Figure 1
Key Figure: Proposed Location-Specific Functions of Mature miRNAs
View Large Image | Download PowerPoint Slide
miRNA: A Moving Target
У животных большинство генов миРНК транскрибируется с помощью RNA polymerase II в ядре (rev. [1]). первичный миРНК транскрипт подвергается преобразованию с помощью Drosha в ядре и становится одним или несколькими предшественниками (pre-miRNAs), которые обладают шпилечной структурой с в 2-nt довеском на 3' конце. Структура довеска распознается с помощью Exportin 5 для экспорта в цитоплазму, где pre-miRNAs подвергаются преобразованию с помощью Dicer, чтобы стать примерно в 22-nt дуплексом. Дуплекс затем загружается на одного из членов семейства AGO (напр., AGO1-4 у человека), который избирательно сохраняет одну нить в качестве зрелой миРНК. Полученные данные показывают, что зрелые миРНК затем располагаются в субклеточном компартменте в цитоплазме и, неожиданно, в ядре (Figure 1, Key Figure).
Figure 1.
Key Figure: Proposed Location-Specific Functions of Mature miRNAs
Чтобы осуществить замалчивание гена миРНК нуждаются AGOs и др. факторах замалчивания, чтобы сформировать разного размера miRNA-induced silencing complexes (miRISC), размером от приблизительно 100 kDa до 3 MDa [2-4]. В зависимости от степени комплементраности последовательности между миРНК и их РНК мишенями, а также от белкового состава miRISCs, исходы связывания миРНК являются разными. Точная комплементраность между миРНК и РНК мишенями позволяет AGO2 (единственный AGO обладающий режущей (slicer) активностью) разрезать РНК мишени. Напротив, почти все животные миРНК идентифицируют РНК мишени с точной комплементарностью т.наз. 'seed последовательности' (2nd-7th нуклеотиды), где рекрутирование AGO-связывающего белка GW182 формирует канонический miRISC комплекс, чтобы репрессировать трансляцию и/или ускорить деаденилирование и деградацию мРНК.
The Possible Roles of P-bodies in miRNA Silencing
Принимая во внимание, что AGO необходим для функционирования miRISCs, его локализация была использована в качестве метки (proxy) для идентификации мест действия миРНК ([5, 6]; rev. [7]). Исследования с помощью флюоресцентной микроскопии показали, что члены AGO располагаются преимущественно в цитоплазматических тельцах, известных как P-bodies (PBs) [8], которые обогащены факторами распада РНК, включая деаденилазы. Помимо AGO, PBs также обогащены GW182, который соединяет AGO белки с деаденилазами. Важно, что миРНК и их мишени рекрутируются на PBs [5]. Такое расположение подтверждает, что PBs являются основным местом для управляемого с помощью миРНК деаденилирования и последующего распада мРНК мишеней. Однако, количественный анализ цитоплазматической локализации AGO2 показывает, что даже при концентрации более высокой, чем в 10 раз в PBs, чем в соседнем цитоплазматическом пространстве, менее 1% цитоплазматического AGO2 локализуется в PBs [9]. Более того, клетки, истощенные по микроскопически видимым PBs обнаруживают нормальную miRNA-обусловленную репрессию транскрипции и деградацию мРНК [7, 10]. Хотя PBs могут быть местом распада мишеней миРНК, эти данные указывают на то, что основное действие miRNAs происходит где-то в цитоплазме, скорее всего, в субмикроскопических комплексах.
PBs, как полагают, также являются местом хранения мРНК, подвергшихся действию миРНК [11]. Напр., субпопуляция мРНК CAT-1 репрессируемая с помощью miR-122, располагается в PBs, но после аминокислотного голодания, эти мРНК меняют локализацию из PBs и возобновляется транскрипция этого транскрипта [11]. Принимая во внимание, что такая вызванная голоданием трансляция происходит даже после воздействия ингибитора транскрипции, поэтому возможно, что прежде репрессированные CAT-1 мРНК меняют локализацию на полисомы для трансляции. Возможный источник этих репрессированных мРНК - это PBs. Фотокинетические эксперименты далее показали, что субпопуляция мРНК, иммобилизованная в PBs после аминокислотного голодания, высвобождается с помощью стресса [12]. Однако, диллема этой модели заключается в том, что ни poly(A)+ мРНК, ни poly(A)-связывающий белок не обнаруживаются в PBs [8, 12]; хотя трудно предположить, что эти локализованные в PB мРНК после воздействия миРНК всё ещё имеют poly(A) хвосты, которые необходимы для эффективной трансляции. Роль PBs в качестве места хранения мРНК для будущей трансляции впервые была продемонстрирована в исследованиях на дрожжах с использованием двух генов репортеров [13]. Однако, недавние геномные исследования на дрожжах показали, что такое поведение ограничено субпопуляцией генов и что мРНК переключение с трансляционного молчания на активную трансляцию также обнаруживает тенденцию к строгим ассоциациям с poly(A)-связывающим белком и имеют длинные poly(A) хвосты [14]. Следовательно, любой из этих транскриптов в PBs д. быть аденилирован с помощью цитоплазматической poly(A) полимеразы перед трансляцией или наблюдаемой трансляцией, вызванной голоданием, и обусловлено это в основном перемещением цитозольных расположенных не на PB, транскриптов на полисомы.
Потенциальным ключом к функции AGO в PBs может быть его динамическое поведение: AGO обладает медленной кинетикой обмена между PBs и цитоплазмой, указывая, что большинство AGO остается в PBs после вступления туда [9, 15, 16]. Принимая во внимание, что др. белковые компоненты в PBs могут быстро обмениваться с соседней цитоплазмой, так что медленная кинетика, специфичная для AGO показывает, что этот стержневой белок связывания миРНК каким-то образом закреплен одним или более иммобилизующих компонентов с PBs. Такое прикрепление AGO может быть изменено при физиологической стимуляции или разрушено с помощью экспрессии патологических повторов гена Huntingtin (HTT) при болезни Гентингтона [15, 16], подтверждая, что иммобилизация AGO в PBs является регулируемым процессом. Необходима идентификация иммобилизующих компонентов и выяснение механизма того, как AGOs закрепляются в PBs, это в свою очередь может пролить свет на возможную роль PBs в замалчивании с помощью миРНК.
The Underappreciated Roles of Endomembranes in miRNA Silencing
Должна ли локализация AGO отвечать за все функции miRISCs, поскольку до 99% этого белка располагается в цитоплазме, если не в PBs? Биохимические эксперименты показали, что часть AGO и Dicer совместно фракционируется с эндоплазматическим ретикулумом (ER) и Гольджи (rev. [17]). Фактически, первые антитела для детекции AGO в клетках млекопитающих были получены путем использования внутриклеточных мембран в качестве антигенов [18]. Генетический скрининг у растений и нематод далее идентифицировал потребность в пути синтеза липидов, как компонента замалчивания РНК [19, 20], это согласуетвася с возможной ролью внутренних мембран в замалчивании с помощью миРНК. Будут рассмотрены две фракции мембран: ER мультивезикулярные тельца.
ER: A Possible Site of miRNA-Mediated Translational Repression
Три недавних исследования на клетках человека, растений и мух показали возможные регуляторные роли ER в обеспечиваемой миРНК репрессии [21-23]. В клетках Drosophila S2, образуется класс связанных с полисомами miRISC (P-miRISC) после сывороточного голодания и некоторые из этих P-miRISCs ассоциируют и совместно осаждаются с компонентами ER [23]. В условиях сывороточного голодания, P-miRISC чувствительны к усилению миРНК обусловленной репрессии в 5-10 раз. Такая репрессия происходит только на трансляционном уровне и не затрагивается нокдауном канонического компонента miRISC GW182. В соотв. с этими находками, P-miRISC лишены GW182, а AGO соединяется вместо этого с др. партнером, Loqs-PB. У человека гомолог Loqs-PB, TAR RNA binding protein (TRBP), также обнаруживается в грубом ER (т.e., в ассоциированном с рибосомами ER) [21]; TRBP необходим для загрузки миРНК на AGO и закрепления образующихся miRISCs на мембраны ER [21]. У Arabidopsis, миРНК обусловленная репрессия регулируется с помощью интегрального мембранного белка ALTERED MERISTEM PROGRAM 1 (AMP1) грубого ER. Как и в случае с Drosophila, репрессия обеспечивается только на трансляционном уровне [22]. Принимая во внимание, что AMP1 гомологи были идентифицированы у млекопитающих и нематод, то такая специфичная для трансляции миРНК обусловленная репрессия, скорее всего, законсервирована.
Геномные исследования показали, что с ER-ассоциированные мРНК кодируют как цитоплазматические, так и ядерные белки, помимо белков, связанных с мембранами, подтверждают, что ER является регуляторным центром (hub) для всех типов транскриптов [24]. Принимая во внимание, что плотность рибосом на ассоциированных с ER транскриптах вдвое выше, чем на транскриптах, связанных цитозольными рибосомами, то такое локальное обогащение рибосомами и miRISCs на грубом ER делает возможной более высокую эффективность, чтобы замерять и замалчивать трансляцию мРНК, которые имеют миРНК-связывающие сайты [21, 22,23, 24]. Одним из способов исследовать механизм того, как миРНК регулируют ER-связанные транскрипты, является использование техники профилирования модифицированных рибосом, чтобы воздействовать только на ER-связанные рибосомы [25], возникает специфический вопрос, вызывают ли P-miRISCs снижение плотности рибосом на мРНК, нацеленных на специфические миРНК. Паттерны расположения рибосом д. иметь значение, будут ли рибосомы делать паузу на определенных сайтах во время инициации или элонгации, или понижаться преждевременно, это возможно объясняет механистически, как миРНК репрессируют трансляцию на ER.
Multivesicular Body-Bound miRNAs Trafficking Inside and Outside of Cells
Multivesicular bodies (MVBs) являются связанными с мембранами компартментами, которые представляют позднюю стадию эндосом и являются ответственными за сортировку молекул в лизосомы на деградацию, или на плазматическую мембрану для секреции или обратно на Golgi/ER для повторного использования. Образование MVB нуждается в комплексе сортировки эндосом для транспорта (ESCRT), а истощение определенных компонентов ESCRT ингибирует миРНК замалчивание. Более того, блокирование пути оборота MVB увеличивает количество миРНК нагруженных AGOs и стимулирует миРНК замалчивание [26, 27]. Итак, эти данные подтверждают, что MVBs действуют как центры для загрузки и рециклинга миРНК.
Регулируемое слияние MVBs с плазматической мембраной приводит к секреции экзосом во внеклеточное пространство. Эти экзосомы заключают в себе избранные miRNAs и компоненты miRISC, включая AGO2 и GW182 [28]. Эти экзосомные AGO2/miRNAs могут модулировать экспрессию генов реципиентных клеток в микроокружении рака, между иммунными клетками и между нейрональными синапсами (напр., [29, 30, 31]). Жгучим вопросом остается, как miRISCs и специфические миРНК отсортировываются в экзосомы для секреции. Недавно такая сортировка в экзосомы была найдена скоррелированной обратным образом со степенью ассоциации miRISC с полисомами в условиях высокой клеточной плотности, где рост ограничен, где повышена ассоциация miRISC с полисомами, приводящие к нарушению экспорта миРНК посредством экзосом [32]. Такая секвестрация полисом приводит к повышению уровней внутриклеточной миРНК, но без увеличения миРНК репрессии. Хотя неясно может ли секвестрация быть миРНК специфичной, эти данные подтверждают, что субклеточная локализация miRISCs связаны одна с др. и дифференциально регулируются на базе условий роста.
New AGO Partners and Non-AGO miRNA-Binding Proteins
Хотя AGO соединяется с GW182 и это связывание важно для миРНК замалчивания [33], не все AGOs связаны с GW182. Как было показано ранее для P-miRISC у Drosophila, соединение AGO с Loqs-PB и GW182 является взаимно исключающим [34], подтверждая, что измененный состав miRISCs приводит к разным функциональным последствиям [4, 11, 35, 36]. Напр., AGO, как было установлено, соединяется с прионовым белком PrPC [37]; это белок, который неправильно укладывается и вызывает нейрологические патологии, включая вариант болезни Creutzfeldt-Jakob. PrPC совместно осаждается с компонентами miRISC на эндосомах, включая MVBs [27], а его соединение с AGO способствует образованию или стабильности GW182-содержащего miRISC [37]. Альтернативно, большинство AGO-связанных miRNAs в тканях взрослых существует в виде комплексов низкого мол. веса, которые не ассоциированы с мРНК и GW182 [2]; эти миРНК не используются активно в целенаправленной репрессии, но могут действовать как резервуары миРНК [2]. Однако, эти резервуары низкого мол. веса миРНК могут повторно инкорпорироваться обратно в канонические GW182-содержащие miRISC после физиологической стимуляции (напр., митогенная реакция для молчащих клеток [38] или активация T клеток [2]). Пока неясно, действительно ли эти резервуары миРНК концентрируются в определенных клеточных компартментах.
Др. недавно обнаруженная загадка в том, что присутствие миРНК не влечет неизбежно присутствие AGO. Скорее, чем корреляция с абсолютным количеством присутствия в клетках, потенциал миРНК замалчивания коррелирует со степенью её связывания с AGO [39] , так же как и её ассоциации с GW182 [2]. Корреляция различий д. быть поэтому лишь в небольшой фракции (<10%) миРНК, связанной с AGO [21, 39, 40], и миРНК могут быть связаны с мРНК мишенями независимо от связывания AGO [40]. Интересно, что определенные миРНК могут соединяться непосредственно с белками, такими как Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein E2 (hnRNP E2; miR-328) [41], TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43; miR-1, miR-206) [42], и toll-like receptor TLR7/8 (miR-21, miR29a) [43], или HIV Gag белком, не специфически [44]. Однако, неясно, как AGOs и миРНК могут стабильно присутствовать в клетках один без др., поскольку их стабильности взаимозависимы [45-48]. Физическое присутствие AGOs является критическим для стабильности миРНК [46], при этом зрелые миРНК истощяются в клетках, лишенных AGOs [45]. Альтернативно, незагруженные AGOs деградируют в клетках посредством протеосом или лизосом [47,48]. Поэтому степень и распространенность такого феномена (миРНК, не связанные с AGOs и/или миРНК, связанные с белками иными, чем AGO) остаются неясными. Взаимоотношение AGO-miRNA сделалось еще более сложным после недавних данных по перекрестной иммунопреципитации (CLIP)-RNA seq с использованием 4-х разных антител, показано, что AGO может соединяться с мРНК независимо от миРНК [49, 50]. Такое независимое от миРНК связывание может быть потеряно во время стресса [50]. Результатом этой вновь открытой биологии, стало обнаружение миРНК, свободных от AGO, AGO, свободных от миРНК, GW182-свободных от miRISC, и др. моноклональных форм miRISCs, и это необходимо исследовать более тщательно на клеточном и биохимическом уровнях.
Localization and Assembly of miRISCs Regulated by Protein Modifications
Как эти различные miRISCs собираются и распределяются регулируемым способом? Один из возможных механизмов это регулируемые посредством обратимых пост-трансляционных модификаций комплексы AGO/miRISC [51]. Напр., фосфорилирование по Ser-387 в AGO2 с помощью mitogen-activated protein kinase (MAPK) или Akt3 является важным для его локализации в PBs и способствует miRISC по репрессии трансляции [51, 52]. AGO1-4 всё больше и больше poly(ADP-ribosyl)ated после разных стресс-факторов, когда активности миРНК редуцируются [53, 54]. При некоторых стрессовых условиях изменяющая размеры фракция AGOs и poly(ADP-ribosylation) полимераз меняет на локализацию в цитоплазматических структурах, наз. стрессовыми гранулами [9, 53], подтверждая, что эти структуры предоставляют локальные места для модификации AGO, чтобы редуцировать активности миРНК. Кроме того, др. белковые модификации, включая prolyl 4-hydroxylation [51, 55], ubiquitination [47, 51, 56] и SUMOylation [57], регулируют стабильность AGO, тогда как фосфорилирование по специфическим сайтам нарушает связывание или загрузку миРНК [51, 58, 59]. Учитывая обязательную роль AGOs в миРНК замалчивании, пост-трансляционные модификации AGOs могут глобально изменять активности миРНК в специфическом контексте [51], таком как при гипоксии hypoxia [55, 59] или иммунной стимуляции [2,56]. Однако, избирательная регуляция субнабора миРНК возможна и недавнее сообщение показало, что вызванное гипоксией фосфорилирование AGO2 по Tyr-393 ингибирует созревание pre-miRNAs с длинными петлями, подкласс миРНК, важный для функции супрессии опухолей [59].
Хотя разнообразные белковые модификации AGOs продолжают идентифицироваться, мы всё ещё на ранней стадии понимания того, как вышестоящие сигнальные пути регулируют сборку miRISCs. После активации T клеток, передача сигналов phosphoinositide 3-kinase (PI3K)-Akt-mammalian target of rapamycin (mTOR) способствует превращению резервуаров низкого мол. веса AGO-связанных с миРНК в комплексы с высоким мол. весом, которые включают мРНК мишени и GW182 [2]. В клетках Drosophila S2 инсулин ингибирует образование ассоциированных с мембраной комплексов Ago1/miRNA, но не P-miRISC, тогда как протеин киназа C, химический активатор PMA, ингибирует формирование обоих [23]. Методичное понимание белковых модификаций компонентов miRISC и их вышестоящей передачи сигналов, не только позволит нам понять, как миРНК регуляторная сеть реагирует на внешние стимулы, но и может также открыть новые пути для терапии. Напр., хотя некоторые миРНК могут всё больше и больше экспрессироваться в злокачественных клетках, общие уровни миРНК снижаются у пациентов с опухолями [60]. Следовательно, чтобы изменить ход туморогенеза, обусловленный глобальной потерей миРНК, является одним из возможных терапевтических путей повышения активности оставшихся миРНК в опухолях путем избирательного блокирования специфических модификаций AGO, которые нарушают активности миРНК.
The Unexpected Localizations of miRNAs
Nucleus
Хотя финальная ступень процессинга и загрузка зрелых миРНК на AGO происходит в цитоплазме, локализация зрелых миРНК в ядре открыта давно, напр., 20% miR-21 было обнаружено в ядерных экстрактах, что соответствует приблизительно 500 копиям на клетку [61]. В дальнейшем, miR-29b была обнаружена преимущественно сконцентрированной в ядре с сигналом локализации в hexanucleotide на 3' конце, который достаточен для управления ядерной локализацией неродственной химически синтезированной в 21-nt short interfering RNA (siRNA) [62]. Недавнее геномное исследование показало, что феномен довольно распространен и что большинство миРНК присутствует как в ядре, так и в цитоплазме [63- 67]. Некоторые из этих миРНК, такие как miR-21 и let-7, как было установлено, расщепляют РНК мишени, которые обладают точной комплементарностью последовательности с соотв. миРНК в ядерных экстрактах, указывая тем самым, что эти miRNAs связаны с AGO2 [61, 68]. Соотв., siRNAs могут замалчивать локализованные в ядре РНК, включая 7SK, U6, Metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1 (MALAT1) и Nuclear paraspeckle assembly transcript 1 (NEAT1) [3, 66, 68], подтверждая мнение, что короткие РНК, нагруженные AGO2, могут присутствовать в ядре. Однако, одно предостережение относительно этих экспериментов по нокдауну заключается в том, что они были осуществлены на делящихся клетках, где цитоплазматические факторы могут иметь доступ к ядерным видам во время митозов.
Используя метод независимого биохимического фракционирования, флюоресцентная корреляционная спектроскопия GFP-нагруженных AGO2, стабильно экспрессируемых в клетках человека, показала, что AGO2 существует в виде комплекса в 158 kDa в ядре в противоположность крупному примерно в 3 MDa комплексу в цитоплазме [3]. Этот небольшой ядерный комплекс, как полагают, представляет только AGO2 и короткую РНК [3]. Однако, недавние биохимические данные говорят в пользу присутствия др. белков, участвующих в биогенезе и замалчивающих зрелых миРНК, таких как Dicer, TRBP и GW182 [66]. Всё же в отличие от цитоплазматического аналога, эти ядерные экстракты лишены способности загружать короткие дуплексы РНК на AGO2 [66], указывая, что короткие РНК, загруженные на AGO2, происходят из цитоплазмы [3], где импорт в ядро AGO2 частично обеспечивается с помощью importin 8 [69]. Удержание в ядре загруженных AGO2 зависит от способа связывания миРНК с РНК мишенями, миРНК остаются в ядре более продолжительно, если они связаны с мишенями центрального выпячивания [3]. Некоторые сообщения показали, что некоторые локализованные в ядре миРНК участвуют в замалчивании генов и/или активации промоторов (rev. [67]); однако, больше экспериментов необходимо, чтобы выяснить, действительно ли такие эффекты являются прямыми. Напр., технологии редактирования генов, такие как Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) [70], могут быть использованы для тестирования, действительно ли одиночные точковые мутации потенциальных сайтов связывания миРНК на ДНК могут устранять эпигенетическую регуляцию и действительно ли эффект может быть устранен с помощью миРНК с компенсаторными мутациями.
Nucleolus
Ядрышко является главным субкомпартментом в ядре, который ответственен за биогенез рибосом, контроль клеточного цикла и передачу клеточных сигналов [71]. Используя флюоресцентную in situ гибридизацию miR-206 впервые была идентифицирована в ядрышке миобластов крыс [72]. Кстати, имеется приблизительно 40 миРНК, идентифицированных ассоциированными с ядрышком во многих линиях клеток [73-75]. Сюда входят miR-191, miR-484, miR-193b, miR-93 и miR-574, которые были идентифицированы в изолированных ядрышках с использованием метода Taqman, northern blots и высокопроизводительного секвенироания [75, 76]. Предварительная характеристика показала, что этия миРНК ядрышек имеют некоторые интересные свойства в смысле их транспорта в цитоплазму и ассоциации с AGO.
Обработка с помощью Leptomycin B приводит к истощению цитоплазматической фракции локализованных в ядрышке миРНК (напр., miR-484, miR-21 и miR-31), подтверждая, что эти миРНК действительно переносятся в цитоплазму способом, зависящим от Exportin 1 [75, 76]. Вирусная инфекция или трансфекция экзогенных нуклеиновых кислот в клетку приводит к перераспределению miR-484 из ядрышка в нуклеоплазму и затем в цитоплазму [75]. Действительно ли Exportin 1 участвует в этом перераспределении в ответ на вирусную инфекцию, предстоит протестировать. Очевидно, Exportin 1 ассоциирует с AGO и является ответственным за снование зрелых miR-16 и miR-29b между ядром и цитоплазмой [77]. Поэтому было бы интересно протестировать этот обеспечиваемый Exportin 1 транспорт ядерных или ядрышковых миРНК в зависимости от связывания AGO, напр., используя клетки, нокаутированные по всем AGOs [45]. Интересно сравнить с miR-20a, которая располагается исключительно в цитоплазме, с miR-484 связывающей меньше AGO2, подтвердив, что локализация miR-484 в ядрышке не зависит от AGO2. Остается неясным, действительно ли ядрышковая миРНК может соединяться с др. белками или соединяться непосредственно со своими мишенями без AGO (как было предположено в [40]). Интересно, что фракция подвергшейся сплайсингу IGF2 мРНК, которая, как полагают, связывается с сайтами для miR-206 и 4-х др. локализованных в ядрышке миРНК в 3' untranslated regions (UTR), была также найдена в ядрышке [78]. Последующие эксперименты смогли бы протестировать, действительно ли insulin growth factor 2 (IGF2) или дрю мРНК мишени специфически связываются с помощью AGO2 и/или миРНК.
Mitochondria
Митохондрии это цитоплазматические, связанные с двойной мембраной органеллы, ответственные за продукцию клетками энергии; каждая митохондрия содержит свою собственную кольцевую ДНК, которая кодирует 13 белков, 22 tRNAs, и две rRNAs [79]. Некоторые исследования идентифицировали, неожиданно, широкий диапазон миРНК (до сотен) из митохондрий, выделенных из клеток и/или тканей крыс, мышей и человека [80-87]. Локализованные в митохондриях миРНК в дальнейшем были подтверждены с помощью обработки RNAases , чтобы удалить цитозольные РНК, ассоциированные с наружными митохондриальными мембранами [80, 82-84, 87]. AGO2, но не Dicer и TRBP, обнаружены в изолированных митохондриях [80,85, 87] и что интересно, только AGO2, но не AGO1 и AGO3, были избирательно импортированы в митохондрии [87]. Было подсчитано, что 13% от общих AGO2 располагается в митохондриях недифференцированных миобластных клеток линии C2C12, и что уровень его увеличивается до 33% после дифференцировки [87]. Итак, эти данные подтверждают, что меняющая свой размер фракция AGO2 и миРНК присутствует в митохондриях.
Как было установлено с помощью иммунопреципитации и CLIP, AGO2 ассоциирует с митоходриально кодирующими мРНК мишенями [85, 87], но два сообщения указали на противоположные роли этих миРНК, идентифицированных в митохондриях, в регуляции экспрессии митохондриальных мРНК. Избыточная экспрессия miR-181c в первичных культурах и у модельных мышей приводит к снижению уровня белка митоходриально кодируемой cytochrome c oxidase subunit 1 (COX1), которая содержит высоко законсервированный сайт связывания для 3rd-8th нуклеотидной miR-181c на 3; UTR [85,88]. Хотя miR-181c, как было установлено, репрессирует экспрессию мРНК репортера luciferase, содержащей COX1 3' UTR? которая экспрессируется в цитозоле, исследование не показало четко, что miR-181c репрессирует мРНК COX1 в митохондриях. Альтернативно, miR-1 усиливает трансляцию COX1 и др. митохондиально кодируемой NADH dehydrogenase 1 (ND1) [87], в противоположность канонической репрессивной роли миРНК. Эта активация трансляции чувствительна к митохондриальному ингибитору трансляции chloramphenicol и устраняется в AGO2-нокаутных клетках. После добавления AGO2 к этим нокаутным клеткам, miR-1 репрессирует экспрессию цитозольных miR-1 мРНК мишеней, но но усиливает экспрессию Cyclooxygenase 1 (COX1) и NADH-ubiquinone oxidoreductase chain 1 (ND1). Более существенно, что добавление AGO2, который сливается с нацеленным на митохондри сигнальным пептидом, приводит к увеличению экспрессии COX1 и ND1, но не изменяет экспрессии цитозольных мишеней. Хотя молекулярный механизм трансляционной активации остается неизвестным, митохондрии не содержат GW182 (компонент miRISC , необходимый для миРНК обусловленной репрессии) и нокдаун GW182 не влияет на экспрессию COX1 и ND1. Более того, активация зависит от 5' seed в miR-1 и её 3' концевой последовательности. Было бы интересно исследовать, какой белок партнер, соединяющийся с AGO2, необходим для активации трансляции в митохондриях, и протестировать, действительно ли 3' концевая последовательность может быть переносимым сигналом локализации в митохондриях
.
Concluding Remarks
Future characterization of these varied location-specific miRNA functions will benefit from deciphering the local composition of these individual miRISCs and the types of target they are associated with (see Outstanding Questions). Recent developments in molecular tools, such as the use of promiscuous biotinylation, should allow investigation of the organelle-specific proteomes and transcriptomes associated with miRNAs [25, 89, 90, 91]. Special attention should be paid to the possible distinct functions of individual AGO members at specific organelles (e.g., AGO2 in mitochondria). Conversely, could there be proteins, other than hnRNP E2, TLR7/8, TDP-43, and HIV Gag proteins, associated with functionally active miRNAs independent of AGOs? Such biochemical understandings may shed light on noncanonical roles of miRNAs and miRNA-dependent translational activation as proposed in mitochondria. In vitro biochemical assays for miRNA functions should also be tailored to include nonprotein components, such as the type of lipids within the membranes, or to use highly purified, intact organelles. Although mature miRNA species are known to be the effectors of miRNA silencing, recent studies suggest that such roles could be expanded to pre-miRNAs [92], which originate from the nucleus [1] and could be identified in nucleoli and mitochondria [74, 84]. Given that the miRNA-processing factors Drosha and its partner DiGeorge syndrome chromosomal region 8 (DGCR8) are enriched in the nucleolus [93, 94], it will be of interest to see whether there are specific functions for pre-miRNAs locally made there.
Most importantly, a quantitative view of miRISC composition and miRNA-target interaction should be established to appreciate whether such localized function is of physiological significance. Considerable efforts have established strategies to determine the copy number of AGOs, miRNAs, and their targets required for global miRNA functions [39, 40, 95, 96]. Such numbers will need to be re-evaluated in the context of local concentration within these varied subcompartments. As discussed above, the recent arrival of the gene-editing technique CRISPR opens the possibility to probe defined location-specific miRNA-target interactions. It is now possible to introduce single-point mutations to test whether mammalian miRNAs in the nucleus can act like siRNAs in yeast or Piwi-interacting (pi)RNAs in Drosophila in generating epigenetic chromatin marks [67]. Similarly, these gene-editing technologies can be applied to mitochondrial genomes to examine whether specific miRNA-mitochondrial mRNA target interaction is of physiological significance.
Lastly, it is paramount to delineate the mechanisms of how miRNAs and/or miRISCs are distributed in intracellular locations and exported from cells. The intracellular distribution is likely dependent on cell types; for example, heart muscle cells have at least 5000 mitochondria per cell and mitochondrially localized miRNAs will likely have a larger role there in modulating the expression of proteins responsible for energy production. Other mechanisms in play are protein modifications on miRISC components and localization signals within miRNAs, particularly those at the 3? end, similar to the signal identified for the nuclear miR-29b [62]. Just as a small-molecule drug can be used to target protein-modification enzymes in modulating miRISC distribution, a defined nucleotide motif will be instrumental for designing next-generation siRNAs for location-specific miRNA targets. This new biological knowledge could then be applied in therapies when the location-specific miRNA functions become apparent. However, the key question remains: are these location-specific miRNA functions physiologically relevant?
