Посещений:
РАЗВИТИЕ МОЛОЧНЫХ ЖЕЛЕЗ



Спецификация, стволовые клетки и микроокружение

Mammary gland development: cell fate specification, stem cells and the microenvironment
Jamie L. Inman, Claire Robertson, Joni D. Mott, Mina J. Bissell
Development 2015 142: 1028-1042; doi: 10.1242/dev.087643

The development of the mammary gland is unique: the final stages of development occur postnatally at puberty under the influence of hormonal cues. Furthermore, during the life of the female, the mammary gland can undergo many rounds of expansion and proliferation. The mammary gland thus provides an excellent model for studying the 'stem/progenitor' cells that allow this repeated expansion and renewal. In this Review, we provide an overview of the different cell types that constitute the mammary gland, and discuss how these cell types arise and differentiate. As cellular differentiation cannot occur without proper signals, we also describe how the tissue microenvironment influences mammary gland development.


Рис. и табл.

Молочные желез, которые отличают млекопитающих от остальных животных, функционируют, чтобы продуцировать и секретировать молоко для кормления потомства. Это также уникальный железистый орган, достигающий полного развития только после рождения. Как таковые молочные железы предоставляют уникальную модель для изучения развития и специфичности органа. Эмбриональные рудименты желез, зачатки, присутствуют при рождении и в ответ на гормональные стимулы начинают ветвиться в жировой подушке, как только самки достигают половозрелового возраста. В течение жизни самки молочные железы подвергаются множественным изменениям в структуре и функции, включая циклическое увеличение в соответствии с гормональными изменениями, вызываемыми течкой/менструальным циклом, а также драматические изменения, происходящие во время беременности, лактации и инволюции. Во время этих разных стадий клетки молочных желез пролиферируют, дифференцируются или подвергаются апоптозу в ответ на стимулы, обнаруживая существенную перестройку архитектуры ткани желез.
В самом деле, исследования развития молочных желез, предоставляют уникальную информацию о механизмах, регулирующих спецификацию клеточных судеб, клеточную и тканевую полярность, морфогенез ветвления и инволюцию функционального органа. Более того, многие пути и процессы нарушения регуляции, наблюдаемые при прогрессировании рака молочных желез, воспроизводят тоже самое, что и при нормальном развитии молочных желез и ремоделирования ткани; эти онтогенетические программы поэтому интересны и для исследователей рака.

An overview of embryonic mammary gland development


У мышей развитие эмбриональных молочных желез происходит между днем эмбриогенеза (E) 10.5 и E18.5 (Hens and Wysolmerski, 2005; Sakakura, 1987; Veltmaat et al., 2003). Оно начинается, когда однослойная эктодерма увеличивается, чтобы сформировать клон молочных желез на ст. E10.5. Эти линии клеток распространяются от зачатков передних конечностей до зачатков задних конечностей. Считается, что клетки молочных желез этой линии мигрируют затем в места будущих зачатков молочных желез (5 пар у мышей) (Hens and Wysolmerski, 2005; Propper, 1978; Robinson, 2007). На ст. E11.5, линзообразные многослойные эктодермальные структуры, наз. плакодами, обнаруживаются, слегка возвышаясь над окружающей эктодермой. Плакоды млекопитающих затем становятся луковицами из эпителиальных клеток, которые отличаются от окружающего эпидермиса. Эти зачатки являются возвышенными шарообразными структурами на ст. E12-E13.5, но углубляются в подлежащий дермис примерно на ст. E13.5 (Sakakura, 1987; Watson and Khaled, 2008). Мезенхимные клетки вокруг осевших зачатков конденсируются и становятся мезенхимой молочных желез. Активация андрогеновых рецепторов в мезенхиме эмбрионов самцов между E13.5 и E15.5 передает сигналы деградации зачатков молочных желез (Sakakura, 1987). Вторичная мезенхима, предшественник жировой подушки, дифференцируется за пределами мезенхимы молочных желез на ст. E14.5 (Sakakura, 1987). Развитие молочных желез самок продолжается на ст. E15.5, при этом пролиферация эпителиальных клеток и элонгация в зачатке приводят к образованию врастаний, которые проникают в предшественник подушки. Грудной сосок образуется из эпидермальных клеток, покрывающих зачаток, а просвет образуется во врастании на ст. E16.5 (Hogg et al., 1983). Врастание затем разветвляется в жировой подушке, давая рудиментарное древо протоков на ст. E18.5 (Sakakura, 1987).

An overview of postnatal mammary gland development


От рождения до половозрелости эпителий молочных желез, возникший в соске, остается молчащим (Fig. 1A). Во время полового созревания и под контролем гормонов и др. факторов, эпителий протоков зачатка молочных желез заполняет жировую подушку молочных желез (Fig. 1B) в процессе морфогенеза ветвления (Lyons, 1958; Nandi, 1958). Высоко пролиферативные терминальные концевые зачатки, содержащие наружный слой из эпителиальных клеток шапочки (cap), расположенные по фронту ветвления, приступают к делу (Silberstein and Daniel, 1982; Williams and Daniel, 1983). Эпителиальные клетки вторжения обладают некоторыми характеристиками мезенхимных клеток, предполагая существование в определенной степени эпителиально-мезенхимного перехода epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) occurs at the end bud (Kouros-Mehr and Werb, 2006;Nelson et al., 2006). Однако, в отличие от опухолевых клеток, EMT гены, используемые во время морфогенеза ветвления, находятся под четким контролем. В саом деле, недавняя работа показала, что транскрипционный фактор Ovol2, главный негативный регулятор EMT, необходим во время морфогенеза молочных желез, чтобы регулировать экспрессию EMT генов (Watanabe et al., 2014). Механизм, с помощью которого процесс ветвления наконец останавливается в жировой подушке - это заполнение, вызывающее продукцию и активацию эндогенного TGFβ, и, скорее всего, регулируется за счет механических и локальных сигналов от архитектуры железы (Nelson et al., 2006), хотя точные этапы остаются загадкой.

Fig. 1. The mammary gland development is multistage and occurs after birth.

Окончательная древовидная, структура из двухслойных протоков состоит из апикально ориентированных просветных эпителиальных клеток, которые с базальной стороны окружены сократительными миоэпителиальными клетками (Fig. 1C). В молочных железах девственных мышей эпителий пролиферирует и подвергается апоптозу во время каждого цикла течки (Fata et al., 2001). Однако, во время беременности альвеолярный эпителий быстро пролиферирует в ответ на циркулирующие гормоны, развиваются секреторные альвеолы, способные продуцировать молоко (Fig. 1D). Во время лактации апикально ориентированные просветные эпителиальные клетки синтезируют и секретируют молоко в просвет альвеол; высвобождаемый oxytocin, вызываемый сосанием детенышей, вызывает сокращения окружающих миоэпителиальных клеток, перемещая тем самым молоко по древу протоков в сосок. Во время процесса отнятия от груди теряются стимулы к продукции молока и обширный эпителиальный компартмент подвергается апоптозу, приводя к 'инволюции'. Железы ремоделируются с помощью ряда протеаз, из которых metalloproteinase 3 (Mmp3) наиболее важная (Talhouk et al., 1991), чтобы вернуться к состоянию 'покоя' до беременности (Fig. 1E). Т.о., эпителиальный компонент и архитектура окружающей ткани проходят через занчительное количество преобразований во время каждой беременности.

Cell types of the mammary gland and their specification


Как и в случае большинства железистых тканей молочные железы взрослых состоят из многих ипов клеток, включая эпителиальные, жировые, фибробласты, иммунные, лимфатические и сосудистые клетки, действующие совместно, чтобы поддерживать структуру и функцию органа.

Epithelial cells


Множественные типы эпителиальных клеток обнаруживаются в молочных железах. Двойной слой молочных желез обнаруживается в железах взрослых девственных мышей, традиционно описывается как состоящий из апикально ориентированных просветных эпителиальных клеток, выстилающих протоки, и базально ориентированные миоэпителиальные клетки, находящиеся в контакте с базальной мембраной (BM) (Fig. 1C, inset). Просветные клетки экспрессируют keratins 8 и 18, тогда как миоэпителиальные клетки экспрессируют keratins 5 and 14, а также гладкомышечный актин, обеспечивающий контрактильные свойства. Кроме того, были идентифицированы некоторое количество предполагаемых стволовых клеток и клеток предшественников в базальной популяции клеток (Shackleton et al., 2006; Stingl et al., 2006; Visvader and Stingl, 2014).
Во время половой зрелости и беременности появляется уникальный тип клеток, без сомнения, связанный с функциями молочных желез в этих фазах развития. Во время половой зрелости, напр., клетки шапочки и соматические клетки, являющиеся специализированными эпителиальными клетками, возникают в концевом зачатке. Клетки шапочки, называются так, поскольку выстилают концевой зачаток, образуя структуру шапочки (колпачка) (Fig. 1B, inset), контактируя с окружающей стромой посредством тонкой базальной ламины и, по-видимому, дифференцируются в миоэпителиальные клетки, которые образуют толстый базальный листок (Daniel and Silberstein, 2000; Williams and Daniel, 1983). Соматические клетки, напротив, заполняют внутренность концевого зачатка. Центральные соматические клетки затем подвергаются апоптозу и формируется просвет, а остальные соматические клетки дифференцируются в просветные эпителиальные клетки, давая эпителий протоков взрослых молочных желез (Fig. 1C, inset) (Hennighausen and Robinson, 2005). Во время беременности просветные эпителиальные клетки быстро увеличиваются, образуя альвеолы, которые выстланы клетками, предназначенными секретировать молоко после родов (Fig. 1D, inset).

Adipocytes


Заполненные жиром адипоциты представляют собой большую популяцию стромы жировых подушек взрослых не лактирующих молочных желез. Плотно расположенные предшественники жировых подушек, обнаруживаемые на ст. E14, развиваются во время эмбриогенеза, при этом превращение в типичную ткань белого жира не наблюдается вплоть до момента, спустя 2-3 дня после родов (Sakakura, 1987). Во время беременности и лактации обнаруживаются адипоциты с пониженным содержанием жира, указывая на то, что этот резервуар жира необходим для метаболического затратного процесса продукции молока (Gregor et al., 2013; Hovey and Aimo, 2010). Адипоциты также выполняют эндокринную функцию в железах: они регулируют рост эпителия и функцию эпителия молочных желез, а также общаются с др. типами клеток молочных желез (Bartley et al., 1981; Hovey and Aimo, 2010). Напр., адипоциты секретируют vascular endothelial growth factor (VEGF) и возможно регулируют ангиогенез молочных желез (Hovey et al., 2001).

Fibroblasts


Стромальные фибробласты внедрены в жировые подушки и часто обнаруживаются в тесной близи к базальной стороне древа ветвящегося эпителия (Muschler and Streuli, 2010; Sakakura, 1987). Фибробласты выполняю многие функции, одной из которых являются двунаправленные коммуникации с эпителием во время морфогенеза ветвления, предоставляя инструкции в форме ростовых факторов, протеаз и др. элементов (Howard and Lu, 2014). Исследования in vivo и in vitro подтвердили, что фибробласты играют важную роль в поддержании как жизнеспособности эпителиальных клеток, так и морфогенеза жировых подушек (Liu et al., 2012; Makarem et al., 2013; Wang and Kaplan, 2012). Более того, фибробласты, как полагают, являются главными составляющими ECM молочных желез: они синтезируют ряд ECM компонентов, таких как коллагены, протеогликаны и фибронектин. Кроме того, фибробласты синтезируют многие энзимы. такие как матричные металлопротеиназы, способные не только деградировать ECM, но и также высвобождать ростовые факторы и цитокины, которые находят кров или внедряются в ECM, что влияет на клеточную и тканевую функцию (Simian et al., 2001;Wiseman and Werb, 2002). Как таковые, эти клетки могут регулировать свойства эпителиальных клеток и эпителиальный раковый фенотип путем нарушения состава или плотности ECM (L?hr et al., 2012). Важно отметить, однако, что миоэпителиальные клетки продуцируют обильные количества laminin-111, который влияет на многие аспекты развития и функции молочных желез, включая полярность ткани (Gudjonsson et al., 2002) и жизнеспособность (Boudreau et al., 1995) просветных клеток.

Vascular and immune cells


В молочные железы проникают обширные сосудистые и лимфатические сети, пронизывающие всю жировую подушку. Во время морфогенеза половозрелых молочных желез лимфатическая сеть развивается в тесной связи с эпителиальным древом молочных желез и сосудистой сетью (Betterman et al., 2012). Лимфангиогенез молочных желез, по-видимому, управляется с помощью происходящего из миоэпителия VEGF-C (Vegfc - Mouse Genome Informatics Database) и/или VEGF-D (Vegfd - Mouse Genome Informatics Database) (Betterman et al., 2012). Иммунные клетки, такие как макрофаги и эозинофилы также необходимы для морфогенеза ветвления и они доставляются на ветвящиеся кончики эпителия, чтобы обеспечить инвазию в жировые подушки (Gouon-Evans et al., 2000). Макрофаги также необходимы для гибели эпителиальных клеток и повторного заселения адипоцитами во время инволюции (O'Brien et al., 2012). Посредством активации своих сериновых протеаз и потери зернистости мастоциты участвуют в нормальном ветвлении молочных желез во время полового созревания и они накапливают и возможно активируют плазматический kallikrein, активируя тем самым каскад plasminogen во время инволюции (Lilla et al., 2009; Lilla and Werb, 2010).
Хотя хорошо известно, что многие типы клеток молочных желез вносят вклад в структуру, развитие и функцию динамическим и взаимным способом, огромное большинство исследований сконцентрировано только на эпителии.

Mammary gland stem and progenitor cells: dramatic regenerative potential


Эпителий молочных желез обладает драматическим регенеративным потенциалом и способностью осуществлять многие циклы роста и инволюции, подтверждая, что эпителиальный компартмент молочных желез содержит стволовые клетки молочных желез, т.е. одиночные эпителиальные клетки, способные генерировать всю эпителиальную архитектуру. Удивительная регенеративная способность эпителия молочных желез впервые была продемонстрирована в начале 1960s с помощью трансплантации небольшого количества эпителиальных клеток в жировые подушки молочных желез, это показало их эпителиальное происхождение (Daniel, 1975; Faulkin and Deome, 1960). Эти клетки оказались способны генерировать ветвление эпителия, который заполнял всю жировую подушку (т.e. воссоздавал железистый эпителий), а клеточные популяции из этого эпителия были способны воспроизвести железы снова в последующих очищенных жировых подушках, демонстрируя строго поведение стволовых клеток. Недавно было показано, что полностью функциональная молочная железа может быть получена от потомства одиночной клетки (Kordon and Smith, 1998; Shackleton et al., 2006; Stingl et al., 2006), подтвердив мнение, что эпителий молочных желез содержит популяцию стволовых клеток.
Начаты поиски популяций mammary stem cell (MaSC) и определение потенциала дифференцировки разных популяций эпителиальных клеток молочных желез (Plaks et al., 2013; Shackleton et al., 2006; Spike et al., 2012; Stingl et al., 2006). Оказалось, что несколько разных популяций эпителиальных клеток обладают свойствами стволовых клеток, некоторые из которых могут действовать как стволовые клетки во время не физиологического процесса трансплантации клеток, но не во время нормального развития и дифференцировки. После этого клетки со способностью воссоздавать эпителий молочных желез при трансплантации были обозначены как mammary gland-reconstituting units (MRUs). Они отличаются от клеток, которые во время нормального развития дают как просветные, так и миоэпителиальные клетки, которые были обозначены как бипотентные MaSCs, а клетки, которые дают только одиночный клон во время нормального развития, были обозначены как однопотентные эпителиальные предшественники молочных желез.

Markers and features of mammary gland-reconstituting cells


Используя сортировку маркеров клеточной поверхности (see Table 1) и способ воспроизведения желез, идентифицированы некоторые отличающие маркеры для MRUs. Эпителий молочных желез мышей обычно первым изолируется с помощью отбора против маркеров immune/hematopoietic (CD45), erythrocyte (Ter119) и эндотелиальных (CD31) клеток (в целом обозначаемых как популяция клона, негативного по маркерам или Lin-). Эти эпителиальные клетки затем сортируются по экспрессии на среднем или высоком уровнях CD24 (heat-stable antigen), на высоких уровнях CD29 (β1-integrin) и/или на высоких уровнях CD49f (α6-integrin) (Badders et al., 2009;dos Santos et al., 2013; Plaks et al., 2013; Shackleton et al., 2006; Stingl et al., 2006; Zeng and Nusse, 2010). Паттерн экспрессии др. маркеров, по-видимому, варьируют от исследования к исследованию, затрудняя количественные сравнения преобладания разных популяций (Fig. 2). Но недавняя работа подтвердила, что клетки, изолированные с помощью подхода сортировки, является миоэпителиальными: миоэпителиальные клетки, экспрессирующие гладкомышечный актин, были единственными клетками, способными повторно заполнять железу (Prater et al., 2014).

Fig. 2. Flow cytometry-based studies of MRUs: discordance between studies.

Table 1. Mammary gland reconstitution studies and MRU markers

Описано сходство одиночных клеток из этой обогащенной MRU популяции при ограниченном разведении дающих весь эпителий железы, ~1/40-1/800, в зависимости от исследования (Badders et al., 2009; dos Santos et al., 2013; Plaks et al., 2013; Shackleton et al., 2006; Stingl et al., 2006; Zeng and Nusse, 2010). Это сравнимо с разведением 1/1400 - 1/7600 в не отсортированной Lin- эпителиальной популяции (Badders et al., 2009; Shackleton et al., 2006) или менее, чем 1/3000 в Lin-CD29- или Lin-CD24- MRU-истощенных эпителиальных популяциях (Shackleton et al., 2006). Однако, Lin-CD24medhiCD29highCD49fhighпопуляции не были чистыми MRU популяциями; а скорее были обогащенными MRU популяциями, а дополнительные популяции были главным образом, но не полностью истощенными по MRU (Shackleton et al., 2006).

Refining MRU surface markers by isolating DNA label-retaining cells


Некоторые последующие исследования также попытались очистить поверхностные маркеры MRUs и идентифицировали несколько несопоставимых популяций со способностью воссоздания железы. Молочные железы взрослых содержат клетки, которые сохраняют их родителей нить ДНК, подтверждая, что эти клетки делятся нечасто и с помощью асимметричных клеточных делений, это свойство характерно для стволовых клеток и предшественников (Smith, 2005). Эти клетки, сохраняющие меченную ДНК и в самом деле, как было установлено, обладают в 5 раз более высокой способностью реконструирования железы по сравнению с немечеными эпителиальными клетками (dos Santos et al., 2013). Более того, выделение и последующее определение профиля ДНК клеток, сохраняющих CD29highCD49fhighCD24+ было использовано для идентификации улучшенных маркеров MRU. Благодаря этой работе, был найден дополнительный поверхностный клеточный маркер, CD1d, гликопротеин, обычно обнаруживаемый на антиген-презентирующих клетках, в ДНК популяции, сохраняющей метку (dos Santos et al., 2013). Добавление этого маркера к современной технике сортировки привело к пятикратному обогащению MRUs в популяции Lin-CD29highCD49fhighCD24+CD1d+ до 1/8. Однако, CD1d+ клетки могут и не представлять всю популяцию стволовых клеток, принимая во внимание редкость CD1d+ популяции (1% от CD29highCD49fhighCD24+) по сравнению с частотой MRUs, наблюдаемой в данном исследовании (1/44 Lin-CD24+CD29hi против 1/8 Lin-CD24+CD29hiCD1d+), подтверждая, что CD1d+ клетки являются частью MRUs. Это исследование также не установило, является ли популяция Lin-CD24+CD29hiCD1d- истощенной по активности стволовых клеток.

Refining MRU surface markers by interrogating the Wnt signaling pathway


Др. плодотворным подходом по изоляции MRUs стала идентификация элементов пути передачи сигналов Wnt, которые активны в развитии молочных желез, учитывая важность передачи сигналов Wnt для поведения стволовых клеток (Reya and Clevers, 2005) и высокую активацию пути Wnt/β-catenin в клетках, сохраняющих метку (dos Santos et al., 2013). В самом деле, нижестоящяя мишень Wnt, с G-белком связанный рецептор Lgr5, по-видимому, действует как маркер стволовых клеток в некоторых др. органных системах (Barker et al., 2010, 2007; Jaks et al., 2008). В молочных железах, Lgr5+ клетки представлены субнабором из keratin 14+ (K14) базальной Lin-CD24+CD49fhigh MRU-обогащенной популяции и являющихся превосходящими их родительскую популяцию в регенерации функциональных молочных желез (de Visser et al., 2012; Plaks et al., 2013). Подтверждена роль Lgr5 не только при реконструкции желез, но и при нормальном развитии, эксперименты по потере функции и делеции показали, что Lgr5 и его принципиальный лиганд, R-spondin, необходимы для нормального постнатального органогенеза молочных желез (Chadi et al., 2009; de Visser et al., 2012; Plaks et al., 2013). Истощенная по Lin-CD24+CD49fhigh Lgr5- популяция не обладает способностью восстановления железы (Plaks et al., 2013), тогда как Lgr5- клетки обнаруживают редкую активность по заселению вновь (Rios et al., 2014). Однако, третье исследование выявила противоположное , так что Lgr5- клетки, которые также экспрессируют protein C receptor (ProcR), обнаруживают более строгое MRU поведение, чем Lgr5+ клетки (Wang et al., 2015).
Др. элементы пути Wnt, включая канонический Wnt путь рецепторов Lrp5 и Lrp6 (Goel et al., 2012), также, по-видимому, маркируют популяции, обогащенные MaSC (Badders et al., 2009; Lindvall et al., 2009) по сравнению с эпителиальными клетками в целом. Соответственно отбор по Lrp5, на белок, связанный с LDL рецептором, усиливает эффективность реконструкции молочных желез по сравнению с не отсортированными эпителиальными клетками (Badders et al., 2009), а Lrp6 необходим для нормальной инвазии ветвящихся молочных желез in vivo (Lindvall et al., 2009). Недавнее исследование сообщило, что ProcR, являющийся мишенью для Wnt3A, также является маркером MRUs: CD24+CD29hiProcR+ клеток, демонстрируя значительно более высокий потенциал реконструкции молочных желез, чем родительская или ProcR-истощенная популяция (Wang et al., 2015). Более того, anthrax toxin receptor 1 (Antxr1), который также участвует в пути Wnt, может действовать как маркер стволовых клеток (Chen et al., 2013). Было бы интересно исследовать, характеризуются ли клеточные популяции с помощью этих разных компонентов передачи сигналов Wnt и с помощью CD1d+, обогащающего MaSC популяции.

Issues with MRU studies


Хотя базирующиеся на жидкостной цитометрии, исследования пригодны для идентификации разных популяций MRUs и маркеров, которые они экспрессируют, вариаций FACS результатов и частоты детекции MRU, наблюдаемых в данном исследовании (Fig. 2). Они могут быть частично объяснены методологическими вариациями, включая возраст донора и условия трансплантации. Т.к. мыши подвергаются половому созреванию и массивным изменениям архитектуры эпителия около 6-8 недель, то после циклов течки каждые 4 дня, молочные железы 6-недельных мышей могут обнаруживать очень отличающийся клеточный состав от 12-недельных мышей. Цикл течки может также драматически изменять эффективность восстановления молочных желез, давая в 10 раз более высокие количества MRU во время progesterone-high фаз лютеинизации (Joshi et al., 2010). Сходным образом, мы недавно продемонстрировали, что очень незначительные отличия в изолированных клетках могут приводить к расхождению данных FACS (Hines et al., 2014). Более того, условия трансплантации могут драматически затрагивать эффективность реконструкции, приводя к десятикратному увеличению реконструкции молочных желез (Spike et al., 2012). Напр., использование matrigel для предупреждения anoikis, и инъекции эпителия в его нативной конфигурации с прикрепившейся стромой, оба строго увеличивали эффективность реконструкции (Spike et al., 2012). Сходным образом, культуры миоэпителиальных клеток в течение 1 недели in vitro оказались достаточными для массивного увеличения активности MRU (Prater et al., 2014). Учитывая эти важные колебания потенциала, опубликована консенсусная техническая работа по сравнению ведущих методов разделения и предоставлению путеводной нити для будущих исследований (Smalley et al., 2012).
Необходимо также отметить, что, хотя реконструкция желез демонстрирует удивительную регенеративную способность MRUs, остается неясным, базируется ли развитие нормальных молочных желез на тех же самых клеточных популяциях. Реконструкция молочных желез, скорее всего, использует ранение от места инъекции, которое может индуцировать выбор др. судеб, чем те, что происходят во время нормального развития молочных желез (Plaks et al., 2013;Shackleton et al., 2006; Van Keymeulen et al., 2011).

Mammary gland stem and progenitor cells: insights from lineage tracing


Отслеживание клонов клеточных популяций у трансгенных животных всё больше используется для определения и лучшего понимания стволовых клеток и предшественников в клеточных популяциях молочных желез. Однако, такие исследования также дают некоторые противоречивые результаты о природе и потенциале стволовых клеток и предшественников во время полового созревания, беременности и инволюции (summarized in Figs 3 and 4).

Fig. 3. An overview of lineage tracing in vivo.

Fig. 4. Mammary gland stem cells in normal development: models of stem cell behavior.

Pubertal development might rely on bipotent MaSCs


Исследования по отслеживанию клонов с двумя окрашиваниями привели к заключению, что развитие молочных желез во время полового созревания преимущественно происходит за счет однопотентных клеток предшественников, так что все базовые клетки возникают только из клеток базальных предшественников, а все просветные клетки из просветных предшественников (Fig. 4C) (Van Keymeulen et al., 2011; van Amerongen et al., 2012). Напротив, недавние обширные исследования по отслеживанию клонов продемонстрировали, что половозрелые железы содержат несколько популяций разных стволовых клеток и предшественников, включая бипотентные стволовые клетки, которые дают как просветные, так и миоэпителиальные клетки протоков (Rios et al., 2014) (Figs 3 and 4). Эта работа использовала многоцветное отслеживание клонов, чтобы маркировать одиночные клетки и их клональное потомство и конфокальную микроскопию толстых срезов для анализа крупных регионов древа протоков, что позволяло определять редкие типы клеток.
В этом исследовании keratin 5 (K5)-экспрессирующие клетки, меченные во время половозрелости, все находились в базальном компартменте во время мечения, но давали непрерывные участки как просветных, так и базальных клеток, подтверждая их бипотентность (Rios et al., 2014). В инициальный момент мечения все K5-меченные клетки находились в базальном компартменте согласно FACS анализу (91% CD29hi, CD24+ и менее 1% просветных CD29lo, CD24+) и гистопатологии. Спустя 1 неделю после индукции K5, отсутствовали окрашенные в один цвет просветные участки, а 65% клональных участков были миоэпителиальными. После 8-нед. слежки, 61% непрерывных, одного цвета участков имели как просветные, так и миоэпителиальные клетки, результат вряд ли обусловлен соседством одинаково окрашенных стволовых клеток и предшественников, дающих участки одного цвета (Fig. 4A?). В самом деле участки, меченные или K5, K14 или Lgr5 в половозрелых молочных железах, все давали клональные участки клеток из обоих клонов, если оценивались с помощью конфокальной микроскопии или с помощью FACS (Rios et al., 2014). Небольшой субнабор делящихся K5+ клеток при половозрелости наблюдался, как экспрессирующий маркеры множественных клонов, включая базальный маркер K14, просветный маркер Elf5 и предполагаемый маркер стволовых клеток Lgr5, подтверждая, что эта клеточная популяция представляет собой популяцию клеток предшественников.
В дополнение к этим бипотенитным стволовым клеткам, Elf5+ просветные клетки, меченные до половозрелости, дают только просветные и альвеолярные клетки, подтверждая, что Elf5+ клетки содержат пул просветных предшественников (Fig. 4D) (Rios et al., 2014). Этот результат является зеркальным отражением более ранних находок, что keratin 8+ (K8) и keratin 18+ (K18) просветные клетки в препубертатных железах дают просветные и альвеолярные клетки только (Van Keymeulen et al., 2011).

Remodeling in the adult mammary gland of virgin mice


Если используется отслеживание клонов в постпубертатных молочных железах девственных взрослых самок мышей, то непрерывные участки меченных клеток обнаруживаются во многих исследованиях (Rios et al., 2014; Van Keymeulen et al., 2011), подтверждая, что даже в покоящихся железах происходит обширная клеточная замена. Используя отслеживание клонов Elf5+ просветных клеток для оценки взрослых животных, крупные участки просветных клеток возникали из одного и того же предшественника на ст. 8 недель, но маленькие клональные участки обнаруживались на ст. 20 недель, что согласовалось с экспансией и медленным истощение просветных предшественников со временем (Rios et al., 2014). Когда использовали отслеживание клонов K5+ базальных клеток во взрослых железах, то наблюдались участки просветных и миоэпителиальных клеток, включая некоторые физически сцепленные пары клеток, предположительно результат недавнего асимметричного деления (Rios et al., 2014). В течение длительных периодов времени, немногие, крупные участки, содержали как просветные, так и базальные меченные клетки, подтверждая массивную клональную экспансию этих K5+ бипотентных клеток предшественников во время ремоделирования желез (Rios et al., 2014). Кроме того, в ходе длительного наблюдения наблюдался сдвиг от смешанных или только миоэпителиальных участков к преимущественно клонам просветных участков при такой схеме мечения, подтверждая, что бипотентные предшественники дают популяцию просветных предшественников, которые затем переключаются на поддержание просветных клеток протоков (Fig. 4B) (Rios et al., 2014).

Conflicting evidence for stem/progenitor cells in pregnancy and involution


Во время беременности железы девственных самок формируют обширную сеть секреторных альвеол, выстланных специализированными просветными клетками. Эти альвеолярные просветные клетки, как полагают, происходят из протоковых просветных клеток, наблюдаемых у взрослых девственных мышей, согласно таким маркерам как Elf5, K8 или K18 (Rios et al., 2014; Van Keymeulen et al., 2011). При многоцветном мечении большинство альвеол, как было установлено, экспрессируют от одного до 4-х разных цветов, подтверждая, что в среднем, два просветных предшественника дают каждую альвеолу (Fig. 4D) (Rios et al., 2014). Когда отслеживают бипотентные K5+, K14+ или Lgr5+ популяции, то наблюдаются как меченные просветные альвеолярные, так и миоэпителиальные клетки. Однако, многоцветные эксперименты подтвердили, что непрерывные альвеолярные и миоэпителиальные клетки не образуются из одного и того же предшественника. Это указывает на то, что хотя бипотентные предшественники во взрослых молочных железах могут давать альвеолярные клетки, они проходят сначала через состояние просветных предшественников (Rios et al., 2014). Однако, отдельное исследование с использованием отслеживания клонов Axin2, который экспрессируется исключительно в базальных клетках желез девственных самок, показало, что индукция беременности дает как базальные, так и просветные альвеолярные клетки внутри теж же самых меченных альвеол, подтверждая, что альвеолярные клетки возникают из бипотентных стволовых клеток, а не из просветных предшественников (van Amerongen et al., 2012). Кроме того, отдельная, радкая популяция Notch2-экспрессирующих просветных клеток, по-видимому, необходима для ветвления третьего порядка и образования альвеол во время беременности, хотя клональное происхождение и свойства этих клеток недостаточно исследованы (?ale et al., 2013).
Celnm,s альвеолярных клеток во время инволюции остаётся неизвестной. Используя маркер клеток просветных предшественников Elf5, оно исследование показало, что новый пул Elf5-меченных просветных клеток предшественников дает альвеолярные просветные клетки во время беременности, но затем эта меченная популяция погибает во время инволюции, чтобы заместиться новым пулом клеток предшественников для последующего раунда беременности (Rios et al., 2014). Однако, разные исследования показали, что производные K8- или K18-меченных просветных клеток предшественников персистируют в ходе множественных циклов беременности (Van Keymeulen et al., 2011). В др. исследовании было установлено, что потомство секреторных альвеолярных клеток, меченное соотв. экспрессией whey acidic protein promoter (Wap), персистирует в течение многих циклов беременности и инволюции. Эти parity-индуцированные эпителиальные клетки обнаруживаются в просвете между беременностями и в секреторных альвеолах во время беременности; они экспрессируют маркеры просветных клеток, включая Elf5, и, по-видимому, не экспрессируют гормональные рецепторы (Chang et al., 2014).

Potential causes of discrepancies in lineage-tracing studies


Расхождения между этими разными исследованиями по отслеживанию клонов могут быть объяснены частично различиями в технике мечения генов, времени мечения и индукционными агентами (Rios et al., 2014). Некоторые исследования отбирали для мечения меньшее общее количество клеток, чтобы индуцировать более низкими концентрациями лекарства (Van Keymeulen et al., 2011), которые предназначены для идентификации клональных участков, тогда как др. использовали более сильную технику мечения, чтобы пометить все потенциальные клетки данного клона (Rios et al., 2014), это нарушает определенную способность идентифицировать клоны. Кроме того, tamoxifen, который обычно используется для cre-lox рекомбинации, является фактически эстрогенным блокатором и дозы этого лекарства, используемые при floxing, по-видимому, по-видимому, изменяют выбор судеб эпителиальными клетками молочных желез (Rios et al., 2014; Visvader and Stingl, 2014).
Когда клон отслеживается с помощью одноцветной метки, то довольно трудно определить, происходят ли соседние, меченные клетки от одного предшественника или двух разных (Van Keymeulen et al., 2011). Недавнее использование многоцветного мечения сделало это менее вероятным, т.к. вероятность двух клеток пометиться одним и тем же цветом связана с вероятностью мечения squared times the probability of the two having the same color (1/16 for four-color labeling), но всё ещё возможно, что некоторые одного цвета участки не являются клональными. Хотя исследования по отслеживанию клонов очень важны для идентификации нормального онтогенетического потенциала в разных популяциях стволовых клеток и предшественников разных молочных желез, необходимы дальнейшие исследования, чтобы урегулировать взаимоотношения между K5+, K8+, K14+, Lgr5+, Axin2+, CD1d+ и parity-индуцированными популяциями эпителиальных клеток молочных желез (Chang et al., 2014; dos Santos et al., 2013; Plaks et al., 2013; ?ale et al., 2013; Van Keymeulen et al., 2011; van Amerongen et al., 2012;Wagner et al., 2002).

The differentiation of mammary gland cell types


Исследования по отслеживанию клонов выявили, что во время развития и гомеостаза молочных желез бипотентные стволовые клетки в половозрелых железах дают просветные и миоэпителиальные клетки, возможно через однопотентное состояние предшественников. Механизмы, управляющие дифференцировкой клеток предшественников молочных желез и/или их потомством в просветные, альвеолярные или миоэпителиальные клетки, недостаточно изучены, но недавнее транскрипционное профилирование, связанное с мышиными нокаутными моделями, оказалось очень пригодным для предоставления новой информации об этих путях клеточной дифференцировки.

Luminal progenitor cell differentiation


Во время беременности просветные клетки или клетки просветных предшественников дают альвеолярные эпителиальные клетки, и эта дифференцировка управляется рядом факторов. Транскрипционный фактор Gata-3, напр., , как известно, является критическим регулятором, необходимым дифференцировки просветного эпителия из просветных предшественников (Asselin-Labat et al., 2007; Kouros-Mehr et al., 2006). Показано, что β3-integrin/CD61 является маркером клеток просветных предшественников (Asselin-Labat et al., 2007, 2011); используя трансгенные модели, было показано, что экспрессия Gata-3 необходима для дифференцировки CD61+ популяции в просветные клетки и для развития альвеол во время беременности (Asselin-Labat et al., 2007). Более того, индукция Gata-3 в популяции, обогащенной MaSC, управляет дифференцировкой в альвеолярный просветный фенотип, определяемый экспрессией Wap и β-casein (Csn2 - Mouse Genome Informatics Database) (Asselin-Labat et al., 2007). Эти исследования показали, что Gata-3 является критическим регулятором детерминации и созревания клона просветных эпителиальных клеток.
Массивные гормональные изменения во время полового созревания, менструации и беременности существенно изменяют структуру молочных желез, но пока клетки просветных предшественников сами по себе не чувствительны к гормонам (Asselin-Labat et al., 2010; Joshi et al., 2010). Эффекты гормонов на MaSCs и предшественники, как полагают, осуществляются с помощью паракринных сигналов от соседних клеток. В самом деле, недавнее исследование показало, что при беременности прогестерон вызывает созревание просветных клеток, передавая сигналы MaSCs посредством RANK Ligand (Tnfsf11) зависимым от Stat5a способом (Obr et al., 2013). В соответствии с этим использование floxed Stat5a/b аллеля специфической для молочных желез экспрессии Cre, Yamaji et al. (2009) показало, что Stat5a/b необходим для альвеолярной дифференцировки, но не для ветвления протоков. Показано, что RANK Ligand индуцирует экспрессию транскрипционного фактора Elf5 в CD61+ просветных предшественниках (Lee et al., 2013). Когда экспрессия Elf5 блокируется, то популяция K8+K14+p63+ MaSCs расширяется и избыточно накапливается в молочных железах беременных мышей, а молочные железы этих животных неспособны к лактации (Chakrabarti et al., 2012; Lee et al., 2013; Oakes et al., 2008). Соотв., Elf5 кондиционные нокауты вызывают полный блок дифференцировки альвеол (Choi et al., 2009).
Передача сигналов Stat5a индуцируется с помощью происходящего из миоэпителиальных клеток neuregulin 1 (Nrg1), который также необходим для активности MaSC (Vafaizadeh et al., 2010; Forster et al., 2014). Nrg1 экспрессируется в миоэпителиальных клетках зависимым от p63 способом и обнаруживается в просветных клетках благодаря рецепторам Erbb4. Эта передача сигналов индуцирует экспрессию Stat5a мишеней Elf5 и cyclin D1, необходимых для функции просветных клеток и клеток просветных предшественников (Forster et al., 2014). Экспансия клеток предшественников также нуждается в Myc, указывая тем самым, что этот прото-онкоген играет физиологическую роль в развитии молочных желез (Moumen et al., 2012). Наконец, Lrg5, по-видимому, действует как рецептор для сигнала, индуцирующего альвеолы при беременности (de Visser et al., 2012; Plaks et al., 2013; Rios et al., 2014), и когда или Lgr5 или его лиганд, R-spondin (de Lau et al., 2011), отсутствуют, то секреторные альвеолы не развиваются (Chadi et al., 2009; Chakrabarti et al., 2012).
Функциональная дифференцировка молочных желез также обеспечивается за счет контакта эпителиальных клеток молочных желез с ECM посредством laminin-111 связывания интегринов. Просветные клетки экспрессируют β-casein в ответ на передачу сигналов laminin-111, независимо от межклеточных контактов (Streuli et al., 1991, 1995). Далее было продемонстрировано, что имеется транскрипционный энхансер (BCE1) в телячьем β-casein промоторе, который чувствителен к prolactin и передаче сигналов ECM (Schmidhauser et al., 1992), а laminin-111, как было установлено, является специфическим белком, обеспечивающим передачу сигналов ECM (Streuli et al., 1995). Молекулярная характеристика BCE1 энхансера показала наличие двух важных регионов, которые связывают C/EBP-β (Cebpb - Mouse Genome Informatics Database) и Stat5 (Myers et al., 1998). Важно, что энхансер интегрирован в геном в таком положении, чтобы быть активированным с помощью laminin-111 и prolactin, подтверждая, что структура хроматина, по-видимому, играет существенную роль в активации этого элемента (Myers et al., 1998). В соответствии с этой находкой, более поздние исследования определили, что устойчивая активация Stat5, обеспечиваемая с помощью laminin-111 важна для ремоделирования хроматина и транскрипции β-casein transcription (Xu et al., 2009).

Myoepithelial cell differentiation


Миоэпителиальные клетки молочных желез идентифицируются по экспрессии специфических белков, включая изоформы кератина и контрактильные белки [rev. Moumen et al. (2011)]. Однако, транскрипционные факторы, которые обеспечивают дифференцировку базальных предшественников в миоэпителиальные клетки in vivo недостаточно изучены. В молочных железах человека идентифицирован p63 в качестве мощного медиатора базального фенотипа (Yalcin-Ozuysal et al., 2010). Дифференцировка миоэпителиальных клеток зависит от serum response factor (Srf), как показано в исследованиях нокаутных мышиных моделей ко-активатора Srf, myocardin-related transcription factor A (MRTF-A; Mkl1 - Mouse Genome Informatics Database), которые показали, что MRTF-A необходим для дифференцировки миоэпителиальных клеток после лактации (Li et al., 2006; Sun et al., 2006). Дополнительные транскрипционные факторы, такие как Slug и Smad3, также как и передача сигналов Notch, участвуют в становлении базального фенотипа [rev. Moumen et al. (2011)].

The microenvironment as a regulator of mammary gland development and homeostasis


Поддержание и дифференцировка различных типов клеток молочных желез также зависят от признаков и свойств локального тканевого окружения, в частности от окружающего ECM. Важность ECM и стромы молочных желез и функции показаны [(Williams and Daniel, 1983), rev. Varner and Nelson (2014)]. Модели химерной рекомбинации [rev. Nelson and Bissell (2006)] продемонстрировали важность стромы в отношении влияния на развивающийся эпителий. Когда эпителий молочных желез рекомбинировался с мезенхимой молочных желез, то в результате возникало типичное древо протоков молочных желез. Однако, эпителий молочных желез рекомбинированный с мезенхимой слюнных желез давал структуры, напоминающие эпителий слюнных желез (Sakakura et al., 1976). С др. стороны, выросты слюнного эпителия в контакте с мезенхимой молочных желез напоминали древо протоков молочных желез и могли даже обнаруживать компетентность отвечать лактацией на гормональные стимулы (Cunha et al., 1995). Эти и др. исследования показали, что эпителиальный компонент очень поддатлив и что клеточная судьба и тканевая функция испытывают сильное влияние со стороны стромального компонента желез.
Недавние исследования (Bruno and Smith, 2012; Bussard and Smith, 2012) продемонстрировали, что клетки не молочных желез и даже раковые клетки человека могут быть репрограммированы в выросты молочных желез, способные к самообновлению после дальнейшей трансплантации в очищенные жировые подушки молочных желез мышей (Boulanger et al., 2013, 2012, 2007). В этих исследованиях совместные инъекции эпителиальных клеток молочных желез были необходимы, указывая тем самым, что 'ниша стволовых клеток', которая включает микроокружение и компоненты ECM, также необходимы для передачи сигналов от bona fide эпителиальных клеток молочных желез. Как такое тканевое микроокружение поддерживает рост, клеточную дифференцировку и развитие молочных желез? Существует прирожденная сигнальная сеть между эпителием и его микроокружением и включает передачу сигналов в ответ на механические силы и межклеточные контакты, передачу сигналов от ECM молекул, происходящие из стромы факторы роста и цитокины и активности протеолитических энзимов в микроокружении.

The role of cell contacts and mechanical forces


Клетки молочных желез тесно связаны др. с др. и со своим окружением и они нуждаются в этих соединениях для нормального функционирования. Миоэпителиальные клетки, напр., закреплены на др. миоэпителиальных клетках и клетками просветного эпителия с помощью десмосом и с BM с помощью полу-десмосом (Adriance et al., 2005; Pandey et al., 2010). Сходные свойства обеспечиваются с помощью интегринового α 6β 4 комплекса, как это показывают просветные клетки молочных желез,огда культивируются на богатом ламинином, трехмерном (3D) ECM геле (Weaver et al., 2002). In vivo, два слоя протоков экспрессируют разные медиаторы межклеточных контактов (Chanson et al., 2011; Huebner et al., 2014; Mroue et al., 2014) и соединения между клетками и ECM (Brizzi et al., 2012); как результат слоеная структура протоков само-организуется, когда просветные и миоэпителиальные клетки перемешивают в 3D культуре (Chanson et al., 2011; Gudjonsson et al., 2002;Huebner et al., 2014; Runswick et al., 2001). Более того, эти соединения необходимы для функции клеток: клетки лактирующих молочных желез нуждаются в E-cadherin для выживания (Boussadia et al., 2002). Итак, эти плотные соединения между клетками молочных желез делают возможной передачу механических сил и биохимических сигналов посредством растущего эпителия и делают возможным коллективное перемещение клеток (Gjorevski and Nelson, 2010), при этом механически активные клетки тянут и толкают более пассивные клетки вместе с собой (R?rth, 2012).

ECM-mediated control of mammary gland development


ECM является главным регулятором эпителиальной архитектуры и функции. В молочных железах миоэпителиальные клетки располагаются на специализированном слое ECM, наз. базальной мембраной (BM). Миоэпителиальные и стромальные клетки синтезируют ECM компоненты, такие как laminins, collagens, fibronectin и proteoglycans, которые включаются в ECM и BM. Эти молекулы матрикса осуществляют не только физическую поддержку правильной тканевой архитектуры, но и также важные сети передачи сигналов, способствующие выбору клетками судьбы и функции молочных желе. BM также закрепляет миоэпителиальные клетки связывая их с молекулами клеточной поверхности и путем организации базальной стороны миоэпителия посредством секретируемого миоэпителием laminin-111 и полу-десмосом (Inman et al., 2011).
Исследования с использованием микромассивов белков микроокружения начинают открывать молекулы ECM, которые влияют на выбор клеточных судеб клетками предшественниками молочных желез (LaBarge et al., 2009; Lin et al., 2012). Эти исследования показали, что laminin-111 регулирует самообновление предшественников молочных желез, тогда как др. комбинации белков ECM приводят к росту, дифференцировке и апоптозу (LaBarge et al., 2009). Как обсуждалось выше, миоэпителиальные клетки являются основным источником laminin-111 в BM, и именно этот ламинин является очень ответственным за становление апикально-базальной полярности просветных эпителиальных клеток (Gudjonsson et al., 2002; Weir et al., 2006). Более того, поскольку их позиция и функция внутри тканей молочных желез, то миоэпителиальные клетки, как полагают, действуют как опухолевые супрессоры во взрослых молочных железах (Adriance et al., 2005; Bissell and LaBarge, 2005; Pandey et al., 2010; Sternlicht and Barsky, 1997; Sternlicht et al., 1997).
Др. стромальные белки ECM важны для инструктирования развития древообразной структуры молочных желез. Напр., недавнее исследование показало, что ориентация collagen I волокон в жировых подушках молочных желез передает сигналы формирования паттерна для ориентации ветвления молочных желез во время развития (Brownfield et al., 2013). Эти collagen I волокна, по-видимому, ориентируются до морфогенеза ветвления молочных желез, показывая, что эпителиальная архитектура может быть предварительно заложена в виде пре-паттерна в строме половозрелых молочных желез. Такие структурные компоненты, которые поддерживают архитектуру ткани, часто не учитываются как регуляторы морфогенеза, но мы понимает, что корректная архитектура ткани и жесткость ECM являются важными компонентами нормального развития, дифференцировки и функции внутри молочных желез (Bissell et al., 1982; Maller et al., 2013; Schedin and Keely, 2011).

Proteases are essential regulators of mammary gland morphogenesis and differentiation


Протеолитическое действие ремоделирует ECM и строму и высвобождает секвестрированные ростовые факторы и цитокины. Не удивительно, что протеазы важны для развития и функции молочных желез. Для эпителиального рудимента, чтобы заполнить жировую подушку после гормональных сигналов во время полового созревания важно, чтобы клетки приобрели инвазивный фенотип и протеиназы, в данном случае матричные металлопротеиназы (MMPs), прокладывают путь путем ремоделирования ECM (Talhouk et al., 1991). Чтобы понять роль протеиназ в молочных железах, получен ряд трансгенных мышей, у которых определенные протеиназы (или протиназные ингибиторы) замалчиваются или избыточно экспрессируются. Хотя компенсация с помощью разных MMPs затрудняет эксклюзивное определение функции одиночных протеиназ in vivo трансгенные мышиные модели предоставляют информацию о важности протеиназ во время развития и функции молочных желез. Кроме того, 3D модельные физиологически важные органотипические культуры проливают свет на важность как каталитической активности, так и вновь открытых функций не каталитических доменов протеиназ во время развития молочных желез(Correia et al., 2013; Kessenbrock et al., 2013;Mori et al., 2013).
Несколько разных классов протеаз необходимы для собственно развития и функции молочных желез. Протеиназы предоставляют локальные средовые сигналы, способствующие EMT и инвазии. Напр., мы показали, что Mmp3 играет критическую роль в ремоделировании молочных желез при инволюции (Talhouk et al., 1991), а её аберрантная активность в 3D коллагеновом геле ведет к EMT и предраковому фенотипу (Lochter et al., 1997). Др. показали, что cathepsins играют важные роли во время инволюции и апоптоза молочных желез (Sloane, 2012; Watson and Kreuzaler, 2009). Сериновые протеазы также важны: мыши, дефицитные по сериновой протеазе plasminogen, обнаруживают затруднения с лактацией из-за нарушений факторов, контролирующих инволюцию (Green et al., 2006). Др. исследования идентифицировали активатор сериновой протеазы плазминогена kallikrein, важный для дифференцировки адипоцитов молочных желез. Kallikrein, как полагают, играет роль в плазминогенном каскаде ремоделирования богатого фибрином стромального ECM пре-адипоцитов (Selvarajan et al., 2001).
Наиболее широко исследовались энзимы в контексте развития и дифференцировки молочных желез это metalloproteinases, которые включают MMPs и 'a dysintegrin and metalloproteinases' (ADAMs). MMPs составляют семейство из более чем 20 zinc-зависимых протеиназ, синтезируемых, как латентные энзимы, которые д. быть активированы после трансляции (Kessenbrock et al., 2010). Их активность модулируется с помощью эндогенных ингибиторов, наз. tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) (Murphy, 2011). Итак, MMPs могут деградировать все белковые компоненты ECM, известен и ряд др. белков, включая E-cadherin (Lochter et al., 1997). Многие трансгенные мышиные модели были получены для изучения функции MMP при развитии и раке (Gill et al., 2010; Wiseman and Werb, 2002). Интересно, что нокаут Mmp14 единственный нокаут гена MMP у модели, который летален. Избыточная экспрессия Mmp14 (Ha et al., 2001) или Mmp3 (Sympson et al., 1994) молочных желез приводит к избыточному образованию боковых веточек и улучшенному морфогенезу альвеол (Fata et al., 2004). Повышенные уровни активной формы Mmp3 не только вызывают избыточное ветвление молочных желез, но и вызывают продукцию реактивных видов кислорода (ROS), изменения в сплайсинге Rac1, EMT и геномную нестабильность (Radisky et al., 2005), которые предшествуют развитию опухоли молочных желез (Sternlicht et al., 1999). Скрещивание мышей с избыточной экспрессией Mmp3 с мышами с избыточной экспрессией Timp1 снижает вредные эффекты избыточная экспрессия и активности Mmp3. Эти данные подтверждают мнение, что активность Mmp3 в молочных железах важны для морфогенеза ветвления, но что внеплановая активность изменяет микроокружение в ткани молочных желез. Более того, тот факт, что активность Mmp3 может быть смягчена с помощью Timp1, подчеркивает важность баланса между энзимами и ингибиторами для собственно тканевого развития и гомеостаза и может объяснить, почему TIMPs также являются факторами риска рака молочных желез.
Др. исследования с использованием мышиных моделей, где Mmp3 генетически супрессирована, выявили роль Mmp3 в дифференцировке адипоцитов (Alexander et al., 2001). Избыточная экспрессия Timp1 дает фенотип, сходный с таковым, обнаруживаемым после истощения Mmp3, подтверждая идею, что активность MMP, в частности, Mmp3 важна для дифференцировки адипоцитов во время инволюции молочных желез. В исследованиях, в которых медленно высвобождающие шарики с Timp1, 2, 3 или 4 были имплантированы в молочные железы мышей, было показано, что Timp1, 3 и 4 ингибируют удлинение протоков, скорее всего, путем ингибирования активности MMP. Однако, Timp2 обнаруживает способствующий удлинению эффект (Hojilla et al., 2007). На поверхности Timp2 приводит, по-видимому, к противоположному, но повышенные уровни Timp2, скорее всего, повышают уровни активации Mmp2 за счет увеличения образования третичных комплексов (Mmp14-Timp2-Mmp2), которые ответственны за активацию Mmp2 in vivo (Ellerbroek and Stack, 1999; English et al., 2006).
Чтобы выяснить механизмы, лежащие в основе этих наблюдений in vivo, изучали клеточные культуры. Эти исследования выявили, что активная Mmp3 повышает уровни ROS, приводя к генетической нестабильности и EMT (Radisky et al., 2005), это вносит вклад в развитие опухолей в стареющих молочных железах. Недавно выявлена не протеолитическая функция Mmp3 (внутри hemopexin домена) важная для EMT и инвазии во время морфогенеза ветвления (Correia et al., 2013). Протеомный анализ партнеров по связыванию Mmp3 hemopexin домена показал, что шаперон heat shock protein, 90β (Hsp90β) взаимодействует специфически с hemopexin доменом в Mmp3 во внеклеточном пространстве и что это взаимодействие является критическим для функции Mmp3. Др. работа показала действие hemopexin домена Mmp3 как регулятора передачи сигналов Wnt и активности MaSC (Kessenbrock et al., 2013). В соответствии с этим мыши, дефицитные по Mmp3, обладают пониженными количествами MaSCs и пониженной активностью по реконструированию молочных желез. Напротив, там же было показано, что избыточная экспрессия Mmp3 усиливает функцию MaSC. Итак, очевидно, что активность Mmp3 необходима для поддержания MaSCs.
Трехмерные модели клеточных культур также важны для выяснения множественных функций MMPs в нормальных и озлокачествленных молочных железах (Barcellos-Hoff et al., 1989; Petersen et al., 1992). Напр., исследования роли Mmp14 в развитии молочных желез затруднены из-за летальности генного нокаута. Однако, используя micropatterned гель из collagen I, было установлено, что hemopexin домен в Mmp14 важен для сортировки эпителиальных клеток молочных желез, чтобы поддержать ветвление, подчеркивая тем самым, что не протеолитические домены Mmp14 также важны для собственно морфогенеза ветвления (Mori et al., 2009). Помимо hemopexin домена, существует короткий внутриклеточный домен в Mmp14 критический для инвазии эпителиальных клеток (Mori et al., 2013). Используя искусственно созданные конструкции Mmp14, в которых разные домены были делетированы, мы открыли, что единственный короткий внутриклеточный домен в Mmp14 необходим для восстановления морфогенеза ветвления в Mmp14-дефицитных клеток, несмотря на тот факт, что эта последовательность не содержит киназной активности. Этот дефицит компенсируется с помощью integrin β1, который взаимодействует с коротким цитоплазматическим доменом в Mmp14. Он необходим для взаимодействия с ECM, и для передачи внеклеточных сигналов, необходимых эпителиальным клеткам, чтобы осуществить инвазию. Следовательно, MMPs важны не только для ремоделирования ECM, но и также для передачи сигналов от микроокружения, необходимых для морфогенетических программ в молочных железах.
Комбинированные мышиные модели вместе с физиологически важными 3D моделями клеток человека делают возможным дальнейшие исследования механизмов действия этих протеиназ. Эта информация важна не только для понимания тканевого развития, но и для идентификации новых мишеней для терапии рака, для исследования некаталитических доменов MMPs как регуляторов тканевого морфогенеза и развития опухолей (Dufour and Overall, 2013; Rodr?guez et al., 2010; Strongin, 2010). Некаталитические домены доступны с помощью антител или блокирующих пептидов, направленных против этих доменов (Basu et al., 2012).

Conclusions


Like all other organs, the mammary gland is composed of many specialized cell types that carry out mammary functions, with interconnected signaling occurring between the different cellular compartments. With its unique developmental mode occurring essentially after birth and its remarkable regenerative properties, the mammary gland provides a superb model for investigating developmental programs, stem and progenitor cell properties, and the stability of the differentiated state.
Early serial transplant experiments and transgenic mouse models have shed light on the identity and role of MaSCs and progenitor cells. More recently, lineage-tracing experiments have identified multiple different, and somewhat conflicting, populations of stem and progenitor cells. Despite the discrepancies, these studies have begun to fine-tune our understanding of MaSCs and how they drive development of the gland and maintain homeostasis of the resulting arboreal architecture. Additionally, the results of a number of recent studies are revealing the role MaSCs play in the many cycles of proliferation and apoptosis needed both to expand and maintain the gland form and functions during pregnancy and to return it to a quiescent state after involution.
Many questions remain. Even the most fundamental puzzles - for example, what signals drive cells down a particular lineage path; and why does this go wrong in cancer? - are not clearly delineated. Of course, interactions and signaling between cells are important, but a major driver of differentiation appears to be signaling from the tissue microenvironment, especially from the ECM in general and the BM in particular. For decades, the ECM and BM were thought to be the inert 'bricks and mortar' of a tissue, simply providing physical structure. We now know that correct tissue architecture, including the organization and stiffness of the ECM, together with the reservoir of growth factors, cytokines and proteinases within which the stem cell niche nestles, are essential for mammary glandular tissue to develop and function properly.