Формирование кровеносной и лимфатической сосудистых систем тонко контролируется с помощью внутренних и внешних механизмов (Tammela and Alitalo, 2010; Alitalo, 2011). В то время как механизмы образования кровеносных сосудов изучалось активно, развитие сосудистой лимфатической системы привлекло большой интерес только в последние годы (Koltowska et al., 2013; Martinez-Corral and Makinen,2013). Во время развития мышей лимфатическая сосудистая система начинает закладываться приблизительно на день эмбриогенеза (E) 9.75, причем это сопровождается экспрессией гомеобоксного транскрипционного фактора Prox1 в специфическом субнаборе кардинальной вены (Srinivasan et al., 2007; Yang et al., 2012). Поскольку главный регулятор лимфатической сосудистой сети Prox1 не только регулирует спецификацию судьбы LEC в венах (Wigle and Oliver, 1999; Wigle et al.,2002), но также играет существенную роль в поддержании качественных особенностей LEC в ходе всей взрослой жизни (Johnson et al., 2008). Отсутствие Prox1 ведет к потере специфических маркеров LEC и усилению активности генов, специфичных для кровеносных эндотелиальных клеток. Инициальная индукция экспрессии Prox1 в кардинальной вене регулируется с помощью COUP-TFII и Sox18 транскрипционных факторов (Francois et al., 2008; Srinivasan et al., 2010). После спецификации предшественники LEC мигрируют из кардинальной вены посредством паракринного действия vascular endothelial growth factor (VEGF)-C, экспрессируемого окружающей мезенхимой и затем формируются первичные лимфатические мешки (Karkkainen et al., 2004; Xu et al., 2010). LECs экспрессируют VEGF рецепторы, VEGFR2 и VEGFR3, а также ко-рецептор Neuropilin 2 (Nrp2) (Wirzenius et al., 2007; Xu et al., 2010), а тирозин киназная активность VEGFR3 после стимуляции лигандом необходима для лимфангиогенеза (Veikkola et al., 2001; He et al., 2005).

Передача сигналов Notch это эволюционно законсервированный путь контроля многих онтогенетических событий, включая определение судьбы сосудистых эндотелиальных клеток и разрастание кровеносных сосудов. Notch рецепторы и лиганды, такие как Notch1 и Dll4, соотв., преимущественно экспрессируются в артериальных эндотелиальных клетках развивающегося эмбриона и специфицируют качественных характеристики артериальных клеток (Kume, 2009; Gridley, 2010). Недавние исследования показывают наличие петли обратной связи между Prox1, COUP-TFII и Notch для поддержания деликатного баланса между судьбами артерио-венозных и лимфатических эндотелиальных клеток (Kang et al., 2010; Choi et al., 2012; Aranguren et al., 2013), и соотв. LEC-специфическая делеция Notch1 или подавление передачи сигналов Notch у мышей приводит к возникновению избыточного количества Prox1⁺ предшественников LEC в венах и к усилению дифференцировки LEC во время сосудистого развития (Murtomaki et al., 2013). Эти новые находки предоставляют доказательства, что передача сигналов Notch негативно регулирует качественные особенности лимфатических эндотелиальных клеток среди венозных эндотелиальных клеток.

Передача сигналов Notch также взаимодействует с путем VEGF, чтобы регулировать разрастание кровеносных сосудов за счет выбора кончиковых и стебельковых клеток (Tung et al., 2012; Blanco and Gerhardt, 2013). По аналогии, активность Notch супрессирует образование кончиковых клеток и разрастание в LECs in vitro (Zheng et al., 2011), и путь Notch1/Dll4 является важным для постнатального и патологического лимфангиогенеза (Niessen et al., 2011; Zheng et al., 2011). Хотя, как было недавно установлено, передача сигналов Notch/Dll4 контролирует формирование паттерна лимфатических сосудов вместе с артериальной сосудистой сетью у эмбрионов рыбок данио (Geudens et al., 2010), роль Notch в лимфангиогенезе у млекопитающих всё ещё остается не изученной (Simons and Eichmann, 2013). Мы продемонстрировали здесь, что Notch1 является ключевым регулятором врастания и роста LEC во время морфогенеза лимфатических сосудов у развивающихся эмбрионов мышей. Вызываемая определенными условиями LEC-специфическая делеция Notch1 у мышей приводит к существенному избыточному росту расширенных лимфатических сосудов, а Notch1 -мутантные LECs обнаруживают повышенную пролиферацию и пониженную клеточную гибель, а также усиление врастания. LEC-Notch1 мутанты также обнаруживаю усиление образования филоподий в лимфатических сосудах. Эти новые результаты существенно расширяют недавнее наблюдение, что активность Notch1 влияет на спецификацию LEC в эндотелии вен (Murtomaki et al.,2013). Более того, наши результаты геномного RNA-seq анализа с использованием Notch1 -мутантных LECs предоставили новую информацию о молекулярных механизмах, которые регулируют ключевые сигнальные пути в развитии лимфатических сосудов (Fig. 4 and see Supplementary Tables S1-3, which are available online). Удивительно, наш анализ пути выявил дополнительные гены, связанные с ангиогенезом, экспрессию хемокиновых и цитокиновых сигнальных молекул, значительно усиливающуюся в Notch1 -мутантных LECs (Fig.4D). Это наблюдение указывает на возможную роль Notch1 в воспалительном ответе LECs посредством регуляции медиаторов воспаления. Наша новая находка, скорее всего, открывает новую область исследований. Мы также установили, что VEGF рецепторы (VEGFR2 и VEGFR3), также, как и VEGFC подавляются (Fig. 4C). Это может быть обусловлено стадией развития (E15.5) и местоположением (кожа спины) выделения LECs в качестве лимфатических прорастаний достигающих, по-видимому, плато на этой стадии. Однако мы установили, что потеря Notch1 снижает экспрессию молекул щелевых соединений Gja4 (Connexin 37) (Fig. 4C). Учитывая недавние доказательства, что Connexin 37 регулируется с помощью транскрипционных факторов Prox1 и Foxc2 и необходим для образования лимфатических клапанов (Sabine et al., 2012; Sabine and Petrova, 2014), то вполне возможно, что передача сигналов Notch играет роль в этом процессе. Однако, очевидно, что дефицит Notch1 увеличивает экспрессию передачи сигналов Tgfbr1 (Alk5), и TGFβ которая является критической для лимфангиогенеза врастания (James et al., 2013). Необходимы дальнейшие исследования для выяснения молекулярных механизмов, лежащих в основе зависимого от Notch морфогенеза лимфатических сосудов, включая взаимодействия с др. сигнальными системами.

Figure 4. Schematic generated by PANTHER, a gene ontology-based pathway database, showing pathway analysis of differentially expressed genes in Lyve1+/CD31+ LECs isolated from Notch1 mutant embryos at E15.5 compared to littermate controls. A, B: Dot plots showing the gating used for sorting Lyve-1+/CD31+ LEC, where Gate1 and Gate 2 indicate a total live LEC population and a Lyve1+/CD31+ LEC population acquired following gating of individual CD31+ and Lyve-1+ populations, respectively. C: Bar graph showing RPKM (reads per kilobase of coding sequence per million mapped) values from RNA-seq of Notch1 mutant and control LECs. Levels ofVEGFR3, VEGFR2, VEGFC, and Gja4 were significantly downregulated inNotch1 mutant LECs. D: Panther pathway analysis of upregulated genes inNotch1-mutant LECs. Note upregulation of chemokine and cytokine signaling pathway genes that may influence the lymphatic phenotype of Notch1 mutant embryos. E: Panther pathway analysis of downregulated genes in Notch1-mutant LECs.