Посещений:
ДВИГАТЕЛЬНЫЕ НЕРВЫ И ПЕРИНЕВРАЛЬНАЯ ГЛИЯ

Роль Nkx2.2+

Mammalian Nkx2.2+ perineurial glia are essential for motor nerve development
Jessica K. Clark, Ashley O'keefe, Teresa L. Mastracci, Lori Sussel, Michael P. Matise and Sarah Kucenas1
Developmental Dynamics Volume 243, Issue 9, pages 1116-1129, September 2014

All vertebrate peripheral nerves connect the central nervous system (CNS) with targets in the periphery and are composed of axons, layers of ensheathing glia and connective tissue. Although the structure of these conduits is well established, very little is known about the origin and developmental roles of some of their elements. One understudied component, the perineurium, ensheaths nerve fascicles and is a component of the blood-nerve-barrier. In zebrafish, the motor nerve perineurium is composed of CNS-derived nkx2.2a+ perineurial glia, which establish the motor exit point (MEP) during development. To determine if mouse perineurial cells also originate within the CNS and perform a similar function, we created a Nkx2.2:EGFP transgenic reporter line.Results: In conjunction with RNA expression analysis and antibody labeling, we observed Nkx2.2+ cells along peripheral motor nerves at all stages of development and in adult tissue. Additionally, in mice lacking Nkx2.2, we demonstrate that Nkx2.2+ perineurial glia are essential for motor nerve development and Schwann cell differentiation. Conclusions: Our studies reveal that a subset of mouse perineurial cells are CNS-derived, express Nkx2.2, and are essential for motor nerve development. This work highlights an under-appreciated but essential contribution of CNS-derived cells to the development of the mammalian peripheral nervous system (PNS).Developmental Dynamics 243:1116-1129, 2014. © 2014 Wiley Periodicals, Inc.


Рисунки к статье

Способность организма взаимодействовать со своим окружением, воспроизводиться и выживать зависит от образования и здоровья периферических нервов, которые соединяются с мишенями на периферии, такими как мышцы, ЦНС. Хотя предыдущие исследования продемонстрировали, что взаимодействия между компонентами периферических нервов важны для сборки нервов, происхождение некоторых из этих клеточных популяций всё ещё неизвестно (Binari et al., 2013; Jessen and Mirsky, 2005; Kucenas et al., 2008, 2009; Parmantier et al., 1999; Shantha and Bourne, 1968).
Все периферические нервы состоят из 5 основных компонентов: аксонов, Шванновских клеток, эндоневрия (endoneurium), периневрия (perineurium) и эпиневрия (epineurium) (Kaplan et al., 2009). Предыдущие исследования по картированию судеб у мышей прямо продемонстрировали, что эндоневральные фибробласты и Шванновские клетки происходят из нервного гребня (Joseph et al., 2004). Напротив, исследования выявили, что происхождение периневрия у мышей менее убедительно. Однако, сообщения с использованием др. модельных организмов описали происхождение из ЦНС популяций периферической глии, которая заключает периферические двигательные нервы (Klambt and Goodman, 1991; Kucenas et al., 2008; Lunn et al., 1987; Parker and Auld, 2006; Schmidt et al., 1997; Sepp et al., 2001, 2000). У Drosophila происходящие из ЦНС глиальные клетки, как известно, продуцируют внутренний и наружный слои периферических двигательных нейронов (Klambt and Goodman, 1991; Parker and Auld, 2006; Schmidt et al., 1997; Sepp et al., 2000, 2001). Недавно мы также продемонстрировали на рыбках данио, что nkx2.2a+ клетки происходят из латеральной части вентральной пластинки нервной трубки спинного мозга, давая клетки периневральной глии, которые мигрируют на периферию и энкапсулируют двигательные аксоны в пучки, формируя в конечном счете периневрий зрелого двигательного нерва (Kucenas et al., 2008). Однако, у млекопитающих происхождение периневрия неясно.
У мышей предполагаются три эмбриональных источника этого компонента нерва: нервный гребень, мезодерма и нервная трубка. В элегантном исследовании с использованием Wnt1-Cre+loxpRosa+ мышей для картирования вклада нервного гребня в периферические нервы, большинство эндоневральных и Шванновских клеток обнаруживало происхождение из нервного гребня, однако периневральные клетки нет (Joseph et al., 2004). Др. исследование с использованием in vitro культуры клеток привело к предположению, что периневрий происходит из мезодермы, т .к. фибробласты, культивируемые со Шванновскими клетками и сенсорными нейронами давали похожие на периневрий оболочки (Bunge et al., 1989). Однако, в отличие от периневриальных клеток, которые экспрессируют специфические для базальной мембраны гены и формируют двойную базальную ламину, фибробласты в этом исследовании не имели таких характеристик (Bunge et al., 1989; Jaakkola et al., 1989; Peltonen et al., 2013). Поскольку периневральнрые клетки не происходят из нервного гребня (Joseph et al., 2004) и отличны от происходящих из мезодермы фибробластов (Shanthaveerappa and Bourne, 1962), поэтому мы предположили, что периневральные клетки млекопитающих, подобно периневральным клеткам у рыбок данио, происходят из Nkx2.2+ предшественников в спинном мозге.
Чтобы исследовать эту гипотезу мы создали линию Nkx2.2:EGFP трансгенных репортерных мышей, используя модифицированные bacterial artificial chromosome (BAC), которая была создана с помощью GENSAT и депонирована в Children's Hospital Oakland Research Institute (CHORI). Комбинируя с этой линией анализа экспрессии РНК и меченных антител, мы показали, что субнабор мышиных периневральных клеток нервов спинного мозга, экспрессирующих Nkx2.2, происходит из ЦНС и экспрессирует маркеры перисинаптических Шванновских клеток (PSC) вблизи neuromuscular junctions (NMJ). Чтобы протестировать роль этих происходящих из ЦНС периневральных глиальных клеток во время развития двигательных нервов, мы использовали мышей, у которых определенные условия вызывали отсутствие Nkx2.2 (Lei et al., 2006; Mastracci et al.,2013). У таких мышей мы наблюдали дефекты образования аксонов в пучки и эктопические двигательные нейроны вне спинного мозга. Потеря Nkx2.2 также приводит к достоверному снижению миелинизации вдоль двигательных нервов, а также общие ультраструктурные деформации нервов и дефекты NMJ. Напротив, чисто сенсорные нервы не были заключены в Nkx2.2+ периневральные клетки и не отличались от таковых у контрольных мышей. Это указывает на то, что: (1) субнабор периневральных клеток у мышей происходит из вентральной части спинного мозга и экспрессирует Nkx2.2, (2) Nkx2.2 может быть новым маркером для PSCs и (3) Nkx2.2+ клетки играют важную роль в развитии двигательных нервов, как у рыбок данио (Kucenas et al., 2008).

Discussion


Периневрий является важным периферическим компонентом нервов, ответственным за заключение в оболочку и защиту аксонов от внешнесредовых воздействий. Его происхождение многие годы из-за бедности специфических маркеров было неясным (Bunge et al., 1989; Joseph et al., 2004; Kucenas et al., 2008). Мы охарактеризовали экспрессию Nkx2.2 в PNS мышей, используя три разные линии в комбинации с иммуногистохимией и гибридизацией in situ. Как было описано ранее на рыбках данио, мы установили, что экспрессия Nkx2.2 в субнаборе происходящих из ЦНС периневральных клеток, которые покрывают оболочкой развивающиеся и зрелые двигательные нервы. Интересно, что Nkx2.2 также экспрессируется в клетках вблизи NMJ, открывая возможность, что Nkx2.2 может быть новым молекулярным маркером PSCs или представляет др. самостоятельную популяцию синаптической глии. Наконец, используя мышей с обусловленным нулевым аллелем гена Nkx2.2, мы наблюдали дефекты образования двигательных нервов, подобные тем, что наблюдались у рыбок данио, включая эктопическую миграцию двигательных нейронов от спинного мозга, дефекты миелинизации и неспособность к созреванию NMJ, демонстрируя тем самым, что Nkx2.2+ периневральная глия необходима для развития периферических спинальных двигательных нервов.
Вплоть до сегодня онтогенетическое происхождение периневрия было спорным. Эксперименты in vitro указывали на то, что периневрий происходит из мезодермы, т.к. краниальные надкостничные фибробласты формировали похожую на периневрий оболочку при совместном культивировании со Шванновскими клетками и сенсорными нейронами (Bunge et al., 1989). Однако, in vivo периневральные клетки экспрессируют гены, специфичные для базальной мембраны (α 1(I) and α 2(IV) collagen и laminin B2 chain) и образуют базальную мембрану, которая закладывается в отдалении от фибробластов (Jaakkola et al., 1989; Peltonen et al.,1987). Более того, ЭМ отличает фибробласты и периневральные клетки как самостоятельные вещи. Фибробласты имеют более компактные ядра, а их эндоплазматический ретикулум более нагляден, чем в периневральных клетках (Shantha and Bourne, 1968).
Привлекательная теория была постулирована Shantha and Bourne (1968), они полагали, что имеются два компонента периневрия: эпителий, состоящий из ряда слоёв слущивающегося клеток, которые окружают пучки нервов и более периферическая соединительная ткань, которая помещается рядом с эпиневрием. Окрашивание гематоксилином-эозином показывает эти различия между двумя слоями в виде менее интенсивной окраски соединительной ткани по сравнению с эпителиальным слоем (Shantha and Bourne, 1968). Интересно, что ЭМ показала, что твердое вещество (dura matter) спинного мозга продолжается на периферию в виде соединительной ткани и эпиневрия, тогда как pia-arachnoid слои (или leptomeninges) продолжаются как эпителий (Shantha and Bourne, 1968). Shanthaveerappa and Bourne предположили, что эпителий морфологически и гистохимически идентичен клеткам, которые дают pia-arachnoid слой, эти структуры д. иметь общее происхождение, а именно нейроэктодерму (Shanthaveerappa and Bourne, 1962). Это указывает на то, что причиной споров вокруг периневрия стало его образование из двух самостоятельных компонентов, происходящих от разных предшественников. Если эпителиальный слой в самом деле имеет эктодермальное происхождение, то следует предположить он возникает из нервной трубки, т.к. отслеживание клонов определило, что периневрий не происходит из нервного гребня (Joseph et al., 2004). Это согласуется с др. исследованиями, показавшими, что периневрий или аналогичные структуры, происходят от ЦНС у рыбок данио и Drosophila (Klambt and Goodman, 1991; Kucenas et al., 2008; Parker and Auld,2006; Schmidt et al., 1997; Sepp et al., 2000, 2001).
В согласии с этой гипотезой , предложенной 60 лет тому назад, наша современная работа демонстрирует, что Nkx2.2+ и 8.1.1+ мечение не всегда отражает всё точно (Figs. 1E, 4C). 8.1.1 является маркером стромальной клеточной линии, обнаруживаемый не только в периневрии, но и в др. типах клеток, таких как миофибробласты и миоэпителий (Schacht et al., 2005). Это указывает на то, что 8.1.1 может также метить фибробласты, это может объяснить дивергентную гипотезу об происхождении периневрия и согласуется с гипотезой, что периневрий д. состоять из более чем одного типа клеток. Кроме того, в нашем исследовании нокаута мы наблюдали дефекты периневрия, как показывает мечение с помощью ZO-1, которое демонстрирует, что в отсутствие Nkx2.2, мечение ZO-1 теряется во внутренних слоях периневрия (Fig. 6H), но сохраняется в наружных слоях, которые, как полагают, является самостоятельным слоем соединительной ткани. К сожалению из-за отсутствия специфических маркеров периневральных клеток (помимо Nkx2.2), не созможно определить, каков процент периневральных клеток происходит из мезодермы в противовес эктодерме. Однако, будущие исследования определят молекулярные характеристики non-Nkx2.2 популяции периневральных клеток и охарактеризуют этот важный компонент пе6риферической нервной системы.
Помимо Nkx2.2+ периневральной глии, ассоциированной с двигательными нервами, мы также наблюдали Nkx2.2+ клетки внутри развивающихся пучков нервов, а также вблизи NMJ. Являются ли эти клетки периневральной глией или новым классом периневральной глии и происходят ли они из ЦНС, остается определить. Однако, мы способны отличить их от периневральной глии, используя меченные антитела и различные трансгенные конструкции, использованные в этой работе. Интересно, что у мышей с обусловленным отсутствием Nkx2.2, NMJs неспособны созревать нормально (Fig. 8), это приводит нас к заключению, что Nkx2.2+ клетки в NMJ являются важными медиаторами в этом процессе и открывают интригующую гипотезу, что они могут также играть роль в регенерации.
Итак, наше исследование демонстрирует, что источник периневральных клеток законсервирован у рыбок данио и мышей и что эти клетки играют важную роль в развитии нервов.