ьусрф    Посещений:
МЕХАНОБИОЛОГИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК



Костный мозг

Stem cell mechanobiology: diverse lessons from bone marrow
Irena L. Ivanovska, Jae-Won Shin, Joe Swift, Dennis E. Discher
Trends in Cell Biol. Volume 25, Issue 9, p523–532, September 2015



Figure 1 Matrix material properties are important at both the cellular and nanometer scales. (A) Schematic representation of the spatial organization of bone marrow cells at their interface with mineralized bone. (B) Transmission electron microscopy (TEM) image of part of an osteoblast [the nucleus (NU) and rough endoplasmic reticulum (rER) are visible inside] and its extracellular environment with two distinct layers: the fibrillar osteoid (Os) and the mineralized bone (Min. Bone). Adapted from F. Bronner and M.C. Farach-Carson [4]; scale bar, 1 micron. Abbreviations: HSC, hematopoietic stem cell; MSC, mesenchymal stem cell.

In vitro approaches to mimic and characterize the extracellular matrix (ECM) in the stem cell niche


Стволовые клетки пластичны, т.к. обладают потенциалом дифференцироваться во многие клоны. Контроль судеб стволовых клеток обычно приписывается факторам роста, которые регулируют транскрипционные факторы. Однако, поскольку стволовые клетки не существуют в изоляции in vivo, то дополнительные внешнесредовые факторы распознаны в качестве регуляторов судеб стволовых клеток. В самом деле, мультипотентные стволовые клетки или предшественники присутствуют во многих тканях взрослых [1] и располагаются в окружении, известном как ниша, которая помогает поддерживать клетки в нативном состоянии вплоть до направления на дифференцировку. Ниша представлена ткане-специфичным матриксом и соседними дифференцированными клетками с ключевыми растворимыми молекулами, все они воспринимаются стволовыми клетками и интерпретируются, когда необходимо начинать дифференцировку [2]. Механотрансдукция также теперь исследуется как механизм дифференцировки, в результате которого клетки физически ощущают свое окружение с помощью механических воздействий от своего окружения с помощью механических сил, которые изменяют организацию белков и в конечном итоге экспрессию генов.
Роль механики ECM в предопределении клеточной функции - включая дифференцировку стволовых клеток - интенсивно исследуется, по крайней мере, частично с использованием упрощенных in vitro подходов, которые упрощают сложные механические свойства ткани. Напр., коллагены являются наиболее многочисленными белками у метазоа, но они обладают сложной механикой; коллагеновые фибриллы являются наполовину гибкими биополимерами с нелинейным эластическим поведением и если они поперечно связаны, то образуют strain-stiffening (жесткие от натяжения) сети [3]. Разработка biomimetic культуральных систем зависит от методов измерения механических свойств как биологических, так и искусственных систем с высоким пространственным разрешением, таких как rheology, micropipette aspiration и atomic force microscopy (AFM) ( Box 1).

Box 1 Common techniques for measuring mechanical properties of ECM, cells, and the nucleus

Influence of matrix mechanics on differentiation of bone marrow cells


Мезенхимные стволовые клетки (MSCs) вносят вклад в популяцию остеогенных предшественников, которые дифференцируются в остеобласты, продуцирующие остеоидный матрикс на поверхности между костным мозгом и кальцифицированным коллагеном (Figure 1A) [4]. Остеоид содержит фибриллярный коллаген, не коллагеновые белки и протеогликаны, все они поперечно связаны c помощью энзимов, секретируемых остеобластами. Со временем инициализируется утолщение и минерализация матрикса посредством отложения апатититовых (минерал фосфата кальция) кристаллов [5]. На уровне нано-шкалы состав и топология костного матрикса (Figure 1B) предопределяет то. как клетки переносят стрессы на субклеточном уровне. Матричные фибриллярные и не фибриллярные белки и кристаллы аппатита имеют измерения нано-шкалы и их структура, скорее всего, отражает нано-механику. Кристаллы фосфата кальция растут между фибриллами, но могут также обнаруживаться внедренными внутрь самих фибрилл [6]. Интересно, что ориентация кристаллов апатита скорее, чем плотность минерала коррелирует наиболее сильно с жесткостью формируемой кости [7].
Выделенные из костного мозга, MSCs являются клетками слипчивого типа, которые распределяются в виде культуры ткани на пластике или стекле. В культуре с соотв. растворимыми факторами, MSCs являются мультипотентными; помимо своего остеогенного и хондрогенного потенциала, они определенно обладают адипогенным потенциалом [8, 9]. Адипоциты наиболее широко представлены в костном мозге человека [10] и можно предположить, что полость мягкого костного мозга способствует адипогенезу, тогда как жесткая поверхность кости влияет на остеогенез. Последнее, скорее всего, является важной функцией MSCs, и имеются некоторые доказательства, что адипоциты костного мозга - вообще-то также дифференцируются из MSCs костного мозга - внося вклад с регуляцию гематопоэза [11, 12].
Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs), выделенные из костного мозга, не являются слипчивыми по сравнению с MSCs и HSPCs также способны расти в суспензии in vitro. тем не менее взаимодействия in vivo с окружающими клетками костного мозга и ECM, по-видимому, неизбежны. В самом деле, HSPCs экспрессируют поверхностные адгезивные рецепторы, включая интегрины и цитоскелетные компоненты, такие как актомиозин, которые, в принципе, способны ощущать физические силы и жесткость ECM своего микроокружения. Исторически, HSPCs были культивированы с вязкой метилцеллюлозной среде в комбинации с растворимыми факторами, чтобы контролировать рост и дифференцировку предшественников. В отличие от суспензии клеток, которые диффундируют прочь и свободно распределяются дисперсно, по мере их деления, вязкое окружение ограничивает подвижность клеток, приводя к образованию колоний, это позволяет исследовать, как индивидуальные клетки предшественники дают специфические клоны. Хотя система метилцеллюлозы может рассматриваться как воспроизведение вязкого окружения костного мозга, но возможно, что клетки ведут себя подругому в этой системе, чем в естественной среде. Недавние исследования с использованием более пригодной системы гидрогеля, которая обеспечивает жесткость, позволили исследовать, как механика матрикса может регулировать MSCs и HSPCs в отдельности или в комбинации с др. внутренними и внешними факторами и силами.
Важно, что MSCs дифференцируются из плюрипотентных стволовых клеток, включая iPSCs [13, 14], и такие клетки обладают ожидаемым мультиклональным потенциалом, если получают стандартные растворимые факторы. Давно используются легко доступные клетки, такие как клетки кожи (в противоположность биопсии костного мозга), чтобы получать специфичные для пациента iPSCs, которые затем могут быть использованы для получения хорошо известных клонов для применения. HSCPs также происходят из плюрипотентных стволовых клеток [14], но эффективность намного ниже и может отражать тот факт, что HSCPs взрослых, по-видимому, чтобы произойти из типа эндотелиальных клеток подвергаются воздействию раннего кровотока [15, 16]. Способность к механотрансдукции iPSC, произошедших из MSCs и HSCPs, пока тестируется.

Tissue mechanics: the case for nanoscale characterization


Солидные ткани в целом гибкие и эластичные на макро-шкале и небольшие деформации были хорошо описываются Young's модулями, E (modulus of elasticity, see Glossary). Ткани обладают широкими пределами эластичности, среди них ткань головного мозга является наиболее гибкой (менее 1 kPa) [17] а минерализованная кость самой твердой (GPa) [18]. Костный мозг является наиболее мягкой тканью с очевидной эластичностью, измеряемой in situ в 0.3 kPa [19, 20]. Однако, важно отметить, что механические свойства могут варьировать в зависимости от разрешения, с которым они измеряются. Эластичность на уровне макро-шкалы данной ткани отражает её структуру на самой крупной шкале и она может отличаться от эластичности, характерной клеткам на шкале в микроны и мельче.
Многие белки ECM помимо фибриллярных коллагенов могут собираться в гель с измеримой эластичностью. Matrigel, напр., является коммерческой экстрагируемой смесью из белков базальных мембран, секретируемых клетками саркомы мышей, который содержит также многие ростовые факторы [21]. Хотя такой гель может быть пригодным субстратом для изучения поведения клеток, модификации этого геля контролируют жесткость (напр., изменения плотности или поперечных связей) обычно изменяя плотность лигандов. Сложный состав matrigel приводит к затруднениям разделения механических эффектов от биохимических [21]. Синтетические гидрогели могут упрощать и прояснять биологию. Polyacrylamide (PA) гели, покрытые лигандом не фибриллярного коллагена определенной плотности являются широко распространенными системами, предложенными Pelham and Wang [22]; гибкость легко контролируется за счет вариации поперечного связывания и/или плотности акриламида. Такие системы и др. интенсивно используются для воспроизведения тканевых микро-условий и для изучения клеточных реакций.

Matrix mechanics and actomyosin contractility in differentiation


Большинство клеток тканей являются зависимыми от закрепления и д. твердо держаться ECM, чтобы собственно выживать и функционировать. Взаимодействия между клетками и матриксом обеспечиваются c помощью рецепторов клеточной адгезии, таких как интегрины, которые обеспечивают трансмембранные соединения и цитоскелетом, передачу сигналов через мембрану. Информация, предоставляемая c помощью специфических мест соединения внеклеточных лигандов на наружных доменах интегринов, передается во внутриклеточные домены, процесс, зависимый от долговременных конформационных изменений, которые регулируются аллостерически [23]. Клетки, реагирующие на пространственную организацию ECM образованием фокальных адгезий (FAs) - сложных динамичных структур, которые связывают интегрины и каркасные белки с актиновым цитоскелетом [24].
Как только клетки слипаются, они оказываются способными 'ощущать' механические свойства своего окружения путем натяжения своего окружения c помощью контрактильных сил, генерируемых сетью актин-миозиновых белков [25]. Не мышечный myosin-II образует филаменты, это белок, поперечно связывающий актины, обладающий свойствами генерации контрактильных сил, которые регулируются c помощью фосфорилирования его легких и тяжелых цепей [26]. Силы, которые вызывает myosin-II, могут приводить к деформации матрикса, но устойчивость матрикса может в свою очередь вызывать напряжение (stress) внутри клетки, где может быть модифицирована сборка и организация стрессовых волокон - цитоскелетных структур, состоящих из собранных в пучки актиновых филамент. Точно такие же процессы обнаруживаются во многих контрактильных типах клеток, включая стволовые клетки.
На клеточную судьбу могут повлиять некоторые механические свойства, включая эластичность, геометрию и адгезию, которые в конечном итоге влияют на натяжение цитоскелета (Figure 2A) . В самом деле, MSCs культивируемые на PA геле, покрытом коллагеном, реагируют на эластичность путем спецификации в клоны. На матриксе с остеоид подобной жесткостью (40 kPa), MSCs становятся остеогенными, тогда как на мягком матриксе (10 kPa), MSCs становятся миогенными [27]. То же самое исследование показало, что фармакологическое ингибирование сократимости myosin-II блокирует спецификацию клонов. Жесткость матрикса благоприятствует сборке актомиозина и контрактильным силам, что подтверждается образованием стрессовых волокон, как предсказывает теория [28]. В частности, расположение стрессовых волокон внутри клеток не является отражением монотонной функции эластичности матрикса, а имеется оптимальное соотношение матрикса с эластичностью, чтобы управлять поляризацией клетки и анизотропией стрессовых волокон.


Figure 2. From outside-in and out again – the relationship between matrix stiffness, cell contractility, nuclear composition, and differentiation. (A) Matrix stiffness increases cell contractility through regulation of non-muscle myosin-II levels. Nuclear stiffness, set by the level of lamin-A,C protein, scales with tissue microelasticity, E, and in cultured mesenchymal stem cells (MSCs) is higher on a stiffer matrix and increases with cellular tension. MSCs in culture and expanded on plastic deposit their own matrix with unknown stiffness and have high lamin-A,C levels. Lamin-A,C knockdown (KD) on soft matrix enhances adipogenesis; lamin-A overexpression (OE) combined with stiffer matrix enhances osteogenesis. (B) Myosin-II proteins polarize in hematopoietic stem cells (HSCs) on stiff matrix, leading to asymmetric division and differentiation. By contrast, soft matrix suppresses myosin polarization, and cells divide symmetrically and proliferate.

При некоторых оригинальных предопределениях тракционных стрессов (τ), осуществляемых клетками в геле, средняя величина тракционного стресса увеличивается в соответствии с модулем эластичности геля E , так что соотношение т/E становится примерно на 3-4% выше предела физиологической эластичности (rev. [25]). Клетки могут осуществлять только ограниченные стрессы τ (вообще-то в пределах kPa), но эластические модули могут быть значительно выше (напр., GPa для стекла или пластика), так что τ/E подход 0%. Ткани также обладают не не нулевой вязкостью, особенно мягкие ткани, такие как костный мозг, и поэтому интересно оценить вклад от потери модуля на клеточное поведение. Недавняя работа показала, что когда клетки культивируются на твердом субстрате, то возникает стрессовая реляксация, их распространение увеличивается по сравнению с эластическими субстратами с тем же самым эластическим модулем [29]. В др. исследовании, где потеря модуля варьировала от фиксированного значения E, MSCs выглядели чувствительными к содраганиям субстрата и обнаруживали усиленный потенциал дифференцировки в направлении клонов с соизмеримой эластичностью [30].
Сили актомиозина также могут быть модулированы путем наложения ограничений на клеточную форму: геометрические свойства, которые увеличивают клеточную контрактильность в постоянно области распространения, благоприятствуют остеогенезу в противовес адипогенезу, независимо от растворимых факторов [31]. На клеточную судьбу также влияют имеющие определенную форму кластеры 'nano-pits' - 120 nm в диаметре и 100 nm в глубину - врезающиеся в polymethylmethacrylate субстраты, выявляемые с помощью electron beam lithography [32]. Остеогенез у MSCs максимальный на рядах нано-ямок (nano-pit) разделенных 50 nm, тогда длинные FAs наблюдается, а длительное культивирование приводит к минерализации. Последующее исследование показало, что MSCs, культивируемые на квадратах из таких рядов поддерживают мультипотентность [33]. При культивировании клеток на эластических столбиках, которые делают возможными тракционные силы, были измерены путем отслеживания сгибания столбиков, наблюдалась строгая корреляция между распределением FA, растягивающими усилиями и распространением клеток [34]. Когда MSCs культивировали в бипотентной остеогенной-адипогенной среде, то жесткость пружины столбиков оказалась решающим фактором в выборе клеточной судьбы, при этом большая жесткость способствовала остеогенезу а низкая жесткость способствовала адипогенезу. Исследование подтвердило, что по тракционным силам и по вызываемому клеточному натяжению можно предсказать, какие клетки будут преимущественно дифференцироваться после воздействия биохимических стимулов и более того предсказывать, какие клеточные натяжения или жесткость могут быть использованы в качестве раннего маркера для предсказания выбора клетками судьбы в гетерогенной популяции MSC.
Многие белки ECM содержат адгезивные последовательности, такие как Arg-Gly-Asp (RGD), и более 20 интегринов, как известно, распознают эти последовательности [35]. Пептиды, иммобилизованные на монослое, обычно являются пригодными для изучения адгезии между клетками и матриксом [36, 37, 38, 39]. Субстраты, представленные пептидами с высоким сродством, способствуют остеогенезу, а пептиды с низким сродством при высокой плотности способствуют миогенезу, тогда как при низком сродстве пептиды с низкой плотностью способствуют нейрогенезу [40]. Такие спецификации клонов, по-видимому, находятся в приближенном согласии с сигналами жесткости матрикса [27], подтверждая унифицированный физико-химический механизм: устойчивость субстрата к клеточным тракционным усилиям сказываются обратным образом на натяжении цитоскелета. Однако, необходимо установить, действительно ли адгезивные лиганды являются ограничивающими in vivo поскольку жесткость ткани варьирует in vivo.
Помимо MSCs, гематопоэтическая дифференцировка в разные клоны также регулируется механическими стрессами. Напр., тромбоциты генерируются из мегакариоцитов (MKs), которые подвергаются созреванию в результате накопления содержимой ДНК без деления. Этот процесс полиплоидизации или эндомитозов, происходящий из-за слабой адгезии с внешними интерфейсами, ограничивает цитокинез. Интересно, что исследования с клетками не млекопитающих показали, что адгезия с матриксом обеспечивает тракционные силы, вынужденные растаскивать клетки др. от др. [41]. В соответствии с этим мнением, полиплоидизация MK ингибируется на жестком матриксе, при этом более сильная адгезия увеличивает растягивающие усилия, чтобы управлять клеточным делением [42]. Напротив, мягкий матрикс (обычно костный мозг [19]) ингибирует силы myosin-II и максимально усиливает созревание MK. Высоко плоидные MKs обладают подвижными проекциями, которые мигрируют в непосредственную близость к кровотоку, где срезающие усилия вызывают фрагментацию их в про-тромбоциты [43], которые затем активируют myosin-II, чтобы спососбстсовать их делению на маленькие, семейные тромбоциты (за исключением случаев, когда myosin-IIA мутантен) [44].
Очень ранняя гематопоэтическая дифференцировка также регулируется с помощью механики ECM в комбинации с др. физическими факторами. Соотношение HSC:предшественник (P) сохраняется или возрастает на очень гибком субстрате tropoelastin по сравнению с жестко поперечно связанным tropoelastin [45]. Как и в случае MSCs, ингибирование myosin II устраняет механочувствительность HSCs и предшественников. Используя масс-спектрометрию-откалиброванную внутриклеточную проточную цитометрию, состав изоформ myosin-II, как было установлено, переключается с поляризуемой B изоформы на более гомогенную A изоформу во время гематопоэтической дифференцировки [19]. Внешние стрессы, такие как сдирание жидкостью и жесткий матрикс индуцируют поляризацию myosin-IIB, приводя к переключению изоформ ламинов. Напротив, мягкий матрикс предупреждает myosin-IIB от поляризации. Если поляризация происходит во время клеточного деления, то myosin-IIB симметрично распределяется между дочерними клетками, это поддерживает стволовость, тогда как клетка с низким содержанием myosin-IIB дифференцируется (Figure 2B). Когда myosin-IIB подавляется в дифференцированных клетках, то myosin-IIA активируется за счет дефосфорилирования, индуцируя полимеризацию актина. Мягкий матрикс также усиливает до максимума фосфорилирование myosin-IIA. Итак, эти находки подтверждают, что мягкий матрикс (далекий от ригидной кости), скорее всего, супрессирует переключение изоформ myosin-II, тогда как твердый матрикс (близкий к кости) вызывает асимметричные деления (Figure 2B).
Поняв, что ограничения матрикса, которые регулируют клеточную дифференцировку, можно начать представлять, как клетки организуются внутри ткани. В костном мозге существуют клетки в окружении с градиентом жесткости на шкале протяженности в несколько раз более высоком, чем клеточная длина. Остеобласты располагаются на остеоидном интерфейсе, которые относительно тверд, но он соседствует с клетками, такими как пре-остеобласты, которые окружены более мягким матриксом. MSCs располагаются внутри костного мозга, но неясно, как они устанавливают заново свое положение во время детерминации в клоны, такие как адипоциты или пре-остеобласты. MSCs не только поляризованы в направлении и мигрируют в регионы большей жесткости [46], но и также стремятся дифференцироваться в соответствии с сигналами эластичности ECM [47, 48]. Очевидно, что такой процесс 'durotaxis' зависит от myosin-II и он очевиден в системе 3D матрикса. Не мышечный myosin II-B (NMII-B) является неполяризованным на мягком субстрате, но поляризуется в задней части клеток, если клетки мигрируют из мягкого субстрата на твердый. Более того, более жесткие субстраты способствуют сборке NMII-A в стрессовые волокна, которые необходимы для поляризации NMII-B [46].

Lamins: regulating cell fate with nuclear structure


Внутри клетки ядро заключено в клетку с помощью цитоскелета, так что воздействия на цитоскелет распространяются на ядерную оболочку (Figure 3) [49] и возможно влияют на глобальную организацию хроматина [50]. Ключом для поддержания структуры и физических свойств ядра является ядерная ламина, сеть из белков промежуточных филамент ламинов A-типа (lamins A и C являются продуктами альтернативного сплайсинга в гене LMNA), а B-типа ламины (lamins B1 и B2 кодируются генами LMNB1 и LMNB2, соотв.). Ламины располагаются на интерфейсе между внутренней ядерной мембраной и хроматином [51-54]. Комплекс 'linker of nucleo- and cytoskeleton' (LINC) является белковым комплексом, который может вносить вклад в механическую передачу сигналов в ядро [55,56]. В частности, nesprins - семейство ядерных мембранных белков - соединяются с актиновыми филаментами в цитоплазме посредством своих N-терминальных доменов, тогда как их C-терминальные домены закреплены на SUN (от Sad1p, UNC-84) доменовых белках, осуществляя прямую физическую связь между цитоскелетом и нуклео-скелетом путем натяжения внутренней ядерной мембраны и в свою очередь соединяясь с ламиной.


Figure 3. Stem cell mechanobiology. (A) Mesenchymal stem cells (MSCs) cultured on soft substrates exhibit a low-contractility phenotype: low spread area, poorly developed focal adhesions (FAs) and stress fibers, and lower levels of lamin-A,C in the nuclear lamina. (B) Lamin-A,C level is regulated by tension-dependent kinase activity. Low tension allows lamin to be phosphorylated (P), leading to increased solubility and turnover. The filamentous lamina is thus maintained in a state appropriate to the mechanical environment of the nucleus. (C) On soft substrates, transcription factor (TF) RAR-? remains in the cytoplasm, reducing transcription of the lamin-A,C gene (LMNA) and favoring adipogenesis, an effect enhanced by agonists of the retinoic acid (RA) pathway. TF YAP/TAZ also remains cytoplasmic, favoring adipose and neuronal lineages over osteogenesis. (D) By contrast, MSCs cultured on stiff substrates have a high-contractility phenotype: high spread area, well-developed FAs and stress fibers, high levels of TF serum response factor (SRF), and a nuclear lamina rich in lamin-A,C. (E) High tension on the nuclear lamina inhibits phosphorylation and turnover of lamin-A,C. (F) The contractility of the actomyosin cytoskeleton is regulated in response to substrate stiffness by the Rho/ROCK signaling cascade. (G) On stiff substrates, TF RAR-? translocates to the nucleus, increasing transcription of LMNA and driving osteogenesis, an effect enhanced by the addition of antagonists to the RA pathway. YAP/TAZ levels in the nucleus are also increased, favoring osteogenesis over adipogenic or chondrogenic cell fates. Further abbreviations: MLC, myosin light chain; RAR-?, retinoic acid receptor-?; Rho, Ras homolog; RARE, retinoic acid response element; ROCK, Rho-associated protein kinase; SRF, serum response factor; TAZ, transcriptional coactivator with PDZ-binding motif; TEAD, TEA domain protein; YAP, Yes-associated protein.

Тканевой анализ показал, что уровни lamin-A,C коррелируют со шкалой жесткости ткани, при этом более жесткие ткани, такие как кость, имеют наивысшие уровни lamin-A,C, по сравнению с более мягкими тканями, такими как жир (Figure 2A) [52]. В то время как экспрессия lamin-A,C возрастает в 30 раз в ткани постоянно экспрессирующиеся B-типа ламины варьируют менее чем в три раза. Хотя верно, что изучение культуры ткани скорее всего намекает на возможные механизмы. По крайней мере, в культуре некоторых типов клеток уровни lamin-A,C также затрагивались за счет клеточного натяжения в процессе, регулируемом с помощью чувствительного к механическим воздействиям фосфорилирования (Figure 3B,E) [57]. Изучение MSCs. культивируемых на пластике, показали, что нокдаун lamin-A,C способствует адипогенезу [58], тогда как избыточная экспрессия lamin-A,C способствует остеогенезу [59]. Путем использования PA геля с жесткостью, воспроизводящей или мягкую жировую ткань или жесткий остеоид, lamin-A,C также показали, что механо-чувствительный усилитель эластичности матрикса управляет спецификацией клонов in vitro (Figure 2A) [52].
Как при переключении изоформ myosin-II при гематопоэзе, состав ядерной ламины не только меняется с дифференцировкой в клоны крови, но при нокдауне и избыточной экспрессии, что также демонстрирует функциональное влияние [53]. Хотя непосредственная роль механики матрикса в обороте ядерной ламины гематопоэтических клеток остается неизученной, более жесткая ламина усиливает миграцию и - в принципе - выход из костного мозга. Более того, lamin-A,C изменяются меньше, чем B-типа ламины в разных гематопоэтических клонах [53]. Поскольку матрикс костного мозга также может быть слишком мягким, чтобы влиять на lamin-A,C, относительно уникальные факторы костного мозга, скорее всего, регулируют B-типа ламины в этом важном компартменте, который генерирует миллионы новых кровяных клеток в сек. у человека. Взаимодействие между матриксом, цитоскелетом и ядерной механикой во время спецификации гематопоэтических клонов определенно нуждается в дальнейших исследованиях, но имеющиеся данные предоставляют инициальную информацию о том, как адгезия, эластичность матрикса и внешние сдирающие силы могут взаимодействовать с цитоскелетной и ядерной механикой в процессах самообновления стволовых клеток, выбора судьбы и даже миграции.

Mechanical regulation of transcription factors


Понимание того, как механические сигналы передаются в ядро, чтобы активировать программы экспрессии разных генов, происходит медленно. Снование между ядром и цитоплазмой транскрипционных факторов, по-видимому, важная ступень в нескольких механо-чувствительных путях, участвующих в дифференцировке разных типов клеток (Figure 3). Напр., передача сигналов SRF (serum response factor), как известно, играет ключевую роль в миогенной дифференцировке в разных мышечных клетках (e.g., [60]) и зависит от RhoA и полимеризации актина благодаря взаимодействию с ко-факторами, включая MRTF (myocardin-related transcription factor) A и B (известен также как MAL). MRTFs A и B соединяются с мономерным G-актином в цитоплазме, но освобождаются от полимеризации актина и переносятся в ядро, чтобы соединиться и активировать SRF [61, 62]. Ограничения, вызываемые матриксом, могут быть достаточными сигналами для транскрипционных факторов, чтобы изменить их ядерно-цитоплазматическую локализацию и тем самым регулировать экспрессию генов. Ограничение контактов между клетками и матриксом, как было установлено, запускают эпидермальные стволовые клетки человека, чтобы инициировать терминальную дифференцировку, т.к. обеспечиваются с помощью регуляции актинового цитоскелета и SRF пути [63]. Компоненты цитоскелета, включая не мышечный myosin-IIA (MYH9), регулируют SRF, также как и жесткость субстрата, также как и уровни lamin-A,C и emerin [52, 57, 63, 64].
Ретиноевая кислота (RA) регулирует развитие, дифференцировку, пролиферацию и апоптоз [65, 66]. Рецепторы ретиноевой кислоты (RAR), RAR-α, RAR-β и RAR-γ, кодируются соотв. генами RARA,RARB и RARG, соединяются с ретиноевыми Х рецепторами в ядре и регулируют транскрипцию многих генов, включая LMNA. Экспрессия Lamin-A,C регулируется с помощью RARs (Figure 3C,G), но ядерно-цитоплазматическое соотношение RARG также увеличивается с увеличением эластичности матрикса и избыточной экспрессии lamin-A,C, тогда как снижается при нокдауне lamin-A,C. В MSCs RAR антагонисты увеличивают уровни lamin-A,C и усиливают шансы остеогенеза на ригидном субстрате, но ни ретиноевая кислота, ни антагонисты не влияют на lamin-A,C в клетках на мягких субстратах [52]. Идея, что только эффекты растворимого фактора зависят от эластичности матрикса, который лежит в основе клеток, подчеркивает необходимость более полной информации о нативной механике любой ниши. Более того, принимая во внимание многие фармакологические варианты агонистов и антагонистов RA, тестирование любого из них д. учитывать влияние матрикса.
YAP (Yes-associated protein) и TAZ (transcriptional coactivator with PDZ-binding motif) ко-активаторы транскрипции являются классической частью пути Hippo, который регулирует рост и развитие органа, но может также играть роль в механотрансдукции [67, 68]. Две киназы MST (mitogen-activated protein kinase kinase kinase 10, известна также как MAP3K10) и LATS (large tumor suppressor kinase) канонически контролируют активность транскрипционных факторов YAP/TAZ [69]. MST фосфорилирует и активирует LATS киназу, а LATS фосфорилирование YAP/TAZ ингибирует её активность и находит транскрипционный фактор в цитоплазме. Если LATS киназа ингибирована, то YAP и TAZ вступают в ядро и соединяются с TEAD (TEA domain) транскрипционными факторами, которые управляют транскрипционной регуляцией пролиферации (Figure 3C,G) [70, 71].
Субклеточная локализация YAP/TAZ зависит от жесткости матрикса и актинового цитоскелета с помощью механизма, отличного от пути Hippo и независимого от MST/LATS, с участием пока неизвестных киназ [72]. Ядерная локализация YAP/TAZ в MSCs увеличивается на жестком матриксе, подобном остеоиду (40 kPa) (Figure 3G), и регулирует активность Rho GTPase и контрактильность актомиозина (Figure 3F). Высокое соотношение ядро:цитоплазма для YAP/TAZ коррелирует с повышением остеогенного потенциала в MSCs в культуре (Figure 3G) [73], хотя тканевое профилирование YAP не обнаруживает четкой тенденции с увеличением жесткости ткани [52]. Накопление в ядре YAP/TAZ, управляемое продолжительной пассивной механической стимуляцией, может всё более ограничивать выбор судьбы клетками MSC в качестве 'механической памяти' [74]. Ингибирование ядерной локализации YAP в hPSCs (human pluripotent stem cells) посредством поддатливых субстратов, которые воспроизводят жесткость головного мозга (0.7 kPa) или с помощью ингибирования полимеризации F-актина, как было установлено, способствует высоко эффективной дифференцировке hPSCs в нейроны, даже в отсутствие растворимых стимулов (Figure 3C) [75].

A next step in dimensionality and greater complexity


In vivo клетки часто окружены др. клетками или матриксом и обычно это 3D окружение обусловливает форму и динамику клеток, ограничивает доступ к растворимым факторам, таким как кислород и влияет на то, как секретируемый матрикс откладывается, помимо прочих эффектов. Учитывая сложности расположения стволовых клеток in vivo, остается затруднительным воспроизвести эти условия in vitro и в точности воспроизвести механические сигналы, которые влияют на выбор судьбы. Среди разработанных новых подходов к культурам клеток является система гидрогеля, которая может воспроизвести 3D паттерн и может быть модифицирована in situ, при этом используется сфокусированный лазер для контроля расположения клетки и для пространственного определения инкорпорации RGDS (Arg-Gly-Asp-Ser) пептидов для закрепления клетки [76]. MSCs , энкапсулированные в такие системы, воспроизводят некоторые признаки хондрогенеза in vivo: клетки ремоделируют матрикс путем подавления и деградации фибронектина, при этом происходит последующая активация гликозамингликанов (GAGs) и типа-II коллагена.
MSCs были также инкапсулированы в базирующийся на гидрогеле матрикс, где жесткость и плотность лиганда может контролироваться вручную [77]. Остеогенез происходит в матриксе с высокой жесткостью (11-30 kPa), тогда как адипогенез происходит на мягком субстрате, это согласуется с находками на подобном 2D гидрогеле. Кроме того, клетки перестраивают свои интегриновые адгезии с количеством связей на клетку, зависящим от отсутствия монотонности эластичности матрикса и это достигает пика при ~20 kPa. Однако, др. находка свидетельствует, что гидрогель с разрываемыми поперечными связями отличается от ковалентно поперечно связанных гидрогелей [78]: MSCs заключенные в не деградируемый, с ковалентно связанной гиалуроновой кислотой (HA). гидрогель с RGD функционализацией способствует адипогенезу, даже на номинально жестком геле. После адаптации к 3D версии микроскопии тракционных сил [79], наблюдалось, что округлые клетки генерируют силы, сходные с наблюдаемыми в клетках с фармакологически ингибированной контрактильностью. Однако, внесение протеолитически расщепляемых поперечных связей делает гель чувствительным к клетками обусловленной деградации, которая позволяет клетками нарушать симметрию, натягивать и распространяться внутри матрикса и подвергаться остеогенезу. Обращение к растворимым факторам и воздействие на отложение секретируемого матрикса остаются непонятными в таких системах. Однако, если симметрия насильственно нарушается использованием тонкого, не способного к деградации HA геля, который откладывается на верхушках MSCs, предварительно культивированных на мягком или жестком геле, клетки, по-видимому, обладают цитоскелетными характеристиками и поляризацией, сходными с клетками, культивируемыми на более жестком геле [80]. Для MSCs, находящихся в контакте с жесткой поверхностью кости и с мягкими гематопоэтическими клетками выше их (Figure 1A), твердость кости будет доминировать в сигналах от ниши и стремится индуцировать остеогенез.
Растворимые факторы являются главными драйверами дифференцировки. Клон-специфические коктейли часто добавляются или даже подмешиваются при изучении эффектов деконструкции субстрата и ECM. Иногда коктейли включают ростовые факторы, такие как transforming growth factor β (TGF-β), которые соединяются с ECM и высвобождаются в зависимости от жесткости матрикса и напряжения в клетке [81]. Глюкокортикоиды, такие как dexamethasone обычно используются in vitro в разных дозах, чтобы повлиять на дифференцировку, но модулирует ли мягкий или жесткий матрикс такие важные транскрипционные факторы, как рецепторы глюкокортикоидов, не было изучено in vitro или in vivo . Независимо от относительного вклада каждого растворимого и 'нерастворимого' фактора и степени, с которой пути объединены в серии или параллели, необходимо детальное исследование современными методами. Определение межклеточной изменчивости по измерениям в одиночных клетках может быть столь же важным для прояснения чувствительности к сигналам из ниш.

Concluding remarks


Although insights into the molecules that contribute to the many types of stem cells and niches have accumulated over the past several decades, measurements of niche mechanics and the forces that can influence stem cells have only emerged within the past 10 years. Bone marrow stem cells that make blood, fat, and bone among other lineages have been the most deeply studied, and considerable evidence from tunable hydrogels demonstrates that matrix elasticity and perhaps viscosity can affect such cell fates. Pathways involve actomyosin contractile forces, which cells use to probe the surrounding matrix, and the nucleoskeletal protein lamin-A, which adjusts nuclear mechanics to the microenvironment and enhances differentiation programs. In these contexts, mechanical regulation of gene expression at least sometimes takes place via mechanosensitive translocation of key transcription factors. Some of these pathways have also been described for cells growing on substrates that are patterned [82], although the physical relationships to niches in tissues are not always clear. 3D hydrogels with controlled properties and patterns are also emerging, but the added complexity always needs to be carefully considered for its effects on cell confinement, permeation of factors, and the relevance to 2D nature of some tissue formation processes (e.g., osteogenesis). The physical properties of intact and fresh tissue clearly need to be studied in greater detail in normal and diseased states to deepen our understanding of stem cell microenvironments. Such information is already foundational to developing and employing optimal cell culture models. Functional studies and characterizations of the epigenetic changes in stem cells in response to mechanical cues from their environment have provided important mechanistic insights into how cells choose their fate. Further measurements of tissues (and proposed culture models) will enable many more types of molecular biology perturbations, super-resolution microscopy analyses of key structures, and detailed evaluation of the cells and their nuclei during differentiation. 'Kinetics reveal mechanism' in terms of the order in which processes occur, and increasing attention to timing will therefore be essential in understanding and controlling the maturation of the many types of pluripotent and multipotent stem cell systems that are rapidly emerging.