяся порция ductal пластинки регрессирует. Дифференцировка холангиоцитов завершается ~30 неделе беременности у людей и во время неонатального периода у грызунов (Terada and Nakanuma, 1993) (Fig. 4D), хотя некоторые клетки ductal пластинки могут сохраняться у новорожденных, детей и даже взрослых. Последующее развитие желчного тракта подробно рассмотрено у др. (Lemaigre, 2010).
Fig. 4.
Bile duct development. Prior to bile duct development, hepatoblasts are the only epithelial progenitor cells in the fetal liver. Ductal plate formation is the first sign of bile duct development. It is initiated at E13.5 in mice and at around day 56-58 after fertilization in humans. The ductal plate is composed of a monolayer of cholangiocyte precursors derived from hepatoblasts in contact with the portal mesenchyme. These precursors express high levels of CK19 compared with hepatoblasts that are located further away from the portal veins. At ?E17.5 in mice, and during the second trimester in humans, the ductal plate duplicates. Luminal pockets develop between the two layers of precursors. In the perinatal period in mice and at ?30 weeks of gestation in humans, some of these pockets form bile ducts composed of mature cholangiocytes that maintain CK19 expression. The remaining ductal plate areas regress in a process called ductal plate remodeling. The hepatoblasts located away from the portal veins differentiate into mature hepatocytes that completely downregulate CK19.
Hepatocyte maturation and heterogeneity
Гепатоциты представляют собой гетерогенную популяцию и эта гетерогенно, как полагают, взникает в результате феномена, наз. 'metabolic zonation' (Jungermann and Kietzmann, 1996, 2000), благодаря этому функции печени компартментализуются в печеночных дольках. Первый ряд гепатоцитов, окружающих портальные вены, получает смешанную кровь от печеночной артерии и портальной вены и находятся в контакте с желчными протоками. На противоположной стороне печеночной клеточной пластинки, гепатоциты окружают печеночную центральную вену печеночной дольки и наз. околовенозными гепатоцитами. Такая организация осуществляет классические зональные функции печени и отражается в компартментализованном расположении ключевых энзимов и транспортеров в дольке. Экспрессия этих энзимов и транспортеров, а, следовательно, и функция гепатоцитов, изменяются в ходе развития (Moscovitz and Aleksunes, 2013). Кроме того, плазматическая мембрана пренатальной печени обнаруживает снижение соотношения phosphatidyl choline:phosphatidyl ethanolamine и повышение соотношения sphingomyelin:phosphatidyl choline. Во время последней недели беременности ингибирование гликолитических энзимов, связанное с увеличением уровней gluconeogenic энзимов отражает созревание печени отказ от ее первоначальной гликолитической роли в первых трех триместрах и приобретение новой продуцирующей глюкозу (gluconeogenic) роли сразу после рождения. Созревание гепатоцитов продолжается после рождения, при этом наблюдается зависимое от возраста снижение соотношения жир:белок и увеличение в мембранах холестерола, понижающего текучесть мембран (Devi et al., 1992).
The regulation of liver development by cell signaling pathways
Морфологические перемещения подставляют клетки под действие разных сигнальных центров во время развития печени. Ключевые пути передачи сигналов используются во время формирования печени, включая те, что контролируются с помощью transforming growth factor β (TGFβ ), Wnt, fibroblast growth factor (FGF), Notch и bone morphogenetic protein (BMP) лигандов (Fig. 5), некоторые из которых вызывают противоположные клеточные реакции на последовательных стадиях развития (Zaret and Grompe, 2008). В последние годы выяснены механизмы, с помощью которых эти сигнальные пути влияют на разные стадии развития печени. Эти находки привели к разработке протоколов происхождения энтодермы и популяций гепатоцитов in vitro путем воспроизведения высоко динамичных процессов передачи онтогенетических сигналов и прогрессивно направляемых бифуркаций клонов (Gouon-Evans et al., 2006; Loh et al., 2014).
Fig. 5.
Key signals mediating progenitor fate decisions during hepatogenesis. (A) Activation of Nodal signaling in the embryonic epiblast (Ep) lineage initiates mesendoderm (ME) formation. In Xenopus and zebrafish, maternal signals activate this pathway. In mice, Nodal, BMP4 and WNT3 act in a reinforcing loop to activate Nodal and induce ME. Subsequently, high levels of Nodal signaling establish the endoderm regulatory network leading to the segregation of, and commitment to, definitive endoderm (DE), while FGF and BMP drive mesoderm (M) formation by antagonizing Nodal signaling. (B) The graded activity of Wnt, FGF and BMP signaling patterns the endoderm along the AP axis to generate posterior foregut precursors (PFG) with hepato-pancreatic potential that can be distinguished from anterior foregut [AFG; deriving lung (L) and thyroid (T)] and midgut-hindgut [MG-HG; deriving intestine (I)] progenitors. P represents pancreatic progenitors. (C) FGF-MAPK, BMP and Wnt signaling positively regulate hepatic specification to generate hepatoblasts (Hb), although the role of Wnt at this stage of liver development has not been demonstrated in mammals (indicated by dashed box). (D) Hepatoblast differentiation into cholangiocytes (Ch) and hepatocytes (H), and the final maturation of these cells, is regulated by a wide array of signaling pathways that display complex cross-regulation. These pathways also influence the 3D structural organization of the liver and define its zonal characteristics. The corresponding developmental stages are indicated beneath the scheme.
Signaling during endoderm specification
В центре спецификации DE находится сигнальный путь Nodal. Nodals являются членами семейства TGFβ факторов роста, которые передают сигналы посредством type I [Alk4 (Acvr1b) или Alk7 (Acvr1c)] и type II [ActRIIA (Acvr2a) или ActRIIB (Acvr2b)] рецепторов активина и ко-рецептора Cripto (Tdgf1), чтобы управлять формированием мезодермы, что сопровождается сегрегацией и детерминацией слоёв энтодермы и мезодермы (Shen, 2007). У всех позвоночных этот путь необходим и достаточен для формирования энтодермы (Fan et al., 2007; Hyde and Old, 2000; Schier and Talbot, 2005; Xanthos et al., 2001). У рыбок данио сигналы от вне-эмбрионального слоя желточного синцития активируют передачу сигналов Nodal, чтобы специфицировать предшественники мезодермы. У мышей нерасщепленный Nodal предшественник в эпибласте активирует экспрессию BMP4 и Nodal proprotein конвертаз furin и SPC4 (PCSK6) во вне-эмбриональной эктодерме (ExE). Эти proconvertases ускоряют локальное созревание экспрессии Nodal посредством ауторегуляторной петли, тогда как BMP4 в ExE активирует экспрессию Wnt3 в задней части эпибласта и висцеральной энтодерме. В свою очередь, передача сигналов Wnt поддерживает высокие уровни Nodal избирательно в задней проксимальной части эпибласта, инициируя тем самым образование первичной полоски и индукцию мезэнтодермы (Ben-Haim et al., 2006).
В то время как высокие уровни Nodal способствуют энтодерме, низкие уровни способствуют мезодерме (Grapin-Botton and Constam, 2007; Vincent et al., 2003), а ауторегуляторная петля поддерживает экспрессию, процессинг и секрецию Nodals и Nodal антагонистов, чтобы усилить и поддержать спецификацию энтодермы. Делеция β-catenin в передней части первичной полоски приводит к образованию эктопической кардиальной мезодермы за счет энтодермы, демонстрируя, что передача сигналов Wnt помогает сегрегации мезодермы и энтодермы из мезэнтодермальных предшественников (Lickert et al., 2002). Сегрегация также обеспечивается с помощью взаимного антагонизма сетей регуляторных генов для энтодермы и мезодермы. Передача сигналов FGF и BMP противодействует передаче сигналов Nodal, напр., с помощью контроля транскрипционной активности Sox32 (Cas), ключевого транскрипционного фактора энтодермы; передача сигналов FGF/ERK ослабляет транскрипционную активность Sox32 за счет фосфорилирования, тогда как BMP индуцирует экспрессию Vox, который соединяется и репрессирует Sox32 (Mizoguchi et al., 2006;Poulain et al., 2006; Zhao et al., 2013). Взаимный антагонизм между передачей сигналов BMP и Nodal регулирует также развитие DE передней кишки у мышей (Yang et al., 2010) и во время спецификации энтодермы из ESC-произошедшей мезодермы (Loh et al., 2014), хотя молекулярный механизм, лежащий в основе этого антагонизма, неизвестен.
Signaling during endoderm patterning
После гаструляции энтодерма подвергается широкому формированию паттерна вдоль AP оси (Horb and Slack, 2001;Kimura et al., 2007), становясь постепенно всё более подразделенной на территории, ассоциированные со специфическими органными клонами с помощью комбинированной и градированной активности передачи сигналов Wnt, FGF и BMP, которые репрессируют качественные особенности передней кишки и способствуют принятию судьбы задней кишки (Zorn and Wells, 2009). На ст. гаструлы и ранних сомитных стадий, происходящие из мезодермы Wnts, включая Wnt5a/5b/8/11, индуцируют высокую активность в ядре β -catenin, которая способствует экспрессии генов задней части энтодермы, тогда как гены передней части репрессируются (Goessling et al., 2008; McLin et al., 2007; Sherwood et al., 2011). Напротив, низкие уровнеи активности β-catenin на передней стороне, регулируемые с помощью экспрессии секретируемых антагонистов Wnt, таких как secreted frizzled-related protein 1 (SFRP1), SFRP2, SFRP3 (FRZB), SFRP5, Crescent и DKK1 необходимы и достаточны для поддержания характеристик передней кишки. Напр., экспрессия SFRP5 важна для формирования передней кишки у Xenopus и рыбок данио, действуя путем локального ингибирования канонической и не канонической передачи сигналов Wnt11 (Li et al., 2008; Stuckenholz et al., 2013). У Xenopus, Wnt рецептор FZD7 стимулирует низкие уровни канонической и не канонической активности Wnt, важной для скоординированной пролиферации предшественников передней кишки и экспрессии генов (Zhang et al., 2013). Взаимодействия SFRP5, Wnt лиганда и FZD7 т.о. регулируют дифференциальные пороги передачи сигналов Wnt/β -catenin и Wnt/JNK, которые координируют выбор судьбы предшественников энтодермы, пролиферацию и морфогенез.
BMP-индуцированное формирование паттерна энтодермы также является динамическим и использует многие лиганды, экспрессирующиеся в соседней мезенхиме, рецепторы, экспрессирующиеся в энтодерме, и внеклеточные модуляторы, включая BMP антагонисты chordin и noggin. BMP активность необходима для передачи сигналов Wnt и FGF, чтобы инициировать экспрессию задних генов и это д. быть заблокировано в DE для передней спецификации (Green et al., 2011). Как и в случае передачи сигналов Wnt, не отсутствие или присутствие передачи сигналов BMP, а соотв. уровни активности существенны для развития передней кишки. Передача сигналов FGF, напротив, поддерживает клетки в состоянии чувствительности к сигналам Wnt и BMP.
После образования энтодермы передней кишки, начало развития печени нуждается в FGF, BMP и Wnt от окружающей мезодермы, чтобы индуцировать печеночную спецификацию. Соотв. экспланты энтодермы мыши инициируют экспрессию печеночных генов (скорее, чем панкреатических), если кардиальная ткань включена, или когда добавляются FGF1 или FGF2, но не FGF8 к культуре (Deutsch et al., 2001; Jung et al., 1999). Однако, FGF1 и FGF2 не нужны для развития печени и только FGF8 и FGF10 экспрессируются в кардиальной мезодерме. Пред-печеночные и печеночные энтодермальные клетки экспрессируют FGFR1, FGFR2 и FGFR4, а путь MAPK является нижестоящей ветвью передачи сигналов, участвующей в печеночной спецификации (Calmont et al., 2006; Shin et al., 2007). У рыбок данио передача сигналов FGF важна для спецификации печени (Shin et al., 2007). Более того, в культуре целых эмбрионов мыши снижение передачи сигналов FGF нарушает экспрессию генов и морфогенез передней порции печени, при этом отмечается незначительное влияние на заднюю часть зачатка, подтверждая, что передача сигналов FGF необходима дифференциально вдоль AP оси (Wang et al., 2015). Передняя часть зачатка ближе к предполагаемому источнику FGF (сердцу), хотя отсутствуют различия в экспрессии компонентов пути или в распределении активности передачи сигналов FGF-MAPK вдоль AP оси (Calmont et al., 2006; Wang et al., 2015). Предшественники передней и задней части печени могут, т.о., приобретать AP паттерн до спецификации и поэтому реагировать по-разному на индуктивные сигналы. В подтверждение этого было показано, что зачаток печени происходит из латерального и вентрального по срединной линии доменов, при этом главный вклад в переднюю часть зачатка вносят предшественники вентральной срединной линии (Angelo et al., 2012; Tremblay and Zaret, 2005). Т.о., домены подвергаются разному воздействию со стороны передачи сигналов BMP и FGF-MAPK еще перед слиянием в одиночный домен с гомогенно активной передачей сигналов FGF.
Передача сигналов BMP из мезенхимы поперечной перегородки и латеральной пластинки мезодермы также обладают способностью индукции печени (Rossi et al., 2001; Shin et al., 2007; Zhang et al., 2004). Исследования по отслеживанию клонов у рыбок данио выцявили печеночно-панкреатические предшественники и было показано, что передача сигналов Bmp2 подавляет экспрессию pdx1, который кодирует транскрипционный фактор, участвующий в развитии поджелудочной железы, в этих предшественниках, но он не нужен для поддержания печеночной программы (Chung et al., 2008). BMP2a, с другой стороны, необходим для собственно продолжительной экспрессии печеночной программы (Naye et al., 2012). Как передача сигналов BMP взаимодействует с путями FGF и Wnt, неясно, но передача сигналов FGF не действует ниже BMP, а передача сигналов Wnt не находится ниже передачи сигналов BMP или FGF.
Наконец, передача сигналов Wnt/β-catenin также важна для спецификации печени (McLin et al., 2007; Negishi et al., 2010; Ober et al., 2006). У рыбок данио Wnt2bb экспрессируется в мезодерме передней латеральной пластинки и необходим для экспрессии генов гепатобластов; потеря Wnt2 и Wnt2bb приводит к агенезу печени (Poulain and Ober, 2011). Напротив, постоянно активный β-catenin вызывает образование эктопической печние у рыбок данио путем превращения панкреатических предшественников в гепатобласты перед спецификацией печени (So et al., 2013). В противоположность передачи сигналов BMP или FGF передача сигналов Wnt/β-catenin может даже индуцировать превращение клеток не гепатобластов, таких как кишечные предшественники, в гепатобласты у рыбок данио. Неожиданно, исследования не выявили четко функции Wnt во время печеночной спецификации у мышей. Хотя Wnt2 и Wnt2b экспрессируются в вентральной мезодерме, окружающей переднюю часть передней кишки с E9.0 по E10.5, потеря только Wnt2 вызывает гипоплазию легких, а Wnt2b-нулевая эмбриональная печень нормальна (Goss et al., 2009; Tsukiyama and Yamaguchi, 2012). Более того, комбинированная потеря Wnt2 и Wnt2b вызывает агенез легких, не влияя на др. происходящие из энтодермы органы (Goss et al., 2009). Несмотря на это эксперименты по совместному культивированию с использованием энтодермальных клеток, дифференцированных из мышиных ESCs или полученных от E8.25 эмбрионов, показали, что канонический Wnt путь вместе с путем Notch д. быть репрессированы, чтобы сделать возможной зависимую от эндотелиальных клеток печеночную спецификацию (Han et al., 2011). Кроме того, компоненты не канонической передачи сигналов Wnt экспрессируются в предшественниках передней кишки и поджелудочной железы, но строго подавляются в печеночных предшественниках (Rodriguez-Seguel et al., 2013). Соотв., молекулы, ассоциированные с не канонической передачей сигналов Wnt , такие как FZD2, ROR2, CELSR2 и FAT1, обогащены в предшественниках эпителия передней кишки и поджелудочной железы, но отсутствуют в печеночных предшественниках на ст. E8.5 и E10.5. Кроме того, Wnt5a экспрессируется на ст. E8.5 в передней кишке; позднее он сохраняется в панкреатических предшественниках , но отсутствует в гепатобластах. Активация не канонического Wnt пути с использованием рекомбинантных WNT5a и WNT5b белков или инъекций РНК в эмбрионы Xenopus индуцирует строго программу панкреатических предшественников, включая печеночный регион, где подавляются ранние печеночные маркеры (Rodriguez-Seguel et al., 2013).
Т.о., ключевые вопросы остаются без ответа относительно роли передачи сигналов Wnt во время спецификации печени.
Signaling during hepatoblast expansion and differentiation
Экспансия гепатобластов регулируется с помощью взаимодействий с окружающими эндотелиальными и мезенхимными клетками в поперечной перегородке (Shin and Monga, 2013), и снова передача сигналов Wnt является ключевым позитивным регулятором. У мышей уровни ядерного β-catenin достигают пика на ст. E10-E12, что коррелирует с количеством пролиферирующих клеток (Micsenyi et al., 2004). Экспрессия постоянно активного β-catenin приводит к увеличению печени на ст. E15, тогда как его подавление дает маленькую печень из-за уменьшения клеточной пролиферации и усиления апоптоза (Suksaweang et al., 2004). Было также показано, что передача сигналов Wnt способствует пролиферации гепатобластов (Goessling et al., 2008; McLin et al., 2007), действуя совместно с hepatocyte growth factor (HGF) и передачей сигналов FGF (Berg et al., 2007; Schmidt et al., 1995). Передача сигналов Wnt может быть активирована путем фосфорилирования β-catenin с помощью HGF рецептора MET или с помощью ядерной транслокации, вызываемой передачей сигналов FGF.
Бипотентные гепатобласты дифференцируются в гепатоциты и в желчные клетки вблизи портальной мезенхимы и этот процесс регулируется с помощью TGFβ , Notch, Wnt, BMP и FGF. Градиент от портальной вены по паренхиме активности TGFβ генерируется за счет экспрессии TGFβ2 и TGFβ3 в околопортальном регионе, давая пик активности передачи сигналов TGFβ вокруг в портальной мезенхиме (Antoniou et al., 2009;Clotman et al., 2005). Была предположена и роль этого пути в созревании развивающихся протоков на более поздних стадиях (Lemaigre, 2010). Несколько исследований оказались связаны с передачей сигналов Notch при дифференцировке гепатоцитов. Напр., мутации в NOTCH2 или JAG1, который кодируют Notch лиганд, ассоциированы с бедностью желчных протоков при синдроме Alagille (Li et al., 1997; McDaniell et al., 2006). Было также показано, что подавление передачи сигналов Notch приводит к снижению желчной дифференцировки, тогда как активация способствует дифференцировке желчных клеток из гепатобластов (Tchorz et al., 2009; Zong et al., 2009). Гепатобласты также нуждаются в Notch медиаторе RBPJ и в Notch гене мишени Hes1, а образование желчных протоков нуждается в передаче сигналов Notch (Lemaigre, 2010). Однако, когда передача сигналов Notch нарушена до дифференцировки гепатобластов, то наблюдается более тяжелый постнатальный фенотип (Falix et al., 2014; Jeliazkova et al., 2013), подтверждая, что дифференцировка холангиоцитов оказывается менее зависимой от Notch2 по мере развития.
Передача сигналов Wnt также способствует спецификации, пролиферации и жизнеспособности холангиоцитов. Стабилизация β-catenin способствует дифференцировке желчных клеток, а его делеция вызывает дефекты образования желчных протоков и усиливает апоптоз гепатобластов в плодной печени мышей в середине беременности (Decaens et al., 2008; Tan et al., 2008). Две изоформы β-catenin обнаруживаются во время раннего развития печени (Lade et al., 2012); только преобладающая полной длины форма обнаруживается в желточных эпителиальных клетках, тогда как укороченный β-catenin располагается на мембранах и ядрах гепатоцитов. Не канонический Wnt путь также участвует в развитии желчных клеток, т.к. нарушения пути Wnt/planar cell polarity (PCP) нарушает образование желчных протоков (Cui et al., 2011). Более того, нокаут не канонического Wnt5a вызывает увеличение количества клеток желчных предшественников и способствует экспрессии желчных маркеров (Kiyohashi et al., 2013). В этом контексте передача сигналов WNT5a увеличивает фосфорилирование calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII), стоящей ниже не канонической передачи сигналов Wnt в печени плода, которая супрессирует дифференцировку холангиоцитов.
Hepatic artery-bile duct cross-talk
Во время формирования печени развивающиеся желчные протоки остаются тесно связанными с печеночными артериями, а передача сигналов между этими двумя тканями регулирует их скоординированное развитие. Напр., VEGF, генерируемый холангиоцитами , и angiopoietin 1 , происходящий из гепатобластов работают совместно, чтобы поддерживать ангиогенез и ремоделирование портальной сосудистой сети это в свою очередь поддерживает развитие эпителия (Fabris et al., 2008). Временные параметры зависят от видов, поскольку развитие желчных протоков у мышей предшествует развитию печеночных артерий, тогда как у людей это происходит наоборот. Более того, зональные характеристики печеночных долек испытывают влияние со стороны архитектуры сосудистой системы печени и это совместное формирование паттерна зависит от передачи сигналов Wnt/β -catenin, Notch и VEGF (rev. Cast et al., 2014).
Signaling during hepatocyte maturation and liver growth
Факторы, способствующие созреванию гепатоцитов, включают OSM, глюкокортикоиды, HGF и Wnt, тогда как TNFα противодействует OSM (Shin and Monga, 2013). Также участвует путь передачи сигналов Hippo/Yap, важный регулятор размера печени (Camargo et al., 2007; Dong et al., 2007). В этом пути опухолевый супрессор NF2 (merlin) и прото-онкоген YAP1 действуют противоположным образом в отношении роста печени (Zhang et al., 2010); потеря YAP1 в печени снижает жизнеспособность гепатоцитов и вызывает выраженные дефекты в развитии желчных клеток, тогда как потеря NF2 вызывает гиперплазию обоих типов клеток. В печени взрослых кондиционная активация ядерного YAP1 индуцирует дедифференцировку гепатоцитов в 'oval' клетки предшественники и этот переход обеспечивается с помощью передачи сигналов Notch (Yimlamai et al., 2014).
The genetic and epigenetic control of liver development
Ряд транскрипционных факторов и эпигенетических регуляторов участвует в развитии печени. Вершиной иерархии для спецификации пред-печеночной судьбы являются сестринские гены из семейств FoxA и GATA ядерных ДНК-связывающих белков.
FOXA1/2/3
ДНК-связывающие активности, которые были первоначально обнаружены в лизатах гепатоцитов, были коллективно обозначены hepatic nuclear factors (HNFs). Фактически они принадлежат разным семействам генов транскрипционных факторов, включая семейство FoxA (HNF3), семейство Cut-homeodomain (HNF6), семейство bZIP (CEBPα), Pou-homeodomain семейство (HNF1α) и orphan рецепторов (HNF4α). Члены семейства FoxA FOXA1/2/3 обладают ДНК-связывающими доменами, содержащими 'forkhead box' (FOX) helix-loop-helix, который включает удлиненную петлю или структуру 'winged helix', сходную с таковой у линкерных гистонов (Kaestner, 2010). Этот структурный аспект влияет на способность непосредственного взаимодействия с компактными нуклеосомами хроматина, свойство, которое ведет к распознаванию FoxA белков (вместе с GATA4) в качестве 'пионерских факторов', которые способны создавать транскрипционные и эпигенетические комплексы специфичных для печени генов (Cirillo et al., 2002).
Foxa1 экспрессируется в пред-печеночной энтодерме передней кишки, но не важен для развития печени. Foxa2 экспрессируется раньше, ~E6.5 в первичной полоске и узелке, а нокаутные по Foxa2 эмбрионы погибают на ст. E9, лишенные энтодермы передней кишки и хорды (Ang and Rossant, 1994; Weinstein et al., 1994). FOXA3 также экспрессируется в энтодерме передней кишки (Monaghan et al., 1993), но Foxa3-нулевые мыши могут выживать. Поэтому промотор Foxa3 был использован в качестве идеального Cre-драйвера для кондиционного истощения др. генов передней кишки. Когда этот подход был использован, чтобы делетировать Foxa2 в энтодерме передней кишки, то потеря Foxa2 компенсировалась за счет Foxa1. В самом деле, спецификация печени, невозможна, когда Foxa2 делетируется кондиционно из энтодермы передней кишки на мутантном Foxa1 (Lee et al., 2005). Возникающая в результате мутантная энтодерма не способна обеспечить печеночную судьбу, даже если in vitro на нее воздействовать FGF. Было также показано, что активность Foxa1/2 в передней части энтодермы передней кишки негативно регулируется с помощью Groucho ко-репрессоров, и что усиление экспрессии GRG3 (TLE1) достаточно, чтобы блокировать печеночную дифференцировку в эксплантах эмбриональной передней кишки (Santisteban et al., 2010), подтверждая, что FoxA-зависимые домены хроматина устанавливаются, но не функциональны до тех пор, пока уровни ко-репрессора GRG3 не будут редуцированы и замещены на продуктивные активаторы. В соотв. с этим возможен механизм, наз. 'bookmarking', FOXA1 остается ассоциированным не специфически с хроматином во время митозов, также как и за счет оставшихся связей с субнабором специфических распознаваемых сайтов, важных для регуляции дифференцировки печени (Caravaca et al., 2013). Такая 'закладка' облегчает эффективную реактивацию программы гепатоцита, когда клетки завершают митотические циклы.
GATA4/5/6
Первоначальные исследования выявили важные функции GATA4 в кардиогенезе, хотя GATA4 и его ближайшие родственники GATA5 и GATA6 экспрессируются также и играют важные роли в производных кишечника органах, включая печень (Laverriere et al., 1994). GATA факторы поэтому регулируют одновременно развитие двух тесно ассоциированных органов (сердца и печени), которые происходят из разных зародышевых слоёв (мезодермы и энтодермы, соотв.,). Подобно FOXA1, GATA4 обладает врожденной способностью взаимодействия с компактным хроматином и связан с энхансером Alb в пред-печеночной энтодерме, как пионерский фактор (Cirillo et al., 2002). Также подобно FoxA факторам, GATA факторы совместно экспрессируются в энтодерме передней кишки и обладают как перекрывающимися, так и ген-специфическими функциями во время органогенеза кишки. У рыбок данио истощение gata4, gata5 или gata6 вызывает тяжелый дефект в экспансии зачатка печени, хотя зачаток специфицируется нормально (Holtzinger and Evans, 2005; Reiter et al., 2001). Более того, совместное истощение любых двух факторов блокирует спецификацию печени (Holtzinger and Evans, 2005), демонстрируя функциональное перекрывание. Обширные исследования по профилированию генов отнесли Gata4/5/6 к 'стержневой' DE программе, состоящей из множественных ауторегуляторных и перекрестно регуляторных петель (Sinner et al., 2006).
Анализ функций GATA в печени мыши осложняются их ранней существенной ролью в развитии вне-эмбриональной энтодермы (ExEn). Однако, используя комплементацию у тетраплоидных эмбрионов для устранения дефекта ExEn, было показано, что Gata4 и Gata6 функционируют в развитии печени (Watt et al., 2007; Zhao et al., 2005). Как и у рыб, потеря любого из генов мышиного эмбриона собственно нарушает экспансию зачатка печени, хотя печеночная энтодерма специфицируется. Следует ожидать, что потеря обоих генов д. устранять печеночную спецификацию, хотя это формально и не было протестировано. Gata5, по-видимому, не функционирует в развитии печени мыши, но то же самое верно для GATA5 в развитии сердца до тех пор, пока мутантный аллель Gata5 не будет скомбинирован с мутантным аллелем Gata4 или Gata6 (Singh et al., 2010). В целом, данные подтвердили раннее перекрывание функций Gata4/5/6 во время спецификации печеночной энтодермы (и вообще энтодермы передней кишки) и последующие не перекрывающиеся роли при росте зачатка печени. Регулируют ли эти факторы те же самые или разные гены, вопрос открытый.
В очищенных взрослых гепатоцитах GATA4 связан с большим количеством генов, контролирующих ключевые аспекты физиологии печени (Zheng et al., 2013). Несмотря на это потеря Gata4 или даже Gata4 и Gata6 в дифференцированных гепатоцитах вызывает неожиданно незначительные изменения в экспрессии генов или функции печени. Это подтверждает, что как только формируется активный транскрипционный комплекс, то др. факторы. такие как FOXA1 могут оказаться достаточны, чтобы отметить регуляторные элементы и поддерживать печеночную программу. Однако, необходимо отметить, что потенциальная компенсаторная роль Gata5, важного для развития печени у рыбок данио, не исключена.
Homeobox genes
Hhex кодирует гомеодоменовый белок, экспрессирующийся как в печеночных клетках, так и желчном эпителии и он необходим для морфогенеза зачатка печени. У мутантных Hhex эмбрионов печеночный дивертикул специфицируется. но клетки неспособны пролиферировать нормально или перемещаться в мезенхиму (Bort et al., 2006). Кондиционное истощение Hhex в печеночном дивертикуле (достигаемое с помощью Foxa3:cre) продемонстрировало его необходимость для нормальной экспрессии Hnf4a, Hnf6 (Onecut1) и Hnf1b, а его мутанты дают гипопластичную кистозную печень (Hunter et al., 2007). Мыши с делецией Hhex в гепатобластах (Afp:cre) выживают, но неспособны поддерживать экспрессию Hnf1b и обладают гиперпролиферативными желчными эпителиальными клетками. Подобно GATA4/6, гомеодоменовый белок HNF1β необходим для развития ExEn, но последующая функция его в спецификации печени была продемонстрирована при использовании комплементации у тетраплоидных эмбрионов нулевого аллеля (Lokmane et al., 2008). Эти мутантные Hnf1b эмбрионы дают гипопластичные дольки печени, лишенные гепатобластов и не способные экспрессировать ALB. HNF1β , по-видимому, стоит ниже Gata6 и необходим для утолщения печеночного зачатка и для поддержания экспрессии Foxa1/2/3. Последующее выделение и миграция печеночных предшественников в строму нуждаются, по крайней мере, в одном из двух функционально перекрывающихся гомеодоменовых факторов HNF6 и ONECUT2 (Margagliotti et al., 2007), а также prospero гомеобелка PROX1 (Sosa-Pineda et al., 2000).
Transcription factor function and cooperation during hepatoblast differentiation
Исследования, базирующиеся на иммуно-преципитации хроматина (ChIP) оценивали потребность в факторах для промоторов печеночных транскрипционных факторов и показали, что дифференцировка специфицированных гепатобластов регулируется с помощью стержневой группы транскрипционных факторов (Kyrmizi et al., 2006), которые включают FOXA2, HNF1β, HNF1α, HNF4α, HNF6 и NR5A2. Кроме того, эмбрионы, лишенные Hnf4a неспособны экспрессировать маркеры дифференцированных гепатоцитов в зачатке печени, тогда как архитектура печени (включая организацию эндотелиальных клеток) нарушена в гепатобластах, лишенных Hnf4a (Parviz et al., 2003). Во время hESC-управляемой дифференцировки, блокирование экспрессии HNF4α с помощью shRNA блокирует раннюю ступень печеночной спецификации, а также экспрессию FOXA1/2 и GATA4/6 (DeLaForest et al., 2011). Это может представлять различия между системами человека и мыши или более неукоснительные потребности в HNF4α в условиях дифференцировки in vitro. Гомеобоксный ген Prox1 также модулирует дифференцировку гепатобластов; если он делетирован из бипотентных гепатобластов, то развиваются эктопические желчные протоки за счет печеночной паренхимы. тогда как в регионах около портальных вен предшественники генерируют исключительно холангиоциты и гиперплазию желчных протоков (Seth et al., 2014).
Foxa2 , по-видимому, также действует параллельно с Sox17 в контроле передней кишки и формировании энтодермы средней и задней кишки (Viotti et al., 2014). Экспрессия Sox17 ассоциирует со спецификацией DE (Sinner et al., 2006). Генетические исследования подтвердили первичную функцию во время спецификации extrahepatobiliary системы из PDX1+ pancreatobiliary бипотентных предшественников, и Sox17 подавляется в области вентральной энтодермы передней кишки, т.к. выбирается печеночная судьба (Spence et al., 2009). Гены дифференцировки печени, включая Hhex, Hnf6 и Hnf4a, также участвуют в развитии древа желчных протоков. Т.о., перекрывающиеся паттерны (и вообще уровни) одних и тех же рекрутируемых наборов транскрипционных факторов контролируют судьбу близко родственных печеночных, панкреатических и желчных клонов.
Stability and flexibility of the liver transcription factor network
Члены семейств FoxA и GATA также важны для спецификации вентральной поджелудочной железы. Следовательно, энтодерма передней кишки, маркируемая с помощью экспрессии Hhex, является первым подразделением с помощью гомеобоксных генов на печеночный (HNF1β-экспрессирующий) или панкреатический (PDX1-экспрессирующий) домены. Бипотентные предшественники в энтодерме 'готовы' к детерминации или судьбы, базируясь на дифференциально распределенных эпигенетических маркерах, которые присутствуют на регуляторных элементах печеночных или панкреатических генов (Xu et al., 2011). Напр., ацетилированный H3K9K14, который обычно ассоциирует с активными генами, обогащен вышестоящими регуляторными элементами молчащего Pdx1 гена по сравнению с молчащими регуляторными элементами печеночных генов. Однако, триметилированная H3K27 метка ассоциирует с репрессией, а EZH2 метилтрансфераза также преимущественно ассоциирует с Pdx1. Т.о., Pdx1 является 'предварительно настроенным', чтобы или активировать или репрессировать, т.к. энтодермальные предшественники детерминированы принять печеночную иди панкреатическую судьбу. Передняя вентральная энтодерма передней кишки, по-видимому, готова к самопроизвольному выбору панкреатической судьбы, при этом p300 (Ep300)-зависимое ацетилирование гистонов необходимо, чтобы активировать печеночную программу (Xu et al., 2011). Ezh2 продолжает функционировать в детерминированных эмбриональных печеночных клетках, способствуя их росту и созреванию и соотв. кондиционный нокаут Ezh2 на ст. E8.5 вызывает существенную потерю печеночной ткани, тогда как нокаут со ст. E13.5 частично ингибирует дифференцировку гепатоцитов (Koike et al., 2014).
Hhex+ предшественники нуждаются в Hnf6 и Prox1 для своей миграции, но эти гены затем по-разному необходимы для спецификации печеночной (Prox1, Hnf4a) или холангиоцитарной (Hnf6, Hnf1b, Sox9) судьбы. Это переключение частично контролируется с помощью Tbx3, который поддерживает экспрессию Prox1 и репрессию Hfn6/Hnf1b в зачатке печени (L?dtke et al., 2009). В соответствии с этим, потеря Prox1 в гепатобластах вызывает экспансию желчных клеток за счет гепатоцитов (Seth et al., 2014), тогда как нокаут Hnf1b вызывает недоразвитие и дисплазию желчных протоков (Coffinier et al., 2002). Это, по-видимому, отражает продукцию предшественников скорее, чем перепрограммирование, поскольку истощение Prox1 в детерминированных гепатоцитах не вызывает гиперплазии желчных протоков. Кроме того, пациенты, гетерозиготные по HNF1B (страдающие от кистоза почек и диабета) имеют нормальную функцию гепатоцитов, но имеют дефекты ресничек, ассоциированные с желчным стазом (Roelandt et al., 2012).
МикроРНК также участвуют в развитии печени. HNF6 и возможно др. печеночные транскрипционные факторы регулируют экспрессию miR122, которая действует как петля позитивной обратной связи, чтобы индуцировать дифференцировку гепатоцитов (Laudadio et al., 2012). Этот механизм может быть связан с подавляющим модулированием репрессорного белка CUTL1 (CUX1) (Xu et al., 2010), а grainyhead-like 2 обеспечивает баланс этой петли путем репрессии уровней miR122 в бипотентных гепатобластах новорожденных (Tanimizu et al., 2014).
Linking signaling to transcriptional regulators
Передача онтогенетических сигналов нуждается в активации экспрессии ключевых транскрипционных факторов, но эти факторы затем образуют обратные связи к сигнальным программам, чтобы координировать онтогенетические переходы и стабилизировать регуляторные сети генов. Во время формирования паттерна энтодермы высокая активность Nodal коррелирует с экспрессией и функцией Foxa2 и Sox17. Wnt/β-catenin также необходимы для экспрессии Sox17 и функционирования DE (Engert et al., 2013; Sinner et al., 2004). Изучение эксплантов у мышей показало, что BMP из мезенхимы поперечной перегородки активирует экспрессию Gata4 (Rossi et al., 2001) и ассоциирует со спецификацией печеночной энтодермы. Кроме того, GATA6 может поддерживать регуляторную петлю на вышестоящий активатор BMPs (Peterkin et al., 2003; Rong et al., 2012). Кардиогенная мезодерма может также предоставлять (помимо BMP) и сигналы FGF, важные для развития передней части зачатка печени (Wang et al., 2015). Во время гаструляции, FGF4 в энтодерме способствует выбору судьбы более задней кишки путем активации экспрессии Pdx1 и CdxB в то же время репрессии судьбы более передней части передней кишки (Dessimoz et al., 2006). Однако, используя хит-шоком индуцированные трансгены, чтобы блокировать передачу сигналов BMP или FGF, оба пути, как было установлено, важны для экспрессии hhex и prox1 и для печеночной спецификации у рыбок данио (Shin et al., 2007).
Ряд исследований подтверждает, что внеклеточный матрикс (ECM) облегчает перекрестную регуляцию BMP, Wnt и FGF. Напр., BMP в передней кишке Xenopus модулируется с помощью ауто-регуляторной петли, которая индуцирует Sizzled, secreted Frizzled-related protein (SFRP), который ингибирует передачу сигналов BMP, это в свою очередь негативно регулирует Tolloid металлопротеазу и контролирует отложения fibronectin (FN) между энтодермой и мезодермой (Kenny et al., 2012). Xenopus Sizzled мофанты обнаруживают пониженную передачу сигналов Wnt в передней кишке, тогда как Sfrp5 в переднем регионе рыбок данио модулирует передачу сигналов Wnt и BMP посредством ингибирования Tolloid (Kenny et al., 2012; Stuckenholz et al., 2013). Было также подтверждено на базе ESC моделирования, что существует FGF-зависимый градиент FN у ранних мышиных эмбрионов, при этом низкие уровни FN соответствуют передней части энтодермы (Villegas et al., 2013). Fn1-нулевые эмбрионы обнаруживают расширенную Cer1 переднюю область, подтверждая, что Fn1 помогает ограничивать проспективный домен передней кишки. Экспрессия Sox17 также обратным образом скоррелирована с экспрессией Cer1, хотя экспрессия Fn1 нормальная у мутантов Sox17, у которых базальная мембрана между мезодермой и энтодермой отсутствует, задняя часть передней кишки нарушена, возникает возможность, что участвуют др. компоненты ECM (Viotti et al., 2014). Время активной передачи сигналов относительно экспрессии ключевых транскрипционных факторов было картировано путем анализа нижестоящих сигналов, напр., фосфорилированного ERK1/2 (MAPK3/1) для FGF и фосфорилированного SMAD1/5/8 для BMPs (Wandzioch and Zaret, 2009). Это исследование показало, что BMP первоначально активирует печеночную (Prox1) программу, в то же время репрессируя панкреатическую (Pdx1) судьбу. Однако, лишь немногими часами позднее на ст. 5- 6-сомитов, BMP активирует обе программы, тогда как FGF репрессирует Pdx1. Активная передача сигналов TGFβ в целое репрессивна для обеих программ, супрессирует экспрессию Hnf1b.
Путь Hippo также оказался связан с контролем транскрипционной сети печени. Путем картирования общих HNF4α и FOXA2 связывающих регионов, которые , как полагают, представляют энхансеры, передача сигналов Hippo участвует в переходе от гепатобластов к дифференцированным гепатоцитам (Alder et al., 2014). Более половины сайтов изменяется в дифференцированных клетках посредством 'переключения энхансеров'. Только регионы, связанные с гепатобластами, были также обогащены мотивом, который связывает транскрипционный фактор TEAD2, который функционирует со своим ко-активатором YAP1. Sphingosine 1-phosphate передача сигналов, действующая посредством LATS1/2 и YAP1, также важна для собственно образования передней энтодермы и может клеточно автономно регулировать присоединение энтодермальных клеток к ECM путем регуляции транскрипции connective tissue growth factor (CTGF), который, как известно, взаимодействует с FN1
(Fukui et al., 2014).
Future perspectives
Although the liver is a naturally regenerative organ, transplantation currently remains the only curative therapy when the liver is damaged to the point of failure. There is thus great interest in translating our understanding of liver development into regenerative therapies, and this knowledge has already facilitated efficient protocols for generating hepatic cells from human pluripotent stem cells in vitro. In addition, hepatic transcription factors that regulate liver development have been used to directly reprogram human fibroblasts to hepatocytes (Du et al., 2014; Huang et al., 2014), although this is relatively inefficient and cells only expand by expressing oncogenes. The concept of hepatocyte transplantation also faces many challenges and, thus far, has shown limited efficacy (Fox et al., 2014). It might therefore be useful to focus on two additional areas of research. First, the generation and rigorously defined phenotyping of earlier progenitors, especially if these can be expanded (without oncogenes) and can provide supportive tissue and niche components, including vascular and biliary cells. Second, given the advances in understanding the developmental programs that generate the liver, it is now reasonable to apply this knowledge to tissue engineering strategies for creating functional liver as replacement tissue.
Using directed differentiation from pluripotent cell sources, hepatic cells can now be grown in culture at scales that could be therapeutic. Yet, given the complexity of liver architecture, it is perhaps not surprising that cellular transplantation to treat human liver failure has not been successful. Efforts have been made to generate extra-corporeal bioartificial liver (BAL) devices that increase hepatocyte survival and blood detoxification, although these have had relatively limited clinical success. The capacity for a stem/progenitor cell to impact adult liver function has also been controversial and might be limited (Miyajima et al., 2014). An alternative approach is to enhance the innate regenerative capacity of the liver, and a better understanding of hepatocyte/cholangiocyte maturation might provide clues for releasing the postmitotic proliferative potential of liver cells, even in damaged tissue. This is likely to involve the same developmental signaling pathways that function during embryonic hepatogenesis, as demonstrated by the requirement of Wnt/?-catenin for regeneration in animal models (Boulter et al., 2012; Tan et al., 2006). With improved understanding of progenitor relationships and fates, particularly in humans, and with the development of humanized mouse models, it might be possible to better organize small liver organoids that have enough supportive environment to survive and that can be scaled or grown in culture for use in either BAL or transplant therapies. Although the cirrhotic liver is not an environment that tolerates transplanted cells/tissues, other internal organs might provide sufficient vascular support, as shown, for example, by the successful transplantation of functional hepatocytes into murine lymph nodes (Komori et al., 2012) or of self-assembled organoids into the mesentery (Takebe et al., 2013).
Tissue engineering strategies might also help to overcome the challenge of strict dependency on the microenvironment for hepatic function, as recently reviewed (Bhatia, 2014). However, a major gap in our knowledge is how to specify the zonal phenotypes that are imparted by hepatic lobule architecture. This is surely impacted by the intricate structure of the lobules, with their arranged cords of polarized hepatocytes that interact with ECM and other cell types. Understanding this problem will benefit from progress in identifying specific signaling components (ligands, receptors, transcription factors) that mediate the cell fate transitions during liver development. However, it is possible that co-culture systems, tissue printing processes or 3D bio-scaffolds might be needed to replicate some aspects of tissue architecture, and this will be a challenge to scale. Animal models that better replicate the clinical manifestations of acute liver failure (such as intracranial hypertension) also need to be developed in order to test and optimize such strategies. Together, these multidisciplinary approaches will hopefully provide a more complete understanding of the orchestration of liver development, both in vivo and in vitro.
Footnotes
