Воспаление влияет на изменения в развитии дистальных частей лёгких, наблюдаемое у сильно недоношенных детей, у которых развивается хроническая болезнь лёгких (бронхо-лёгочнакя дисплазия), которая характеризуется образованием аномальных альвеол. Поскольку многие аспекты лёгочных повреждений и воспаления сходны у новорожденных и взрослых млекопитающих, то развитие лёгких является уникальным объектом побочных эффектов морфогенеза. Данные по сильно недоношенным детям показывают, что воспаление возникает в результате инфекции, искусственной вентиляции лёгких и оксидативных стрессов, мешающих развитию сосудов и альвеол (Husain et al., 1998; Coalson et al., 1999). Исследования на трансгенных мышах с избыточной экспрессией воспалительных цитокинов, включая tumor necrosis factor (TNF-α ), transforming growth factor (TGF-β ), interleukin-6 (IL-6), interleukin-11 (IL-11) и RelA/p65 субъединицы транскрипционного фактора NF-κB, также выявили образование аномальных альвеол (rev. Jobe and Bancalari, 2001; Londhe et al., 2008). Эти наблюдения подтверждают, что активация воспалительных путей во время критического периода развития может влиять на морфогенез лёгких.
Белок Lung-inducible Neuralized-related C3HC4 RING domain (LINCR) был идентифицирован при скрининге генов, чья индукция в лёгких мышей с помощью LPS ослаблялась глюкокортикоидами (Smith et al., 2002). Ранее мы сообщали, что экспрессия LINCR в лёгких взрослых мышей во время эндотоксикоза преимущественно обнаруживается в клетках альвеол типа II и что LINCR индуцируется в линии альвеолярных эпителиальных клеток T7 с помощью LPS и воспалительных цитокинов, но индуцируется в линиях клеток макрофагов или фибробластов (Hu et al., 2005). LINCR индуцируется также в лёгких мышей при гипероксии. Белок LINCR обнаруживает структурное сходство с Drosophila Neuralized, RING доменовой убиквитин E3 лигазой, которая регулирует онтогенетически важную передачу сигналов Notch, способствуя убиквитинированию Delta, лиганда для Notch (Lai et al., 2001). Ранее мы показали, что LINCR, подобно Neuralized, обладает ubiquitin E3-лигазной активностью (Hu et al., 2005). Базируясь на этих находках, мы полагаем, что индукция LINCR при воспалении м. влиять на развитие лёгких путем модулирования передачи сигналов Notch.
Передача сигналов Notch является критической для тканевого гомеостаза и эмбрионального развития в широком наборе систем органов млекопитающих, влияя на клеточную дифференцировку, пролиферацию и апоптоз (Artavanis-Tsakonas et al., 1999). Notch рецепторы являются рецепторами, единожды пронизывающими клеточную мембрану, чья активация с помощью лигандов клеточной поверхности Delta и Jagged семейств инициирует каскад внутриклеточных событий, приводящий к высвобождению Notch внутриклеточного домена и к транскрипции нижестоящих генов мишеней для Notch, включая Hairy/Enhancer of Split 1 (Hes1) млекопитающих. Во время морфогенеза лёгких, Hes1 обычно присутствует в проксимальных частях воздушных путей, включая трахеи, бронхи и дистальные бронхиолы воздушных путей и он очень слабо экспрессируется в дистальных бронхиоло-альвеолярных соединениях по ходу эмбриогенеза и во взрослых лёгких (Deimling et al., 2007). Передача сигналов Notch, по-видимому, регулирует клеточные судьбы лёгочного эпителия, а её активация предупреждает дифференцировку предшественников кончиков дистальных легочных зачатков в альвеолярные клетки (Dang et al., 2003). Специфические сигналы, которые модулируют передачу сигналов Notch во время развития легких изучены плохо.
Мы полагаем, что если LINCR, подобно Neuralized, облегчает передачу сигналов Notch, тогда избыточная экспрессия
LINCR должна вызывать альтерации в развитии лёгких, согласующиеся с активацией передачи сигналов Notch. Чтобы протестировать эту гипотезу, мы получили линии трансгенных мышей, экспрессирующие
LINCR трансген под контролем зависимого от тетрациклина промотора (tetOT-Lincr). Таких мышей скрещивали с хорошо охарактеризованными трансгенными мышами, экспрессирующими reverse tetracycline transactivator под контролем промотора сурфактантного белка C (SPC-rtTA мыши), описанными Perl et al. (2002). Будучи подвергнуты действию doxycycline, мыши с обоими трансгенами избыточно экспрессируют
LINCR в лёгочном эпителии. Заметные аномалии развития лёгких наблюдали у двойных трансгенных мышей, подвергшихся воздействию doxycycline. начиная со дня эмбриогенеза (E) 6.5, но не у одиночных трансгенных сибсов или у контрольных двойных трансгенных эмбрионов, не подвергшихся действию doxycycline. Избыточная экспрессия
LINCR задерживала нормальное ветвление, снижала рост лёгких, вызывала образование крупных кист и нарушала развитие дистальных воздушных пространств. Выстилка легочным эпителием пространств кист у таких мышей обнаруживает мощную экспрессию Hes1 и снижение экспрессии SPC.
Discussion
Созревание лёгких плода сложная онтогенетическая программа во время позднего эмбриогенеза млекопитающих, которая может быть нарушена воспалительными процессами. Базируясь на их свойствах как генах, чья экспрессия индуцируется LPS и ослабляется глюкокортикоидами в клетках альвеолярного типа II эпителия и в развивающихся лёгких, и на их структурном и энзиматическом сходстве с модулятором notch-пути Neuralized, мы полагаем, что LINCR может играть роль как в воспалительных, так и онтогенетических процессах. Чтобы проверить гипотезу, что избыточная экспрессия LINCR в лёгочном эпителии может затрагивать развитие дистальных частей лёгких, мы создали модельных трансгенных мышей с doxycline-индуцированной экспрессией LINCR под контролем промотора SP-C. полученные результаты показали, что избыточная экспрессия LINCR в клетках с активным состоянием промотра SP-C приводит к аномалиям в выборе роста и клеточной судьбы в дистальных частях лёгких. Аномальные кистозные структуры выстланы эпителиальными клетками, которые строго экспрессируют Hes-1, нижестоящую мишень активации Notch. Эти наблюдения подтверждают возможность, что повышенная экспрессия LINCR, вызываемая воспалительными процессами в незрелых лёгких может вносить вклад в нарушения развития дистальных частей лёгких.
Роль передачи сигналов Notch в развитии дистальных частей лёгких была продемонстрирована с помощью ингибирования и избыточной экспрессии в некоторых исследованиях на животных . Эксперименты на ранних эмбрионах (E8.5) мышей с эксплантами зачатков лёгких в передней кишке, обработанных ингибитором γ-secretase, чтобы подавить передачу сигналов Notch, вызывали экспансию клеток предшественников, экспрессирующих SPC и Nkx2.1 (Tsao et al., 2008). Сходным образом, экспланты лёгких E11.5 эмбрионов мыши, обработанные антисмысловыми олигонуклеотидами, чтобы блокировать индивидуальные лиганды для Notch, обнаруживаемые эктопическими зачатками в проксимальных регионах, и увеличить количество и размер дистальных частей зачатков (Kong et al., 2004). Напротив, эктопическая экспрессия Notch3 во внутриклеточном домене, предназначенном стать дистальным легочных эпителием у трансгенных мышей, используя промотор SP-C, вызывает арест дифференцировки альвеолярного эпителия путем блокирования созревания клеток альвеолярного типа IIи формирования клеток альвеолярного типа I (Dang et al., 2003). Кроме того, экспрессия конститутивного Notch1 внутриклеточного домена (NotchIC) в эпителии дистальных частей лёгких посредством трансгенной стратегии Cre-recombinase с использованием NotchIC-IRES-GFP мышей (Murtaugh et al., 2003), скрещенных с SPC-Cre мышами (Wert et al., 1993), блокирует развитие альвеол (Guseh et al., 2009). Напротив, модели с пониженной передачей сигналов Notch обнаруживают незначительные альтерации развития дистальных частей лёгких. В частности, кондиционная делеция Pofut1, важна для продуктивных Notch-лиганд взаимодействиях у млекопитающих, а делеция Rbpjk, транскрипционного эффектора канонической передачи сигналов Notch, не вызывает очевидных дефектов в образовании альвеол (Tsao et al., 2009). Более того, кондиционная делеция Rbpjk в энтодерме лёгких не влияет на экспрессию Hes1 (Morimoto et al., 2010), а делеция Lunatic Fringe (Lfng), модификатора активации Notch рецептора, вызывает лишь умеренные дефекты альвеолярного эпителия (Xu et al., 2010). Итак, эти исследования подтвердили, что в то время как снижение передачи сигналов Notch оказывает незначительный эффект на развитие дистальных частей лёгких, усиление передачи сигналов Notch в эпителиальных клетках ингибирует собственно рост и созревание эпителия дистальных частей лёгких.
Многие эффекты избыточной экспрессии LINCR и избыточной экспрессии NotchIC (Guseh et al., 2009) очень сходны. Обе модели приводят к появлению в дистальных частях легких расширенных кистозных пространств и к гибели при рождении. Лёгочный эпителий, выстилающий кисты в обеих моделях экспрессирует Nkx2.1, но обнаруживается снижение экспрессии SP-C, маркера клеток альвеол типа II, и клеток лёгочных предшественников. Клетки кист в обеих моделях также экспрессируют E-cadherin, маркер проксимальных частей воздушных путей, и окружены слоем эктопических гладких мышц, другой характеристики эпителия проксимальных частей воздушных путей. Маркеры клеточной пролиферации были снижены в обеих моделях. Очень незначительное (2%) усиление апоптоза отмечено у у мышей с избыточной экспрессией NotchIC. У LINCR мышей, TUNEL окрашивание не обнаруживало усиления апоптоза, но мРНК BCL-2 была повышена, а мРНК Caspace 3 оставалась незатронутой у LINCR мышей. У LINCR мышей обнаружение мРНК Sox-9 на ст. E15.5 подтверждает, что уже присутствуют дистальные предшественники. Поскольку Nkx2.1 также присутствует, хотя на пониженных уровнях, то избыточная экспрессия LINCR , по-видимому, не затрагивает ранней спецификации проксимальных в дистальные части легочного эпителия, но нарушает терминальную дифференцировку дистальных клонов, на что указывают низкие уровни SPC и SPB.
В обеих моделях мишень для Notch пути Hes1, которая в нормальных лёгких экспрессируется минимально дистальнее соединения бронхоальвеолярных протоков, мощно экспрессируется в эпителии, выстилающем расширенные дистальные кисты. Это может быть непосредственным результатом усиления передачи сигналов Notch в обеих моделях. Хотя эпителий проксимальных частей воздушных путей экспрессирует Hes1, однако мощная экспрессия Hes1 в эпителии кист д. быть альтернативно косвенным результатом проксимализации, связанной с др. механизмами. Т.о., сходства в дистальном компартменте лёгких в нашей модели с моделью Guseh et al. согласуются с, но не доказывают идею, что LINCR нарушает развитие дистальных частей воздушных путей за счет усиления передачи сигналов Notch. В свете структурного сходства LINCR's с Neuralized, и их ферментативной ubiquitin E3 лигазной активности, мы полагаем, что LINCR, подобно Neuralized, облегчает передачу сигналов Notch за счет убиквитинирования одного или нескольких лигандов для Notch млекопитающих. Однако, специфические мишени для лигазной активности LINCR's E3 пока ещё не установлены и в свете данного исследования не исключена возможность, что эффекты LINCR's в данной модели обусловливаются д. механизмами.
Эффекты избыточной экспрессии LINCR (в данной работе) и избыточной экспрессии NotchIC (Guseh et al., 2009) отличаются в некотором отношении. Лёгкие двойных трансгенных LINCR мышей, подвергнутые воздействию doxycycline были сильно гипопластичными и имели очень крупные кисты. Напротив, лёгкие NotchIC не обнаруживали крупных видимых изменений. Это может быть обусловлено, по крайней мере, частично различиями в размахе и распределении экспрессии двух трансгенов. В то время как трансген Lincr мощно экспрессируется по всему легочному эпителию, что ожидаемо для распределения SPC промотора (Fig. 5), трансген NotchIC экспрессируется мозаично из-за cre-lox методологии, использованной в этом исследовании. Возможно, что довольно значительные различия связаны с тем, что избыточная экспрессия LINCR и NotchIC оказывает противоположные эффекты на секреторные и снабженные ресничками популяции клеток проксимальных частей воздушных путей. В лёгких на ст. E15.5 мышей с избыточной экспрессией LINCR, в секреторных клетках мРНК для клеточного маркера CCSP/Scgb1a1 заметно снижена, тогда как в ресничатых клетках мРНК маркера FoxJ1 заметно увеличена (Fig. 9). Эти изменения являются противоположными, увеличение в секреторных клетках и снижение в ресничатых клетках, вызываемые избыточной экспрессией NotchIC (Guseh et al., 2009), и вместо этого наблюдаются параллельные изменения, наблюдаемые с моделях со снижением передачи сигналов Notch (Tsao et al., 2009; Morimoto et al., 2010). Имеется несколько возможных объяснений этого противоречивого эффекта LINCR на баланс ресничатых и секреторных клеток, который мы были не в состоянии исследовать далее из-а потери трансгенной линии LINCR. Во-первых, дифференцировка клеток воздушных путей не завершена на ст. E15.5, а уровни мРНК на этой стадии не могут аккуратно отображать относительные пропорции речничатых и секреторных клеток воздушных путей (E18.5), изученных в др. исследованиях (Guseh et al., 2009; Tsao et al., 2009; Morimoto et al., 2010). Во-вторых, LINCR может действовать посредством механизмов, иных чем или дополнительных к передаче сигналов Notch. В-третьих, наиболее интересная возможность заключается в том, что LINCR может дифференциально облегчать передачу сигналов Notch в некоторых парах Notch рецептор-Notch лиганд, но не в др. У млекопитающих существуют 4 Notch рецептора (Notch1 to Notch 4) и, по крайней мере, 5 крупных Notch лигандов (Jag1, Jag2, Dll1, Dll3, and Dll4), и множество дополнительных факторов, которые модулируют передачу сигналов Notch у специфических пар рецептор-лиганд (Hicks et al., 2000; Morimoto et al., 2012). В то время как избыточная экспрессия конститутивно активного NotchIC обходит многие регуляторные ступени, которые обычно влияют на передачу сигналов Notch, то модуляция передачи сигналов Notch с помощью Neuralized, и гипотетически с помощью LINCR, если он действует таким же способом, д. быть предметом для многих дополнительных регуляторных сигналов. Недавние исследования начали выявлять различия в экспрессии и эффектах специфических Notch лигандах и Notch рецепторах в дифференцировке клеток воздушных путей (Rock et al., 2011; Morimoto et al., 2012; Xing et al., 2012; Zhang et al., 2013; Firth et al., 2014; Gomi et al., 2015).
Итак, индукция LINCR у двойных трансгенных tetO-Lincr/SPC-rtTA мышей вызывает кистозно-гипопластический фенотип лёгких, приводящий к гибели после рождения и характеризующийся ингибированием дифференцировки обычного дистального эпителия. Повышенная экспрессия Hes-1 в аномальном эпителии у этой модели и сходство с дистальным легочным фенотипом, вызываемым избыточной экспрессией LINCR и NotchIC согласуется с, но не доказывает гипотезу, что избыточная экспрессия LINCR влияет на развитие лёгких за счет активации передачи сигналов Notch в лёгочном эпителии. Далее необходимо исследовать возможность, что вызываемое воспалением усиление экспрессии эндогенного LINCR может вносить вклад в нарушения развития дистальных частей легких и формирование альвеол, которые ассоциируют с воспалительными процессами в развивающихся лёгких.
