Меланин, пигмент, который окрашивает кожу, глаза, волосы, шерсть, перья и чешуйки позвоночных (see Box 1), продуцируется специализированными клетками, наз. меланоцитами. Некоторые животные, такие как птицы, рыбы и рептилии имеют дополнительные клетки, продуцирующие др. пигменты, которые благодаря отражению и рефракции, дают широкое разнообразие цветов, но меланоциты повсеместны у позвоночных. В первых генетических экспериментах на животных Cuenot (1902) использовал скрещивания непигментированных albino мышей, чтобы подтвердить законы Менделя. Идентифицировано почти 200 генов у мышей, которые играют роль в биологии пигментации и многочисленные гены у др. видов, в частности у рыбок данио, которые управляют развитием и клеточной биологией меланоцитов.

Box 1. Melanosomes and melanin production

Melanin is a macromolecule synthesised by melanocytes. The first step in melanin synthesis is catalysed by the enzyme tyrosinase, which converts tyrosine to dihydroxyphenylalanine (DOPA). The lack of this enzyme results in albinism. Melanin in mammals and birds comes in two forms: eumelanin, which is black or dark brown, and phaeomelanin, which is red or yellow. The biosynthetic pathways for the two pigments diverge downstream of DOPA, and the choice of pathway is determined by the signalling activity of the melanocortin receptor MC1R. The biosynthetic intermediates of melanogenesis are toxic, which is perhaps one reason why the synthesis occurs in a specialised organelle, a modified lysosome known as melanosome. Most melanocytes do not retain melanin, but rather the melanin granules are transported along microtubules to the tips of dendrites, long cell protrusions, from where they are transferred to nearby keratinocytes in the skin, hair or feather. The situation in fish is somewhat different: melanocytes only produce eumelanin and the melanin granules are retained by the cell. MC1R activity in fish produces a movement of the melanin granules out along microtubules, which results in a darkening of the fish as camouflage. The reverse movement of melanin into the centre of the fish melanocyte is produced via a different signalling system involving the melanin-concentrating hormone (MCH) receptor.

Меланоциты и их потомки, меланобласты, представляют собой прекрасную модель развития: это единственный тип клеток, который дифференцируется из мультипотентных стволовых клеток, они мигрируют по всему развивающемуся эмбриону и взаимодействуют со своим окружением, чтобы расположиться в специфических местах тела, и они генерируют популяцию стволовых клеток повсюду, где они само-обновляются.

The neural crest and the origins of the melanocyte lineage

Клон меланоцитов происходит из нервного гребня, который возникает в нервной трубке. Эти клетки выделяются из нервной трубки с помощью процесса эпителиально-мезенхимного перехода. Эти клетки мигрируют и образуют многие специализированные структуры и ткани развивающегося эмбриона (Mayor and Theveneau, 2013). Передне-заднее положение выделения клеток нервного гребня в целом предопределяет их судьбу: краниальный, вагусный, крестцовый, туловищный и кардиальный. Нервный гребень района туловища дает помимо прочего меланоциты, нейроны и глию. Установлено, что клетки, которые покидают нервный гребень рано, мигрируют вентрально через переднюю часть склеротома и становятся нейронами и глией, тогда как позднее отделяющиеся клетки следуют дорсо-латеральным путем между эктодермой и сомитами по всей развивающейся коже и становятся меланоцитами (Erickson and Goins, 1995). Клетки, скорее всего, специфицируются перед тем, как покинуть нервный гребень. Было установлено, что некоторые изолированные клетки дают смешанные клоны, состоящие из нейронов, глии и меланоцитов, а др. были предопределены, чтобы давать только один тип клеток: некоторые клетки были предшественниками глии и нейронов, тогда как др. могли продуцировать глию и меланоциты (Henion and Weston, 1997). Более того, Шванновские клетки, которые являются глиальными клетками ПНС, могут дедифференцироваться in vitro в предшественники глии и меланоцитов (Dupin et al., 2003). Подтверждается двойное происхождение меланоцитов, за счет ранней дифференцировки из нервного гребня, т.е. за счет дорсолатеральной миграции, а др. источник Шванновские клетки (глиальные) и предшественники меланобластов с вентрального пути.

Transcriptional regulation of melanocyte identity

Транскрипционный фактор microphthalmia-associated transcription factor (MITF), по-видимому, является основным регулятором качественных особенностей меланоцитов и включен в транскрипционную сеть (Fig. 1), которая контролирует развитие меланоцитов из нервного гребня [rev. Baxter et al. (2010)]. Мыши, лишенные MITF не могут формировать меланоциты (Steingrimsson et al., 2004). Сходным образом, рыбы, лишенные одного из ортологов MITF, mitfa, не имеют меланоцитов, а эктопическая экспрессия mitfa может продуцировать эктопические меланоциты (Lister et al., 1999). Более того, экспрессия MITF в эмбрионах Medaka, происходящих из стволовых клеток, вызывают дифференцировку в меланоциты (Bejar et al., 2003), а экспрессия MITF в клетках NIH3T3 может активировать маркеры меланоцитов (Tachibana et al., 1996). Идентифицированы многочисленные транскрипционные мишени для MITF, включая гены, кодирующие компоненты органелл, специфичных для меланоцитов (меланосомы) и пути синтеза меланина (see Box 1), а также более широко экспрессирующиеся гены, такие как ген жизнеспособности Bcl2 (Cheli et al., 2010). У человека мутации зародышевой линии в MITF могут приводить к синдрому Waardenburg или синдрому Tietz [Online Mendelian Inheritance in Man database (OMIM) entries 193510 and 103500, соотв.], которые характеризуются отсутствием пигментации и глухотой, т.к. меланоциты играют также важную функцию в ухе. Более легкие изменения в транскрипционной активности MITF регулируются с помощью IRF1 и частично ответственны бледность кожи, голубые глаза и веснушки с каштановыми волосами, наблюдаемые в некоторых популяциях Сев. Европы (Praetorius et al., 2013).

Ключевой ступенью во время образования меланоцитов является активация MITF. Исследования экспрессии гена показали, что усиливается активность WNT3A и подавляется активность bone morphogenetic protein 4 (BMP4) во время спецификации меланобластов в нервном гребне перепела и что WNT3A вызывает образование меланобластов в культуре клеток нервного гребня перепела (Jin et al., 2001). Более того, добавление WNT3A в культуру меланоцитов мыши вызывает экспрессию MITF (Takeda et al., 2000). Мутации в любом из двух генов, PAX3 или SOX10 (OMIM entries 606597 and 602229, соотв.), у людей вызывают синдром Waardenburg и уменьшение меланоцитов, как и в случае мутаций в MITF, а мыши, мутантные по любому из генов, также лишены меланоцитов (Tachibana et al., 2003). Оба гена также воздействуют на энтерическую нервную систему из-за дефицита клеток, происходящих из нервного гребня (Tachibana et al., 2003).

Далее было показано, что PAX3 и SOX10 действуют синергично, чтобы активировать транскрипцию MITF (Potterf et al., 2000; Watanabe et al., 2002; Bondurand et al., 2000). Показано, что эти транскрипционные факторы также специфицируют глиальные клетки, , однако, как дифференцируются клоны меланоциты и клоны глиальных клеток? Подтверждено, что два др. транскрипционные факторы, FOXD3 и SOX2, играют жизненно важные роли. FOXD3 экспрессируется в мигрирующих клетках нервного гребня, которые дают глию и нейроны, но не обнаруживаются у позже мигрирующих клеток, предназначенных стать меланоцитами. Нокдаун экспрессии FOXD3 у птиц в культуре нервного гребня или in vivo вызывают увеличение клеток за счет клона меланоцитов, в то время как избыточная экспрессия FOXD3 in vivo супрессирует образование меланоцитов (Kos et al., 2001). Кроме того, кондиционный нокаут Foxd3 у мышей с использованием Wnt1-Cre, чтобы специфически удалить ген из клеток нервного гребня, дает MITF-позитивные клетки, которые располагаются вдоль развивающихся нервов у эмбриона, подтверждая, что приобретшие глиальную судьбу клетки переключаются на клон меланоцитов (Nitzan et al., 2013a). FOXD3 действует точно таким же способом в позднее дифференцирующихся меланобластах у эмбрионов кур, которые обладают клоном Шванновских клеток (Nitzan et al., 2013b). Исследуя механизм такого переключения, Thomas and Erickson (2009) продемонстрировали, что FOXD3, в клетках меланомы мыши или клетках нервного гребня перепела наблюдается репрессия экспрессии MITF даже в присутствии PAX3 и SOX10. Эта репрессия, по-видимому, осуществляется посредством высоко законсервированного мотива в промоторе MITF, специфичного для меланоцитов, который содержит сайты связывания для PAX3 и SOX10. Однако, куриный FOXD3 не соединяется с этим элементом, по крайней мере, in vitro; скорее всего, репрессирующая активность обеспечивается с помощью механизма, который не зависит от связывания ДНК. FOXD3 взаимодействует с PAX3 и предупреждает дальнейшее связывание с и активацию промотора MITF. В самом деле, модифицированный FOXD3 белок содержит домен активации транскрипции скорее, чем репрессорный домен, всё ещё репрессирующий транскрипцию MITF в клетках меланомы. Однако, напротив репрессия у рыбок данио транскрипции mitfa с помощью FOXD3 является непосредственной; имеются сайты связывания FOXD3в промоторе mitfa рыб данио, посредством которых и обеспечивается репрессия, а ДНК-связывающий домен FOXD3 рыб данио необходим для репрессии транскрипции в трансфицированных клетках меланомы мыши или в фибробластах, трансфицированных также и SOX10 (Curran et al., 2010, 2009). Сходные результаты получены, когда SOX2 усиливает свою активность или подвергается нокауту у эмбрионов кур и мышей. SOX2 соединяется с промотором MITF и репрессирует его экспрессию in vitro. В соответствии с этим кондиционная делеция Sox2 в клетках нервного гребня мышей приводит к переключению судьбы с глии на судьбу меланобластов, тогда как избыточная экспрессия SOX2 у эмбрионов кур приводит к потере MITF-позитивных клеток (Adameyko et al., 2012).

Запуск клона меланобластов, следовательно, по-видимому, связан с подавлением FOXD3 и/или SOX2 в общем предшественнике глии и меланоцитов. Как в точности это запускается неясно, хотя histone deacetylase 1, по-видимому, важна для репрессии экспрессии sox10 и foxd3 в клоне меланоцитов у рыб данио (Ignatius et al., 2008; Greenhill et al., 2011). Известно также, что экспрессия FOXD3 в нервном гребне первоначально, по-видимому, запускается с помощью ZIC1 и PAX3 (Plouhinec et al., 2014), но позднее поддерживается с помощью SNAIL2 и SOX9 (Nitzan et al., 2013a). Существует, по-видимому, транскрипционная иерархия, в которой SNAIL2 активирует SOX9, который в свою очередь активирует FOXD3. Т.о., сохраняющаяся экспрессия SNAIL2 у эмбрионов кур приводит к сохранению экспрессии SOX9 и FOXD3, а персистенция SOX9 обеспечивает также непрерывную экспрессию FOXD3, но не SNAIL2. Соответственно, экспрессия доминантной негативной формы или SNAIL2, или SOX9 приводит к подавлению FOXD3 (Nitzan et al., 2013a). Кроме того, эктопическая экспрессия MITF в клетках нервного гребня с приобретенной глиальной судьбой у эмбрионов кур подавляет SNAIL2, SOX9 и FOXD3, подтверждая механизм, с помощью которого как только активируется MITF возникает петля обратной связи, поддерживающая стабильность судьбы меланоцитов, которая запрограммирована. Сходный механизм перекрестной репрессии также действует для SOX2; эктопическая экспрессия MITF, индуцированная с помощью doxycycline у эмбрионов кур, приводит к быстрому подавлению SOX2 и усиливает выбранную судьбу меланобласта, индуцированную с помощью MITF (Adameyko et al., 2012).

Melanoblast development and migration in mouse and chick embryos

Чтобы колонизировать эпидермис и полностью заселить развивающиеся волосяные фолликулы, специфицированные меланобласты д. пролиферировать, чтобы увеличивать свои количества и мигрировать на длительные расстояния. На день эмбриогенеза (E) 10.5 у мышей имеется менее чем 100 меланобластов в области туловища, но на ст. E15.5 они увеличиваются до 20,000 (Luciani et al., 2011). В органотипичных культурах E14.5 мышиные меланобласты пролиферируют и, по-видимому, случайно мигрируют со скоростью порядка 0.5 µm min^-1 (Mort et al., 2010). Неспособность мигрировать или пролиферировать дает непигментированные участки, видимые у людей (Fleischman et al., 1991), многочисленных мутантных мышей (Lamoreux et al., 2010) и у специально разводимых разношерстных домашних животных, таких как лошади и коровы (Hauswirth et al., 2012;Fontanesi et al., 2010).

The dorsolaterally migrating melanoblast population

Предшественники меланобластов отделяются приблизительно на ст. E9 у эмбрионов мыши и начинают экспрессировать специфические маркеры Mitf, Dct и Pmel, и со ст. E10.5 (Baxter and Pavan, 2003; Nakayama et al., 1998; Mackenzie et al., 1997) они начинают мигрировать дорсо-латерально в развивающемся эмбрионе (Fig. 2A). У эмбрионов кур миграция нервного гребня в туловище начинается на ст. Hamburger-Hamilton (HH) 12-13 (Loring and Erickson, 1987). Хотя вентральная миграция начинается немедленно, меланобласты выдерживают паузу в области между сомитами и нервной трубкой, наз. migration staging area (MSA) прежде чем стать на дорсо-латеральный путь, начиная со ст. 20 (Erickson et al., 1992; Weston, 1991; Wehrle-Haller and Weston, 1995). Эту дорсо-латеральная миграцию можно наблюдать у химер между пигментированными и не пигментированными эмбрионов мыши, и у вызванного с помощью ретровируса восстановления tyrosinase-экспрессирующих мозаичных мышей, которые обнаруживают широкие полосы цвета, распространяющиеся дорсо-латерально в шерсти взрослых (Huszar et al., 1991; McLaren and Bowman, 1969; Mintz, 1967). Эти полосы имеют четкое mid-dorsal разделение, указывающее на то, что две стороны эмбриона специфицируются отдельно. Эти паттерны, как полагают, представляют собой клоны мигрирующих меланобластов, возникающие из небольших количеств предшественников, но имеется поразительное количество перемешиваний по осевому уровню между соседними клонами меланобластов, что делает предсказание точного числа предшественников проблематичным (Wilkie et al., 2002).

Хотя и не нужный для инициальной спецификации меланобластов endothelin receptor type B (EDNRB; с G-белком связанный рецептор, экспрессирующийся в меланобластах) и его лиганд endothelin B необходимы для миграции и пролиферации меланобластов в коже между E10.5 и E12.5 (Lee et al., 2003; Shin et al., 1999). Если EDNRB2 (один из двух куриных EDNRB ортологов) неправильно экспрессируется в в ранних клетках нервного гребня кур, то они сдвигают свой путь миграции с вентрального на дорсо-латеральный (Krispin et al., 2010), хотя у мышей, Ednrb экспрессируется в клетках нервного гребня как в дорсальном, так и вентральном путях.

Изменения в экспрессии молекул клеточной адгезии также необходимы для миграции. Напр., популяции премиграторных клеток нервного гребня экспрессируют в зависимых от кальция слипчивых соединениях белок N-cadherin, но экспрессия подавляется после активации SLUG (у кур) или Snail (у мышей) во время эпителиально-мезенхимного перехода (Nieto et al., 1994; Jiang et al., 1998). Более того, на ст. E11.5 у мышей большинство кожных меланобластов являются E- и P-cadherin негативными, но в следующие 48 ч, обнаруживается 200-кратное увеличение экспрессии cadherin так, что большинство меланобластов становится E-cad high/P-cad low, одновременно с их миграцией из дермиса в эпидермис (с E12.5 у мышей, HH22 у кур) (Nishimura et al., 1999). Необходимо отметить, что перемещение из дермиса в эпидермис является активным процессом, но не нуждается в деградации базальной мембраны (Li et al., 2011). На ст. E13.5 большинство меланобластов являются эпидермальными и продолжают мигрировать и пролиферировать зависимым от EDNRB образом. Однако, не все меланобласты пересекают соединение дермис/эпидермис и дермальная популяция также сохраняется. Этот процесс четко регулируется и хотя дермальные меланобласты остаются пролиферирующими, их количество остается неизменным, указывая на постоянные и контролируемые перемещения из дермы в эпидермис (Luciani et al., 2011). Более того, у мышей с мутациями, которые вызывают экспансию популяции ранних меланобластов, количество меланоцитов, достигающих эпидермиса, по-видимому, остается неизменным, тогда как количество меланобластов в дерме увеличивается, в результате возникает тёмная кожа (Van Raamsdonk et al., 2004), подтверждая механизм контроля размера эпидермальной популяции меланобластов.

Рецепторная тирозин киназа KIT и её лиганд (KITL) необходимы для жизнеспособности, миграции и пролиферации эмбриональных меланобластов во время их миграции вдоль дорсо-латерального пути (Yoshida et al., 1996). Мутации в генах мыши, кодирующих эту пару рецептор/лиганд, лежат в основе классических доминантных white spotting (W) и steel (Sl) локусов, могут приводить к отсутствию меланоцитов, а также к др. онтогенетическим эффектам. KITL проявляется в двух формах: секретируемого, растворимого белка и связанного с мембраной белка, обнаруживаемого на поверхности кератиноцитов в развивающемся эпидермисе мыши. У мышей связанный с мембраной лиганд абсолютно необходим для мигрирующих дермальных и эпидермальных меланобластов, регулируя их жизнеспособность и адгезию во внутриэпителиальных нишах (Tabone-Eglinger et al., 2012). Ни одна из форм KITL не нужна для спецификации меланобластов или инициации миграции по дорсо-латеральному пути. Однако, вступлению на дорсо-латеральный путь предшествует временная экспрессия KITL в эпителиальных клетках дерматома (Wehrle-Haller and Weston, 1995). Передача сигналов посредством KIT, как было установлено, облегчает миграцию и жизнеспособность меланобластов посредством независимых механизмов; миграция не нуждается в RAS активности, стоящей ниже KIT, тогда как жизнеспособность нуждается (Wehrle-Haller et al., 2001).

A ventrally migrating population of melanocytes

Как обсуждалось выше, меланоциты и глия могут происходить из общего бипотентного предшественника нервного гребня. Однако, недавние доказательства подтверждают, что субпопуляция меланоцитов взрослых в туловище возникает из клеток предшественников, которые обладают двойным потенциалом, давать Шванновские клетки и меланобласты, и мигрируют по вентро-латеральному пути ниже развивающихся нервных оболочек. Напр., Adameyko et al. (2009) показали, что у эмбрионов кур и мышей происходит потеря MITF/SOX10-позитивных меланобластов из дорсо-латерального пути между E10.5/HH24 и E11.5/HH27, и что эти клетки замещаются второй волной происходящих из нервного гребня MITF/SOX10-позитивных меланобластов, возникающих в непосредственной вблизи к дистальной, вентральной ветви спинального нерва на ст. E12/HH22. Если у кур физически устранить вентро-латеральный путь, то эта поздно дифференцирующаяся популяция теряется, но если устраняется дорсо-латеральный путь, то нет. Было также продемонстрировано, что эта вентрально мигрирующая популяция меланобластов у эмбрионов кур (Nitzan et al., 2013b), в которой происходит значительная пространственная сегрегация; дорсально мигрирующие меланоциты занимают epaxial дермис (который происходит из соматической мезодермы), тогда как вентрально мигрирующие, позднее дифференцирующиеся популяции колонизируют hypaxial дермис (который происходит из латеральной пластинки мезодермы). Происходит ли такое пространственное разделение предшественников меланоцитов у мышей, неизвестно; в самом деле, имеется ли различие между hypaxial и epaxial дермисом у мышей, неизвестно. Adameyko с колл. использовали Plp-CreErt2 (Leone et al., 2003) , чтобы метить клон Schwann cell precursors (SCPs) после инъекции tamoxifen (Adameyko et al., 2009). Они показали, что воздействие tamoxifen на ст. E11 не метит дорсо-латералные меланобласты, а метит клон SCP и что на ст. P11, 65% меланоцитов волосяных фолликулов могут быть отслежены обратно в SCPs. Неясно, не меченные меланоциты волосяных фолликулов также происходят из SCPs, но не эффективно метятся tamoxifen, или они происходят из дорсо-латерально мигрирующих клеток.

Ситуация в голове ещё более сложная и исследования по мечению Dct-lacZ рострально мигрирующих E10.5 меланобластов (Mackenzie et al., 1997) и Pmel17-меченных латерально мигрирующих E9.5 меланобластов (Baxter and Pavan, 2003) подтверждают, что, по-видимому, присутствуют несколько перекрывающихся краниальных популяций меланобластов. Adameyko с колл. продемонстрировали (опять используя Plp-CreERT2) клональные взаимоотношения между SCPs и рано мигрирующими краниальными меланобластами, но также описали поздно мигрирующую популяцию, не связанную с нервами или родственную клонам SCPs (Adameyko et al., 2012). Транскриптомный анализ мышиных меланобластов на ст. E15.5 показал, что они также экспрессируют PLP (Colombo et al., 2012), тогда как Hari с колл. показали, что Plp-CreERT2 активна и в нервах, и меланобластах на эмбриональных стадиях E11.5, E12.5 и E14.5 (Hari et al., 2012). Далее они показали, что Desert hedgehog Cre (Dhh-Cre) (Jaegle et al., 2003), др. предполагаемый маркер SCP, не метит меланобласты или будущие меланоциты у мышей. Более того, трансплантационные исследования Rawles (1940, 1947) and Mayer (1973) подтвердили, что популяции функциональных меланобластов, способные колонизировать трансплантат и ткань хозяина, присутствуют в дермисе на ст. E11 , а также в дермисе и эпидермисе на ст. E12, перекрываясь с промежутком времени, когда согласно Adameyko et al. меланобласты в дорсо-латеральном аспекте оказываются отсутствующими (Adameyko et al., 2009). Т.о., в то время как общий эмбриональный источник меланоцитов и глии и пластичность Шванновских клеток не вызывают сомнения, необходимая дальнейшая работа с использованием альтернативных подходов к Plp-CreERT2, чтобы выяснить временные промежутки и клональные взаимоотношения меланобластов и SCPs в развивающемся мышином эмбрионе.

Cellular and molecular mechanisms of melanoblast migration

Недавние успехи в технике получения изображений позволили наблюдать поведение меланобластов в развивающейся коже, используя живые конфокальные изображения (Mort et al., 2010, 2014). Эти подходы расширили наше понимание поведения меланобластов на уровне одиночных клеток и коллективов клеток и предоставили информацию о регуляции миграции и пролиферации. Эти исследования были сфокусированы на ключевых игроках организации цитоскелета и миграции клеток, таких как RAC1, Fascin1, Lamellipodin и Scar/WAVE комплекс (Li et al., 2011; Law et al., 2013; Ma et al., 2013).

RAC1 основная изоформа RAC млекопитающих, контролирующая сборку актинового цитоскелета, обеспечиваемую с помощью Scar/WAVE и ARP2/3 для управления закладкой (nucleation) актина, и с помощью PAK и LIM киназ, чтобы управлять оборотом актина (Delorme et al., 2007; Insall and Machesky, 2009). Специфичное для меланобластов удаление Rac1 у мышей приводит к дефектам миграции и проблемам с ходом клеточного цикла и цитогенеза, приводя к непигментированным участкам в дорсальной и вентральной позициях (Li et al., 2011). Наблюдение вживую миграции меланобластов у Rac1 мутантов показало, что меланобласты обеспечивают свою миграцию, используя длинные и короткие выпячивания, псевдоподии и короткие ножки, соотв. RAC1 регулирует частоту сборки псевдоподий (Li et al., 2011). Сходным образом, устранение Rac-специфической Rho GTPase GEF Prex1 приводит к фенотипу пятен на животе (Lindsay et al., 2011). Ни Prex1, ни Rac1 мутантные фенотипы не могут быть устранены за счет постоянно активного N-RAS, подтверждая, что пролиферация сама по себе дает фенотипических отклонений (Lindsay et al., 2011; Li et al., 2012). Комплекс Scar/WAVE является эффектором передачи сигналов RAC1 и в согласии с этим исследования показали, что Scar/WAVE комплекс, в ассоциации с lamellipodin (Lpd), регулирует миграцию меланобластов у мышей (Law et al., 2013). Специфичное для меланобластов устранение Fascin1, каркасного белка, участвующего в образовании пучков из актиновых филамент, обнаруживается и в filopodia, и invadopodia (Li et al., 2010a; Schoumacher et al., 2010), и часто обнаруживается в мигрирующих эмбриональных клетках; это также приводит к слабому фенотипу пятнистости на брюшке и к гипопигментации кончика хвоста и конечностей (Ma et al., 2013). У этих мутантов задержка хода клеточного цикла и уменьшение количества меланобластов, также как снижение скорости генерации псевдоподий (а, следовательно, подвижности) приводит к неспособности меланобластов полностью заполнять дорсо-вентральную ось (Ma et al., 2013).

Неожиданно фенотипы специфичных для меланобластов нокаутов этих генов - Rac1, Lpd и Fascin1- относительно умеренные (Li et al., 2011; Law et al., 2013). Это означает, что миграция меланобластов в эпидермис, скорее всего, не очень строгий инвазивный процесс, т.к. он не нуждается абсолютно в этих цитоскелетных факторах и факторах мобильности или в деградации внеклеточного матрикса с помощью metalloproteases (Li et al., 2011; Ma et al., 2013). Необходимы также исследования связи chemokinetic эффекта Kit-лиганда с его нижестоящей активацией RAS/MAPK и AKT, а также клеточной биологии пролиферации и миграции меланобластов посредством регуляции цитоскелета.

Post-migratory behaviour

У мышей колонизация развивающегося эпидермиса меланобластами завершается на ст. E15.5, с помощью этого закладывается первичный паттерн волосяных фолликулов и начинает формироваться вторичный паттерн (Mann, 1962). Со ст. E15.5 меланобласты начинают колонизировать развивающиеся волосяные фолликулы и начинается продукция пигмента (see Box 1) на ст. E16.5 (Hirobe, 1984). Мало известно о молекулярных путях, которые контролируют расположение волосяных фолликулов, но хемокин SDF-1/CXCL12, как было установлено, действует как хемоаттрактант для меланобластов посредством их рецептора CXCR4 (Belmadani et al., 2009), в то время как растворимый KITL, как было установлено, действует как chemokinetic фактор (Jordan and Jackson, 2000). Перемещение в фолликулы ассоциирует с переключением с E-cadherin-high/P-cadherin-low на E-cadherin-negative/P-cadherin-medium-high, чтобы отразить профиль cadherin из окружающих средовых кератиноцитов (Nishimura et al., 1999), подтверждая, что внеклеточные сигналы важны для регуляции экспрессии cadherin меланобластов и что кадгерины играют роль в позиционировании меланобластов в фолликулах. У ранних постнатальных мышей существуют популяции фолликулярных и межфолликулярных меланобластов, но в волосистой коже экспрессия KITL кератиноцитами быстро снижается после рождения и поэтому межфолликулярная популяция меланобластов исчезает за несколько дней после рождения, так что они отсутствуют у взрослых (Hirobe, 1984). У людей межфолликулярная популяция сохраняется и переносит меланин на окружающие кератиноциты, пигментируя тем самым кожу.

Melanocyte development in zebrafish

У рыбок данио меланоциты являются одним из трех типов пигментных клеток - меланоцитов, иридофор и ксантофор (xanthophores) - которые образуют знаменитые полоски у рыбок данио. Меланоциты рыбок данио возникают из небольшого количества бипотентных меланогенных предшественников, которые происходят непосредственно из нервного гребня без промежуточного участия стволовых клеток во время первых трех дней развития и образуют др. популяцию, которая возникает за счет промежуточных MSC (Budi et al., 2011; Dooley et al., 2013; Hultman et al., 2009; Tryon et al., 2011). Существование этих популяций легко доказывается во время формирования эмбрионального паттерна и на взрослой стадии, и с помощью генетических мутаций, некоторые из которых дают нормальные эмбриональные паттерны, но дефектные паттерны у взрослых или vice versa (Parichy, 2003). Первая волна меланоцитов (обозначаемых как эмбриональные меланоциты) возникает непосредственно из нервного гребня и формирует паттерн у рыб данио во время их эмбриональных стадий, давая 4 полоски: дорсальная личиночная полоска, латеральная личиночная полоска, вентральная личиночная полоска и полоска желточного мешка (Fig. 2B). Эти меланоциты перемещаются по пути дорсо-латеральной миграции между сомитами и эпидермисом и вносят вклад в полоски личинок, и также по вентро-медиальному пути, при этом меланобласты перемещаются вдоль нервов и вносят вклад латеральные, вентральные и желточного мешка полоски (Dooley et al., 2013). Поскольку в меланоцитах млекопитающих KIT функционирует в этой первой волне меланоцитов на разных путях, преимущественно способствуя миграции в течение первых двух дней развития посредством своих внеклеточных Ig доменов, что сопровождается передачей сигналов жизнеспособности посредством своих цитоплазматических тирозин киназных доменов (Rawls and Johnson, 2003).

Затем развивается др. набор меланоцитов на более поздней стадии личиночного развития и во время перехода у рыб данио к взрослой форме тела (метаморфоз), чтобы сгенерировать взрослые полоски (Hultman and Johnson, 2010). Важная серия исследований этих metamorphic или происходящих из MSC меланоцитов у эмбрионов и у взрослых осуществлена в лаб. Johnson и включала идентификацию токсичных для меланоцитов малых молекул для избирательного удаления дифференцированных меланоцитов (Hultman et al., 2009; Rawls and Johnson, 2000; Yang et al., 2004; Yang and Johnson, 2006; O'Reilly-Pol and Johnson, 2008). Эти исследования позволили нам установить, что регенерация меланоцитов после удаления у эмбрионов происходит из MSC, образование которых зависит от передачи сигналов ERB и KIT (Hultman et al., 2009; Yang and Johnson, 2006; O'Reilly-Pol and Johnson, 2013). Важно, что эмбрионы, подвергнутые действию ингибитора ERB в первые несколько дней развития, и erbb3 мутанты, с дефектами у взрослых и регенеративных меланоцитов, подтверждают, что MSC популяция, используемая во время регенерации, является той же самой популяцией клеток, которая генерирует меланоциты полосок у взрослых (Budi et al., 2011; Hultman et al., 2009; Hultman and Johnson, 2010). В плавнике взрослых, меланоциты возникают из стволовых клеток, расположенных в основании плавника (Tu and Johnson, 2010).

Принимая во внимание доказательства, подтверждающие существование популяции MSCs у взрослых рыб данио, в лаб. Parichy предпринято успешное исследование по идентификации клеток у взрослых рыб данио, которые экспрессируют маркеры нервного гребня и меланоцитов (Budi et al., 2011). Такие клетки, располагающихся вне гиподермы, экспрессирующие mitfa-GFP трансгенный маркер, зависит от передачи сигналов ERB и непосредственно вносят вклад в паттерн взрослых меланоцитов (Budi et al., 2011). Интересно, что эти mitfa-GFP позитивные клетки ассоциируют с периферическими нервами и ганглиями, включая ганглии дорсальных корешков (DRG), вентральные двигательные корешки волокон нервов боковой линии и нервов, проходящих через миотомы.

Преимуществом системы рыб данио является доступность изображений вживую целого эмбриона. Чтобы идентифицировать MSCs у эмбрионов рыб данио, Dooley с колл. из лаб. Nusslein-Volhard получали изображения живых целых эмбрионов, чтобы продемонстрировать, что небольшие количества меланобластов поддерживают экспрессию mitfa-GFP трансгена на третий день развития, в то время, когда экспрессия mitfa-GFP трансгена обычно снижается в дифференцированных меланоцитах и что эти клетки вносят вклад во взрослые полоски (Dooley et al., 2013). Эти клетки являются круглыми и тесно ассоциированы с DRG. Mitfa-GFP-позитивные клетки также ассоциируют с вентральными спинальными нервами и авт. отмечают их удлиненную форму, подтверждающую, что это Шванновские клетки (Dooley et al., 2013).Однако, необходимо заметить, что активность MITF сама по себе не нужна для становления MSC, поскольку потеря активности MITFa во время эмбриогенеза (с помощью morpholino или mitfa чувствительного к температуре мутантного аллеля) всё ещё позволяет полное восстановление паттерна личиночных и взрослых полосок (Dooley et al., 2013; Johnson et al., 2011). Ассоциированные с DRG клетки являются стационарными, но если восстанавливается активность MITF, то эти клетки могут пролиферировать и давать цепочки меланобластов, путешествующих вдоль периферических нервов и мигрирующих в кожу (Dooley et al., 2013). Dooley с колл. предположили, что DRG являются нишей для MSC и что передача сигналов KIT является критической для рекрутирования и поддержания этих клеток внтри ниши. Эффекты устранения этих MSCs являются долгосрочными, а воздействие ингибитора ERB во время первых нескольких дней развития эмбриона предупреждает будущее развитие меланоцитов взрослых (Budi et al., 2011; Dooley et al., 2013; Hultman et al., 2009). Недавние исследования по отслеживанию клонов и наблюдений вживую лаб. Nusslein-Volhard показали. что iridophores и melanophores возникают из общих ниш на DRG, и следуют вдоль периферических нервов в кожу, меланобласты затем мигрируют в кожу пока не достигнут полос, дифференцируются в меланоциты и драматически увеличиваются в размерах (Singh et al., 2014).

Мало известно о регуляции драматических изменений пигментации, которые происходят во время метаморфоза рыб данио. Учитывая роль тироидного гормона (TH) в метаболизме и росте, в лаб. Parichy высказано предположение, что формирование паттерна пигмента у взрослых может находиться под гормональным контролем (McMenamin et al., 2014). Они установили, что генетические активирующие мутации в thyroid stimulating hormone receptor(tshr) приводят к потере меланоцитов и к увеличению желтых xanthophores, тогда как целенаправленное генетическое устранение thyroid, или генетические мутации потери функции в tshr, приводят к увеличению меланоцитов и потере xanthophores. Очевидно, что устранение TH у взрослых рыб со сформированными полосками приводит к увеличению количества меланоцитов, указывая, что TH играет активную роль в репрессии гомеостатического количества меланоцитов. Это может иметь отношение к увеличению риска меланом (Shah et al., 2006).

Mammalian MSCs

Доказательства от многих видов подтверждают наличие резервуара MSCs, который может использоваться при необходимости восстановления пигментации кожи и/или волос (Fig. 3). Идентификация и потенциальные манипуляции с MSCs могут привносить терапевтические количества при нарушениях пигментации, ранениях и меланомах.

Melanocyte reservoirs in the skin and hair

Концепция резервуара недифференцированных меланоцитов, которые активируются, чтобы восполнить исчезнувшие меланоциты, возникла в результате наблюдений пациентов с витилиго (Nishimura, 2011). Vitiligo - это состояние, которое характеризуется потерей меланоцитов и соотв. пигментации в коже и волосах. При vitiligo, узко-полосная UVB терапия может стимулировать восстановление пигментации, давая крошечные островки пигментации, которые в конечном итоге соединяются, чтобы сформировать участки униформной пигментации (Fig. 3A). эти островки имеют волосяной фолликул в своем центре, показывая, что меланоциты из фолликула являются источником новых меланоцитов кожи. В самом деле, ранние исследования (Nishimura, 2011; Staricco, 1959, 1963) идентифицировали популяцию клеток в наружной оболочке корня (root sheath) в нижней постоянной части фолликула волоса, которая лишена меланина (т.e. amelanotic) и которая активируется после УФЛ облучения или ранений эпидермиса и, следовательно, действует как резервуар для кожных меланоцитов (Cui et al., 1991). В то время как появились доказательства резервуара меланоцитов в волосяных фолликулах человека, сходные резервуары обнаружены и у мышей. KIT необходим для жизнеспособности меланоцитов, так что воздействие anti-KIT антителами приводило к поседению волос за счет ингибирования пролиферации и дифференцировки меланоцитов (Botchkareva et al., 2001). Последующие волоски, однако, оказывались пигментированными, указывая, что KIT-независимая популяция предшественников располагается в волосяных фолликулах (Botchkareva et al., 2001). Важная находка сделана Nishimura с колл., которые идентифицировали эту KIT-независимую популяцию как MSCs (Nishimura et al., 2002).

Недавние исследования показали, что во время развития и как только в волосяном фолликуле некоторые меланобласты дифференцируются, пигментируя волосы первого волосяного цикла, тогда как др. остаются ассоциированными с областью выпячивания, то стволовые клетки волоса, редуцируют свою экспрессию Mitf и становятся молчащими MSCs до тех пор, пока не будут активированы в следующем волосяном цикле (Nishimura, 2011). Эти молчащие MSCs располагаются в самой низкой постоянной порции волосяного фолликула недифференцированными, медленно делящимися меланобластами (Fig. 3A), маркированные экспрессией трансгена aDct:lacZ, и обеспечивают волосяной матрикс амплифицирующимися и дифференцирующимися меланоцитами для этой волосяной единицы. Отсутствуют уникальные маркеры для этих MSCs, но они имеют характерную клеточную форму и расположение внутри волосяного фолликула, медленно пролиферируют и имеют низкие уровни экспрессии KIT и MITF (Nishimura et al., 2002; Ueno et al., 2014). Анализ транскриптома подтвердил, что эти клетки имеют очень низкую скорость транскрипции и находятся в покоящемся состоянии, только будучи стимулированными инициируют экспрессию генов и клеточную активность в начале стадии роста волосяного фолликула (anagen) (Osawa et al., 2005; Freter et al., 2010).

Экспериментальные доказательства показывают, что MSCs мышей могут функционировать сходным образом, что и бес пигментная популяция в нижней постоянной порции волосяного фолликула человека. В отличие от кожи человека волосистая часть кожи мыши не содержит меланоцитов и не экспрессирует Kitl. Однако, эктопическая экспрессия трансгена Kitl кератиноцитами позволяет выживать меланоцитам в коже мышей, предоставляя возможность генерировать мышам меланоциты в волосах и коже (Kunisada et al., 1998), как у людей. Воздействие на новорожденных мышат KIT-блокирующими антителами избирательно элиминирует KIT-позитивные дифференцирующиеся меланоциты, не затрагивая MSCs. Поэтому в следующей anagen стадии волосяного фолликула MSCs активируются и генерируют дифференцированные, временно амплифицирующиеся дочерние клетки. Эти меланоциты пигментируют волосы и у трансгенных мышей экспрессируют KITL в коже, они способны мигрировать, выживать и пигментировать кожу. Важно, что сходная возобновленная пигментация у пациентов с vitiligo образует островки меланоцитов, повторно заселяющих кожу из волосяных фолликулов, является экспериментальным доказательством того, что MSCs фолликулов у мышей могут представлять собой резервуар меланоцитов для волос и кожи (Nishimura et al., 2002).

Информация о путях, которые управляют MSCs, была получена также в исследованиях видимой седой пигментации волос, ассоциированной с дефектными MSCs. Сюда входят фенотипические отклонения, возникающие вследствие пертурбаций BRAF и CRAF киназ, которые регулируют вступление в клеточный цикл (Valluet et al., 2012), BCL2, который контролирует жизнеспособность (Nishimura et al., 2005; Mak et al., 2006), и SOX10, который необходим для поддержания внутри выпячивания (bulge) и для восполнения дифференцировавшихся меланоцитов в луковице (Harris et al., 2013). Передача сигналов Notch также важна для поддержания меланобластов и MSCs, как во время развития, так и у взрослых (Moriyama et al., 2006; Schouwey et al., 2007; Kumano et al., 2008; Aubin-Houzelstein et al., 2008). Экспрессия Notch1 достаточна, чтобы превратить пигментированные зрелые первичные меланоциты человека в мультипотентные подобные нервному гребню стволовые клетки, подчеркивая тем самым важность передачи сигналов Notch в программировании меланоцитов (Zabierowski et al., 2011).

Как только в фолликулярной нише временно амплифицирующееся потомство MSCs сможет колонизировать соседние пустые ниши и стать MSCs для новой волосковой единицы, или они могут вернуться обратно к покоящемуся состоянию MSC вследствие избирательного устранения пула стволовых клеток, напр., с помощью радиации или генотоксичных лекарств (Nishimura et al., 2002; Ueno et al., 2014). В нише, TGFβ играет критическую роль в регуляции перехода MSCs в покоящееся состояние во время цикла волоса, действуя путем ингибирования экспрессии гена дифференцировки (пигментации) и путем инициации BCL2-зависимого ареста клеточного цикла (Nishimura et al., 2010). В регионе выпячивания MSCs интимно взаимодействуют с hair follicle stem cells (HFSCs), которые закреплены с помощью коллагена XVII и образуют функциональную нишу для MSC (Fig. 3A). Две популяцуии стволовых клеток координируют рост волоса с пигментацией посредством перекрестного взаимодействия передачи сигналов TGFβ и WNT (Tanimura et al., 2011; Rabbani et al., 2011). Недавно также было показано, что транскрипционный фактор NFIB действует в качестве координатора этого перекрёстного общения; т.к. ингибирование endothelin 2 с помощью NFIB в HFSCs предупреждает усиление пролиферации и преждевременную дифференцировку в MSCs (Chang et al., 2013).

Хотя большая часть нашего понимания MSCs исходит от MSCs, ассоциированных с волосяными фолликулами, выявлены два дополнительных источника меланоцитов, которые важны для идентификации MSCs в коже. В лаб. Herlyn разработана трехмерная реконструкция, моделирующая кожу крайней плоти человека, которая лишена волосяных фолликулов, и было установлено, что когда дермальные стволовые клетки проникают в дермис, то субпопуляция мигрирует в базальную мембрану эпидермиса и дифференцируется в меланоциты (Li et al., 2010b). Такие дермальные стволовые клетки могут обладать потенциалом замещать вне-фолликулярные эпидермальные меланоциты. Еще один источник меланоцитов выявлен в потовых железах acral ладонно-подошвенной кожи человека и мыши (Fig. 3B); в лаб. Nishimura недавно идентифицировали секреторную низкую постоянную часть потовых желез в качестве новой анатомической ниши для MSCs, которая может снабжать эпидермис дифференцированными меланоцитами (Okamoto et al., 2014). Важно, что эти ниши могут также поддерживать клетки меланомы в незрелом состоянии, т.о., это объясняет характерный dermoscopic 'рисунок параллельных гребней', формируемый acral клетками меланомы (Okamoto et al., 2014) (Fig. 3B).

MSC depletion in aging, disease and wounding

Несмотря на их потенциал к возобновлению, MSCs являются ограниченной популяцией. Постепенное уменьшение количества фолликулярных MSCs во время физиологического старения приводит к поседению волос у людей и мышей (Nishimura et al., 2005). MSCs у рыб данио также обладают потенциалом повторного возобновления после устранения и хотя рыбки данио 'не седеют', эти MSCs могут в конечном счете истощаться, приводя к потере гиподермальных полос меланоцитов (Budi et al., 2011).

Хотя мало известно об истощении MSC у рыб данио или кур, работа Nishimura и колл. демонстрирует, что физиологическое истощение MSCs в нише сопровождается клеточной дифференцировкой (Nishimura et al., 2005). У старых мышей и людей эктопически пигментированные (дифференцированные) меланоциты (EPM) становятся видимы в регионе bulge наружного root sheathи ассоциируют с потерей MSCs (Nishimura et al., 2005). Истощение MSC также наблюдается при поседении волос, вызванном повреждениями ДНК, за счет воздействия рентгеновских луче или химиотерапевтических препаратов, но реакция отлична от пути повреждения ДНК, который запускает апоптоз или старение др. популяций стволовых клеток (Inomata et al., 2009). Интересно, что этот путь повреждения ДНК не зависим от p53 , а вместо этого базируется на Ataxia-telangiectasia mutated (ATM) MSC 'stemness checkpoint' (Inomata et al., 2009). Появление EPMs, сопровождаемое повреждениями ДНК, подтверждает, что EPM, наблюдаемые у стареющих индивидов вызываются накоплением повреждений ДНК и подтверждают идею, что одной из главных причин истощения стволовых клеток является накопление повреждений ДНК после определенного периода времени.

О преждевременной седине? Фактически индивиды с мутациями пути репарации повреждений ДНК, такими как при синдроме преждевременного поседения, Werner's синдроме (вызываемого мутацией в ReqQ helicase WRN) или Ataxia-telangiectasia (вызываемым мутацией в ATM), обнаруживают преждевременное поседение волос (see Box 2), указывающее на то, что реакция на повреждения ДНК важна для поддержания обновления стволовых клеток. Преждевременно поседевшие волосы без признаков старения в др. ситемах, обнаруживаются у пациентов, несущих мутации MITF и у мышей с мутациями Mitf^vitiligo. Эти примеры генетики человека и мыши показывают, что несмотря на присутствие экспрессии на низком уровне в MSC, MITF является важным для поддержания пула стволовых клеток. Можно предположить, что это может быть связано с реакциями на повреждения ДНК, поскольку EPMs обнаруживаются после повреждений ДНК, вызванных продолжительной экспрессией меланогенных генов, регулируемых MITF (Inomata et al., 2009), и поскольку MITF непосредственно регулирует гены репарации повреждений ДНК в меланоме (Giuliano et al., 2010; Strub et al., 2011). Было бы интересно определить, способны ли EPMs выполнять роль в предупреждении меланомы путем удаления поврежденных стволовых клеток.

Box 2. Premature greying syndromes

Hair pigmentation is one of the most striking phenotypes in humans. Most humans begin to show grey hair at about 35 years of age, but some people develop grey hair prematurely - before 20 years in Europeans, 25 years in Asians and 30 years in Africans (McDonough and Schwartz, 2012;Pandhi and Khanna, 2013). The aetiology of premature hair greying is not always known, but it can be symptomatic of underlying autoimmune disorders such as vitiligo, or endocrine disorders such as hypothyroidism (McDonough and Schwartz, 2012; Pandhi and Khanna, 2013). Genetic conditions affecting melanocyte biology, including Waardenburg Type II syndrome and Tietz syndrome (caused by mutations in MITF and SOX10), are also characterised in part by premature hair greying and, as with physiological hair greying, the greying is associated with a loss of melanocytes (Tassabehji et al., 1995). Premature hair greying also features in segmental progeroid syndromes, rare genetic syndromes of accelerated aging of multiple organs and tissues, including dyskeratosis congenital (which is caused by mutations in TERT), Hutchinson-Gilford progeria syndrome (which involves mutations in Lamin A/C) or syndromes caused by defective DNA repair, such as Werner syndrome, Cockayne syndrome or xeroderma pigmentosum (Sahin and Depinho, 2010). Environmental factors, such as UV light (Trueb, 2006), smoking (Mosley and Gibbs, 1996) and oxidative stress (Shi et al., 2014; Wood et al., 2009;Kamenisch and Berneburg, 2009) might also contribute to premature hair greying, possibly through an increase in intracellular reactive oxygen species. Nutritional deficiencies in trace elements (Fatemi Naieni et al., 2012), including vitamin D3 (Bhat et al., 2013), vitamin B12 (such as in pernicious anaemia) and copper (such as in Menkes disease) can also lead to hair greying. These conditions are thought to reflect deficiencies in the pigmentation pathway rather than loss of melanocytes, such that colour can be restored with nutritional supplementation (Heath and Sidbury, 2006).

MSCs обладают также потенциалом покидать нишу. Недавние эксперименты показали, что MSCs сами скорее, чем пролиферирующие дочерние клетки мигрируют из ниши волосяного фолликула с помощью MC1R-зависимого процесса, чтобы предоставить источник меланоцитов в коже мыши во время репарации ран или после облучения УФЛ (Chou et al., 2013). В контексте заживления ран, миграция MSCs из ниши может быть столь радикальной, что она опустошает нишу волосяного фолликула (Chou et al., 2013). Однако, вызванные ранением эпидермальные меланоциты - те, что, по-видимому, способны продуцировать пигмент в коже - могут быть рекрутированы во вновь образуемые волосяные фолликулы, чтобы занять их место в качестве их MSCs (Chou et al., 2013). Раны могут быть также ассоциированы с гиперпигментацией, это может быть связано с тем, что процесс заживления ран продуцирует хемокины, которые привлекают меланоциты (Chou et al., 2013), или он выполняет не каноническую функцию для меланоцитов во время заживления ран. У рыбок данио ранения вызывают гиперпигментацию за счет рекрутирования меланобластов и меланоцитов к месту ранения и это зависит от активности макрофагов и нейтрофилов в ране (Levesque et al., 2013). У млекопитающих коммуникации между макрофагами и меланоцитами в ответ на УФЛ облучение (Zaidi et al., 2011), вместе с существованием похожих на макрофаги меланоцитов, располагающихся около сосудов (Zhang et al., 2012, 2013) и реакцией на воспаление (Bald et al., 2014), предоставляют дополнительные доказательства, что меланоциты могут обладать потенциалом окрашивать кожу и волосы.

The melanocyte lineage in melanoma

Одной из наиболее смертельных и метастазирующих форм рака является меланома - рак меланоцитов. Ключ к терапии меланомы получен благодаря пониманию развития меланоцитов. В самом деле, обнаруживается растущее количество примеров, показывающих корреляции между генами, которые регулируют развитие нервного гребня и меланоцитов и теми, что вносят вклад в меланому (Shakhova, 2014; White and Zon, 2008). Понимание онтогенеза и биологии меланоцитов - их развитие из стволовых клеток и клеток предшественников, их пролиферация, миграция, дифференцировка, регенерация и гибель, и их взаимодействия со своим окружением - могут быть высоко информативными для создания новых терапевтических подходов к нарушениям пигментации и меланоме.

Активирующие мутации в BRAF это довольно частые мутации при меланоме, и соматические мутации были также идентифицированы в генах, кодирующих транскрипционный аппарат, который управляет развитием нервного гребня и меланоцитов. Напр., связь между MITF и меланомой впервые была установлена с помощью гистопатологии меланомы человека и большинство MITF молекулярных механизмов и генов мишеней при меланоме были затем установлены (Cheli et al., 2010; Tsao et al., 2012). Экспрессия MITF может приводить к экспрессии генов клеточного цикла, которые и способствуют, и ингибируют прогрессирование меланомы, подразумевая 'модель реостата', согласно которой MITF нарушает экспрессию разных генов мишеней, в зависимости от его экспрессии и уровня активности. Высокие уровни MITF способствуют дифференцировке меланоцитов и аресту клеточного цикла, тогда как низкие уровни активности MITF активируют клеточный цикл, не влияя на экспрессию генов пигментации (Hoek and Goding, 2010). Интересно, что мутации MITF, которые ассоциируют с синдромами Waardenburg и Tietz, отличаются от тех, что обнаруживаются в меланоме: при синдромах Waardenburg и Tietz мутации MITF прежде всего меняют свойства связывания с ДНК MITF и инактивируют его транскрипционную активность, тогда как мутации MITF в меланоме обусловливают измененную транскрипционную активность MITF (Grill et al., 2013; Cronin et al., 2009). Напр., экспрессия MITF, обладающего ассоциированной с меланомой мутацией MITF^4TΔ2B у рыбок данио не ингибирует спецификацию и дифференцировку меланоцитов, но вместо этого делает возможной неограниченную пролиферацию дифференцированных меланоцитов во время развития (Taylor et al., 2011). Было также показано, что у рыбок данио гипоморфная мутация mitfa кооперирует с онкогенным BRAF, чтобы способствовать поверхностному распространению меланомы (Lister et al., 2014). Более того, у лошадей мутация в MITF вызывает преждевременное поседение, связанное с меланомой (Curik et al., 2013; Rosengren Pielberg et al., 2008). MITF экспрессируется в меланоцитах и почках, а мутации зародышевой линии у человека в MITF предрасполагают к меланомам и раку почек. Такая MITF318K мутация приводит к изменению активности MITF и хотя транскрипция некоторых меланогенных генов остается неизменной, одним из следствий мутации является транскрипция hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF1-α ), это создает преимущества для роста раковых клеток (Bertolotto et al., 2011; Ghiorzo et al., 2013; Yokoyama et al., 2011).

Связи между SOX10 и меланомой были выявлены и установлено, что SOX10 может быть эффективной мишенью для меланомы и гигантских врожденных родимых пятен, которые является кожными повреждениями, содержащими доброкачественные меланоциты, которые иногда могут развиваться в меланому. Sommer с колл. отметили сходные гистопатологические признаки у детей с гигантскими врожденными родимыми пятнами и у мышей, которые экспрессируют активированный N-RAS в меланоцитах: гнезда пигментных клеток в родимых пятнах находятся в дермисе, не вовлекая эпидермис и в невусах человека и мыши меланоциты экспрессируют Sox10, который контролирует меланоциты (Shakhova et al., 2012). Потеря меланомного опухолевого супрессора INK4A (CDKN2A - HUGO Gene Nomenclature Committee) приводит к быстрому образованию меланомы у мышей с активированным N-RAS, и экспериментально было показано, что потеря одного аллеля Sox10 достаточна, чтобы противодействовать гиперпигментации и меланоме с активированным N-RAS (Shakhova et al., 2012). Сходные находки в лаб. Pavan показали, что гаплонедостаточность SOX10 предупреждает образование меланом у Grm1-трансгенных мышей, моделирующих меланомы (Cronin et al., 2013). Soengas с колл. идентифицировали RAB7 в качестве нового регулятора прогрессирования меланомы и показали, что это специфически закреплено в клоне меланомы с помощью транскрипционных факторов SOX10 и MYC (Alonso-Curbelo et al., 2014).

Зависимость меланомы и родимых пятен от факторов развития меланоцитов может быть признаком важным для клиники. Гаплонедостаточность по Sox10 у мышей может приводить к регрессии опухоли в уже развившемся родимом пятне, а у рыбок данио выключение активности MITF в возникшей меланоме приводит к быстрой регрессии опухоли (Lister et al., 2014; Shakhova et al., 2012). Более того, недавний геномный анализ меланом человека выявил, что MITF и программа, специфичная для клона меланоцитов являются особенно важными для меланом, резистентных к лекарствам, подтвердил, что MITF участвует в механизмах возникновения резистентности к лекарствам (Johannessen et al., 2013).

Conclusions

In recent years, great progress has been made in understanding the molecular events that lead a neural crest cell to become a melanocyte, how these melanocytes are maintained during homeostasis, and how melanocytes respond to their environment. The interplay between transcription factors resulting in expression of the 'master regulator' MITF is being explored, and some knowledge exists of the roles played by SOX10, PAX3, FOXD3, SOX2, SOX9, ZIC3 and SNAIL2. There appear to be mechanistic differences between, for example, chick and zebrafish, and it remains to be seen whether these are real species-dependent features or whether they simply reflect differences in experimental approaches. Some of the extrinsic factors that determine or guide melanocyte differentiation, such as WNT3A, KIT-ligand and EDN3 (the ligand of EDNRB), have also been identified but there might well be more to find. In particular, thyroid-stimulating hormone has been shown to participate in zebrafish pigment cell development but has not, as yet, been directly implicated in melanocyte development in other vertebrates.

The recent findings that melanocytes can arise from neural crest cells on a ventral migratory pathway, which can be identified as Schwann cell progenitors by their gene expression, are provocative. Certainly, melanocytes in zebrafish can arise from precursors migrating along nerves, and in chick, a dual origin, depending on the mesodermal source of the dermis, has been demonstrated. Establishing the degree to which these novel progenitors contribute to functional melanocytes in mice probably needs the development of better lineage-restricted Cre-driver mice.

The biology of MSCs in various species has also been well examined recently. In mice, much of the work has focussed on the readily identifiable stem cells present in the hair follicle and, latterly, those in the sweat glands. It is likely, however, that there are also stem cells in the interfollicular epidermis that remain to be found. Any roles for these stem cells in melanoma formation and/or in vitiligo might point the way to future therapies for these diseases. Overall, understanding the ontogeny and biology of melanocytes will undoubtedly be highly informative for developing new therapeutic approaches to pigmentation disorders and melanoma.

The melanocyte lineage in development and disease Richard L. Mort, Ian J. Jackson, E. Elizabeth Patton Development 2015 142: 620-632; doi: 10.1242/dev.106567

The melanocyte lineage in development and disease
Richard L. Mort, Ian J. Jackson, E. Elizabeth Patton
Development 2015 142: 620-632; doi: 10.1242/dev.106567