Первые морфологические признаки появления респираторного зачатка у мышей возникают на день эмбриогенеза (E) 9.5 в виде двух первичных зачатков легких, возникающих из вентральной части передней кишки (Fig. 1). Эти тупо оканчивающиеся полые трубки состоят из трех слоёв клеток: внутренний, происходящий из энтодермы эпителиальный слой, окружаемый рыхло упакованной мезенхимой и тонкий наружный мезотелиальный слой (Rawlins, 2010). Взаимные коммуникации между этими слоями клеток управляют морфогенезом ветвления, устанавливающим базовое распределение долей. Лёгкие развиваются асимметрично и образование долей различается у мышей и людей. У мышей правый первичный зачаток дает 4 доли (краниальную, медиальную, каудальную и дополнительную доли), тогда как левый зачаток образует только одну долю (Fig. 1). Лёгкие человека, однако, состоят только из трех правых долей (верхней, медиальной, нижней) и двух левых долей (верхней и нижней). Морфогенез ветвления определяет каркас будущего развития альвеол.

Как только предшественники респираторной энтодермы на вентральной стороне передней части передней кишки специфицируются к образованию первичного поля лёгких, характеризующегося экспрессией Nkx2.1 (NK2 homeobox 1), также наз. TTF-1 (thyroid transcription factor 1), появляются два зачатка первичных легких приблизительно на ст. E9.5 у мышей (~22 сомитов стадия) и ~28 день у человека. Развитие лёгких традиционно подразделяется на 4 основные стадии: pseudoglandular, canalicular, saccular, and alveolar (Fig. 1). Однако, согласно современному представлению различаются две основные стадии: (1) Стадия ветвления, которая соответствует псевдожелезистой стадии, которая начинается E9.5 и завершается приблизительно на E16.5, во время которой эпителиальные предшественники дают эпителий проводящих воздушных путей (Hashimoto et al., 2012; Chang et al., 2013; Rockich et al.,2013; Alanis et al., 2014) и (2) стадия дифференцировки альвеол, начинающаяся приблизительно E16.5 и завершающаяся примерно на ст. P4, чтобы закончиться спустя несколько недель после рождения, в это время дистальные эпителиальные предшественники дают бипотенциальных альвеолярных эпителиальных предшественников, которые затем дифференцируются непосредственно в клетки alveolar type I (ATI) и ATII (Desai et al., 2014; Treutlein et al., 2014).

Overview of Wnt and FGF Pathways During Lung Development

Способность одной ткани изменять поведение соседней ткани наз. индукцией, это ключевой процесс во время органогенеза, включая и морфогенез лёгких. Индуктивные взаимодействия могут быть инструктивными или разрешающими (permissive). При инструктивных взаимодействиях индуцирующая клетка инициирует экспрессию генов в чувствительной клетке, чтобы специфицировать её так, чтоб она смогла дифференцироваться определенным способом. При разрешающих взаимодействиях чувствительная клетка уже специфицирована и нуждается лишь в правильном окружении, чтобы сделать возможным проявление этих признаков.

Энтодермально-мезенхимные взаимодействия постоянно возникают в ходе эмбрионального развития. Концепция, что скоординированные эпителиально-мезенхимные взаимодействия являются жизненно важными, чтобы инструктировать морфогенез лёгких, были продемонстрированы в серии элегантно осуществленных экспериментах по трансплантации ткани (Shannon and Hyatt, 2004). Классическим примером исследования является работа, в которой дистальную часть легочной мезенхимы мыши трансплантировали на участок эпителия трахей, лишенный свой собственной мезенхимы. У таких рекомбинантов эпителий трахеи ветвится способом, сходным с таковым для эпителия дистальных частей лёгких (Alescio and Cassini, 1962; Wessells, 1970). В последующем исследовании было показано, что эпителий трахеи, индуцируемый мезенхимой из дистальных частей легких, экспрессирует маркеры предшественников эпителия дистальных частей лёгких, такие как Sftpc (surfactant protein C) (Shannon, 1994). Эти эксперименты выявили потребность в легочной мезенхиме для инициации морфогенеза ветвления и предопределения эпителиальной клеточной судьбы.

Основополагающее исследование Taderera показало, что эпителий, изолированный из E12.5 измельченных лёгких при культивировании сам по себе на фильтре 0.45 µm, начинал давать веточки только, когда легочная мезенхима мыши помещалась на противоположной стороне (Taderera, 1967). Это указывало на то, что мезенхима способна индуцировать эпителий даже если эти ткани физически разделены фильтром. Taderera также наблюдал, что собственно дифференцировка мезенхимы лёгких (сосуды и гладкие мышцы) зависит от присутствия эпителия, демонстрируя, что индукция соотв. роста, формирования паттерна и дифференцировки происходят в обоих направлениях между энтодермальным эпителием и происходящей из мезодермы мезенхимы. Интересно, что эпителиальная индукция подавлялась, когда она оказывалась расположенной слегка сдвинутой к краю противостоящей мезенхимы. Более того, эпителий никогда не рос за границы мезенхимы на др. сторону фильтра (Shannon and Hyatt, 2004). Эти пионерские наблюдения показали, что градиент растворимых факторов имеет ограниченные пределы, которые, скорее всего, необходимы для становления разных дистальных сигнальных центров в развивающихся лёгких. Способные к диффузии факторы, необходимые для такого двунаправленного взаимодействия, называются факторами роста, и они способны индуцировать разные клеточные исходы. Некоторые из этих факторов участвуют в регуляции морфогенеза лёгких, включая fibroblast growth factors (FGFs), Wnts, bone morphogenetic proteins (BMPs) и Sonic Hedgehog (SHH).

FGF Signaling in the Developing Lung

FGF лиганды осуществляют свои широкого диапазона биологические эффекты за счет связывания и активации семейства FGF receptor (FGFR) из пронизывающих один раз трансмембранных receptor tyrosine kinases (RTK) (Fig. 2A), которые кодируются 4 FGFR генами (Fgfr1-4) у позвоночных. Первая половина (N-концевая) FGFR's - это внеклеточный D3 домен, кодируемый экзоном 7 (также известным как экзон IIIa), тогда как вторая половина кодируется или экзоном 8 (также известным как экзон IIIb) или экзоном 9 (также известным как экзон IIIc) (Goetz and Mohammadi, 2013). Альтернативный сплайсинг во второй половине D3 домена FGFR1-3 в конечном счете генерирует всего 7 изоформ FGFR, отличающиеся своим сродством связывания в отношении FGF лигандов (Johnson et al., 1991; Miki et al., 1992; Yayon et al., 1992; Orr-Urtreger et al., 1993; Yan et al., 1993; Chellaiah et al., 1994). Действительно, структурные исследования показали, что альтернативный сплайсинг в D3 домене FGFR2 определяет специфичность связывания лиганда за счет изменения ключевых остатков, важных для формирования водородных мостиков с лигандом (Plotnikov et al., 2000; Yeh et al., 2003; Olsen et al.,2006). Событие альтернативного сплайсинга регулируется ткане-специфическим способом, при этом изоформы FGFRIIIb и FGFRIIIc обычно экспрессируются в эпителии и мезенхиме, соотв. (Orr-Urtreger et al., 1993). Эпителиальные изоформы FGFR преимущественно связывают лиганды, которые экспрессируются в мезенхимной ткани и наоборот (Zhang et al., 2006). Такая реципрокная ткане-специфичная экспрессия изоформ рецепторов и лигандов является фундаментальной для становления специфической паракринной передачи сигналов FGF между эпителием и мезенхимой, которая является критической для регулирования многих онтогенетических процессов, включая и морфогенез лёгких. Связывание FGF лиганда в комбинации с гепаран сульфатом, необходимым для стабилизации комплекса передачи сигналов FGF/FGFR (Schlessinger et al., 2000), вызывает димеризацию рецептора и транс-фосфорилирование специфических остатков тирозина в цитоплазматическом киназном домене рецептора. Это облегчает задействование нескольких адапторных белков, необходимых для активации ниже расположенного сигнального каскада FGF, включая MAPK (mitogen-activated protein kinase), PI3K (phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase)/AKT и phospholipase C/Ca²⁺ пути (Fig. 2B). Передача сигналов FGF точно регулируется с помощью модуляторов негативной петли обратной связи, включая членов семейства белков Sprouty (Spry), которые ингибируют вызываемую FGF активацию Ras-MAPK в разной степени. Более того, Spry-обеспечиваемая модуляция передачи сигналов RTK очень гибкая и является клеточно- и контекст-зависимой (Cabrita and Christofori, 2008).

Передача сигналов FGF является критическим компонентом регуляторной сети генов, регулирующих развитие лёгких, включая поддержание популяций клеток предшественников, формирование эпителиального и мезенхимного паттерна и дифференцировку, а также морфогенез ветвления. Несколько FGF лигандов экспрессируются в развивающихся лёгких, включая Fgf7, Fgf8, Fgf9, Fgf10 и Fgf18. Из них только FGF10 абсолютно необходим для инициального образования лёгких. Мыши, лишенные Fgf10 или его главного рецептора Fgfr2b всё ещё формируют трахею, но обнаруживают полный агенез лёгких (Min et al., 1998; Sekine et al., 1999; De Moerlooze et al., 2000; El Agha et al., 2012). Fgf10 динамически экспрессируется в субмезотелиальной мезенхиме в месте где появятся будущие зачатки лёгких (Bellusci et al., 1997). Он действует на подлежащий эпителий, экспрессирующий Fgfr2b, чтобы индуцировать выросты зачатков, вызывая реакцию хемотаксиса и миграцию (Bellusci et al., 1997; Park et al., 1998; Weaver et al., 2000; Hyatt et al., 2004) и удерживая дистальные эпителиальные предшественники в недифференцированном состоянии (Nyeng et al., 2008; Abler et al., 2009; Volckaert et al., 2013). Важно, что Fgf10-экспрессирующие клетки представлены пулом мезенхимных предшественников, которые дают гладкомышечные клетки воздушных путей и сосудов, а также липофибробласты (Mailleux et al., 2005; El Agha et al., 2014).

Экспрессия Fgf7 может быть обнаружена в развивающихся лёгких, начиная со ст. E14.5 по всей лёгочной мезенхиме, окружающей лёгочную энтодерму (Mason et al., 1994; Finch et al., 1995). Инактивация Fgf7 , однако, не затрагивает морфогенеза лёгких (Guo et al., 1996), указывая тем самым, что др. FGFs (напр., FGF10) компенсируют его потерю. Специфичная для эпителия избыточная экспрессия Fgf7, с др. стороны, увеличивает размер лёгких, пролиферацию эпителия и вызывает кисто-аденоматоидные пороки развития (Tichelaar et al., 2000).

FGF10 и FGF7 воздействуют на эпителий посредством FGFR2b, и всё же они вызывают разные клеточные исходы в эксплантах изолированного лёгочного эпителия. Эпителиальное ветвление усиливается в присутствии повсеместно распространенного рекомбинантного FGF10, тогда как FGF7 индуцирует пролиферацию, приводя к эпителиальной гиперплазии и образованию кисто-подобных структур (Shiratori et al., 1996; Zhou et al., 1996). Возникает вопрос, как могут FGF10 aи FGF7 активировать столь отличающиеся эпителиальные реакции, хотя они активируют один и тот же рецептор FGFR2b? Эта загадка недавно была разрешена в исследовании, показавшем, что FGF10 стимулирует фосфорилирование Y734 в FGFR2b, которое облегчает рекрутирование PI3K вместе с SH3 (SRC Homology 3) domain binding protein 4 (SH3bp4) (Fig. 2C). Этот комплекс, который образуется после стимуляции FGF10, но не FGF7, является молекулярным ключом, который стимулирует интернализацию FGFR2b, сопровождаемую его повторным использованием (recycling). Как результат стимуляция FGF10 приводит к продолжительной активации PI3K-AKT пути, который приводит к повышенной миграции клеток и эпителиальному ветвлению (Francavilla et al., 2013). FGF7, с др. стороны, способствует деградации FGFR2b, приводя к временной передаче сигналов FGFR2b и пролиферации. Эктопическая экспрессия Y734F-мутантной формы FGFR2b или нокдаун Sh3bp4 в эксплантах лёгких, культивируемых in vitro, нарушает реакцию на FGF10 с хемотактической (образование зачатка) на пролиферативную (кисто-подобные структуры) (Francavilla et al., 2013). Интересно, что путь PI3K-AKT, как было установлено, непосредственно активирует передачу сигналов β-catenin во время развития лёгких, также как и в эпителии воздушных путей взрослых после повреждений (Volckaert et al., 2011, 2013) (see below). Следовательно, разные эпителиальные исходы в ответ на FGF10 vили FGF7, скорее всего, вызываются различиями в нижестоящей активации передачи сигналов β-catenin.

В противоположность локализации в мезенхиме FGF10 и FGF7, ген Fgf9 экспрессируется в лёгочном эпителии и мезотелии, наиболее наружном слое лёгких вплоть до примерно E12.5, после чего он становится ограниченным мезотелием (Colvin et al., 1999; del Moral et al., 2006). Fgf9^-/- лёгкие обнаруживают снижение пролиферации мезенхимы и нарушение эпителиального ветвления, приводящих к перинатальной гибели (Colvin et al., 2001; White et al., 2006). Во время развития лёгких, происходящие из мезотелия сигналы FGF9 к расположенной под мезотелием мезенхиме действуют посредством FGFR1/2c (White et al., 2006), где он способствует пролиферации клеток, экспрессирующих Fgf10, и ингибирует дифференцировку airway smooth muscle cell (ASMC) (Colvin et al., 2001; De Langhe et al., 2006; del Moral et al., 2006; Yi et al., 2009). Кроме того, происходящие из эпителия FGF9 регулируют морфогенез ветвления за счет аутокринной активации эпителиальных FGFRs или косвенно путем регуляции передачи сигналов FGFR в субэпителиальной мезенхиме и в их нижестоящих мишенях (del Moral et al., 2006; White et al., 2006; Yin et al., 2008, 2011).

FGF8 и FGF18 являются тесно связанными лигандами, которые экспрессируются в развивающемся легочном эпителии, но фенотипы Fgf18^-/- совершенно отличны от таковых у гипоморфов Fgf8. Fgf18-дефицитные мыши имеют гипопластичные лёгкие с пониженной клеточной пролиферацией и незатронутой дифференцировкой эпителия (Usui et al., 2004), тогда как Fgf8 мутантные лёгкие имеют гиперпластический фенотип с избыточной пролиферацией дистальных эпителия и мезенхимы и с нарушенной дифференцировкой эпителия (Yu et al., 2010). Более того, избыточная экспрессия Fgf18 во время развития лёгких приводит к эктопическому образованию хряща (Whitsett et al., 2002).

Wnt/β-catenin and Hippo Signaling in the Developing Lung

Имеющиеся данные показывают, что каноническая передача сигналов Wnt является главным регулятором развития лёгких. В отсутствие канонической передачи сигналов Wnt, цитоплазматические уровни этого нижестоящего эффекторного белка β-catenin удерживаются низкими за счет связывания с "деструктивным комплексом," который состоит из центрального каркасного белка Axin, APC (adenomatous polyposis coli) и serine/threonine kinases GSK-3β (glycogen synthase kinase-3 beta) ab CK1α (casein kinase-1 alpha) (Fig. 3). Отловленный β-catenin постепенно фосфорилируется на своем N-конце с помощью CK1α (Ser45) и GSK-3β (Thr41, Ser37 и Ser33) (Liu et al., 2002). Этот фосфорилированный мотив распознается с помощью ubiquitin E3 ligase β-TrCP (β-transducin repeat-containing protein), которая убиквитинирует β-catenin и направляет его на быструю деградацию с помощью протеосом (Aberle et al., 1997; Kitagawa et al., 1999). Удаление β-catenin из деструктивного комплекса посредством деградации с помощью протеосом, запускает повторно в оборот деструктивный комплекс для др. раунда деградации β-catenin (Li et al., 2012). Wnt лиганды соединяются с гетеротримерным рецепторным комплексом, который состоит из Frizzled (Fzd) и low density lipoprotein receptor-related protein (LRP) 5/6 белка. Признаком активации Wnt рецептора является фосфорилирование LRP5/6 (Tamai et al., 2004), которое создает место прикрепления для Axin-содержащего деструктивного комплекса (Mao et al., 2001; Tamai et al., 2004; Davidson et al., 2005; Zeng et al., 2005). Как следствие деструктивный комплекс ингибируется, приводя к накоплению и транслокации в ядро β-catenin. Как в точности комплекс деградации противодействует в ответ на передачу сигналов Wnt всё ещё неясно (MacDonald et al., 2009). Одна модель говорит в пользу гипотезы, что передача сигналов Wnt предохраняет β-catenin от соединения с деструктивным комплексом (Kim et al., 2013). Однако, недавнее исследование показало, что после связывания Wnt, интактный комплекс деградации рекрутируется на активированный рецепторный комплекс, где он всё ещё способен отлавливать и фосфорилировать β-catenin, но не может более его убиквитинировать (Li et al., 2012) (Fig. 3). Следовательно, отделение β-TrCP от деструктивного комплекса представляет собой ключевую ступень, лежащую в основе Wnt реакции (Li et al., 2012). Рекрутирование β-TrCP зависит от включения цитоплазматического YAP (Yes-associated protein) и TAZ (transcriptional co-activator with a PDZ-binding domain), коллективно обозначаемых как YAP/TAZ, которые также являются ядерными эффекторами пути Hippo, в деструктивном комплексе, где они соединяются с Axin (Azzolin et al., 2014). В Wnt-стимулированных клетках, LRP вытесняет YAP/TAZ из деструктивного комплекса за счет перемещения его от Axin, это делает отловленный β-catenin невидимым для β-TrCP (Azzolin et al., 2014). Комплекс деградации быстро насыщается фосфорилированным β-catenin, вновь синтезированный β-catenin накапливаться в цитоплазме и транслоцироваться в ядро, где он используется транскрипционными факторами, в основном принадлежащими к LEF1/TCF (lymphoid enhancer-binding factor 1/T cell-specific transcription factor) семейству, чтобы активировать Wnt транскрипционную программу (Staal et al., 2002; Li et al., 2012).

Передача сигналов Wnt/β-catenin регулируется на многих уровнях, включая секретируемые ингибирующие белки, которые предупреждают Wnt лиганды от соединения со своим рецепторным комплексом (Kawano and Kypta, 2003; Cruciat and Niehrs, 2013). Секретируемые Fzd-related proteins (sFRPs) и Wnt inhibitory factors (WIFs) противодействуют Wnts путем непосредственного связывания с ними, это делает их неспособными взаимодействовать с Wnt рецепторами (Bovolenta et al., 2008). MЧлены семейства Dickkopf (DKK), с др. стороны, противодействуют передаче сигналов Wnt путем непосредственного соединения с эктодоменами LRP5/6 ко-рецепторов, делая их недоступными для Wnt лигандов в результате конкуренции за один и тот же сайт связывания (Bao et al., 2012) (Fig. 3).

β-catenin mediates crosstalk between canonical Wnt signaling and cadherin-mediated cell adhesion

Белок β-catenin первоначально был идентифицирован как интегральный структурный компонент базирующихся на cadherin слипчивых соединений (Ozawa et al.,1989), где он сцепляет внутриклеточный домен cadherins с α-catenin, который в свою очередь взаимодействует с актиновым цитоскелетом (Rimm et al., 1995; Drees et al., 2005; Yamada et al., 2005) (Fig. 3). Однако, мнение, что это приводит к прямому и стабильному сцеплению между кадгеринами и актином оказаось спорным после открытия, что α-catenin соединяется с β-catenin и актином взаимоисключающим способом (Yamada et al., 2005). Передача сигналов канонических Wnt и cadherin-обусловленная клеточная адгезия конкурируют за β-catenin. Избыточная экспрессия кадгеринов у Xenopus и Drosophila эмбрионов снижает возможность β-catenin's осуществлять свою ядерную функцию по секвестрированию его на клеточных соединениях и воспроизводит фенотипы, вызываемые ингибированием передачи сигналов канонических Wnt (Heasman et al., 1994; Sanson et al., 1996). Протеолиз кадгеринов также может влиять на передачу сигналов Wnt путем стимулирования высвобождения β-catenin, который транслоцируется в ядро, чтобы активировать Wnt/β-catenin гены мишени. Однако, очевидно, что нарушение механизма деградации β-catenin является обязательным условием активирования передачи сигналов β-catenin после потери кадгеринов (Kuphal and Behrens, 2006; Herzig et al., 2007; Heuberger and Birchmeier, 2010). Др. словами, высвобожденный β-catenin, после протеазами обусловленной потери кадгеринов, может действовать, усиливая передачу сигналов β-catenin? когда передача сигналов Wnt уже активна. События фосфорилирования также регулируют переключение между передачей сигналов β-catenin и cadherin-обеспечиваемой клеточной адгезии. Напр., фосфорилирование С-конца кадгеринов регулирует взаимодействия с β-catenin в зависимости от места фосфорилирования (Lickert et al., 2000; Choi et al., 2006; Qi et al., 2006). Кроме того, фосфорилирование β-catenin с помощью цитоплазматической тирозин киназы Src и EGFR (epidermal growth factor receptor) по остатку тирозина Y654 снижает способность β-catenin соединяться с кадгерином, это ослабляет зависимую от кадгерина адгезию и увеличивает ядерный β-catenin (Roura et al., 1999; Rhee et al., 2007). Сходным образом, фосфорилирование Y142 β-catenin усиливает передачу сигналов Wnt за счет нарушения взаимодействия β-catenin с α-catenin (Rosato et al., 1998; Piedra et al., 2003; Brembeck et al., 2004). Это показывает, что зависимое от фосфорилирования высвобождение β-catenin из кадгеринового комплекса не только регулирует межклеточную адгезию, но и может также служить альтернативным механизмом усиления/активации передачи сигналов β-catenin. В дополнение к непосредственному фосфорилированию β-catenin по Y654 и Y142 (Krejci et al., 2012), передача сигналов FGF также может прямо активировать передачу сигналов β-catenin посредством пути PI3K-AKT, который действует, чтобы предупредить деградацию β-catenin путем ингибирования GSK-3β, и с помощью фосфорилирования β-catenin по Ser552, которое помогает направлять β-catenin в ядро (Fang et al., 2007; He et al., 2007). Наконец, многие гены мишени канонических Wnt кодируют протеазы, которые снижают межклеточную адгезию, такие как matrix metalloproteinase (MMP) 7 (Crawford et al., 1999), и транскрипционные факторы, которые непосредственно ингибируют промотор гена E-cadherin, такие как Twist (Howe et al., 2003), Snail1 (Zhou et al., 2004; Bachelder et al., 2005) и Snail2 (Vallin et al., 2001; Conacci-Sorrell et al., 2003).

Crosstalk between Wnt and Hippo signaling

Эволюционно консервативный путь Hippo начинает выступать как критический регулятор размеров органов, гомеостаза ткани и регенерации (Halder and Johnson, 2011; Zhao et al., 2011; Harvey et al., 2013; Lin et al., 2013; Yu and Guan, 2013). Будучи активным канонический Hippo путь стимулирует киназный каскад, состоящий из MST1/2 и LATS1/2 киназ, которые в конечном итоге фосфорилируют Hippo эффекторные белки YAP/TAZ, способствуя тем самым их удержанию в цитоплазме и деградации. Vice versa, инактивация передачи сигналов Hippo направляет YAP/TAZ в ядро, jult они взаимодействуют с TEA domain (TEAD) транскрипционными факторами, чтобы регулировать экспрессию генов.

Биологические реакции, обеспечиваемые ядерными YAP/TAZ удивительно сходны м теми, что управляются с помощью Wnt/β-catenin, подтверждая, что пути передачи сигналов Hippo и Wnt взаимодействуют функционально и генетически. Одним из примеров такого взаимного общения является инкорпорация YAP/TAZ в деструктивный комплекс, где они важны для деградации β-catenin, также как и для TAZ за счет рекрутирования β-TrCP (Azzolin et al., 2012, 2014) (Fig. 3). Активация Wnt приводит к диссоциации YAP/TAZ из деструктивного комплекса, что позволяет им проникать в ядро (Azzolin et al., 2014). Фактически было показано, что только β-catenin способен транслоцироваться в ядро в клетках, которые или уже содержат ядерные YAP/TAZ или полностью лишены YAP/TAZ (Azzolin et al., 2012, 2014). Следовательно, YAP/TAZ/TEAD-обеспечиваемая экспрессия генов является интегральной частью транскрипционного ответа Wnt. Имеются также доказательства активации Wnt/β-catenin как результата ядерных YAP/TAZ в ответ на инактивацию передачи сигналов Hippo (Varelas et al., 2010; Heallen et al., 2011; Imajo et al., 2012). В самом деле, направление YAP/TAZ в ядро отводит их прочь от цитоплазматического β-catenin деструктивного комплекса, подтверждая, что ядерные YAP/TAZ могут активировать передачу сигналов β-catenin вообще-то даже независимо от Wnt лигандов (Azzolin et al., 2014). Помимо способности ингибировать стабилизацию β-catenin посредством доставки β-TrCP в деструктивный комплекс, цитоплазматические YAP/TAZ, как было установлено, ослабляют также передачу сигналов Wnt путем регулирования CK1α-обеспечиваемого фосфорилирования dishevelled (Dvl) (Varelas et al., 2010; Imajo et al., 2012), нижестоящего медиатора передачи сигналов канонического и не канонического Wnt. Однако, функциональное значение фосфорилирования Dvl в контексте передачи сигналов Wnt недостаточно ясно, хотя имеются доказательства, что фосфорилирование Dvl происходит независимо от деструктивного комплекса (Gonzalez-Sancho et al., 2013; Azzolin et al., 2014). Интересно, что Dvl играет также роль в ядре, где он спосоствует передаче сигналов Wnt/β-catenin путем стабилизации комплекса ?β-catenin/TCF (Itoh et al., 2005; Gan et al., 2008), механизм, который подавляется с помощью цитоплазматического YAP благодаря ограничению транслокации в ядро Dvl (Barry et al., 2013). Наконец, Yap, как было установлено, является непосредственной транскрипционой мишенью для β-catenin в клетках колоректального рака (Konsavage et al., 2012).

Слипчивые соединения образуют др. клеточный перекресток, где встречаются сигнальные пути Hippo и Wnt/β-catenin. Подобно β-catenin, фосфорилированный YAP взаимодействует с α-catenin посредством 14-3-3 белков , а делеция α-catenin достаточна, чтобы сдвинуть YAP в ядро и индуцировать плоскоклеточную карциному в коже (Schlegelmilch et al., 2011; Silvis et al., 2011). Т.о., присутствие этих ко-факторов в межклеточных соединениях представляет собой важный аспект в их функциональной регуляции их влиянии на клеточное поведение. Как таковой частичный epithelial-mesenchymal transition (EMT), наблюдаемый в раковых клетках, которые наследуют потерю апико-базальной клеточной полярности и дестабилизацию соединительных комплексов (Thiery et al., 2009; De Craene and Berx, 2013), является средством для приобретения стволовости с помощью нетрансформированных и опухолевых клеток (Mani et al., 2008; Guo et al., 2012), а недавняя работа показала, то этот процесс в основном обеспечивается за счет индукции транслокации в ядро TAZ (Cordenonsi et al., 2011). Это подтверждает, что дестабилизация соединительных комплексов, происходящая во время прогрессирования опухолей и метастазирования, может действовать, чтобы вызывать клеточный рост путем смещения β-catenin и YAP/TAZ из межклеточных соединений, чтобы усилить транскрипционную активность Wnt и Hippo.

Wnt/β-catenin signaling regulates respiratory specification and epithelial and mesenchymal differentiation during lung development

Многочисленные компоненты сигнального каскада Wnt экспрессируются в развивающихся лёгких и многие сообщения, касаются некоторых из этих разнообразных аспектов регуляции морфогенеза лёгких. Из 19 Wnt генов, присутствующих в геноме позвоночных, 5 экспрессируются в развивающихся лёгких: Wnt2, Wnt2b, Wnt7b, Wnt5a и Wnt11 (Lako et al., 1998; Li et al., 2002; Shu et al., 2002; Weidenfeld et al., 2002; De Langhe et al., 2005; Rajagopal et al., 2008; Goss et al., 2009). Экспрессия Wnt2 и Wnt2b наблюдается в мезодерме, окружающей переднюю вентральную часть передней кишки со ст. E9.0 по E10.5, т.е. во время спецификации лёгких и формирования первичных зачатков, экспрессия продолжается и на более поздних стадиях в развивающейся легочной мезенхиме, при этом наивысший уровень экспрессии наблюдается в дистальных частях (De Langhe et al., 2005; Goss et al., 2009). Потеря Wnt2 (Wnt2^-/- нулевые мыши) приводит к тяжелой легочной гипоплазии, дефектам в развитии ASMC и снижению клеточной пролиферации как в эпителиальном, так и мезенхимном клеточных компартментах (Goss et al., 2009, 2011). Wnt2b^-/- нулевые мутанты жизнеспособны без видимых аномалий, но одновременное удаление Wnt2 и Wnt2b (Wnt2-/-;Wnt2b-/-) приводит к агенезу лёгких (Goss et al., 2009). Wnt7b экспрессируется исключительно в энтодерме вентральной передней части передней кишки во время спецификации лёгких и продолжает экспрессироваться в эпителии воздушных путей в ходе всего развития лёгких, при этом наивысшие уровни Wnt7b обнаруживаются дистально (Shu et al., 2002; Weidenfeld et al., 2002; De Langhe et al., 2005). Генетическая инактивация Wnt7b приводит к сходному гипопластическому фенотипу лёгких, как и у мышей Wnt2-/- , с дефектами в развитии гладкомышечных мышц (Shu et al., 2002; Rajagopal et al., 2008; Cohen et al., 2009), а комбинированная потеря Wnt2 и Wnt7b приводит к более тяжелым лёгочным аномалиям, включая драматическое снижение ветвления вместе с нарушениями паттерна дистальной энтодермы (Miller et al., 2012). Это подтверждает, что Wnt2 и Wnt7b кооперируются, чтобы регулировать формирование проксимо-дистального паттерна и развитие мезенхимы в легких. Не канонический Wnt5a лиганд первоначально экспрессируется на низких уровнях в мезенхиме и эпителии, но затем ограничивается дистальным эпителием после ст. E12.5 (Li et al., 2002; De Langhe et al., 2005). Отсутствие Wnt5a (Wnt5a-/-) приводит к усилению мезенхимной пролиферации, избыточной экспрессии дистального эпителия и к задержке созревания лёгких (Li et al., 2002). Эти дефекты могут быть обусловлены усилением передачи сигналов β-catenin? поскольку Wnt5a, как было установлено, противодействует каноническому Wnt пути, способствуя GSK-3β-независимой деградации β-catenin (Topol et al., 2003). Белки Fzd и LRP также экспрессируются в виде ткане-специфических паттернов во время развития лёгких. Экспрессия Fzd8, Fzd10 и Lrp6 ограничена эпителием, Fzd1 и Fzd4 экспрессируются в мезенхиме, тогда как Fzd2, Fzd3,Fzd6, Fzd7 и Lrp5 экспрессия может обнаруживаться в обоих тканевых компартментах (De Langhe et al., 2005; Wang et al., 2005). Эти паттерны экспрессии подтверждают, что передача сигналов Wnt может быть активирована паракринным и/или аутокринным способом в эпителии и мезенхиме. Экспрессия эндогенных модуляторов Wnt, таких как Dkk1, Dkk2, Dkk3, sFrp1, sFrp2 и sFrp4 также обнаруживается в развивающемся эпителии и/или соседней мезенхиме в виде специфических пространственно-временных паттернов (Tebar et al., 2001; De Langhe et al., 2005). Воздействие на изолированную переднюю кишку экзогенным DKK1 ингибирует образование первичных зачатков лёгких (Chen et al., 2010). Кроме того, воздействие на E11.5 лёгочные экспланты DKK1 нарушает развитие ASMC и сосудов, и приводит к тяжелым дефектам ветвления, характеризующихся неспособностью образования щели (cleft), и к укрупнению терминальных зачатков (De Langhe et al., 2005; Mahoney et al., 2014), вызываемых за счет уменьшения отложений фибронектина (De Langhe et al., 2005). In vivo избыточная экспрессия Dkk1 ингибирует экспрессию маркеров дистальной эпителия, способствуя при этом образованию проксимального эпителия (Shu et al., 2005; Volckaert et al., 2013).

β-catenin также как и транскрипты Tcf1, Lef1, Tcf3 и Tcf4, как было установлено, локализуются в развивающейся энтодерме и соседней мезенхиме (Tebar et al., 2001). Витальные функции передачи сигналов канонических (т.e., β-catenin-опосредованных) Wnt во время развития лёгких были выявлены с помощью исследований нокаута и стабилизации β-catenin. Ранняя специфическая для энтодермы делеция Ctnnb1, гена, кодирующего β-catenin, приводит к полной неспособности специфицировать лёгочные предшественники в вентральной части энтодермы передней кишки (Goss et al., 2009; Harris-Johnson et al., 2009), сходные с теми, что наблюдаются у Wnt2/2b-дефицитных мышей (Goss et al., 2009). На поздних стадиях развития легких, специфичная для эпителия инактивация Ctnnb1 с использованием Sftpc-rtTa; tet(O)Cre системы, приводит к респираторной недостаточности из-а тяжелых аномалий лёгких, включая пониженное ветвление и дефекты формирования проксимо-дистального паттерна лёгких, частично с помощью специфического подавления множественных критических генов мишеней и путей, включая передачу сигналов N-myc, BMP4 и FGF (Mucenski et al., 2003; Shu et al., 2005). Ранняя, специфичная для энтодермы (Shh-Cre) стабилизация β-catenin, которая отсутствует в регионе, содержащем GSK-3?β-обусловленные сайты фосфорилирования, кодируемые экзоном 3 в Ctnnb1(Ctnnb^Δ(ex3)), приводя к репрограммированию энтодермы пищевода и желудка в предшественники лёгочной энтодермы (Goss et al., 2009; Harris-Johnson et al., 2009). Аллель Ctnnb^Δ(ex3)) был также скомбинирован с др. линиями Cre драйверов, чтобы стабилизировать β-catenin в развивающийся эпителий на поздних ст. развития. Nkx2.1-Cre управляемая стабилизация β-catenin приводит к дилятации воздушных путей, ингибированию дифференцировки эпителиальных типов клеток проводящих воздушных путей и к образованию полип-подобных структур в эпителии трахей и бронхов (Li et al.,2009). Во взрослых лёгких стабилизация β-catenin в club клетках, с использованием линии Scgb1a1-Cre, нарушает дифференцировку эпителиальных клеток, вызывает гиперплазию бокаловидных клеток, увеличивает воздушное пространство и вызывает опухоли лёгких (Mucenski et al., 2005) и увеличивает пул лёгочных стволовых клеток (Reynolds et al.,2008; Zhang et al., 2008). Система Sftpc-Cre;Ctnnb^Δ(ex3)) была использована для стабилизации β-catenin в презумптивных бронхиолах и дистальных кончиках энтодермы, приводя к дефектам дифференцировки бронхиолярного, но не альвеолярного эпителия (Hashimoto et al., 2012). Однако, избыточная экспрессия постоянно активного слитого белка β-catenin/LEF1 с использованием того же самого Sftpc-Cre драйвера, блокирует гены дифференцировки, специфичные для альвеолярных типов клеток (Okubo and Hogan, 2004). В противоположность эффектам стабилизации β-catenin перед спецификацией лёгких (Goss et al., 2009; Harris-Johnson et al., 2009) , во время которой энтодерма пищевода и желудка адаптирует лёгочную судьбу, избыточная экспрессия постоянно активного β-catenin/LEF1 слитого белка на поздних стадиях во время развития лёгких заставляет клетки легочного эпителия приобретать судьбу кишечника (Okubo and Hogan, 2004), это указывает на то, что функция β-catenin в переключении клеточных судеб зависит от контекста. Важным различием между системой Ctnnb^Δ(ex3) и β-catenin/LEF1 слитым белком является то, что первая нуждается в эндогенной совместной экспрессии LEF/TCF факторов, чтобы активировать передачу сигналов канонических Wnt, тогда как последний не нуждается. Поэтому очень возможно, что разные реакции при этих двух стратегиях стабилизации β-catenin обусловлены неправильной экспрессией транскрипционного фактора LEF1.

Роль передачи сигналов канонического Wnt в развивающейся легочной мезенхиме была исследована совсем недавно. Специфичная для мезенхимы инактивация β-catenin с использованием Dermo1-Cre линии приводит к дефектам мезенхимы, которые напоминают таковые при Pitx1-/-;Pitx2-/- фенотипе (Marcil et al.,2003), подтверждая, что передача сигналов β-catenin в мезенхиме базируется на транскрипционных факторах семейства PITX (De Langhe et al., 2008). Установлено, что передача сигналов β-catenin в мезенхиме регулирует образование и умножение Fgf10-экспрессирующих ASMC предшественников и косвенно регулирует собственно дифференцировку ангиобластов в зрелые эндотелиальные клетки (De Langhe et al., 2008). Находка, что передача сигналов Wnt/β-catenin в мезенхиме необходима для экспансии и развития ASMC предшественников в лёгких, подтверждена делецией β-catenin специфически в предшественниках ASMC , а также в зрелых ASMCs с использованием Sm22α-Cre линии (Cohen et al., 2009). Cohen et al. (2009) далее показали, что это происходит посредством оси передачи сигналов Wnt/tenascin/platelet-derived growth factor receptor (Pdgfr) , которая также сильно активируется у мышей, моделирующих индуцируемую аллергеном астму, а также при пульмональной артериальной гипертензии у пациентов. Недавно успешное отслеживание клонов подтвердило, что все ASMCs происходят из дистальной легочной мезенхимы и что передача сигналов Wnt в мезенхиме необходима для инструкции неподготовленной легочной мезенхимы по принятию судьбы предшественников ASMC (Kumar et al., 2014).

Role of Wnt and FGF Signaling in the Specification and Initiation of the Respiratory Lineage

Вскоре после гаструляции (E7.5 у мышей),дефинитивная энтодерма складывается, чтобы сформировать первичную кишечную трубку. По мере развития эмбриона активно перемещающаяся энтодерма кишечной трубки подвергается воздействию со стороны временных и пространственных специфичных для мезенхимы паттернов экспрессии генов. В ответ энтодерма экспрессирует транскрипционные факторы, которые воздействуют обратно на мезенхиму. В самом деле, утонченное взаимное общение между энтодермой и мезодермой контролируется с помощью ключевых сигналов, включая FGFs, Wnts, SHH и BMPs, это является критическим для становления паттерна кишечной трубки вдоль передне-задней оси, также как и вдоль вентро-дорсальной (V-D) оси, и тем самым специфицируются первичные поля органов. Первая ступень спецификации представлена очерчиванием первичной кишечной трубки в домены передней, средней и задней кишки (Fig. 4A), каждый характеризуется своим собственным профилем генной экспрессии. На ст. E7.5-E8.5, продуцируется A-P градиент FGF4, BMP2 и Wnt лигандов в мезодерме, так что низкие уровни экспрессии находятся спереди, на наивысшие уровни экспрессии сзади, это способствует образованию задней кишки и ингибирует судьбы передней кишки, маркированных соотв. экспрессией Cdx (caudal type homeobox) и Sox2/Hhex (hematopoietically-expressed homeobox protein) транскрипционных факторов (Zorn and Wells,2009). Hox гены экспрессируются в энтодерме и мезодерме вдоль A-P оси и , как полагают, играют важную роль в формировании паттерна передней кишки (Ornitz and Yin, 2012), но их функция в точности ещё не установлена. Как только вычленяется энтодерма кишечной трубки возникает передняя, средняя и задняя кишка, происходит вторая ступень спецификации, в которой эти домены далее подразделяются на орган-специфические регионы за счет локальной передачи средовых сигналов между энтодермой и мезодермой. Несколько органов возникает из передней кишки, включая лёгкие, трахеи, пищевод, щитовидные железы, желудок, печень, желчная система и поджелудочная железа (Fig. 4A). Энтодермальные предшественники в передней части передней кишки, которые предназначены стать респираторной системой и щитовидной железой, экспрессируют Nkx2.1 (Kimura et al., 1996), предшественники, которые дают печень, экспрессируют Hex (Martinez Barbera et al., 2000), тогда как проспективные панкреатические и дуоденальные предшественники экспрессируют Pdx1(pancreatic and duodenal homeobox 1) (Offield et al., 1996). Средняя кишка формирует тонкий кишечник, а задняя кишка даёт толстый кишечник (Fig. 4A).

Некоторые сигнальные пути, которые репрессируют выбор судьбы передней кишки с самого начала, такие как передача сигналов Wnt, FGF и BMP, являются критическими для становления респираторной судьбы позднее (Fig. 4C). Наблюдается парадокс, но он демонстрирует, насколько важны время и расположение этих сигналов для формирования паттерна энтодермы передней кишки (Kadzik and Morrisey, 2012). Интересно, как клетки могут менять свою реакцию на одни и теже сигналы в течение нескольких часов. Передача сигналов факторов роста специфицирует лёгочный домен частично за счёт активации транскрипции Nkx2.1 (Serls et al., 2005; Que et al.,2007; Goss et al., 2009; Harris-Johnson et al., 2009; Domyan et al., 2011), который является самым ранним из известных маркеров, специфицирующих респираторную энтодерму, и он присутствует в проспективном регионе легких/трахей в вентральной части энтодермы iпередней кишки на ст. E9.0 (Lazzaro et al., 1991; Minoo et al., 1999). Однако, Nkx2.1 экспрессируется не только трахеях и легких, но и обнаруживается в развивающемся головном мозге и щитовидной железе (Lazzaro et al., 1991). На ст. E9.5, два первичных энтодермальных зачатка из вентральной части передней кишки формируют лёгкие. Вскоре после образования зачатков лёгких передняя кишка непосредственно кпереди от развивающихся зачатков лёгких начинает выделяться в вентральную часть трахеи и дорсальную часть пищевода в каудально-краниальном направлении (Fig. 4B).

Вдоль V-D оси одиночная передняя часть передней кишки формирует паттерн в результате экспрессии генов различных транскрипционных факторов. Sox2 первоначально экспрессируется по всей передней кишке, но подавляется в вентральном проспективном респираторном поле около ст. E9.0, которое теперь маркируется с помощью экспрессии Nkx2.1 (Sherwood et al., 2009; Domyan and Sun, 2011) (Fig. 4C). Оба транскрипционных фактора обладают важными функциями по формированию V-D паттерна передней части передней кишки, которая связана со спецификацией и дифференцировкой вентральной части трахеи и дорсальной части пищевода. Делеция Nkx2.1 вызывает эктопическую экспрессию Sox2 в вентральной части и приводит к неразделенной дорсализованной передней кишке, специфицирующейся как пищевод (Minoo et al., 1999; Que et al., 2007). Vice versa, потеря функции Sox2 расширяет экспрессию Nkx2.1 дорсально и создает вентрализованную переднюю кишку. Это подтверждает, что Sox2 и Nkx2.1 ингибируют экспрессию др. др. (Que et al., 2007). Осуществляется ли эта взаимная регуляция прямо или косвенно пока неизвестно. Этот фенотип, при котором трахея и пищевод неспособны разделиться, часто наблюдается у мышей, дефицитных по факторам роста, участвующим в формировании паттерна передней части передней кишки и напоминает патологию человека, характеризующуюся атрезией пищевода с или без фистулами между трахеей и пищеводом (EA/TEF).

Mesenchymally Expressed Wnt and FGF Ligands Specify and Establish the Primary Respiratory Field in the Anterior Foregut

Динамические морфогенетические перемещения приводят к развитию переденей части передней кишки в тесной близости от кардиальной мезодермы до или во время спецификации печеночных и респираторных предшественников. Первоначально развивающееся сердце экспрессирует низкие уровни Fgf2, это стимулирует экспрессию альбумина (маркера судьбы печени) в энтодерме (Jung et al., 1999). Вскоре после этого, в соответствии с экспрессией Nkx2.1 в вентральной части энтодермы передней кишки, экспрессия Fgf2 становится более мощной и объединяется с экспрессией Fgf1 в кардиальной мезодерме (Jung et al., 1999). In vitro эксперименты на эксплантах передней кишки мышей подтвердили, что происходящие из кардиальной мезодермы FGF1&2 играют важную роль в сегрегации из общего пула клеток энтодермы передней кишки полей легких, печени и поджелудочной железы, зависимым от дозы способом, при этом наивысшие уровни FGF способствуют экспрессии Nkx2.1 и выбору респираторной судьбы (Serls et al., 2005). В отсутствие кардиальной мезодермы или FGF1&2, энтодерма адоптирует автоматически (default) панкреатическую судьбу (Deutsch et al., 2001; Rossi et al., 2001; Serls et al., 2005). Т.о., очевидно, что интенсивность экспрессии тотального FGF лиганда позитивно коррелирует с последовательной индукцией печеночной и респираторной судьбы в соседней энтодерме передней кишки. Исследования на Xenopus подтвердили, что и мезодерма, и передача сигналов FGF необходимы для спецификации органов передней кишки, но подтверждает, что необходима длительная продолжительность передачи сигналов FGF, чтобы детерминировать судьбы печени и легких, последние нуждаются в более длительной продолжительности активной передачи сигналов FGF и как результат специфицируются позднее всех происходящих из передней кишки органов (Shifley et al., 2012). Это исследование также показало, что передача сигналов FGF действует в основном посредством пути PI3K-AKT, чтобы детерминировать лёгочную судьбу, это согласуется с недавним сообщением, что специфичная для энтодермы инактивация Mek1/2 или Erk1/2, которые являются критическими медиаторами MAPK плеча передачи сигналов FGF, не влияет на спецификацию лёгких (Boucherat et al., 2014). Fgf10 строго экспрессируется в вентральной части мезенхимы неразделенной передней кишки (Que et al., 2007). Обработка эксплантов передней кишки мышей экзогенным FGF10 приводит к усилению активности Nkx2.1 и подавлению экспрессии Sox2 и нарушает нормальное подразделение передней части передней кишки (Que et al., 2007). Однако, хотя мыши, дефицитные по Fgf10 (Fgf10^-/-) или его рецептору Fgfr2b (Fgfr2b^-/-) обнаруживают полный агенез лёгких, спецификация не затрагивается и разделение передней кишки происходит нормально (Min et al., 1998). Др. Fgfs экспрессируются в мезенхиме и могут компенсировать потерю Fgf10 (Serls et al., 2005).

Каноническая передача сигналов Wnt/β-catenin является динамической в ранней передней части передней кишки перед и после разделения на трахею и пищевод. На ст. E9.5 передача сигналов Wnt/β-catenin активна в вентральной части энтодермы передней кишки в ответ на секретируемые Wnt2/2b соседней мезенхимой (Goss et al., 2009; Harris-Johnson et al., 2009; Jacobs et al., 2012) (Fig. 4C). Wnt2/2b^-/- мутанты или мыши, обладающие специфичной для энтодермы (Shh-Cre) делецией β-catenin (кодируемого Ctnnb1) обнаруживают полный агенез лёгких и отсутствие экспрессии Nkx2.1 не затрагивая при этом спецификации щитовидной железы, печени и поджелудочной железы (Goss et al., 2009; Harris-Johnson et al., 2009). Формирование V-D паттерна трубки передней кишки нарушается у этих мутантов, у которых экспрессия Sox2 расширяется на вентральную часть энтодермы передней кишки за счет экспрессии Nkx2.1. Это приводит к неспособности разделения трубки передней кишки, приводя к полному агенезу легких и трахеи и давая одиночную трубку передней кишки, специфицирующейся как пищевод (Goss et al., 2009; Harris-Johnson et al., 2009). Избыточная экспрессия секретируемого Wnt ингибитора Dkk1 также предупреждает экспрессию Nkx2.1 и устраняет образование первичного респираторного поля (Volckaert et al., 2013). Напротив, избыточная экспрессия постоянно активного белка β-catenin по всей энтодерме передней кишки приводит к эктопической экспрессии Nkx2.1 и репрограммирует дорсальную часть энтодермы передней кишки (т.e., пищевод) и заднюю часть энтодермы передней кишки (т.e., переднюю часть желудка) в судьбы предшественников легочной энтодермы (Goss et al., 2009; Harris-Johnson et al., 2009). Хотя эти данные показывают, что передача сигналов Wnt играет критическую роль во время этой фазы формирования паттерна и необходима, и достаточна, чтобы специфицировать респираторный клон. Экспрессия Tbx5, члена семейства T-box транскрипционных факторов, впервые обнаруживается на ст. E9.0 в мезенхиме полей трахеи легких, в то время, когда экспрессия Nkx2.1 впервые начинает обнаруживаться в вентральной части энтодермы передней кишки (Arora et al., 2012). ПотеряTbx5 приводит к односторонней потере спецификации легочного зачатка и к полному отсутствию спецификации трахеи. Некоторая редукция экспрессии Wnt2/2b обнаруживается у этих мутантов подтверждая, что Tbx5 находится выше этих генов, чтобы контролировать респираторную спецификацию (Arora et al., 2012). Как кооперируются передачи сигналов FGF и Wnt/β-catenin, чтобы специфицировать первичное лёгочное поле, изучено недостаточно. В нашей лаб. показано, что FGF10 неспособен восстанавливать спецификацию легких in vivo у эмбрионов, у которых передача сигналов Wnt подавлена за счет избыточной экспрессии Dkk1 (Volckaert et al., 2013). Это указывает на то, что во время спецификации лёгких передача сигналов FGF10 не может непосредственно активировать β-catenin в отсутствие Wnt лигандов, механизм, которые происходит позднее во время морфогенеза ветвления (Volckaert et al., 2013) и в эпителии воздушных путей взрослых после повреждений (Volckaert et al., 2011). Эти находки были недавно подтверждены в сходных экспериментах у эмбрионов Xenopus, у которых активация индуцибельного доминантного активного FGFR1 не может восстановить экспрессию Nkx2.1 и инициацию легких при нокдауне Wnt2/2b (Rankin et al., 2014). Скорее всего, передача сигналов Wnt и FGF является частью feed-forward петли, сходной с той, что описана для мезенхимны дистальных частей легких (White et al., 2006; Yin et al., 2008, 2011), это предполагает, что они контролируют экспрессию др. др.

Передача сигналов BMP также участвует в формировании паттерна и в спецификации энтодермы передней части передней кишки (Que et al., 2006; Li et al.,2007, 2008; Domyan et al., 2011). Между E8.5-E9.5, Bmp4 экспрессируется в вентральной части мезенхимы развивающейся передней кишки (Que et al., 2006; Li et al., 2008). Напротив, Noggin экспрессируется в дорсальной части мезенхимы, где он противодействует экспрессии Bmp4, чтобы установит градиент передачи сигналов BMP в эмбриональной передней кишке (Weaver et al., 1999; Que et al., 2006). Кондиционное удаление Bmp4 с использованием Foxg1-Cre линии, которая активна в энтодерме передней кишки, начиная с E8.5 и в энтодерме и мезенхиме на ст. E9.5, приводя к агенезу трахеи из-за нарушения пролиферации эпителия и мезенхимы, не затрагивая инициальную респираторную спецификацию (Li et al., 2008). Кондиционные делеции гена типа I BMP рецептора (BMPR) Bmpr1a и Bmpr1b в энтодерме передней кишки (Shhcre/+;Bmpr1afl/-;Bmpr1b-/- (hereafter Bmpr1a;b)) приводят к агенезу трахеи из-за неспособности поддерживать респираторную судьбу, которая не может быть восстановлена с помощью конституитивно активной передачи сигналов Wnt в энтодерме передней кишки (Domyan et al., 2011). У таких мутантов, экспрессия Nkx2.1 значительно снижена в одиночной трубке передней кишки, которая теперь приобрела маркеры пищевода (p63, Sox2, Pax9) (Li et al., 2008; Domyan et al., 2011). Более того, способность передачи сигналов Wnt индуцировать эктопическую экспрессию Nkx2.1 в энтодерме задней части передней кишки (Goss et al., 2009; Harris-Johnson et al., 2009) нуждается в интактной передаче сигналов BMP (Domyan et al., 2011). Современная модель предполагает, что BMP и Wnt лиганды передают сигналы кооперативно, чтобы регулировать спецификацию энтодермы легких (Fig. 4C). Интересно, что инактивация Sox2 из вентральной части энтодермы Bmpr1a;b мышей устраняет агенез трахеи, указывая, что передача сигналов посредством BMPR1 и BMPR2 способствует приобретению респираторной судьбы посредством подавления Sox2 (Domyan et al., 2011). Noggin-дефицитные мыши (Nog^-/-) обнаруживают усиление передачи сигналов BMP и примерно 70% этих мутантов обнаруживают EA/TEF, который может быть устранен снижением экспрессии Bmp4 на 50% (Que et al., 2006). Это указывает на то, что дорсальная часть передней кишки нуждается в низких уровнях передачи сигналов BMP, чтобы приобрести судьбу пищевода (Hines and Sun, 2014).

Shh экспрессируется в энтодерме вентральной части передней кишки (Litingtung et al., 1998). У Shh^-/- мышей, перегородка между трахеей и пищеводом не образуется и как следствие трахея и пищевод не отделены от передней кишки, которая приобретает подобную трахее морфологию (Litingtung et al.,1998). У мышей передача сигналов SHH посредством трех транскрипционных факторов с цинковыми пальчиками Gli1, 2 и 3, которые строго экспрессируются в спланхнической мезодерме во время развития передней кишки во время псевдогландулярной стадии (Hui et al.,1994; Grindley et al., 1997). Gli2^-/-;Gli3^+/- мутантны обнаруживают отклонения EA/TEF, сходные с таковыми у Shh^-/- мышей, а устранение обоих генов Gli2 и Gli3 (Gli2^-/-;Gli3^-/-) приводит к полному отсутствию пищевода, лёгких и трахеи (Motoyama et al., 1998). Интересно, что фенотип EA/TEF наблюдается также у некоторых пациентов с мутациями GLI3 (Johnston et al., 2005).

Несмотря на прогресс в идентификации факторов, ответственных за респираторную спецификацию и формирование паттерна пердней кишки, очень мало известно о том, как эти пути взаимодействуют и интегрируются в сигнальные сети, чтобы интегрироваться в сигнальные сети, чтобы регулировать эти процессы. Кроме того, отсутствуют маркеры, чтобы отличать между легочными и трахейными клонами до возникновения этих структур. Неожиданно, хотя Nkx2.1 является самым ранним из известных маркеров для респираторного клона, Nkx2.1^-/- мыши формировали первичные легочные зачатки, которые были неспособны ветвиться и были лишены каких-либо маркеров дифференцировки эпителия (Minoo et al., 1999). Это указывает на то, что Nkx2.1 необязателен для инициальной спецификации зачатков лёгких и что дополнительные не идентифицированные факторы лежат в основе этого процесса. Кроме того, поскольку экспрессия Nkx2.1 не ограничена респираторным клоном, то это может вызывать существенную проблему при попытке выделения чистой популяции клеток лёгочных предшественников, создаваемых из эмбриональных стволовых клеток (ESCs) или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPS). Следовательно, существует отчаянная необходимость в дополнительных ранних маркерах для клеток респираторных предшественников.

Wnt Ligands Regulate Mesenchymal Fgf10 Expression which is Required for Primary Lung Bud Formation in Part by Driving Epithelial β-Catenin Signaling

Первое морфологическое появление зачатков легких происходит на ст. E9.5 (~25 сомитов ст.) в виде выпячивания двух зачатков из вентральной передней части энтодермы передней кишки в окружающую спланхническую мезодерму (Fig. 4B). Отпочкование трахейной системы у Drosophila вызывается branchless (гомологом FGF), экспрессируемым динамически в проспективных местах зачатков, которые действуют на breathless (гомолог FGFR) в энтодерме, инициируя их почкование (Sutherland et al., 1996). Сходным образом, образование легочных зачатков у млекопитающих критически зависит от передачи сигналов FGF. Мыши, лишенные Fgf10 (Fgf10^-/-) или его рецептора Fgfr2b (Fgfr2b^-/-) обнаруживают широкий диапазон морфологических аномалий, включая скелетные черепно-лицевые дефекты, также как и агенез конечностей и легких (Min et al., 1998; Sekine et al., 1999; De Moerlooze et al., 2000). В отличие от Fgf10^-/- мутантов, , однако, Fgfr2b^-/- мыши всё ещё формируют рудиментарные легочные зачатки, которые быстро подвергаются апоптозу (De Moerlooze et al.,2000). Это может быть объяснено тем фактом, что FGF10 также соединяется с FGFR1b, хотя с более низким сродством. Кроме того, трансплантация Fgf10-экспрессирующей дистальной мезенхимы, изолированной из легких E12, на эпителий трахеи вызывала образование эктопического зачатка (Alescio and Cassini, 1962). Тот же самый эффект наблюдался, когда помещали кусочек, покрытый heparin-sepharose с рекомбинантным FGF10, показавшим, что FGF10 достаточен, чтобы индуцировать образование зачатка (Hyatt et al., 2004). Важность мезенхимного FGF10 для инициации легочного зачатка вызывает огромный интерес к факторам, регулирующим его экспрессию во время этой ранней стадии развития легких.

Tbx4 экспрессируется в передней кишке и легочной мезенхиме у развивающихся эмбрионов кур и его домен перекрывается таковым для Fgf10. Эктопическая экспрессия Tbx4 приводит к эктопической экспрессии Fgf10и образованию энтодермального зачатка. Vice versa, эктопическая экспрессия доминантно негативной формы Tbx4 снижает экспрессию Fgf10 и предупреждает образование первичного зачатка у трети проанализированных мутантов (Sakiyama et al., 2003). У мышей Tbx4 экспрессируется в мезенхиме развивающейся передней кишки во время формирования легочных зачатков (E9.5), но его делеция не предупреждает инициальную спецификацию и образование зачатков легких и трахеи, хотя морфогенез ветвления затрагивается позднее во время развития (Arora et al., 2012). Конечно, доминантно негативная конструкция Tbx4 репрессора в экспериментах с курами использовала полный T-box домен, который очень похож на Tbx4 и Tbx5. Следовательно, вполне возможно, что доминантно негативный Tbx4 также целенаправленно воздействует на Tbx5, который обладает критической функцией в спецификации легких (see above).

Каноническая передача сигналов Wnt непосредственно регулирует экспрессию Fgf10 в развивающихся сердце и конечностях (Kawakami et al., 2001; Cohen et al., 2007). Как описывалось выше, Wnt2 и Wnt2b экспрессируются в мезодерме неразделенной передней части передней кишки на ст. E9.0-E9.5, где они выполняют кооперативную роль по спецификации клеток предшественников легочной энтодермы и продолжают экспрессироваться мезенхимой во время морфогенеза ветвления (Yin et al., 2008; Goss et al., 2009; Yi et al., 2009). Потеря Wnt2 (Wnt2-^/-) приводит к гипоплазии легких и резкому подавлению экспрессии Fgf10 (Goss et al., 2009, 2011). Ингибирование передачи сигналов Wnt в эксплантах передней кишки или воздействием на них рекомбинантного DKK1 или quercetin, флавиноида, известного тем, что нарушает взаимодействие между TCF и β-catenin в ядре, возникает зависимый от дозы эффект на образование первичных легочных зачатков. Высокие дозы полностью предупреждают образование зачатков лёгких и блокируют экспрессию Fgf10 в презумптивном легочном поле, тогда как низкие дозы позволяют образование только одного зачатка (Chen et al., 2010; Volckaert et al., 2013). С др. стороны, активация передачи сигналов Wnt в изолированной передней кишке приводит к достоверному увеличению экспрессии Fgf10 и индуцирует образование эктопической почки (Chen et al., 2010).

Дефицит витамина A давно ассоциирует с аномалиями легких, включая агенез легких у грызунов и людей (Wilson et al., 1953; Golzio et al., 2007; Gavrilova et al., 2009). Заметим, что гиповитаминоз A является третьим из наиболее распространенных пищевых дефицитов мире и он присутствует в большой популяции женщин репродуктивного возраста в развитых странах (West, 2002). Ретиноевая кислота (RA), биологически активная форма витамина A, синтезируется в мезодерме (мезенхиме и мезотелии) передней части передней кишки около ст. E8.5-E9.5 и анализ эмбрионов, обладающих RARE-LacZ трансгеном, обнаруживает широко распространенное использование RA во всех клеточных слоях передней кишки, где формируются легкие и трахея (Malpel et al., 2000). Мыши, лишенные retinaldehyde dehydrogenase Raldh2 (также известной как Aldh1a2), которая играет выдающуюся роль в синтезе RA , обнаруживая полный агенез легких, хотя инициальная ст. спецификации клеток предшественников легких не нарушена (Desai et al., 2006). Более того, воздействие на E8.5 эмбрионов и изолированные E8.5 экспланты передней кишки с помощью антагонистом pan-RA рецептора BMS493 также предупреждает образование зачатков легких, это приписывается неспособности индуцировать экспрессию Fgf10 в мезенхиме передней кишки проспективного легочного поля (Desai et al., 2004). RA, по-видимому, регулирует экспрессию Fgf10 косвенно путем подавления TGFβ (transforming growth factor beta) (Chen et al., 2007) и делая возможной передачу сигналов Wnt посредством локальной супрессии экспрессии Dkk1 (Chen et al., 2010). Активация передачи сигналов Wnt в RA-дефицитной передней кишке может только восстанавливать образование одного зачатка легкого, несмотря на билатеральную экспрессию Fgf10. Однако, одновременная активация передачи сигналов Wnt и репрессия TGFβ восстанавливает образование зачатков легких с обеих сторон в RA-дефицитной передней кишке, подтверждая, что клетки предшественники легких требуют разных порогов FGF10 для собственного формирования для правого и левого зачатков легких (Chen et al., 2010). Предложена модель, согласно которой эндогенная RA обеспечивает баланс передачи сигналов Wnt и TGFβ, чтобы контролировать экспрессию мезенхимного Fgf10 во время инициации легочных примордиев у мышей (Chen et al., 2010) (Fig. 4D).

FGF10-KRAS/β-catenin Signaling Drives Epithelial Branching and Prevents Epithelial Differentiation

Формирование функциональных легких нуждается в двух фундаментальных онтогенетических процессах: морфогенез ветвления, который строит древо-образую сеть эпителиальных трубок, и эпителиальная дифференцировка для построения функциональных единиц (т.e., эпителий альвеолярных и проводящих воздушных путей). Хотя оба процесса тщательно исследовали в отдельности, менее известно о том, как они взаимодействуют и кооперируют, чтобы гарантировать, что функциональные единицы будут расположены правильно и интегрированы с процессом ветвления.

Epithelial Branching Generates the Respiratory Framework

Ветвящиеся структуры обнаруживаются в природе повсюду, от растений до речной цепи, от органов (напр., лёгкие, печень, почки, молочные и слюнные железы) до сосудистой сети, от снежных хлопьев до сверкания молний. Контролируется ли ветвление в не биологических системах исключительно по правилам физики, но морфогенезом ветвления у организмов управляю генетические регуляторные факторы и физические ограничения.

Stereotypic branching morphogenesis sculpts the conducting airway network

Два возникших первичных зачатка лёгких в передней части передней кишки быстро удлиняются и подвергаются морфогенезу ветвления, которое сопровождается впечатляющим экспоненциальным ростом лёгких во время псевдожелезистой стадии и стадии ветвления. Принимая во внимание детально разработанную сеть, обнаруживаемую в лёгких, можно ожидать, что процесс морфогенеза ветвления чрезвычайно сложен. Metzger et al. предложили неожиданно простую модель, согласно которой бронхиальное древо генерируется в результате повторного использования трех геометрически отличающихся моделей локального ветвления, названных доменовым ветвлением (domain branching), плоскостным раздвоением (planar bifurcation) и ортогональным раздвоением (orthogonal bifurcation), которые происходят в трех разных последовательностях (Metzger et al., 2008). При доменовом ветвлении, дочерние веточки отделяются от родительской ветви в ряды ("домены") в разных позициях, очень сходно с рядами щетинок на ерше для мойки бутылок. Этот способ ветвления создает главные вторичные веточки и устанавливает паттерн образования долей, а также генеральную форму каждой доли. Планарное и ортогональное раздвоение, с др. стороны, дает по две дочерних веточки в результате расщепления кончика родительской ветви. Способ плоскостного раздвоения означает, что события расщепления на веточки происходят в одной и той же плоскости. Если же имеется ~90° поворот в плоскости раздвоения в последующем делении кончика, тогда событие ветвления наз. ортогональной бифуркацией (Metzger et al., 2008). Разворачивание способа ветвления варьирует между клонами веточек, и исходная родительская ветвь может генерировать дочерние веточки более чем одним способом. Большинство поздно сгенерированных веточек образуется с помощью планарной и ортогональной бифуркации. lПервое используется для тонких краёв долей, тогда как последнее формируется на поверхности долей и заполняет их внутренность.

FGF10 drives the branching program by inducing Sox9 expression

Как же биологически кодируется информация, лежащая в основе генерации столь сложного бронхиального древа? Как лёгкие узнают где и когда формировать каждую веточку во время развития? Основной прорыв в нашем понимании процесса ветвления произошёл с открытием, что экспрессия Fgf10 в развивающихся лёгких локализуется в дистальной субмезотелиальной мезенхиме, соседствующей с будущими зачатками лёгких (Bellusci et al., 1997). Необходимость FGF10 для морфогенеза ветвления драматически иллюстрируется полным отсутствием лёгких у мышей с отсутствием Fgf10 (Fgf10^-/-) или его первичного рецептора Fgfr2b (Fgfr2b^-/-) (Min et al., 1998; Arman et al., 1999; Sekine et al., 1999; De Moerlooze et al., 2000). Поскольку специфический и динамический паттерн экспрессии Fgf10 происходит в течение всего очень длительного времени направленного роста зачатков лёгких, то он зависит от точной локализации экспрессии Fgf10. Подтверждение получено в пионерских экспериментах с эксплантами, в которых E12 дистальная Fgf10-экспрессирующая легочная мезенхима трансплантировалась на трахею, которая обычно не подвергается отпочкованию, , однако, в этом случае она оказалась способной индуцировать образование зачатков (Alescio and Cassini, 1962). Этот эффект может быть воспроизведен, когда дистальная мезенхима замещается кусочком, смоченным в FGF10, который также индуцировал выросты зачатков (Shannon and Hyatt, 2004). Однако, образуются веточки изолированного легочного эпителия в MatrigelTM в присутствии повсеместно распространенного рекомбинантного FGF10, и Fgf10 оказывается экспрессирующимся более широко в мезенхиме, начиная с E13.5, когда легочный эпителий всё ещё продолжает ветвиться (Bellusci et al., 1997). Мы недавно установили, что повсеместная избыточная экспрессия Fgf10 на фоне Fgf10^-/- восстанавливает образование лёгких близко к нормальному паттерну ветвления (Volckaert et al., 2013). Очевидно, что эффект FGF10 на эпителий является дозволяющим скорее, чем инструктивным. Др. словами, информация о ветвлении уже присутствует в эпителии, установленная другими пока не идентифицированными молекулярными и физическими механизмами, а FGF10 может быть необходим только для поддержания самого себя. Эти данные подтверждают модель, согласно которой точно локализованная экспрессия Fgf10 в дистальной части мезенхимы не обязательна для непосредственного морфогенеза ветвления, а, скорее всего, способствует самообновлению популяции клеток предшественников дистальной части эпителия и для предупреждения их преждевременной дифференцировки (Volckaert et al., 2013).

Стало ясно, что хотя FGF10 важен для управления морфогенезом ветвления, хотя и разрешающим способом, др. молекулярные и физические механизмы д. предопределять, где и когда и в каком количестве будут формироваться новые веточки. Напр., путь PCP, плечо в передаче сигналов Wnt, который контролирует организацию цитоскелета, привлекает интерес, как важный регулятор образования формы трубок и точек ветвления во время раннего развития легких. Лёгкие, все же важные дефекты ветвления описаны в отсутствие компонентов PCP, таких как scribbled, Celsr1 (cadherin EGF LAG seven-pass G-type receptor 1) или Vangl2 (Van Gogh-like-2) (Yates et al., 2010, 2013). Др. недавнее исследование показало, что Fzd2 необходим для образования новой точки ветвления, роста веточки, а также регуляции размерове эпителиальных трубок. Авт. продемонстрировали, что Fzd2 обеспечивает эти процессы независимо от β-catenin путем регуляции передачи сигналов Rho и путем локализации фосфо-миозиновой легкой цепи 2 (Kadzik et al., 2014). Интересно, что это исследование далее показало, что Fzd2-дефицитный эпителий не может поддерживать собственно морфологию ветвления в присутствии фокального FGF10 (Kadzik et al., 2014). Взаимодействия между эпителиальными клетками и базальной мембраной (BM), которая специфицируется в пластинчатый слой внеклеточного матрикса (ECM), состоящий преимущественно из laminin, collagen IV и fibronectin, как полагают, являются критическими для непосредственного морфогенеза ветвления. Напр., фибронектин драматически накапливается в бифуркациях веточек и его ингибирование приводит к снижению ветвления и образованию расщепления (cleft) (Sakai et al., 2003; De Langhe et al., 2005), подтверждая, что взаимодействия клетка-ECM жизненно важны для предопределения, где будут сформированы новые веточки. Эти взаимодействия в основном обусловлены рецепторами интегринов, которые транслируют механическую информацию в биохимические сигналы. В свете этого, потеря β1 интегрина в эпителии развивающихся легких, как было установлено, блокирует морфогенез ветвления (Chen and Krasnow, 2012). Дистальные эпителиальные кончики также заключаются в BM, отделяя дистальный эпителий от мезенхимы, а ремоделирование BM, как полагают, происходит, чтобы приспособиться к морфогенезу ветвления. Имеются доказательства, что BM на дистальных кончиках становится перфорированной сотнями микроскопических отверстий, которые локально дают эластичную петлеобразную ECM сеть (Harunaga et al., 2014). Это чрезвычайно динамическое ремоделирование BM устанавливается с помощью протеазной и актомиозиновой активности (Harunaga et al., 2014). Было бинтересно выяснить механизмы, контролирующие экспрессию и локализацию этих белков.

Экспрессия Sox9 динамична во время процесса бифуркаций легочных зачатков, при этом наивысшая экспрессия там, где будут сформированы два зачатка, и наинизшая в области разделения (cleft) (Rockich et al., 2013). Эксперименты с избыточностью и недостаточностью функции выяснили важную функцию Sox9 в морфогенезе ветвления. Делеция Sox9 или избыточная экспрессия с использованием Shh-Cre драйвера приводят к образованию маленьких легких, содержащих немного веточек воздушных путей с растянутыми кисто-подобными дистальными эпителиальными кончиками (Chang et al., 2013; Rockich et al., 2013). Наблюдение, что и избыток, и потеря функции Sox9 приводят к сходному фенотипу, скорее всего, обусловлено ограниченностью возможных исходов, когда нарушается ветвление. Когда эпителиальные зачатки неспособны к бифуркациям они просто дают крупные кистозные зачатки (Rockich et al., 2013). Интересно, что Shh-Cre;Sox9f/f лёгкие также обнаруживают высокие уровни экспрессии Fgf10 в дистальной мезенхиме (Chang et al., 2013). Это указывает на то, что помимо потребности в Sox9 в эпителии, который действует ниже передачи сигналов FGFR2b/KRAS в эпителии (Chang et al., 2013), Sox9 также регулирует экспрессию Fgf10 в мезенхиме клеточно неавтономным образом, скорее всего, посредством регуляции продукции фактора роста, участвующего в механизмах эпителиальной обратной петли (Chang et al., 2013). Наконец, Sox9 может также прямо или косвенно регулировать организацию цитоскелета, перемещения эпителия и отложение компонентов ECM, чтобы повлиять на морфогенез ветвления (Rockich et al., 2013). Sox2, с др. стороны, экспрессируется в неветвящемся эпителии и его избыточная экспрессия в энтодерме развивающихся легких снижает ветвление (Gontan et al., 2008).

FGF10 Maintains Distal Epithelial Progenitor Cells in the Developing Lung

Эмбриональные клетки предшественники являются сутью развития органов. Они само-обновляются и могут давать многие типы клеток. В эмбриональных легких хорошо охарактеризована популяция мультипотентных клеток энтодермальных предшественников, располагающихся на дистальных кончиках развивающихся зачатков легких. По мере роста эпителиальных зачатков дочерние клетки занимают более проксимальные позиции, это позволяет им дифференцироваться во многие типы клеток, которые заселять эпителий воздушных путей. Неустойчивое равновесие между самообновлением и дифференцировкой клеток предшественников д. поддерживаться, чтобы сделать возможным собственно созревание легочного эпителия. Сложная и тонко устроенная сеть передачи сигналов и транскрипционных факторов из энтодермы и мезодермы действует совместно в гармонии, чтобы достичь этого.

Multipotent Sox9+/Id2+ epithelial progenitor cells are located in the distal tip of the developing lung bud

Эксперименты по отслеживанию клонов во время морфогенеза ветвления в развивающейся поджелудочной железе показали присутствие дистальной популяции мультипотентных клеток эпителиальных предшественников (Zhou et al., 2007). Сходным образом, в развивающихся легких дистальным эпителий обнаруживает высокий индекс пролиферации (Okubo et al., 2005), он обогащен большим набором транскрипционных факторов , включая Sox9 (Perl et al., 2005; Chang et al., 2013; Rockich et al., 2013), Id2 (Inhibitor of DNA-binding 2) (Rawlins et al., 2009), Nmyc (Okubo et al., 2005), Etv (E26 transformation-specific (ETS) translocation variant) (Liu et al., 2003), Elf5 (E74-like factor 5) (Metzger et al., 2007), Foxp1 (forkhead box protein P1) и Foxp2 (Shu et al.,2007), и обнаруживает высокую активность путей передачи сигналов FGF, Wnt и BMP (Rawlins, 2008, 2010) (Fig. 5A). Клетки более проксимального эпителия экспрессируют Sox2, который необходим для их дифференцировки в эпителиальные типы клеток проводящих воздушных путей (Que et al., 2009; Tompkins et al., 2011) (Fig. 5A). Отслеживание клонов с использованием Id2-CreERT2 knock-in линию мышей, чтобы отлеживать судьбу этих клеток предшественников дистального эпителия на разных стадиях во время развития легких (Rawlins et al., 2009) выявило, что будучи меченными во время псевдожелезистой стадии или стадии ветвления клеток дистальных эпителиальных предшественников, обнаруживают потенциал давать все типы бронхиолярных и альвеолярных эпителиальных клеток (Fig. 5A,B). Однако, когда клетки дистальных эпителиальных предшественников метятся после ст. E16.5, их судьбы оказываются ограниченными выбором судьбы альвеолярных эпителиальных клеток (Rawlins et al., 2009) (Fig. 5C,D). Интересно, что одиночные Id2⁺ клетки на ст. E11.5 дают и бронхиолярные и альвеолярные типы клеток, подтверждая, что дистальный эпителий состоит из гомогенной популяции само-обновляющихся клеток предшественников. Эта находка, что дистальная легочная энтодерма во время раннего развития легких является мультипотентной и чрезвычайно пластичной по своему онтогенетическому потенциалу, но становится ограниченной на более поздних стадиях, недавно было подтверждено в исследовании, использующем Sox9-CreER;RosamTmG систему отслеживания клонов (Alanis et al., 2014). Как такое ограничение онтогенетических судеб достигается, неизвестно, но, скорее всего, участвуют временные альтерации в экспрессии сигнальных молекул и транскрипционных факторов в эпителиальном и мезенхимном компартментах развивающихся легких. Помимо того, что он является маркером дистальных эпителиальных мультипотентных клеток предшественников, Sox9 также участвует в поддержании дистальных эпителиальных клеток предшественников в недифференцированном состоянии. Поэтому делеция Sox9 приводит к преждевременной дифференцировке эпителия проводящих воздушных путей (Chang et al., 2013; Rockich et al., 2013), тогда как избыточная экспрессия Sox9 предупреждает дифференцировку дистальных эпителиальных клеток предшественников (Rockich et al., 2013).

Figure 5. Patterning and differentiation of the developing lung epithelium. A:Top: Patterning of the developing lung epithelium during the branching stage (E9.5-E16.5). Shown is a schematic representation of an E11.5 mouse lung. The distal tip of the developing lung buds contains a pool of multipotent Sox9+/Id2+ epithelial progenitor cells (green), which give rise to Sox2+conducting airway epithelium (blue), but also have the potential to generate alveolar epithelium. Bottom: Overview of the molecular players involved in the epithelial-mesenchymal crosstalk, which establishes and maintains a distal tip organizing center. FGF10 and Wnt signaling play a central role in this communication. Red arrows, negative regulation; green arrows, positive regulation; blue arrows, transcriptional activation. B: Model showing the lineage relationships between epithelial progenitor cells and their differentiated progeny during early lung development. Note that basal cells can only be found in the cartilaginous (extrapulmonary) airways in the mouse. Basal cells most likely arise from Sox2+ progenitors but their origin has not been definitively established by lineage tracing experiments. The differentiated conducting airway epithelial cell types retain Sox2 expression throughout development and adult life (not shown). C: Starting at around E16.5, the Sox9+ distal epithelial progenitor cells no longer give rise to the conducting airway epithelium, but instead become restricted to alveolar epithelial fate. This results in a stretch of Sox2-/Sox9- bipotential epithelial cells, expressing both ATI (Pdpn) and ATII (Sftpc) markers, located between the Sox2-expressing conducting airways and the leading edge of Sox9+progenitor cells. At this time, the bronchioalveolar duct junction (BADJ) is being established. D: Model showing the lineage relationships between distal epithelial progenitors and their progeny during alveolar epithelial differentiation. ATI, alveolar type I; ATII, alveolar type II. See main text for details.

FGF10-KRAS/β-catenin signaling maintains the distal epithelial progenitors by inducing Sox9 and suppressing Sox2 expression

Точные молекулярные механизмы, лежащие в основе формирования, поддержания и дифференцировки дистальных Sox9+/Id2+ клеток предшественников изучены недостаточно, но, по-видимому, используют деликатное эпителиально-мезенхимное общение. Передача сигналов FGF, Wnt и BMP высоко активна в дистальном эпителии и нарушения этих путей влияет на баланс между экспансией пула клеток предшественников посредством пролиферации и его уменьшением посредством дифференцировки. В качестве такового хорошо поддерживаемый дистальный организующий центр является важным для предопределения окончательных размера и морфологии легких (Morrisey and Hogan, 2010) (Fig. 5A).

Эффекты, происходящего из дистальной мезенхимы, FGF10 на дистальный эпителий в основном обеспечиваются с помощью KRAS, непосредственно активирующего передачу сигналов β-catenin (Volckaert et al., 2013), и экспрессию Bmp4 (Hyatt et al., 2004) (Fig.5A). Fgf10 гипоморфы обнаруживают снижение эпителиальной пролиферации во время псевдожелезистой стадии, это сопровождается снижением передачи сигналов β-catenin в эпителии и снижением уровней p-Erk в дистальном эпителии (Ramasamy et al., 2007). Более того, кондиционная инактивация передачи сигналов FGF10/FGFR2b после инициации легких подавляет выбор дистальных судеб, как показывает экспансия проксимальных экспрессирующих Sox2 эпителиальных клеток за счет клеток предшественников, экспрессирующих Sox9⁺ (Abler et al., 2009; Chang et al., 2013). Vice versa, избыточная экспрессия Fgf10 приводит к дистализации легких, когда клетки предшественники дистального эпителия арестовываются в недифференцированном состоянии, которое удерживает их от дифференцировки в более проксимальные типы клеток (Nyeng et al.,2008; Volckaert et al., 2013). Кроме того, избыточная экспрессия гиперактивного Kras, малой GTPase , стоящей ниже передачи сигналов RTK (напр., FGF) во время развития легких (Johnson et al., 1997; Tang et al., 2011), по всему эпителию (Chang et al., 2013) или в Sox9-экспрессирующих клетках эпителиальных предшественников (Alanis et al., 2014) приводит к избыточному образованию веточек в расширенном домене экспрессии Sox9. Tранскрипционные факторы Etv4/5 и Elf5 сконцентрированы в дистальных частях энтодермальных зачатков и обеспечивают некоторые эффекты передачи сигналов эпителиальных FGF (Liu et al.,2003; Metzger et al., 2007). Итак. эти данные показывают, что передача сигналов FGF10 является главным регулятором популяции Sox9+ мультипотентных клеток предшественников в дистальной части энтодермы, удерживая их в недифференцированном состоянии и стимулируя их само-обновление.

Благодаря своей жизненно важной функции в спецификации легочной энтодермы и инициальном формировании зачатков, передача сигналов β-catenin пзаставляет быть активным в развивающемся эпителии нижестоящего FGF10 (Volckaert et al., 2013), при этом наивысшая активность наблюдается в клетках предшественниках дистального эпителия (De Langhe et al., 2005). Передача сигналов эндогенного эпителиального Wnt/β-catenin способствует выбору дистальной судьбы и ингибирует дифференцировку (Mucenski et al., 2003; Shu et al.,2005), это обеспечивается прежде всего посредством регуляции экспрессии Fgfr2, Bmp4 и Nmyc в дистальном эпителии (Shu et al., 2005). В соответствии с этим специфичная для эпителия делеция Nmyc также сдвигает баланс между пролиферацией клеток предшественников и дифференцировкой в направлении последнего, тогда как избыточная экспрессия Nmyc в эпителии расширяет популяцию Sox9+ предшественников дистальных клеток и ингибирует эпителиальныую дифференцировку (Okubo et al., 2005). Кроме того, ранняя делеция Ctnnb1 в Sox9+ дистальном эпителии (Sox9-CreER) приводит к потере экспрессии Sox9 (Alanis et al., 2014), тогда как эктопическая активация передачи сигналов β-catenin в развивающемся дистальном эпителии (Sftpc-Cre;Ctnnb1(ex3)flox) предупреждает дифференцировку эпителия воздушных путей путем ингибирования экспрессии Sox2 (Hashimoto et al., 2012). Bmp4 является нижестоящим геном мишенью как передачи сигналов FGF10 (Hyatt et al., 2004) , так и β-catenin (Shu et al., 2005) dj время развития легких и участвует также в формировании проксимо-дистального паттерна развивающихся легких (Bellusci et al., 1996; Weaver et al., 1999; Eblaghie et al., 2006; Wang et al.,2013). Ингибирование передачи сигналов BMP за счет делеции Bmpr1a (Eblaghie et al., 2006; Sun et al., 2008) или за счет избыточной экспрессии доминантно-негативного (dn)Bmpr1b (Weaver et al., 1999), или секретируемых антагонистов Xnoggin (Weaver et al., 1999) или Gremlin (Lu et al., 2001) приводит к экспансии экспрессии Sox2, в то же время ингибирует дистальную судьбу. С др. стороны, воздействие на легочные экспланты экзогенного BMP4 супрессирует экспрессию Sox2 и снижает количество Sox2+ энтодермальных предшественников, в то же время расширяет количество Sox9+ клеток предшественников (Wang et al., 2013). Имеются доказательства, что Bmp4 является непосредственной мишенью histone deacetylases 1 и 2 (Hdac1/2), кторые действуют, чтобы супрессировать экспрессию Bmp4 в проксимальной энтодерме, чтобы сделать возможной собственно эпителиальную дифференцировку. Делеция Hdac1/2 в развивающейся энтодерме приводит к экспансии экспрессии Bmp4 по всему эпителию воздушных путей вместо того, чтобы ограничиться дистальными кончиками, это приводит к подавлению экспрессии Sox2 и экспанссии экспрессии клеток предшественников Sox9⁺ (Wang et al., 2013). Однако, Shh-Cre-управляемая эпителиальная делеция Bmp4 приводит к кажущимся нормальными доменам Sox9/Sox2(Alanis et al., 2014), подтверждая участие дополнительных компенсаторных BMP лигандов.

Во время раннего развития легких Hippo эффектор YAP располагается в ядре Sox9⁺ недифференцированных дистальных эпителиальных предшественниках, но он находится в цитоплазме проксимального Sox2⁺ эпителия проводящих воздушных путей (Mahoney et al., 2014), подтверждая роль ядерного YAP в поддержании статуса дистальных эпителиальных предшественников. Неожиданно, кондиционная инактивация в эпителии Yap во время раннего развития легких (Shh-Cre;Yapf/f) приводит к увеличению Sox9⁺ клеток дистальных эпителиальных предшественников и к отсутствию дифференцировки их потомков в эпителиальные клетки Sox2⁺ проводящих воздушных путей (Mahoney et al., 2014). Авт. пришли к заключению, что ядерный YAP кооперирует с происходящим из мезенхимы TGF-β в зоне перехода Sox2/Sox9, чтобы способствовать экспрессии Sox2, но не рассматривается возможность, что цитоплазматический YAP, как упоминалось выше, может играть активную роль в репрессии Sox9 путем блокирования передачи сигналов β-catenin (Hashimoto et al., 2012; Volckaert et al., 2013; Azzolin et al., 2014).

Наконец, Notch динамически активируется на кончиках эпителиальных зачатков легких (Post et al., 2000; Kong et al., 2004; Tsao et al., 2008) а фармакологическое подавление передачи сигналов Notch в передней кишке или культурах эксплантов легких приводит к экспансии пула клеток предшественников дистального эпителия (Tsao et al., 2008). Более того, трансгенные мыши с избыточнаой экспрессией доминантно активного Notch3 в дистальном легочном эпителии обнаруживает нарушения дифференцировки клеток дистальных предшественников, которые остаются незрелыми (Dang et al., 2003).

FGF10 blocks the differentiation of Sox2+ conducting airway epithelial cells along the ciliated cell lineage and promotes their differentiation along the basal cell lineage

Проводящие воздушные пути респираторной системы взрослых млекопитающих обладают впечатляющим репертуаром специализированных эпителиальных типов клеток, включая секреторные клетки (club и goblet клетки), реснитчатые клетки, базальные клетки и нейроэндокринные (NE) клетки. Знание того, как эти разные эпителиальные типы клеток дифференцируются из Sox9⁺ мультипотентных клеток предшественников, расположенных на дистальных кончиках разрастающихся зачатков имеет главное значение для понимания многих дефектов развития легких, также как и способности контролировать дифференцировку ESCs или iPS клеток в фармакологических исследованиях и в будущей заместительной клеточной терапии.

По мере роста легочного эпителия во время псевдожелезистой стадии и стадии ветвления потомство мультипотентных дистальных эпителиальных клеток предшественников занимает более проксимальные позиции в разрастающихся легочных зачатках, становятся более ограниченными в своем онтогенетическом потенциале и начинают дифференцироваться в разные типы клеток будущих бронхов и бронхиол, включая club, реснитчатые и NE клетки (Fig. 5A,B). Как только эти дочерние клетки выходят из дистального сигнального центра, у них подавляется экспрессия Sox9, характерного маркера клеток предшественников дистального эпителия и начинается экспрессия Sox2, которая, как было установлено, необходима и достаточна для созревания клеток проводящих воздушных путей (Gontan et al., 2008; Que et al., 2009; Tompkins et al., 2009, 2011). Онтогенез базальных клеток, которые у мышей располагаются в свободном от патогенов окружении и могут обнаруживаться только во внелегочных воздушных путях, довольно непонятен. Хотя имеются доказательства, что Sox9⁺ эпителиальные предшественники могут давать базальные клетки в условиях избыточной экспрессии Fgf10 (Volckaert et al., 2013), но, скорее всего, что эндогенные базальные клетки трехеи возникают из альтернативного источника.

Базальные клетки экспрессируют keratin 5 (Krt5) и transformation-related protein 63 (Trp63 (or p63)) и у мышей они ограничены хрящевой частью воздушных путей трахеи и главных стержневых бронхов, тогда как в легких человека они обнаруживались более дистально. Базальные клетки являются эпителиальными стволовыми клетками, способными к долговременному поддержанию эпителия воздушных путей во время нормального гомеостаза и участвуют в регенерации эпителия после повреждений (rev. Hogan et al., 2014; Kotton and Morrisey, 2014; Volckaert and De Langhe, 2014).Транскрипционный фактор p63 экспрессируется на высоком уровне в базальных клетках стратифицированного и псевдостратифицированного эпителия во всем теле, включая эпидермис кожи, эпителий пищевода и трахеи и бронхов. Важность p63 в спецификации и/или в поддержании базальных стволовых клеток подчеркивается полным отсутствием базальных клеток у p63 нулевых мышей в этих эпителиях, которые формируют вместо этого простые цилиндрические эпителиальные структуры (Mills et al., 1999; Yang et al., 1999; Daniely et al., 2004). Это было подтверждено недавним исследованием, показавшим, что кондиционное устранение p63 специфически в популяции базальных клеток у взрослых приводит к упрощению эпителия трахей от псевдостратифицированного до простого цилиндрического эпителия, лишенного базальных клеток (Zhao et al., 2014), подтверждая критическую роль p63 в поддержании базальных стволовых клеток. p63 имеет две изоформы, которые содержат (TA) или лишены (ΔN) трансактивационного домена (Yang et al., 1998). ΔNp63 является превалирующей изоформой, экспрессирующейся в базальных стволовых клетках (Zhao et al., 2014) а её избыточная экспрессия способствует стратификации эпителия в легких мышей (Romano et al., 2009), тогда как TAp63 изоформа несущественна для поддержания базальных стволовых клеток (Zhao et al., 2014). Недавно описано функциональное и биохимическое взаимодействие между p63 и Hippo транскрипционным ко-активатором YAP, чтобы поддерживать базальные стволовые клетки воздушных путей взрослых (Zhao et al., 2014).

Очень мало известно о молекулярных процессах, лежащих в основе образования базальных клеток, также как и клеток предшественников, из которых они происходят. Ингибирование передачи сигналов Wnt посредством избыточной экспрессии Dkk1 способствует дифференцировке базальных клеток в нижних частях проводящих воздушных путей (Volckaert et al., 2013), скорее всего, в результате подавления экспрессии Sox9 и форсирования экспрессии Sox2, это, как известно, регулирует экспрессию p63 (Hashimoto et al., 2012; Ochieng et al., 2014; Watanabe et al., 2014). Это согласуется с недавним сообщением, показавшим, что β-catenin супрессирует экспрессию Sox2 (Hashimoto et al., 2012).

Более того, Fgf10, который помимо дистальной мезенхимы экспрессируется также в трахее между хрящевыми кольцами, как было установлено, участвует в дифференцировке базальных клеток и поддержании в хрящевых частях воздушных путей, где базальные клетки обычно располагаются. Fgf10^-/- трахеи обнаруживают меньше базальных клеток и базальные клетки драматически уменьшаются в трахее мышей с избыточной экспрессией доминантного негативного секретируемого рецептора для FGF10 со ст. E15.5 до E18.5 (Volckaert et al., 2013). Кроме того, избыточная экспрессия Fgf10 направляет выбор судьбы Sox2⁺ эпителиальных клеток нижних частей проводящих воздушных в сторону клона базальных клеток, поскольку блокируется дифференцировка в сторону клона реснитчатых клеток (Volckaert et al.,2013), подтверждая, что это одна из причин, почему базальные клетки могут обнаруживаться только в хрящевых частях воздушных путей у мышей дикого типа во время нормального гомеостаза, т.к. присутствует экспрессия Fgf10 в мезенхиме между хрящевыми кольцами (Tiozzo et al., 2009; Sala et al.,2011), но не в ASMCs, которые покрывают бронхи (Mailleux et al., 2005). В целом эти результаты указывают на то, что передача сигналов FGF10 и Wnt важна для развития и/или поддержания базальных клеток (Volckaert et al., 2013). Как в точности функционируют эти пути и взаимодействуют, чтобы инициировать и/или поддержать эти базальные клетки, всё ещё неизвестно.

Современная модель дифференцировки эпителия проводящих воздушных путей полагает, что первый клональный выбор среди Sox2⁺ бронхиолярных предшественников происходит приблизительно на ст. E13.5, когда делается выбор между клетками предшественниками, предназначенными стать NE клетками, маркированными с помощью achaete-scute homolog 1 (Ascl1) (также наз. Mash1) и клетами предшественниками иной не NE судьбой, экспрессирующими Scgb3a2 (Fig. 5B). Вскоре после этого популяция не-NE клеток подвергается второму выбору судьбы, чтобы детерминировать клоны реснитчатых клеток (Foxj1⁺/β-tubulin⁺) или club клеток, маркированных с помощью Scgb1a1 (secretoglobin family 1A member 1) (также наз. Clara cell-specific 10 kD protein [CC10] или Clara cell secretory protein [CCSP]). Достаточно доказательств подтверждает, что передача сигналов Notch участвует во многих выборах судеб легочных эпителиальных клеток (Borges et al., 1997; Ito et al., 2000; Post et al., 2000; Shan et al., 2007; Guseh et al., 2009; Tsao et al., 2009; Morimoto et al., 2010, 2012; Guha et al., 2012; Zhang et al., 2013). Однако, детальное описание роли передачи сигналов a Notch в дифференцировке эпителиальных клеток проводящих воздушных путей вне пределов цели данного обхора.

The FGF10-KRAS-Sox9-driven branching program antagonizes the alveolar differentiation program

Во время ст. ветвления Sox9-позитивные клетки предшественники дистального эпителия дают разветвленную сеть Sox2⁺ эпителия проводящих воздушных путей. Однако, начиная примерно со ст. E15.5/E16.5 мультипотентные Id2+/Sox9+ клетки предшественники дистального эпителия не вносят более вклада в бронхиальный клон, но начинают приобретать бипотенциальную судьбу клеток предшественников альвеолярного эпителия (Rawlins et al., 2009; Chang et al., 2013; Rockich et al., 2013; Volckaert et al., 2013; Alanis et al., 2014; Desai et al., 2014; Treutlein et al., 2014). Эти бипотенциальные альвеолярные клетки предшественники, экспрессирующие субнабор маркеров ATI и ATII клеток, будут в конечном счете дифференцированы в целиком зрелые альвеолярные эпителиальные клетки за счет последовательного выключения непригодных клеточных маркеров и за счет включения поздних маркеров специфичных типов клеток (Desai et al., 2014; Treutlein et al., 2014) (Fig. 5C,D). Зрелые альвеолы выстланы двумя основными типами эпителиальных клеток. Сквамозные ATI клетки составляют около 90% области поверхности и расположены непосредственно по соседству с капиллярами, это делает эффективной диффузию кислорода и CO₂, тогда как кубовидные ATII клетки секретируют сурфактант, чтобы защитить альвеолы от коллапса и, как было установлено, являются bona fide долговременными само-обновляющимися стволовыми клетками во взрослых легких (Barkauskas et al., 2013; Desai et al., 2014). Последовательное созревание бипотенциальных клеток предшественников в ATI и ATII клетки было недавно картировано с использованием подхода геномики одиночных клеток (Treutlein et al., 2014). Как и в случае дифференцировки бронхиального эпителия, созревание альвеолярного эпителия происходит в проксимо-дистальном направлении (Desai et al., 2014).

FGF10-KRAS-Sox9 управляет программой ветвления, противодействующей программе альвеолярной дифференцировки (Chang et al., 2013; Rockich et al.,2013; Volckaert et al., 2013; Alanis et al., 2014). Инактивация Sox9 в эпителии ранних легких включает преждевременную экспрессию Sftpbв дистальных частяхъ зачатков легких, начиная с E11.5, указывая, что Sox9, помимо своей жизненно важной роли в морфогенезе ветвления и предопределения программы раннего дистального легочного эпителия, супрессирует преждевременную активацию генов альвеолярного эпителия (Chang et al., 2013). Однако, др. альвеолярные гены, включая Rage (receptor for advanced glycation end products) и Aqp1 (Aquaporin-1) не экспрессируются преждевременно в отсутствие Sox9 (Chang et al., 2013), подтверждая, что др. регуляторы необходимы для полной активации программы дифференцировки альвеол. Напротив, избыточная экспрессия Fgf10 (Volckaert et al., 2013), гиперактивного аллеля Kras (Chang et al., 2013) или Sox9 (Rockich et al., 2013) , начиная со ст. E15.5 поддерживают программу ветвления и блокируют программу дифференцировки эпителия альвеол. Интересно, что почти идентичный легочный фенотип и блокирование альвеолярной эпителиальной дифференцировки недавно был описан для Nkx2.1-Cre;Mst1/2f/f мышей, у которых Hippo киназы Mst1/2 генетически инактивированы в респираторном эпителии во время позднего развития легких (Chung et al., 2013). Кроме того, нокаутные по Taz мыши, одному из ядерных эффекторов пути Hippo, экспрессирующемуся в дистальных эпителиальных клетках предшественниках во время развития легких (Park et al., 2004), вызывают дефекты образования альвеол (Makita et al., 2008) , которые напоминают те, что наблюдаются при эмфиземе у человека и при bronchopulmonary dysplasia (BPD). Эти находки указывают на то, что ядерные YAP/TAZ предупреждают дифференцировку клеток предшественников дистального эпителия и что их секвестрация в цитоплазме необходима для дифференцировки альвеолярного эпителия.

Временная передача сигналов глюкокортикоидов, начинающаяся со ст. E17.0, прекращает прогрессию домена Sox2⁺ и инициирует программу дифференцировки альвеол в эпителиальном потомстве, оставшихся вне прогрессирующих Sox9⁺ дистальных предшественников во время позднего легочного развития (Alanis et al., 2014). Важно, что эта модель также предоставляет информацию о формировании соединений бронхиол и альвеол (bronchioalveolar duct junction (BADJ)), границы компартментов, разделяющей эпителий проводящих воздушных путей и альвеол.

Mesenchymal Wnt Signaling Regulates the Amplification of Fgf10 Expressing Airway Smooth Muscle Cell Progenitors in the Distal Mesenchyme

Развивающаяся мезенхима легких дает гомогенную популяцию специализированных типов клеток, которые играют важные роли во время развития легких и гомеостаза у взрослых, включая гладкомышечные клетки воздушных путей и сосудов , перициты, эндотелиальные клетки, миофибробласты и кишечные фибробласты. развитие мезенхимных клонов в точности следует энтодерме во времени и пространстве посредством сложной сети сигнальных путей, касающихся энтодермы, мезенхимы и мезотелия. В качестве таковых передача паракринных сигналов, происходящих из мезенхимы, управляет ростом и дифференцировкой эпителия, а также морфогенезом ветвления. Vice versa, происходящие из эпителия и мезотелия сигналы действуют на мезенхиму, чтобы контролировать её пролиферацию и дифференцировку. Здесь мы сконцентрировались на ASMC клоне из-за его важной функции в качества ниши для эпителиальных стволовых клеток для проводящих воздушных путей у взрослых (Hines et al., 2013; Volckaert et al., 2013). В верхних частях воздушных путей взрослых гладкие мышцы могут обнаруживаться на дорсальной стороне трахеи и медиальной (внутренней) стороне основных бронхов, противоположной С-образным хрящевым кольцам. Во внутрилегочных воздушных путях мыши эпителий лишен хрящей и полностью покрыт гладкомышечными клетками. ASMCs контролируют диаметр воздушных путей, обеспечивая эластичностью и образуя нишы для эпителиальных стволовых клеток. Дефекты развития ASMC могут приводить к хроническим легочным болезням, включая астму.

Fgf10 Expressing Cells in the Distal Lung Mesenchyme are Airway Smooth Muscle Cell Progenitors

Эксперименты по отслеживанию клонов с использованием Fgf10LacZ трансгена, в которых LacZ ген экспрессируется с помощью промотора Fgf10 или Fgf10CreERT2 knock-in мыши, несущие Cre-ERT2-IRES-YFP кассету под контролем промотора Fgf10, продемонстрировали, что Fgf10-экспрессирующие клетки, располагающиеся в субмезотелиальной мезенхиме дистальных кончиков, являются предшественниками для ASMCs во время раннего развития легких (Mailleux et al., 2005; El Agha et al., 2012, 2014) (Fig. 6). Недавно получено дальнейшее подтверждение, что все ASMCs в самом деле происходят из пула мезенхимных предшественников, располагающихся в дистальной части легочной мезенхимы (Kumar et al., 2014). Во время ранней стадии ветвления эти Fgf10-экспрессирующие мезенхимные предшественники также вносят вклад в образование сосудистых гладкомышечных клеток и липофибробластов, тогда как вторая волна Fgf10-экспрессирующих клеток во время альвеолярной дифференцировки дает главным образом (lipo)fibroblasts (El Agha et al., 2014). Др. популяция предшественников гладкомышечных клеток идентифицирована вблизи ворот (hilum) легких (Shan et al., 2008), где встречаются трахея и главные бронхи, и в Wt1+ мезотелии (Dixit et al., 2013). Наконец, популяция Wnt2+/Gli1+/Isl1+ мультипотентных предшественников кардиопульмональной мезодермы недавно идентифицирована, которая генерируют большинство происходящих из мезодермы клонов легкого и сердца, включая ASMCs, и координирует совместное развитие легких и сердца (Peng et al., 2013).

Figure 6. Model for the coordinated differentiation of conducting airway epithelium and airway smooth muscle. A subset of Fgf10-expressing cells located in the distal submesothelial mesenchyme are progenitors for airway smooth muscle cells (ASMCs) and their amplification, as well as Fgf10expression is dependent on mesenchymal Wnt/?-catenin signaling. FGF10 directly activates β catenin in the distal epithelial progenitors, and inducesBmp4 and Sox9 expression, to maintain them and keep them from differentiating into the Sox2+ conducting airway epithelium. As the epithelial tube grows towards the distal source of FGF10, progeny from the distal multipotent epithelial progenitors are left behind in the epithelial stalk and once they are out of FGF10's reach they lose Sox9 expression, start expressing Sox2, and differentiate into conducting airway epithelium. At the same time as ASMC progenitors passively acquire more proximal positions, they come in contact with epithelial-derived BMP4 and SHH, causing them to stop expressing Fgf10 and ultimately differentiate into mature ASMCs that envelop the developing conducting airway epithelium.

FGF and Wnt Signaling Form the Central Regulatory Axis in ASMC Development

Развитие легочной мезенхимы критически зависит от сигналов, исходящих из эпителия и мезотелия. Гистологически и молекулярно легочная мезенхима может быть подразделена на субмезотелиальный и субэпителиальный домены (White et al., 2006). Как обсуждалось выше, FGF9 секретируется эпителием и мезотелием (Colvin et al., 1999; del Moral et al., 2006), а передача сигналов осуществляетcя преимущественно посредством мезенхимных рецепторов FGFR1c/2c, хотя существует также способность передачи сигналов в эпителий аутокринным способом (del Moral et al.,2006; White et al., 2006; Yin et al., 2008). Инактивация Fgf9 по всему мезотелию, используя Dermo1-Cre драйвер драматически снижает мезенхимную пролиферацию, но оказывает незначительный эффект на ветвление эпителия, тогда как происходящие из эпителия FGF9 регулируют морфогенез ветвления в отсутствии мезенхимного фенотипа (Yin et al., 2011). Передача сигналов мезенхимных FGF необходима для экспрессии Wnt2a, который стабилизирует мезенхимный β-catenin аутокринным способом (Yin et al., 2008, 2011; Yi et al., 2009). Передача сигналов Wnt/β-catenin в мезенхиме в свою очередь необходима для поддержки экспрессии FGFR1c/2c и ответной реакции на FGF9 (De Langhe et al., 2008; Yin et al., 2008). Т.о. передача сигналов FGF и Wnt/β -catenin в мезенхиме позитивно усиливают др. др. с помощью feed-forward сигнальной петли, чтобы регулировать пролиферацию мезенхимы (Fig. 5A). Wnt7b экспрессируется в эпителии воздушных путей, а также активирует передачу сигналов β-catenin в мезенхиме, чтобы регулировать клетки предшественники гладких мышц посредством Wnt/tenascin/Pdgfr пути (Shu et al., 2002; Rajagopal et al., 2008; Cohen et al., 2009).

Gередача сигналов β-catenin в мезенхиме специфицирует дистальную легочную мезенхиму, чтобы выбрать судьбу клеток предшественников ASMC (Kumar et al., 2014). Однако, передача сигналов FGF и β-catenin в мезенхиме вместе регулируют амплификацию экспрессирующих Fgf10 клеток предшественников ASMC в дистальной легочной мезенхиме и ингибирует их преждевременную дифференцировку в клон ASMC (De Langhe et al., 2006, 2008; del Moral et al., 2006; Yi et al., 2009). Недавно microRNA, miR142-3p, как было установлено, экспрессируется на высоком уровне в развивающейся легочной мезенхиме, где она способствует амплификации и предупреждает преждевременную дифференцировку предшественников ASMC путем подавления уровней мРНК Apc, негативного регулятора β-catenin (Carraro et al., 2014). Обработка легочных эксплантов DKK1, ингибитором передачи сигналов Wnt (De Langhe et al.,2005), или избыточная экспрессия Dkk1 во время легочного развития также нарушают развитие ASMC (Volckaert et al., 2013). Однако, на более поздних стадиях передача сигналов Wnt, которая активируется в развивающихся предшественниках ASMC (Shu et al., 2005), также стимулирует дифференцировку ASMC частично за счет усиления активности Pdgfrs (Cohen et al., 2009; Goss et al., 2011).

Дифференцировка Fgf10-экспрессирующих ASMC предшественников далее управляется с помощью BMP4, секретируемого дистальным эпителием в ответ на передачу сигналов FGF10 (Lebeche et al., 1999; Weaver et al., 2000; Mailleux et al., 2005). Роль передачи сигналов BMP4 в дифференцировке ASMC также подтверждена экспрессией его нижестоящего эффектора Smad1 в дифференцированных ASMCs во время развития легких (Chen et al., 2005). Парадоксально BMP антагонист Noggin также экспрессируется в ASMCs , начиная с E11.5 (Weaver et al., 2003), подтверждая, что передача сигналов BMP нуждается в тесном контроле, чтобы регулировать дифференцировку ASMC. Передача сигналов SHH в мезенхиме, которая негативно регулирует экспрессию Fgf10, также важна для формирования гладких мышц воздушных путей и трахеи (Pepicelli et al., 1998; Li et al., 2004; Miller et al.,2004).

В проксимальной части хрящевых воздушных путей, гладкие мышцы и хрящи воздушных путей располагаются в комплементарных доменах. окруженных эпителием. Гладкомышечные клетки обнаруживаются на дорсальной стороне трахеи и вдоль средины главных бронхов и развиваются в непосредственном соседстве с вентральными/латеральными хрящевыми клетками. Такое пространственное и временное соседство хрящей и гладких мышц необходимо для развития обеих тканей (Hines et al., 2013). Нарушение образования гладких мышц или хряща приводит к компенсаторному увеличению количества клеток оставшегося клона, а в главных бронхах это соответствует экспансии по окружности оставшегося хряща или домена гладких мышц, соотв. (Hines et al., 2013). Молекулярные взаимодействия, лежащие в основе этих коммуникаций между хрящом и гладкими мышцами, остаются неизвестными.

Conclusions

Much is to be gained from the investment in basic lung developmental research. Pathways that govern the differentiation of epithelial progenitors during development are often reactivated upon injury and regeneration. Therefore, a better understanding of how the different molecular pathway are integrated into gene regulatory networks to regulate progenitor cell populations during lung development will undoubtedly provide essential information about how the lung regenerates itself. However, the recapitulation of developmental pathways can become a curse when activated chronically or aberrantly, such as during tumorigenesis and in chronic lung diseases. While our understanding of lung development and its impact on lung regeneration has grown dramatically in recent years, more information is still needed regarding the capacity of lung epithelial progenitors to generate the various epithelial lineages of the adult lung. For example, very little is known about the progenitors that give rise to basal cells, which constitute the main adult lung stem cell population, as well as the developmental pathways involved in this process. Additional studies are also needed about the factors controlling the transition from the branching to alveolar differentiation program. Most preterm babies are born during the saccular stage of the alveolar differentiation stage (between week 26 and 36) when distal epithelial progenitors start to give rise to bipotential alveolar epithelial progenitors. In some extreme cases, at birth the lungs may have only developed until the end of the branching stage, when distal epithelial progenitors are still giving rise to conducting airway epithelium, but not alveolar epithelium. Unraveling the mechanisms involved in alveolar epithelial differentiation and septation may pave the way for new treatments to accelerate alveolar maturation, while minimizing ventilation-mediated damage to increase survival chances of preterm babies. Another important area of research is the controlled differentiation of lung epithelium from iPS cells, which holds great promise for its use in regenerative biology, diagnostics, and personalized medicine. Thus far, the differentiation of human ESCs and iPS cells into pulmonary epithelium has been challenging. Several research groups have reported the successful differentiation into various lung epithelial cell types using a variety of protocols (Wang et al., 2007; Van Haute et al., 2009; Ameri et al.,2010; Green et al., 2011; Kadzik and Morrisey, 2012; Longmire et al., 2012; Mou et al., 2012; Ghaedi et al., 2013; Firth et al., 2014; Fox et al., 2014), which are based on sequentially exposing pluripotent stem cells to growth factors in a way that mimics the steps of lung endoderm development in vivo. However, the efficiency of this process is still subpar and usually generates a mixed population of epithelial cells. Therefore, a complete understanding of the molecular mechanisms that not only drive the specification of respiratory progenitors, but also their subsequent differentiation into the impressive array of specialized cell types that populate the lung epithelium will be critical to achieve this goal. An area of lung development that only recently started to gain attention is the study of the differentiation of the lung mesenchyme. This is very important as different mesenchymal populations make up different stem cell niches in the adult lung, which provide important signals in regards to stem cell activation and quiescence.

Wnt and FGF mediated epithelial-mesenchymal crosstalk during lung development Thomas Volckaert and Stijn P. De Langhe Developmental Dynamics Volume 244, Issue 3, pages 342–366, March 2015

Wnt and FGF mediated epithelial-mesenchymal crosstalk during lung development
Thomas Volckaert and Stijn P. De Langhe
Developmental Dynamics Volume 244, Issue 3, pages 342–366, March 2015