Pathways and sites for the major modifications of tubulin in a microtubule. Acetylation is primarily found on K40 of α-tubulins, which is exposed in the lumen of the microtubule. αTAT1 and Mec17 are the major enzymes responsible for acetylation (Ac), and HDAC6 and SIRT2 are the enzymes involved in deacetylation. The C terminus of α-tubulin is a hot spot for modification and various combinations are illustrated. Tubulin tyrosine ligase (TTL) is the enzyme responsible for tyrosination of tubulin dimers, but the enzyme that catalyzes detyrosination remains to be identified. By contrast, multiple enzymes are capable of removing the penultimate glutamate residue to create Δ2-tubulin, including all six cytoplasmic carboxypeptidases (CCP1-6). These same enzymes can also trim the length of polyglutamylated chains; however, only one enzyme has been shown to remove the final iso-peptide linked glutamate (CCP5). Detyrosination is restricted to α-tubulins, but glutamylation and polyglutamylation can also occur on various glutamates in the C-terminal domain of β-tubulins. Multiple related enzymes have been identified that can add the iso-peptide link for initiating polyglutamylation [tubulin tyrosine ligase-like family members (TTLL4, 5, 7)]. Other members of the same family (TTLL1, 6, 11, 13) can add glycine to the same set of residues in the C-terminal domain of tubulins (not shown), but this reaction is seen only in ciliary microtubules. Curiously, the enzyme responsible for extension of polyglycine chains (TTLL10) is not functional in humans, and only monoglycine modifications are seen. Finally, polyamination (PA) is mediated by transglutaminases, particularly transglutaminase 2 (TG2) in the nervous system. One putative modification site for polyamination identified by mass spectrometry is the conserved Q15 of β-tubulins. However, several other sites on both α- and β-tubulin may also be subject to polyamination. Enzyme(s) responsible for removing polyamines have not been confirmed and the degree to which polyamination is reversible in vivo is uncertain.
Microtubule diversity and post-translational modifications
Первой описанной post-translational modification (PTM) тубулина стала РНК независимое ферментативное включение тирозина [1]. Выявлено удивительное количество модификаций тубулина и микротрубочек (MTs) (Table 1), включая совсем недавние, полиаминирование [2]. PTMs тубулина обнаруживаются во всех клетках с MTs [3, 4] и они особенно разнообразны в нейронах [3, 4, 5]. Хотя региональные различия в динамике и стабильности MT важны для всех клеток [6], важность PTMs выходит за пределы динамики MT.
Table 1 Post-translational modifications of tubulin and microtubules
Тубулин может быть модифицирован как растворимый димер или в MT (Table 1), а некоторые PTMs происходят и там и там. Изменчивость C-треминальных доменов α-тубулина представляет собой горячую точку модификаций, тогда как лишь немногие модификации появляются в ассоциации с C-концами β-tubulin (Figure 1). Кроме того, некоторые модификации картируются в др. регионах тубулинового димера. Исследования показали. что MTs модифицируются разными способами, при этом PTMs сосуществуют или концентрируются в разных доменах MTs. В самом деле, предопределение специфических функций для данной модификации in vivo осложняется гетерогенностью модификаций, обнаруживаемых в MT, а также множественными модификациями, которые могут присутствовать на индивидуальных тубулиновых димерах (Figure 2).
Detyrosination and tyrosination of tubulin
Большинство, если не все, α-tubulins содержат терминальный тирозин. Исключение составляет TUBA4A человека с терминальным глутаматом и TUBA8 с терминальным фенилаланином [7]. Устранение тирозина чаще всего затрагивает MTs, скорее, чем тубулиновые димеры [8]. Терминальный тирозин удаляется с помощью неустановленной cytosolic carboxypeptidase (CCP), чтобы открыть глютамат, неожиданно мало известно о регуляции этой активности.
Напротив, tubulin tyrosine ligase (TTL), которая быстро тирозинирует detyrosinated тубулины, высвобождается из MTs и хорошо охарактеризована [3, 4], завершает цикл detyrosination/tyrosination. Структурные исследования показывают, что TTL обнаруживает множественные взаимодействия с α- и β-tubulin в димерах [10]. TTL связывание с димером мешает полимеризации, а избыточная экспрессия TTL ингибирует полимеризацию MT in vivo [11]. Stathmin, белок, взаимодействующий с тубулиновыми димерами и регулирующий полимеризацию MT [12], может также регулировать функцию TTL. TTL и stathmin конкурируют за связывание тубулиновых димеров, из-за частичного перекрывания их сайтов связывания или изменения конформации stathmin-tubulin комплексов; и stathmin ингибирует тирозинирование тубулина [13].
Удаление и добавление тирозина к тубулинам [14, 15, 16] нарушается на участках вдоль MTs аксонов, при этом происходит обогащение detyrosinated тубулинами в проксимальных сегментах аксонов и усиление тирозинирования в ростовом конусе [15,16]. Такое распределение является критическим для развития, как показывают TTL-нулевые мыши, которые погибают в течение 24 ч после рождения из-за респираторных проблем, атаксии и сильно измененной морфологии нейронов [17]. Гибель может быть ассоциирована с изменениями в образовании нейритов, наведении аксонов и усилении передачи сигналов Rac1 [18]. Устранение тирозина ассоциирует с продолжительностью жизни MT, поскольку многие detyrosinated MTs замещаются медленнее, чем tyrosinated MTs in vivo, но MTs, обогащенные detyrosinated тубулином более стабильны не от природы [19]. Обогащение detyrosinated тубулином в стабильных MTs отражает предпочтительное действие carboxypeptidase на MTs, создавая составные MTs с вновь сформированными плюс концами, богатыми tyrosinated тубулином, и старыми доменами, обогащенными detyrosinated тубулином.
Дифференциальные взаимодействия белков с tyrosinated и detyrosinated тубулинами хорошо известны (Figure 3). Реципрокные реакции detyrosination/tyrosination тубулинов помогают определить разные субклеточные компартменты и генерировать поддержку для передачи клеточных сигналов путем регуляции белковых взаимодействий с MTs [20, 21]. Напр., хотя plus-end tracking protein (+TIP) EB1 соединяется с плюс концами MTs независимо от тирозинирования тубулина, CAP-Gly доменовые белки, такие как CLIP170 или P150 Glued, нуждаются как в EB1, так и в tyrosinated тубулинах, чтобы расположиться на плюс конце MT [22]. Тирозинирование MT также влияет на активность MT по обслуживанию белка spastin, который преимущественно расщепляет detyrosinated MTs [23], несмотря на ассоциацию detyrosination с длительно живущими MTs.
Зависимые от detyrosination/tyrosination изменения в динамике и взаимодействиях MT могут возникать в разных типах клеток на разных ст. развития. Напр., detyrosination влияет на взаимодействия MT с промежуточными филаментами [24] и микрофиламентами in vivo [18]. Кроме того, detyrosination связана с дифференцировкой и поляризацией некоторых клеток [25, 26] (Figure 4). В этих исследованиях, subconfluent клетки имеют умеренные уровни detyrosination, которые возрастают по мере слияния и снижаются, как только сливающиеся клетки оказываются поляризованными [25, 26]. Локальная обратимость detyrosination создает тубулины и MTs с определенными свойствами более эффективно, чем белковый синтез и деградация.
Detyrosination и tyrosination тубулина может играть роль в функции белка. Kinesin-13 соединяется предпочтительно с tyrosinated плюс концами и деполимеризирует MTs in vivo и in vitro [27, 28], подтверждая, что detyrosination д. защищать MTs. Кроме того, detyrosination усиливает связывание свободных нуклеотидов kinesin-1 с MTs in vitro c Kd значением 29 nM (deTyr) and 81 nM (Tyr) [29], но физиологическое значение этого наблюдения неясно, поскольку концентрации kinesin в нейронах (500 nM) на порядок величин выше. В культивируемых нейронах некоторые kinesins (напр., kinesin-2 и -3) накапливаются и в аксонах, и в дендритах, тогда как др. (kinesin-1) проникает исключительно в аксоны, создавая возможность, что различия в треках MT могут объяснить дифференциальное целенаправленное воздействие [30]. Повышение уровней detyrosinated MT в нейронах приводит к накоплению kinesin-1 во всех нейритах [30], а с зеленым флюоресцентным белком (GFP)--kinesin-1, преимущественно ассоциирует с detyrosinated MTs и обнаруживает более медленную скорость перемещений [31]. Сходным образом, мутации в регионе, предположительно чувствительном к тирозинированию, превращает kinesin-1 из аксональной формы в мотор для всех нейритов [30]. Однако, последующее исследование оказалось неспособным обнаружить прямую корреляцию между содержанием detyrosinated MT в нейритах и целенаправленным воздействием kinesin-1 [32]. Анализ in vitro взаимодействий моторного белка с модифицированными C-концами тубулина с использованием химерных дрожжевых тубулинов [33] выявил, что detyrosination умеренно снижает kinesin-1 processivity, не затрагивая его скорости или перемещение dynein movement. Напротив, detyrosination увеличивает processivity и скорость kinesin-2, подтверждая, что эффекты тирозинирования на функцию мотора сложные.
Δ2-Tubulin
Δ2-тубулин является дальнейшей модификацией detyrosinated тубулина, при этом предпоследний глутамат также удаляется [5]. Все 6 избирательных CCPs (CCP1 [34], CCP2, CCP3 [35], CCP5 [36], CCP4 и CCP6 [37]) модифицируют α-tubulin C-окончания путем удаления терминальных глютаматов или укорачивая полиглютаминовые цепочки (Table 1). Подобно detyrosination, Δ2-tubulin накапливается в долго живущих MTs и концентрируется в дифференцированных нейронах, также как в центриолях и ресничках [38]. В отличие от detyrosination, Δ2-tubulin является терминальной модификацией, при этом удаление предпоследнего глютамата дает тубулины, которые неспособны tyrosinated [39]. Удаление предпоследнего глютамата затрагивает готовность тубулина к модификациям, таким как тирозинирование и полиглютаминирование [4]. Хотя Δ2-tubulin может репрессировать ≥35% тубулина головного мозга
[38], функциональная роль Δ2-MTs остается плохо изученной.
Polyglutamylation and polyglycylation of tubulin in MTs
Полиглютаминирование встречается часто в нейронах [40], также как и в ресничках и центриолях [41, 42]. Энзимы, содержащие родственный с TTL домен [т.e., TTL-like (TTLL) белки] добавляют аминокислоты к тубулинам посредством Независимой от РНК ферментативной реакции. Разные TTLLs добавляют глютамат или глицин, инициируя боковые цепочки на одном или нескольких глютаматах в C-терминальных доменах α и β-tubulins [3,4, 43, 44]. Некоторые TTLL glutamylases (TTLL4, 5, and 7) добавляют по одному глютамату путем образования γ-сцепленного изопептидного мостка, тогда как др. (TTLL1, 6, 11 и 13) добавляют боковые цепочки глютаматов к γ-сцепленному глютамату посредством стандартной пептидной связи, чтобы сформировать боковые цепочки полиглютамата [3]. Глютаматы могут быть добавлены по-разному к специфическим изотипам тубулинов или к разным местам. Напр., TTLL7 преимущественно модифицирует β-tubulin, тогда как TTLL5 и 6 предпочитают α-tubulin в качестве субстрата [44]. Некоторые TTLLs модифицируют также др. цитоплазматические и ядерные белки [44].
Количество комбинаций polyglutamylation с разной длиной цепочек и модификациями разных глютаматов в C-терминальном домене, также как α и β тубулиновых изотипов, делает затруднительным определение их функции. Одним из общих элементов является адаптор PGs1, необходимый для локализации polyglutamylase комплекса на MTs в ресничках и нейронах [45], а потеря функции PGs1 у ROSA22 мышей значительно редуцирует полиглютаминирование MT [46]. Такие мыши жизнеспособны, но обладают аномальной подвижностью спермиев, изменениями поведения, снижением жира в теле [47] и нарушениями композиции и функции синапсов [46]. Эффекты полиглютаминирования могут зависеть оти клеточного контекста и ассоциированных белков.
Как и при др. PTMs тубулинов полиглютаминирование может изменять взаимодействия белков с MTs. Напр., дифференциально влияет на связывание MAP1 и MAP2 с тубулином [48] и стимулирование spastin-обусловленной разделки MT [49] (Figure 3). Напротив, эффекты полиглютаминирования на моторы MT менее ясны. В одном исследовании сообщалось, что снижение полиглютаминирования тубулина головного мозга изменяет распределение kinesin-3, но не kinesin-1 [46]. О
в др. исследовании сообщалось, что увеличение полиглютаминирования в MT сопровождается ингибированием синаптической активности, коррелирующей с ингибированием kinesin-1, но не подвижностью kinesin-3 [50]. Связь с синаптической активностью подтверждает, что локальные изменения в полиглютаминировании могут служить доставке отобранных грузов [50]. Однако, эти находки контрастируют с исследованиями химерных С-терминальных доменов дрожжевых тубулинов при изучении in vitro подвижности кинезинов и цитоплазматического динеина [33]. Добавление множественных глютаматов к С концу β3-tubulin затрагивает разные kinesins и dynein по-разному: цепочки Glu10 снижают processivity, но не скорость, kinesin-1, тогда как Glu3 цепочки не оказывают эффекта. Kinesin-2 также, по-видимому, не затрагивается полиглютаминированием, т.к. dynein обнаруживает повышенную processivity. Однако, эти полиглютаминирования были связаны с тубулином посредством maleimide через сконструированный Cys остаток [33] скорее, чем через нормальный glutamate γ-carboxyl изопептидный мостик. Структура и эффекты этих искусственных конструкций д. отличаться от эндогенных полиюглютаминаций.
CCP1 (Nna1) стимулируется во время развития двигательных нейронов и регенерации, подтверждая роль в росте нейритов [51] (Figure 5). Мыши pcd, возникающие в результате потери функции из-за мутации в CCP1, обнаруживают дегенерацию определенных нейронов (включая клетки Пуркинье) и увеличивают полиглютаминирование тубулинов у взрослых [37]. Когда CCP1 был идентифицирован как мутантный ген, нейропатология pcd мышей считалась как результ снижения Δ2-tubulin, но не уровня Δ2-tubulin, нормального у взрослых pcd мышей, а полиглютаминированные тубулины продолжали накапливаться. В соответствии с повышенным полиглютаминированием, вызывающим нейропатологию, супрессия TTLL1 защищала клетки Пуркинье от генерации у pcd мышей [34, 37]. Др. CCPs могут компенсировать потерю CCP1 в отдельных тканях [37], тогда как тяжело поврежденные нейроны (Purkinje and mitral cells), экспрессирующие более низкие уровни др. CCPs, обнаруживют наиболее существенные различия в модификации тубулина.
В противоположность полиглютаминированию, polyglycylation оганичивается тубулинами ресничек [42, 52], и может быть важным для сборки ресничек у некоторых организмов [53]. Поскольку глютаминирование и glycylation мишеней затрагивает одни и те же глютаматы по соседству с С концом, могут существовать реципрокные пути, при этом glycylation модулирует полиглютаминирование [4]. И TTLL3 и 8 добавляют по одному глицину к глютаматам С-терминального домена посредством γ-сцепленного изопептидного мостика [53, 54], которое распространеяется на полиглютаминирование посредством TTLL10 [55]. Поскольку TTLL10 неактивен у человека, то формирующиеся тубулины жгутика спермиев monoglycylated [54], и в отсутствие длинной цепочки polyglycylation не влияют на подвижность ресничек [56], поэтому функциональное значение удлиненных polyglycine цепочек неясно. Однако, нокаут TTLL3 устраняет glycylation со всех тубулинов в толстом кишечнике, где TTLL3 единственная экспрессирующаяся glycylase. Это отсутствие glycylation приводит уменьшению количества первичных ресничек и усиливает канцерогенез в толстом кишечнике, подтверждая, что glycylation тубулинов может играть роль в поддержании первичных ресничек и клеточной пролиферации.
Acetylation and deacetylation of tubulins
Acetylation
Тубулин является главной цитоплазматической мишенью для ацетилирования [58]. В отличие от detyrosination и глютаминирования, каноническим местом ацетилирования тубулина является Lys40 α-tubulin [59], расположенный на просветной поверхности MT [60]. Как ацетилаза получает доступ к Lys40 неясно, но недавнее исследование показало, tubulin acetyltransferase (TAT) эффективно сканирует MTs в обоих направлениях внутри просвета, используя поверхностную диффузию, ацетилирование Lys40 осуществляется стохастически [61]. Эта активность не ограничивается препятствиями на пути просветной диффузии, согласно наблюдениям, что скорость ацетилирования тубулина одинакова для коротких и длинных MTs [62]; следовательно, ацетилирование не ограничивается MT концами, а распространяется вдоль MTs. исследования также показали связывание ацетилаз с поверхностью MT in vitro, независимо от состояния ацетилирования [63].
Хотя некоторые энзимы могут ацетилировать тубулины, включая ELP3, ARD1-NAT1 и GCN5 [58], но основными тубулиновыми ацетилазами являются αTAT1/MEC17 [64-67]. Элиминация активности αTAT1/MEC17 эффективно устраняет ацетилирование MT в разных моделях, но регуляция и специфичность αTAT1 плохо изучена. Основным субстратом для αTAT1 является α-tubulin, но αTAT1 также аутоацетилируется [68]. Устранение αTAT1 сайтов ауто-ацетилирования не влияет на связывание с MT, но снижает ацетилирование тубулина [68], подтверждая, что оно регулируется с помощью ауто-ацетилирования. αTAT1концентрируется также вблизи активных обеспечиваемых клатрином мест эндоцитоза, благодаря её взаимодействию с белком сборки clathrin, AP2 [69]. Более того, αTAT1 ассоциирует с ацетилированными MTs в аксонах и ресничках in vivo [65, 66]. В самом деле, самцы мышей, лишенные αTAT1, менее плодовиты из-за изменений в морфологии и подвижности спермиев [65]; , однако, они не обнаруживают обычных поведенческих и нейрологических дефектов помимо незначительных изменений в архитектуре головного мозга [70]. Однако, у мышей без αTAT1 или ацетилирования MTs, MTs были более резистентны к nocodazole, подтверждая усиление стабильности MT [65]. MEC17 может также иметь др. функции, поскольку экспрессия enzyme-dead MEC17 восстанавливает чувствительность к касаниям в отсутствие ацетилирования тубулина [67].
Хотя Lys40 высоко консервативен у большинства млекопитающих α-tubulins изотипы (за исключением TUBA8 человека), не все изотипы ацетилируются в одинаковой степени. У Physarum [71] и Trypanosoma [72], только TUBA3 ацетилирует, тогда как протеомный анализ ацетилирования клеток человека [73] подтверждает предпочтительное ацетилирование с помощью широко экспрессирующихся TUBA1 и TUBA4 [7]. Ацетилирование тубулина также варьирует в разных клетках и тканях [58], оказываясь ниже в быстро делящихся клетках, чем в постмитотических клетках. Однако, некоторые клетки и организмы лишены ацетилируемого тубулина [58], указывая тем самым, что ацетилирование тубулина несущественно для жизнеспособности клеток. Напр., MEC12 имеет только ген α-tubulin у Caenorhabditis elegans с Lys40, но MEC12 Lys40Gln мутант устраняет ацетилирование не нарушая жизнеспособности [67]. Дополнительные сайты ацетилирования тубулина были идентифицированы при протеомном скрининге [73] и при изучении др. ацетилтрансфераз [74]. Распространенность и функция этих сайтов неизвестны, но они могут влиять на полимеризацию MT [74].
Несмотря на присутствие большой PTM тубулинов, имеется мало согласия относительно функции ацетилирования тубулина [58]. Ассоциация ацетилирования с долго живущими MTs подтверждает роль в стабилизации MTs. Пока эта идея сохраняется, но прямые тесты не обнаруживают эффектов ацетилирования на динамику MT [3]. Ацетилирование встречается чаще в долго живущих MTs, поскольку растворимые тубулиновые димеры быстро деацетилируются и вновь сформированные MTs оказываются дефицитными по ацетилированию. Зависимость αTAT1 от геометрии решетки MTs и её медленная каталитическая скорость эффективно ограничивает динамику ацетилирования MTs [61]. Более того, как активная, так и acetylase-dead формы αTAT1 мыши могут соединяться с MTs и дестабилизировать их in vitro [68].
Ацетилирование может также влиять на структуру MT. Дикого вида MTs у C. elegans в чувствительных к прикосновениям нейронах имеются 15 протофиламент, а мутации в MEC17 или MEC12 приводят к уменьшению количества MTs в тактильных нейронах, тогда как оставшиеся MTs имеют изменивые количества профиламент [67, 75]. Однако, эффект ацетилирования MT протофиламент не обнаруживается в др. системах, где ацетилированные MTs имели стандартное количество из 13 протофиламент. Более того, крио-электронная микроскопия неспособна обнаружить структурные отличия между ацетилированными и не ацетилированными MTs [63].
Ацетилирование MT влияет на белковые взаимодействия с MTs. В самом деле, связывание хитшокового белка 90 (Hsp90) с MTs усиливается при ацетилировании, а рекрутируемый Hsp90 активирует Akt и p53 [76]. Усиление ацетилирования MT может также индуцировать IL10 (противовоспалительный цитокин) и активировать p38 mitogen-activated protein (MAP) киназу в макрофагах [77]. Ацетилированный тубулин является предпочтительным местом для действия разрезающего белка katanin [78] (Figure 4), а избыточная экспрессия katanin вызывает расщепление MT в не нейрональных клетках и сомато-дендритных регионах нейронов [78]. Напротив, MTs аксонов менее чувствительны к katanin, поскольку аксональный tau защищает ацетилированные MTs от katanin [79, 80]. Как katanin ощущает ацетилирование MTs в просвете, неизвестно.
Ацетилирование MT также усиливает базирующийся на кинезине транспорт [81], поскольку ингибирование тубулиновой деацетилазы слегка усиливает adenylylimidodiphosphate (AMP-PNP), обеспечиваемое связыванием кинезина с MTs, и перераспределяет предполагаемые груз кинезина. Однако, ацетилирование и подвижность кинезина не скоррелированы in vivo [32] и in vitro и на длину перемещения не оказывает влияния ацетилирование MT [82], поэтому роль ацетилирования на двигательную функцию остается нерешенной.
Deacetylation
Ацетилирование преимущественно происходит на тубулинах в MTs, то тубулиновые димеры быстро деацетилируются, когда высвобождаются из MTs [58]. Эукариотические протеин деацетилазы представлены двумя семействами: 11 классических histone deacetylases (HDACs) [83] и 7 sirtuins (SIRTs) [84]. Хотя HDAC6 является основой α-tubulin деацетилазой неделящихся клеток [85], она имеет и дрю. субстраты, которые могут не быть связаны с её эффектами на тубулин, такие как, Hsp90, cortactin, β-catenin и periredoxins. HDAC6 взаимодействует также с убиквитином независимо от своей ацетилазной активности [86], подтверждая свою роль в реакции на белковые агрегаты и др. вызывающие стресс вещества (stressors) [87]. Т.о., манипуляции с уровнями или активностью HDAC6 могут влиять на многие пути [83, 84, 85]. Однако, в то время как нокауты ядерных HDAC вызывают эмбриональную или перинатальную гибель [83], HDAC6 нулевые мыши жизнеспособны и развиваются нормально, хотя хоть и с гиперацетилированным тубулином [88]. Умеренный фенотип HDAC6 нулевых мышей подтверждает, что существуют компенсаторные пути для функции HDAC6. Сюда могут входить HDACs, которые обычно ядерные, такие как HDAC5, которая экспортируется из ядра сенсорных нейронов после повреждения и транспортируется в аксон, где она может деацетилировать тубулин [89, 90].
Неклассические HDACs или SIRTs являются NAD+-зависимыми деацетилазами и ADP-ribosyltransferases [84], которые структурно не родственны классическим HDACs [83]. SIRTs имеют множественные субстраты [91], но только SIRT2 деацетилирует α-tubulin [92]. SIRT2 является по преимуществу цитоплазматической, но может проникать в ядро [93]. Хотя α-tubulins являются преимущественно цитоплазматическими субстратами, SIRT2 имеет ядерные субстраты [84] и может играть роль в регуляции клеточного цикла путем деацетилирования histone-4 и/или α-tubulin [94].
Поскольку избыточно экспрессирующиеся SIRT2 и HDAC6 взаимодействуют и ко-иммунопреципитируются, то любой может индивидуально деацетилировать α-tubulin [92]. Воздействие на клетки siRNA для SIRT2 или HDAC6 усиливает ацетилирование тубулина, но замалчивание HDAC6 более эффективно. SIRT2 деацетилаза регулируется с помощью зависимых от клеточного цикла киназ, включая Cdk1, Cdk2 и нейрональную Cdk5 [95]. Поскольку Cdk5 является главной киназой нейрофиламент [96], чья активность высока в нейронах [97], деацетилирование с помощью SIRT2 тубулина в нейронах может быть ограничено зависимым от фосфорилирования ингибированием с помощью Cdk5 [98]. Однако, SIRT2-зависимое ацетилирование тубулина играет ключевую роль в делящихся и раковых клетках [91]. Нокаут SIRT2 и двойной нокаут SIRT2/HDAC6 у мышей не вызывает гибели и отклонений от нормы [98], несмотря на гиперацетилирование тубулина. Минимальное фенотипическое отклонение внезапно указывает, что тубулиновые деацетилазы имеют множество субстаратов помимо α-tubulins. Фенотип таких мышей может возникать позднее или в ответ на специфические stressors, но ни гипо-, ни гиперацетилирование тубулина не нарушает существенно клетки или функции организма; , следовательно, физиологическая роль α-tubulin остается неясной.
Polyamination of tubulin in microtubules
MTs в зрелых аксонах необычно стабильны, оставаясь интактными после деполимеризующих воздействий, таких как холод, Ca2+, и анти-митотические вещества [2, 99]. Эта фракция тубулинов содержит биохимически отличающиеся тубулины, значительно более щелочные (basic), чем предполагаемые последовательности [99], указывая на новую пост-трансляционную модификацию, которая добавляет позитивные заряды. Полиаминирование, при котором transglutaminase (TG) ковалентно связывает полиамины с внутриклеточными белками, является примером такой модификации.
TGs в основном катализируют две реакции на белках in vivo : (i) ковалентное поперечное связывание пептидов и белков посредством γ-glutamyl-ε-lysyl мостиков; и (ii) полиаминирование, т.е. ковалентное образование γ-glutamyl amine мостиков с poly/di/monoamines, такими как putrescine, spermine и spermidine [2]. Когда уровни полиаминов высоки, как в нервной системе, то доминирует полиаминирование глютамина и это, скорее всего, обратимо при физиологических условиях. Активность поперечного связывания TG зависит от кальция и может быть ингибирована с помощью свободных GTP/GDP [100]. Деаминирование может происходить в условиях низкого pH in vitro , при которых полиамины могут быть удалены. Основной цитоплазматический TG (TG2) может также действовать как киназа [101], GTPase [100,102] и протеин дисульфидная изомераза [103].
Модификации белков с помощью TG2 могут играть роль в апоптозе [104]. TG2 может стабилизировать неправильно упакованные белковые агрегаты и способствовать воспалению при болезнях, таких как болезнь Алцеймера, Гентингтона, Паркинсона, боковой амиотрофический склероз (ALS) [105, 106]. TG2 нокаутные мыши жизнеспособны и в основном нормальны, несмотря на некоторые аномалии в секреции инсулина, заживлении ран, аутоиммунной реакции и воспаление [107, 108].
Тубулины нейронов, полимеризованные MTs и taxol-стабилизированные MTs все они являются субстратами для TG-катализируемого полиаминирования in vitro и эта модификация обеспечивает устойчивость MTs против холода и Ca2+ [2]. Ингибирование синтеза полиаминов с помощью difluoromethylornithine (DFMO) или генетического нокаута TG2 снижает стабильность MT in vivo [2]. Некоторая активность TG и стабильность MTs остаются в гомогенатах головного мозга от TG2 нулевых мышей, подтверждая, что множественные TGs вносят вклад в стабилизацию MTs аксонов [2].
Полиаминированный тубулин облегчает нуклеацию и полимеризацию MT in vitro, предупреждая диссоциацию MT, что согласуется с полиаминированием, регулирующим динамику MT [109]. Уровни белка и ферментативной активности TG увеличиваются в аксонах как развивающихся, так и зрелых нейронов, коррелируя с увеличением стабильности MTs. Ингибирование активности TG2 в культуре снижает выросты и созревание нейритов, тогда как нейроны у модельных demyelinating мышей обнаруживают низкую активность TG2 и пониженную стабильность MT [109, 110].
Структура нейронов, ведение аксонов, рост и ретракция среди прочих параметров нуждаются в балансе между стабильностью и пластичностью MT. Уровни полиаминов и TG коррелируют со стабильностью MT во время развития и созревания нейронов. Остаются вопросы о распределении и функции полиаминирования тубулина в нейронах, но нарушение стабильности и пластичности MT может влиять на многие аспекты развития. старения, регенерации и дегенерации головного мозга. Изменения в полиаминировании тубулина может быть защитным, когда гиперстабильность MT помогает поддерживать структуру аксонов, но может усиливать патологию за счет снижения пластичности и изменения синаптической функции.
Антитела против полиаминированных тубулинов располагаются на идентифицированных сайтах полиаминирования вдоль MTs [2] , это может облегчить изучение полиаминирования тубулинов. Сходным образом, флюоресцентные TG-ингибиторы [111] могут помочь отследить распределение TG2 и активность на разных стадиях нейронов, для определения роли TG2 в аксонах в норме и при болезни. Комбинирование этих реагентов с TG2 нокаутными мышами [112] сделает возможным понимание полиаминирования тубулинов.
Other modifications of tubulin
Тубулиновые PTMs, рассмотренные выше, затрагивают большую фракцию tubulin/MTs в головном мозге и,или др. тканях. Однако, описан ряд дополнительных модификаций, которые менее распространены. Эти PTMs могут затрагивать минорные функции тубулинов или MTs, могут быть ограничены специфическими типами клеток или субклеточных компартментов или могут быть временными.
Phosphorylation of tubulin
Фосфорилирование является одной из наиболее распространенных пост-трансляционных модификаций. Хотя фосфорилирование белков, ассоциированных с микротрубочками, привлекает все больше внимания, тубулины также могут быть фосфорилированы. Фосфорилирование β-tubulin было первоначально описано в MTs дифференцированных клеток нейробластомы [113]. Впоследствии, α и β-tubulins, как было установлено, фосфорилируются с помощью serine/threonine киназ таких как Cdk1, CK2 и CamKII, а также тирозиновых киназ, подобных Jak2, Syk, Fes и Src [4]. Большинство из этих киназ фосфорилирует тубулины в MTs [4], но киназа клеточного цикла Cdk1 фосфорилирует S172 растворимого β-tubulin и ингибирует полимеризацию [114]. Фосфорилирование тубулинов может быть ассоциировано со взаимодействиями MT с мембранами [4] или регуляцией полимеризации [114, 115].
Glycosylation and glycation of tubulin
Углеводы могут быть добавлены к тубулину посредством или O-сцепленного гликозилирования [116,117] или не ферментативного glycation [118]. O-сцепленное гликозилирование часто возникает на местах фосфорилирования и может регулировать межбелковые взаимодействия и активность. O-сцепленное гликозилирование тубулинов, по-видимому, гетерогенно и клеточно специфично, но наше знание относительно его клеточной функции ограничено. Известно, что гликозилированный тубулин может собираться в MTs, а MTs вблизи ядра позитивны по sialyloligosaccharide антителам [117]. Дифференцировка нейрон-подобных клеточных линий с помощью ретиноевой кислоты нарушает O-GlcNAcylation α и β-tubulins и ингибирует полимеризацию тубулинов [119]. Более того, гликозилирование TUBB3 может быть ассоциировано с резистентностью химиотерапевтическим лекарствам [116].
В то время как O-сцепленное гликозилирование является нормальным физиологическим событием, не ферментативное glycation является патологическим и ассоциирует с диабетом [118]. Белки glycated, когда высокие уровни глюкозы, ассоциированные с гипергликемией, реагируют с аминокислотами [120]. Tubulin Glycation тубулинов в аксонах существенно при диабете и может бытьфактором диабетической нейропатии [118], поскольку glycation может денатурировать тубулин и привести к деполимеризации.
Palmitoylation of tubulin
Низкие уровни тубулинов в мембранных фракциях обнаруживаются постоянно [121], но они плохо изучены. Palmitoylation может влиять на белковые взаимодействия с мембранами и субклеточную доставку [122]. Поскольку множественные механизмы могут обеспечивать взаимодействия тубулинов с мембранами, palmitate может быть обратимо сцеплен с α-tubulin Cys376 [123]. Palmitoylation тубулина может влиять на микровязкость мембраны или изменять взаимодействие тубулина с мембранными белками [121]; , однако, palmitoylated тубулин не ограничивается мембранами. Напр., C376S мутантный α-tubulin затрагивает организацию астральных MTs у дрожжей и позиционирование ядра [123]. Кроме того, palmitoylated тубулин не подвергается эффективному преобразованию (циклу), но может быть включен в MTs [124]. Анти-митотический vinblastine ингибирует palmitoylation тубулина [125], но неизвестно, играет ли это роль в действии vinblastine на полимеризацию MT.
Ubiquitylation and sumoylation of tubulin
Ubiquitin и SUMO это малые белки, добавляемые ковалентно к белкам с помощью избирательных лигаз [126, 127]. Добавление полимерного ubiquitin или SUMO обычно связано с протеосомной деградацией, но добавление одиночного ubiquitin или SUMO может влиять на взаимодействия белков, ферментативную активность, транспорт белков или локализацию [126, 128].
Убиквитиновая E3 лигаза parkin, которая мутантна в некоторых случаях семейной болезни Паркинсона [129, 130], соединяется и ubiquitylates тубулиновые димеры, усиливая деградацию тубулинов и рециклинг [131]. Parkin и убиквитинированный α-tubulin могут накапливаться в агрегатах при болезни Паркинсона и ALS [132,133], это усиливается при ингибировании протеосом [134]. Убиквитинирование α-tubulin, но не β-tubulin, важно для разборки м резорбции жгутика Chlamydomonas [135], но ответственная E3 лигаза не идентифицирована. Кроме того, sumoylated тубулин был идентифицирован при протеомном скрининге у дрожжей [136] и в клетках млекопитающих [137], где TUBA1, TUBA6 и TUBB6 были модифицированы. Сумоилирование ассоциирует с клеточными функциями, с участием MTs, такими как внутриклеточная доставка и пластичность и может быть изменено при нейрологических болезнях [126]. Т.о., эти модификации играют роль в деградации тубулина, но они могут иметь дополнительные эффекты.
Concluding remarks
Relating specific tubulin modifications to specific cellular functions remains a major challenge. Initial correlations often broke down with additional study due to the overlap of different modifications. Nonetheless, common themes are emerging and questions continue to arise (Box 1). First, the regulation of MT dynamics remains a key aspect of tubulin PTMs, but new mechanisms have been identified and new functions are emerging. Second, MTs are intrinsically heterogeneous. There are not only tyrosinated plus ends, but other PTMs may be concentrated in specific domains along the MT and these domains may overlap. Individual subunits within the MT may be unmodified or have multiple modifications. Third, PTMs affect the interaction of specific proteins with MTs, such as the association of some +TIP proteins with tyrosinated tubulin or the targeting of severing proteins by acetylation and polyglutamylation. As a result, PTMs may play a critical role in defining MTs as a cellular compartment for organizing signaling cascades within the cell. Fourth, the cellular contexts of PTMs remain critical for proper cell function, including enrichment of polyamination in axons and polyglycylation in cilia. MTs in these cellular domains require specific properties, such as the need for unusual stability in axonal domains that may extend a meter or more from the primary site of tubulin synthesis. Finally, tubulin PTMs are dynamic and must be regulated during development and differentiation and in response to injury and stress. Just as MTs can be dynamic or long-lived, both the distribution and levels of a given PTM may be changed in response to physiological and pathological cues.
