Посещений: 
ФОРМИРОВАНИЕ ОТОКОНИЕВ И ОТОЛИТОВ
Механизмы и генетический контроль
Mechanisms of otoconia and otolith development Yunxia Wang Lundberg, Yinfang Xu, Kevin D. Thiessen and Kenneth L. Kramer
 Developmental Dynamics
Volume 244, Issue 3, pages 239–253, March 2015
Otoconia are bio-crystals that couple mechanic forces to the sensory hair cells in the utricle and saccule, a process essential for us to sense linear acceleration and gravity for the purpose of maintaining bodily balance. In fish, structurally similar bio-crystals called otoliths mediate both balance and hearing. Otoconia abnormalities are common and can cause vertigo and imbalance in humans. However, the molecular etiology of these illnesses is unknown, as investigators have only begun to identify genes important for otoconia formation in recent years. Results: To date, in-depth studies of selected mouse otoconial proteins have been performed, and about 75 zebrafish genes have been identified to be important for otolith development. Conclusions: This review will summarize recent findings as well as compare otoconia and otolith development. It will provide an updated brief review of otoconial proteins along with an overview of the cells and cellular processes involved. While continued efforts are needed to thoroughly understand the molecular mechanisms underlying otoconia and otolith development, it is clear that the process involves a series of temporally and spatially specific events that are tightly coordinated by numerous proteins. Such knowledge will serve as the foundation to uncover the molecular causes of human otoconia-related disorders. Developmental Dynamics 244:239-253, 2015.
Рисунки к статье
| |
Преддверие внутреннего уха служит в качестве датчика скорости, определяющего движения головы вокруг любой оси (горизонтальной2, вертикальной или торсионной). Оно содержит три полукружных канала, отвечающих на ротационное ускорение (повороты головы, напр.), и два рецепторных органа гравитации, которые ощущают линейное ускорение (ускорение в автомобиле, напр.) и гравитацию (Fig. 1). Маточка (utricle) и мешочек (saccule) являются двумя органами ощущающими гравитацию и содержат отоконии, биокристаллы карбоната кальция (CaCO3) с белками. У позвоночных не млекопитающих третий отолитической орган называется lagena. Отоконии и внедренные в них мембранозные структуры, отокониальные мембраны, расположены поверх киноцилия и стереоцилий волосковых клеток в сенсорном эпителии (macula) отолитических органов (Fig. 2C). У костистых рыб биокристаллы затвердевают в три отолита, каждый из которых непосредственно взаимодействует со всем участком сенсорного эпителия. Наклон головы и линейное движение головой вызывают смещение отокониального комплекса, вызывая усилия сдвига, которые наклоняют пучки волосков и затем деполяризуют сенсорные волоски клеток. Эти электрические сигналы затем передаются в ЦНС с помощью афферентного вестибулярного нерва, который вместе с др. проприоцептивной информацией стимулирует ЦНС, чтобы инициировать реакцию нейронов для поддержания равновесия тела. Правильное образование и закрепление отоконий важны для оптимальной вестибулярной функции и равновесия (Anniko et al., 1988; Jones et al., 1999, 2004; Kozel et al.,1998; Simmler et al., 2000a; Trune and Lim, 1983a; Zhao et al., 2008b).
Figure 1. Illustrations of the mammalian (A) and zebrafish (B) inner ear as well as the proteins known to participate in otoconia (C) and otolith (D) development. References are provided in Table 1.
Figure 2. Development of otoconia and otoliths. A: Otoconia are seeded across the lumen above the sensory epithelium of the utricle and saccule in mice, and seeding begins as early as E14.5. A seed has an inorganic CaCO3crystallite (asterisk) enveloped by an organic matrix (arrows, stained with Toluidine Blue). Without Oc90, the matrix is nearly gone (Zhao et al., 2007).B: During growth, the individual crystallites fuse in an organized pattern. Growth begins right after seeding and continues until about a week after birth.C: During or shortly after growth, tens of thousands of otoconia are anchored to the otoconial membrane atop the hair bundles, and some are in contact with the hair bundles (arrow). The inset shows a partially decalcified otoconium (hence abnormally shaped, arrowhead) in contact with a hair bundle (arrow). D: Otoliths in zebrafish are also seeded across the lumen, and some seeds, while still adding matrix and CaCO3, become anchored (arrows) to tether cells. As in mice, Oc90 is expressed very early to initiate seeding. Seeding particles are readily visible by 18.5 hpf. E: Seeds are anchored to tether cells and aggregate in a controlled pattern to form a single large otolith on each patch of hair cells. Bead-like aggregates of Oc90 may indicate the origin of crystallite nucleation. F: Fish otoliths continue to grow throughout the lifespan, as indicated by the daily growth rings. The arrow denotes a hair bundle underneath the otolith and arrowheads mark layers in the fish otolith. G: Summary of mechanisms governing otoconia and otolith development. More than one mechanism drives each of the three steps in bio-crystal formation illustrated in A-F and are discussed within the text in more detail. hpf and dpf, hour and day post fertilization, respectively; E17.5, embryonic day 17.5; P4, postnatal day 4; 6M, 6 months old; STM, Starmaker; AcTub, Acetylated Tubulin. Нарушения равновесия, связанные с отокониями, превалируют. Напр., benign paroxysmal position vertigo (BPPV), болезнь, вызываемая смещением отоконий из маточки в полукружные каналы (Salvinelli et al., 2004; Schuknecht, 1962, 1969; Squires et al., 2004), является наиболее распространенной причиной головокружений (vertigo) у людей. Пожилые люди склоны к дегенерации отоконий и к BPPV (Anniko et al., 1984; Igarashi et al.,1993; Ogun et al., 2014; Ross et al., 1976), подтверждая, что дегенерация усиливает смещения. Аномалии отоконий могут быть результатом генетических мутаций, травм головы и ото-токсических лекарств. Чтобы идентифицировать молекулярную этиологию вестибулярных нарушений, важно понять механизмы, с помощью которых отоконии формируются и поддерживаются. Более 24 мышиных и около 75 рыбьих генов было идентифицировано как важные для развития отоконий и отолитов, соотв. Поскольку отолиты рыбок данио структурно отличны ln отоконий млекопитающих, то крупномасштабные генетические исследования продемонстрировали, что рыбки данио являются предсказательной моделью для развития и болезней у человека (Howe et al., 2013). Следовательно, изучение модельных мышей и рыбок данио сможет помочь определить, как формируются отоконии млекопитающих. В данной статье мы предоставим краткий обзор белков отоконий, с привлечением недавних находок на рыбках данио. Мы также рассмотрим клетки и клеточные процессы, важные для развития отоконий и отолитов.
Constituent Proteins in Otoconia and Otolith Development Отоконии и отолиты содержат CaCO3, но морфология, кристаллиновая структура и белковый состав варьируют между двумя типами биоминералов. С бочкообразным телом и трехплоскостными facets на каждом конце, каждый отоконий действительно содержит ряд крошечных кристаллов, которые очерчиваются с помощью органического матрикса (Fig. 2A, B) (Lim, 1984; Lins et al., 2000; Mann et al., 1983; Steyger and Wiederhold, 1995; Zhao et al., 2007). Напротив, куполовидные отолиты рыб содержат концентрические слои из органического матрикса, чередующиеся с CaCO3 (Campana and Neilson,1985). Структура кристаллической решетки также отличается: от примитивной до продвинутой у рыб и у высших позвоночных, т.е. кристаллические состояния с участием от apatite до aragonite и до calcite, соотв. (Carlstrom, 1963; Ross and Pote, 1984). Отоконии млекопитающих образуются на поздней эмбриональной стадии и могут нуждаться в поддержке после этого (Salamat et al., 1980; Thalmann et al., 2001; Lundberg, unpublished data). После инициального зарождения (seeding) отолиты рыб быстро прикрепляются к незрелым волосковым клеткам, известным как закрепляющие клетки, и быстро растут во время раннего развития уха (Fig. 2D, E) (Petko et al.,2008; Riley and Moorman, 2000). Ежедневные нарастающие слои, которые варьируют по толщине и составу в зависимости окружения, затем последовательно добавляются к отолитам в течение всей жизни рыб (Fig. 2F) (Campana, 1999).
Недавние данные подтвердили модель, согласно которой CaCO 3 кристаллиновая структура и морфология отокониев и отолитов регулируется с помощью органического матрикса из белков и протеогликанов (Deans et al., 2010; Kang et al., 2008; Sollner et al., 2003; Zhao et al., 2007). Белки отоконий, обозначаемые как отоконины (otoconins) и многие важные для кристаллизации CaCO 3, т.к. они связывают кальций из окружения, бедной кальцием эндолимфы (Endo et al., 1991; Ferrary et al., 1988; Ito et al., 1994; Marcus and Wangemann, 2009; Pisam et al., 2002; Pote and Ross, 1991; Salt et al., 1989; Verpy et al., 1999; Wang et al., 1998; Xu
et al., 2010). Кстати, идентифицировано 9 отоконинов у мыши: Otoconin-90 (Oc90, aka Oc95) (Wang et al., 1998; Verpy et al., 1999), Otolin-1 (Zhao et al., 2007), Keratan sulfate proteoglycan(s) (KSPGs) (Yang et al., 2011b), α-Tectorin (Legan et al., 1997), Fetuin-A (aka countertrypin; (Thalmann et al., 2006; Zhao et al., 2007), Osteoin (aka Spp1; Sakagami, 2000; Takemura et al., 1994; Zhao et al., 2008a), Sparc-like protein 1 (Sc1, aka hevin and Ecm2; Thalmann et al., 2006; Xu et al., 2010), Secreted protein acidic and rich in cysteine (Sparc, aka BM-40 and osteonectin) и Dentin matrix protein 1 (DMP1) (Xu et al., 2010). Эти белки и регуляторы отокониев хорошо законсервированы в ходе эволюции.
Oc90 Oc90 является наиболее многочисленным отоконином (Pote and Ross, 1991; Verpy et al., 1999; Wang et al., 1998) , он необходим для отокониального матрикса, чтобы специфически обеспечить рекрутирование др. компонентов с кальция (Yang et al., 2011b; Zhao et al., 2007). Хотя Oc90 выполняет сходную роль в зарождении отолитов рыб, он не является основным отоконином (Sakagamihas, 2000). В отолитах рыб преобладает матричный белок OMP-1, не нужный для зарождения (seeding) отолитов, но необходимый позднее для роста отолитов (Murayama et al., 2005; Murayama et al., 2004).
Несмотря на свое структурное сходство с секреторной phospholipase A2 (sPLA2), Oc90 не обладает каталитической активностью этого энзима, но имеет законсервированную способность связывать кальций, функция, общая большинству др. отоконинов (Pote and Ross, 1991; Wang et al., 1998). Oc90 чрезвычайно кислый с изоэлектрической точкой, соответствующей 2.9 (Lu et al., 2010), это позволяет ему связывать кальций или CaCO3. В отсутствие Oc90, связанный с матриксом кальций на поверхности макулы существенно уменьшается в количестве (Yang et al., 2011b). В in vivo и in vitro исследованиях, Oc90 облегчает нуклеацию и рост кристаллов CaCO3 (Zhao et al., 2007; Lu et al., 2010). Будучи богатым цистеинами, Oc90 может формировать многочисленные дисульфидные мостики, чтобы генерировать ригидный каркас для этих целей. Частичное образование отокониев у Oc90 нулевых мышей может быть обусловлено компенсацией за счет Sc1 (Xu et al., 2010). Напротив, oc90-морфантные рыбки данио лишены отолитов (Petko et al., 2008), подтверждая, что Oc90 является критическим во время ранних стадий формирования отолитов у рыбок данио.
Экспрессия Oc90 начинается за день перед началом всех остальных известных отокониальных генов у мышей и рыбок данио (Petko et al., 2008; Verpy et al., 1999; Wang et al., 1998). Органический матрикс впоследствии формируется, когда Oc90, по-видимому, начинает рекрутировать др. компоненты во время своей экспрессии (arrow in Fig.2A) (Zhao et al., 2007). У мышей временные изменения в уровнях экспрессии Oc90 совпадают по времени с развитием отокониев (Xu and Lundberg, 2012 2012). В сравнении экспрессия oc90 у рыбок дано относительно низкая, но устойчивая в ходе самых ранних стадий образования отолитов (Petko et al., 2008). Oc90 экспрессируется в несенсорном эпителии развивающегося преддверия у мышей, ново всех клетках развивающейся слуховой плакоды у рыбок данио. Позднее, точечные зародыши Oc90 сливаются с соседними волосковыми клетками перед образованием отоциста (Fig. 2D; Kramer unpublished data).
Sc1 В отсутствие Oc90, образуются немногое гигантские отоконии, содержащие сильно повышенные уровни Sc1 (Xu et al., 2010). У нормальных мышей уровень Sc1 чрезвычайно низок, если имеется вообще в отокониях (Thalmann et al., 2006; Xu et al., 2010) но его уровень высок в головном мозге и разных типах нервной ткани (Johnston et al., 1990; Lively et al., 2007; McKinnon and Margolskee, 1996; Mendis and Brown, 1994). Сегодня неясно, какие вышестоящие гены регулируют экспрессию Sc1 или Sparc во внутреннем ухе, но усиление активности Sc1 в нулевых Oc90 отокониях обусловлено повышенным включением в них белка (Xu et al., 2010). Точная роль Sc1 в биоминерализации не установлена, т.к. отоконии не были тщательно изучены у Sc1 нулевых мышей, которые, по-видимому, обладают нормальной функцией равновесия (McKinnon et al., 2000).
Sc1 и Oc90 обладают разными последовательностями, но имеют общими некоторыми важными свойствами. Sc1 также является кислым гликопротеином, богатым цистеинами, и имеет высокое содержание (22%) кислых аминокислот и мотив EF-hand для связывания производных кальция (Chun et al., 2006; Xu et al., 2010). Sc1 также содержит Sparc-подобный регион, который состоит из follistatin-подобного, коллаген-связывающего и двух кальций-связывающих (EF-hand) доменов (Maurer et al., 1995). Эти домены образуют "Phe pocket" (Hohenester et al., 2008; Sasaki et al., 1998) после соединения с колагенозными белками, такими как Otolin. Эти свойства д. позволять Sc1 компенсировать потерю Oc90.
Otolin Otolin-1 (aka Otolin) является специфичным для внутреннего уха коллагеном и, скорее всего, образует коллаген-подобный каркас для оптимального образования отокониев (Zhao et al.,2007; Deans et al., 2010; Yang et al., 2011b). Он также является секретируемым гликопротеином и присутствует как в отокониальных кристаллах, так и фиброзных мембранах. Хотя нокаут Otolin у мышей не был описан, но отолиты у otolin1a morphant рыб сливаются и нестабильны (Murayama et al., 2005).
Как член семейства collagen X и сверхсемейства C1q (Deans et al., 2010; Kishore and Reid, 1999; Yang et al., 2011b), Otolin обладает тремя collagen-подобными доменами и глобулярным C1q (gC1q) доменом и оба типа доменов взаимодействуют с Oc90, чтобы сформировать матрикс отокониев и секвестрировать кальций для оптимального образования отокониев. Oc90 и Otolin кооперируются, чтобы синергично облегчить кальцификацию матрикса в культивируемых клетках (Yang et al., 2011b). In vitro, Oc90 нуждается в присутствии Otolin, чтобы генерировать кристаллы подобной отокониям морфологии (Moreland et al.,2014). Сходным образом, нормальный рост отолитов у рыбок данио нуждается в OMP-1 и инкорпорации в них Otolin1a (Murayama et al., 2004, 2005).
Keratan Sulfate Proteoglycan(s) (KSPGs) Широко распределенные на клеточной поверхности и во внеклеточном матриксе, протеогликаны состоят из стержневого белка с ковалентно прикрепленными цепочками glycosaminoglycan (GAG). Классы протеогликанов отличаются своими GAG цепочками и включают heparan sulfate proteoglycans (HSPGs), chondroitin sulfate proteoglycans (CSPGs) и KSPGs (Kramer, 2010). Протеогликаны могут формировать крупные комплексы за счет взаимодействий с др. протеогликанами и коллагеном. Кроме того, протеогликаны обладают сильным отрицательным зарядом и могут притягивать ионы, такие как Ca2+. Эти свойства делают KSPGs прекрасными кандидатами на роль кальцификации отокониев. Делеция разных HSPGs и CSPGs вызывает дефицит кальцификации (Hassell et al., 2002; Viviano et al., 2005; Xu et al., 1998; Young et al., 2002), что свидетельствует об их критической роли в формировании костей и зубов.
Во внутреннем ухе KSPG(s) являются преобладающим классом протеогликанов (Killick and Richardson, 1997; Xu et al., 2010), и присутствуют в отокониях мышей, шиншиллы и кур (Fermin et al., 1990; Swartz and Santi, 1997; Xu et al., 2010). KSPG(s), по-видимому, взаимодействуют с Oc90 и Otolin (Yang et al., 2011b), но детальная роль KSPG(s) в отокониях или отолитах ещё не установлена, и KS стержневой белок не идентифицирован у мышей и рыбок данио. В улитке мышей α-Tectorin является KSPG (Killick and Richardson, 1997), но его экспрессия в основном ограничена отолитической мембраной (El-Amraoui et al., 2001).
Other Minor Otoconins Немногие отокониальные белки, важные для формирования зубов и костей у мышей, а также отолитов у рыбок данио, не важны для развития отокониев у мышей. Напр., Osteopontin, small integrin-binding N-linked glycoprotein (SIBLING) белок, богатый в минерализованном матриксе костей и зубов, и важный для организации костного матрикса, поддерживает прочность кости и регулирует размеры костных кристаллов (Boskey et al., 1993; Duvall et al., 2007; Hunter et al., 1994; Shapses et al., 2003; Thurner et al., 2010). В преддверии, однако, Osteopontin не нужен для формирования отокониев или вестибулярной функции, несмотря на присутствие белка в ткани дикого типа (Zhao et al., 2008a).
Др. член семейства SIBLING, Dentin matrix acidic phosphoprotein 1 (DMP1), также обилен в зубах и костях, где он является критическим для зарождения апатитовых кристаллов и их роста (George et al., 1993; Hirst et al., 1997; MacDougall et al., 1998). Помимо тяжелых дефектов костей DMP1 нулевые мыши обнаруживают неустойчивое поведение (Lv et al., 2010). Хотя последнее приписывается аномальной структуре кости внутреннего уха, но отоконии также содержат DMP1 (Xu et al., 2010) и также могут быть повреждены. В самом деле, рыбки данио, дефицитные по DMP1-родственному белку Starmaker имеют отолиты с измененной структурой кристаллической решетки (Bajoghli et al., 2009; Sollner et al., 2003).
Sparc присутствует в тканях, подвергающихся ремоделированию (Bolander et al., 1988; Hohenester et al., 1997; Sage and Vernon, 1994) и может быть критическим для инициации минерализации костей (Bianco et al., 1985; Termine et al., 1981). Его функция может быть связана с высоким сродством к кальцию и коллагену (Bolander et al., 1988; Hohenester et al., 2008; Maurer et al., 1995). Хотя Sparc присутствует в чрезвычайно низких количествах и может быть не важным для формирования отоконий мышей (Xu et al., 2010), он необходим для формирования отолитов у рыбок данио (Kang et al., 2008). Несмотря на усиление его активности у Oc90 нулевых мышей, член его семейства Sc1, по-видимому, является преобладающим матричным белком при отсутствии Oc90 (Xu et al., 2010).
Direct Regulators of Otoconia and Otolith Development Формирование биокристаллов во внутреннем ухе регулируется с помощью non-constituent белков, которые не инкорпорируются в отоконии и отолиты. Эти регуляторные белки являются критическими в становлении соотв. среды для зарождения (seeding) и роста кристаллов путем (1) влияния на секрецию отоконинов или функциональную модификацию (2) регенерации пространственных и временных градиентов кальция и др. ионов.
NADPH Oxidase 3 (Nox3) and Associated Proteins Связанные с мембраной энзимы NADPH oxidases (Noxs) продуцируют реактивные виды кислорода, играющие как нормальную, так и патологическую роль (Bedard and Krause, 2007). Активности Noxs модулируются с помощью партнеров, таких как p22phox, Nox organizers (Noxo1, p47phox, and p40phox) и Nox activators (Noxa1 и p67phox). Среди 7 членов Nox у млекопитающих, Nox3 преимущественно экспрессируется во внутреннем ухе и располагается в цитоплазматической мембране. Nox3 и её регуляторы p22phox и Noxo1 являются важными для образования отоконий и функции равновесия у мышей (Kiss et al., 2006; Nakano et al., 2007, 2008; Paffenholz et al., 2004).
Пока неизвестно, как Nox и ассоциированные с ней белки обеспечивают формирование отоконий. Если отоконины окисляются с помощью Nox3, то конформационные изменения д. гарантировать облегчение зарождения (nucleation) кристаллов (Xu et al., 2012). Альтернативно, электроны, генерируемые с помощью Nox3, д. деполяризовать апикальную плазматическую мембрану и увеличить локальную концентрацию кальция, как полагают Nakano et al. (2008). Также возникающий в результате супероксид может увеличивать локальный pH за счет реакции с протонами, способствуя тем самым образованию и поддержанию кристаллов CaCO 3 . Кстати, Noxs не были описаны в ухе рыбок данио, это могло бы прояснить механизм.
Otopetrin-1 (Otop1) Otop1 необходим для развития отокониев и отолитов возможно за счет регуляции секреции белка и мобилизации кальция (Hughes et al.,2004; Hurle et al., 2003). Otop1 имеет множественные трансмембранные домены (TM), а точковые мутации в этих доменах могут вызывать отсутствие отокониев, напр., у двух мутантных мышей, tilted (tlt) и mergulhador (mlh). Это похоже на фенотип, наблюдаемый у мутантов backstroke рыбок данио, у которых дефектен otop1 (Sollner et al., 2004).
У рыбок данио, otop1 экспрессируется в волосковых и поддерживающих клетках, до зарождения отолитов, но только в волосковых клетках во время роста отолитов (Hurle et al.,2003; Sollner et al., 2004). Паттерн его экспрессии противоположен таковому Oc90 у мышей. Недавнее исследование (Kim et al., 2010) показало, что Otop1 располагается в апикальном регионе поддерживающих клеток и в некоторых переходных клетках. Нарушение подобной апикальной лoкализации Otop1 в tlt и mlhmutant эпителии может быть причиной отсутствия отокониев (Kim et al., 2011). Это подтверждает, что Otop1 может обеспечивать секрецию отоконинов, поскольку отоконин Starmaker не секретируется в просвет отоциста, а остаётся в отическом эпителии у otop1-мутантных рыбок данио (Sollner et al., 2004). Мобилизация кальция может также регулироваться с помощью Otop1, поскольку белок может увеличивать концентрацию кальция в цитозоле путем подавления пуринергического рецептора P2Y (Hughes et al., 2007; Kim et al., 2010). Следовательно, Otop1 может регулировать множественные аспекты развития отокониев и отолитов.
PMCA2
PMCAs является Calmodulin-sensitive plasma membrane calcium-ATPases. PMCA2a является важным источником кальция для образования отокониев. Эти насосы, обменники Ca 2+/H +, которые вытесняют Ca 2+ из стереоцилий волосковых клеток, увеличивая тем самым [Ca 2+] вблизи плазматической мембраны. Все 4 PMCAs экспрессируются в улитке млекопитающих, но только PMCA2a, белок, кодируемый геном Atp2b2, присутствует в пучках вестибулярных волосков (Crouch and Schulte, 1996; Dumont et al., 2001; Furuta et al., 1998; Yamoah et al., 1998). Отоконии и отолиты отсутствуют у Atp2b2 нокаутных мышей и при нокдауне у рыбок данио, соотв. (Blasiole et al., 2006; Kozel et al., 1998).
Pendrin
Более 150 мутаций в Slc26a4 приводят к комбинации врожденной потере слуха, равновесия и нарушениям щитовидной железы, известным как синдром Pendred (Dai et al., 2009; Luxon et al., 2003). Продукт гена Slc26a4 Pendrin, является транспортером анионов, преимущественно экспрессируемым в эндолимфатических протоке и мешке, вестибулярном переходном эпителии и наружной борозде улитки (Everett et al., 1999). Нокаутные Slc26a4 мыши имеют достоверно более низкий эндолимфатический pH, это приводит к образованию немногих, но крупных кристаллов как в utricle, так и saccule (Everett et al., 2001; Kim and Wangemann, 2010, 2011; Nakaya et al., 2007). В то время как близко родственный белок Prestin является электромеханическим преобразователем, миссенс мутации в Slc26a4 специфически нарушают активность транспорта анионов и фенокопируют Slc26a4 нокаутных мышей (Dror et al., 2010). Следовательно, Pendrin регулирует образование отокониев благодаря свой способности транспортировать анионы, такие как HCO3 -, и путем буфферизации эндолимфатического pH. HCO3 --ATPase и Cl -/HCO3 --обменники обеспечивают транс-эпителиальный транспорт HCO3 - в эндолимфу и регулируют образование отолитов (Tohse and Mugiya, 2001).
Carbonic Anhydrase (CA)
CA, скорее всего, регулирует развитие и поддержание отокониев также за счет предоставления HCO3 - и поддержания соотв. pH. Во внутреннем ухе млекопитающих CA широко экспрессируется в сенсорном и не сенсорном эпителии (Lim et al., 1983; Pedrozo et al., 1997), особенно в эмбриональном эндолимфатическом мешке. Ингибирование активности CA снижает концентрацию HCO 3- и pH в эндолимфатическом мешке (Kido et al., 1991; Tsujikawa et al., 1993), и вызывает аномальные и уменьшенные отоконии у развивающихся эмбрионов кур (Anken et al., 2004; Kido et al., 1991). Альтерации макулярной CA также ассоциируют с изменениями у рыбок данио роста отолитов (Anken et al., 2004). Изоформа CA2 и Pendrin могут кооперироваться, чтобы поддерживать нормальную функцию эндолимфатического мешка, где оба экспрессируются совместно (Dou et al., 2004). Отоконии также отсутствуют в utricle у мутантных по транспортеру цинка 4 (SLC30A4) мышей, возможно в результате снижения активности CA (Huang and Gitschier, 1997).
Other Ion Channels
Семейство transient receptor potential vanilloids (TRPVs), которое избирательно транспортирует кальций и магний, может обеспечивать гомеостаз эндолимфы во внутреннем ухе. В то время как все мышиные TRPVs (TRPV1-6) и рыбок данио TRPV4 экспрессируются в вестибулярном и кохлеарном сенсорном эпителии, TRPV4 также присутствует в эндолимфатическом мешке, а TRPV5 вместе с TRPV6 обнаруживаются в вестибулярных протоках полукружных каналов (Amato et al., 2012; Ishibashi et al., 2008; Kumagami et al., 2009; Takumida et al., 2009; Yamauchi et al., 2010). Низкий эндолимфатический pH у Pendrin-дефицитных мышей, по-видимому, ингибирует чувствительные к кислоте кальциевые каналы TRPV5/6, увеличивает содержание кальция в эндолимфе, это, скорее всего, вносит вклад в формирование аномальных кристаллов отокониев (Nakaya et al., 2007). TRPV4 нокаутные мыши обнаруживают дефекты слуха и TRPV5 и TRPV6 нокаутные мыши, также как и мутанты trpv6 рыбок данио обнаруживают дефекты образования костей (Chen et al., 2014; Hoenderop et al., 2003; Tabuchi et al., 2005; Vanoevelen et al., 2011). Однако, TRPV-дефицитные мыши и рыбки данио не связаны с существенными аномалиями отокониев и отолитов.
Anchoring Proteins in Otoconia and Otolith Functional Development
Отокониевые кристаллы прикреплены к сенсорному эпителию с помощью отокониальной мембраны, похожей на соты структуры (Fig. 2C), которая играет критическую роль в механо-трансдукции. Нарушения отокониальной мембраны м. приводить к отсоединению и смещению отокониев, приводя к головокружениям и проблемам с равновесием. Поскольку отолиты рыбок данио также, по-видимому, внедрены в желатинозную мембрану, но взаимодействие отолитов с киноцилием волосковой клетки отличается: киноцилий рыбок данио внедрен в ранний отолит, тогда киноцилий мыши косвенно взаимодействует с большинством отоконий посредством отокониальной мембраны (Fig. 2C and F). Несмотря на это гомологичные белки, по-видимому, обеспечивают прикрепление в обеих модельных системах.
Отокониальная мембрана состоит из коллагенозного белка Otolin, а также 5 не коллагеновых гликопротеинов (Otogelin, Otogelin-like, α-Tectorin, β-Tectorin, b Otoancorin) и KSPG(s). Otogelin является гликопротеином, которые присутствует только в бесклеточных мембранах внутреннего уха (Cohen-Salmon et al., 1997). Он экспрессируется поддерживающими клетками и экспрессия продолжается и во взрослом преддверии, но не в улитке (El-Amraoui et al., 2001). Otogelin необходим для закрепления отокониальной мембраны и cupula с соотв. сенсорным эпителием. Мутантные по Otogelin мыши обнаруживают смещение бесклеточного матрикса и тяжелые вестибулярные нарушения (Simmler et al.,2000a,b). Эти мыши также глухи из-за дефектов в организации фибриллярной сети текториальной мембраны.
Otogelin и Otogelin-like мыши имеют сходные аминокислоты в 33.3% (56.0% сходства), но последний экспрессируется на более низких уровнях в разных тканях человека (Yariz et al., 2012). Мутации в гене Otogelin-like также вызывают от слабой до умеренной потери слуха у людей (Bonnet et al., 2013; Yariz et al., 2012), а нокдаун otogelin-like у рыбок данио приводит к нейросенсорной глухоте (Yariz et al., 2012). От человека до рыбок данио Otogelin-like присутствует во всех трех бесклеточных мембранах внутреннего уха, как и Otogelin. Однако, клетки, экспрессирующие его слегка отличны: помимо поддерживающих клеток, экспрессирующих Otogelin, Otogelin-like экспрессируется также в наружных волосковых клетках улитки и волосковых клетках мешочка. Уровень экспрессии наивысший во время эмбрионального развития и постепенно снижается от новорожденных ко взрослой стадии. Следовательно, Otogelin и Otogelin-like выполняют сходные, но не перекрывающиеся роли во время развития внутреннего уха.
α - и β -Tectorin являются главными не-коллагеновыми гликопротеинами текториальной пластинки млекопитающих (Legan et al., 1997) м отокониальных мембран, но не присутствует в cupula (Goodyear and Richardson, 2002; Xu et al., 2010). α -Tectorin является glycosylphosphatidylinositol (GPI)-сцепленным белком, который, по-видимому, является KSPG (Legan et al., 1997; Kramer unpublished data). Нулевые мыши по α -Tectorin имеют редуцированную отокониальную мембрану и немногие разбросанные гигантские отоконии (Legan et al., 2000). Мутации α-Tectorin вызывают аутосомно доминантную и рецессивную выраженную потерю слуха у человека (Alloisio et al., 1999; Mustapha et al., 1999).
β-Tectorin экспрессируется в striolar регионе utricule и saccule, тогда как α-Tectorin экспрессируется в переходной зоне и регионе крыши (roof) (Legan et al., 1997; Rau et al., 1999). Разрушение текториальной мембраны связано с потерей слуха низких частот у Tectb нулевых мышей (Russell et al., 2007), пока не описаны вестибулярные дефекты. Несмотря на это, нокдаун tectb у рыбок данио влияет на позицию и количество отолитов (Yang et al., 2011a). Др. отоконины, включая, Otogelin и α-Tectorin, обладают несколькими для von Willebrand factor type D доменами, которые содержат консенсусный сайт мультимеризации CGLC (Mayadas and Wagner, 1992), подтверждая, что эти структурные свойства приводить к образованию гетерогенных, высокого порядка структур.
В интерфейсе между сенсорным эпителием и лежащими поверх бесклеточными мембранами внутреннего уха находится др. GPI-закрепленный белок, Otoancorin (Zwaenepoel et al., 2002). Хотя мутации Otoancorin приводят к аутосомно рецессивной потере слуха у человека (Walsh et al., 2006; Zwaenepoel et al., 2002), текториальная мембрана остается соприкасающейся с сенсорными волосковыми клетками мыши, которые дефицитны по Otoanchorin (Lukashkin et al., 2012). Нарушения равновесия не были описаны у людей и мышей, дефектных по Otoanchorin; и otoanchorin, по-видимому, не экспрессируется во внутреннем ухе рыбок данио (Kramer, unpublished data), всё это указывает на то, что Otoanchorin не является критическим в вестиб4улярной системе.
Cells and Cellular Processes Involved in Otoconia and Otolith Formation
Participating Cell Types and Cellular Structures
Отоконии и отолиты лежат поверх сенсорного эпителия, все же все эпителиальные клетки в utricle и saccule участвуют в образовании отокониев и отолитов, синтезируемых различными отоконинами и регуляторными белками: Oc90 экспрессируется во всех не-сенсорных эпителиях, Otolin, Sc1 и Otop1 в волосковых и поддерживающих клетках, Nox3, Noxo1 и PMCA2 в волосковых клетках, p22phox (3-й компонент Nox комплекса) в эндолимфатических протоке и мешке, Pendrin в переходных клетках и разные карбонангидразы в сенсорном и не сенсорном эпителии (references are listed in each corresponding sub-sections). Морфологически и функционально сходные маргинальные клетки в stria vascularis, тёмные клетки в utricle млекопитающих экспрессируют немногие отокониальные белки (Oc90, α-Tectorin, и carbonic anhydrases) и активно транспортируют ионы (включая Ca2+, HCO3-, Cl- и H+) благодаря экспрессии многочисленных ионных каналов и транспортеров (Pendrin, KCNQ1, KCNE1, ATP1B2, ATP1A1 и SLC12A2). Экспрессия ионных каналов и транспортеров в эндолимфатическом мешке у мыши или в полукружных каналах у рыбок данио также помогают оптимизировать условия образования и поддержания отоконий (Abbas and Whitfield, 2010; Dou et al., 2004; Grunder et al., 2001; Lee et al., 2001; Salt, 2001; Stankovic et al., 1997; Taguchi et al., 2007; Wangemann et al., 1996).
Чтобы сохранить сбалансированный ионный состав эндолимфы у мышей и рыбок данио, отоцист д. поддерживаться как герметический пузырёк, окруженный поляризованным эпителием, с которым контактирует с помощью плотных апикальных соединений. Комплексы апикальных соединений аномальны во внутреннем ухе рыбок данио, несущих мутации в транскрипционном факторе Grhl2 (Han et al., 2011). Отолиты значительно редуцированы, отоцист расширен, а экспрессия claudin b и epcam драматически снижена. Удивительно, совместная инъекция claudin b и epcam может устранять мутантный фенотип. Мутации в epcam или белке плотных соединений claudin j также приводит у рыбок данио к более мелким отолитами и нарушениям равновесия (Hardison et al., 2005; Slanchev et al., 2009). Поскольку частицы зародышей аномально сохраняются у claudin j-мутантных рыбок данио, состав эндолимфы, по-видимому, является критическим для роста отолитов. Некоторые калаудины, экспрессируются в вестибулярном эпителии мыши и мутации множественных клаудинов ассоциируют с потерей слуха у мыши и человека (Ben-Yosef et al., 2003; Kitajiri et al., 2004; Nakano et al., 2009). Неожиданно, не выявлено очевидных вестибулярных нарушений у любых Claudin-дефицитных мышей и людей, подтверждая, что имеется функциональная компенсация с помощью др. белков плотных соединений. Однако, недавние данные анализа белка tricellular плотных соединений MarvelD2 вместо этого подтвердили, что образование отоконий и вестибулярная функция могут противостоять некоторым изменениям в ионном составе (Nayak et al.,2013). Мутации в MarvelD2 ассоциированы с аутосомно рецессивной не синдромальной глухотой у человека и мыши (Nayak et al., 2013; Riazuddin et al., 2006). Несмотря на присутствие ультраструктурных аномальных плотных соединений в эпителии улитки и преддверия, вестибулярная функция, по-видимому, нормальная у MarvelD2-мутантных мышей (Nayak et al., 2013).
Отолитические зародышевые частицы обычно прикреплены к киноцилию, специализированной неподвижной ресничке волосковых клеток у рыбок данио и высших позвоночных (Spoon and Grant, 2011). Кроме того, рыбки данио имеют подвижные реснички, которые локализуются рядом в волосковых клетках ранних рыбок данио (связующие клетки), нуждающиеся в dynein регуляторном комплексе для своей функции и вносящие вклад в асимметричную форму отолитов (Colantonio et al. 2009; Wu et al., 2011). У рыбок данио, у которых отсутствуют волосковые клетки, отолитическая масса агрегирует и плавает незакрепленная по отоцисту (Millimaki et al., 2007). Если волосковые клетки присутствуют, но образование ресничек блокировано, то зародышевые частицы прикреплены к и растут на поверхности волосковых клеток (Stooke-Vaughan et al., 2012). Эти результаты подтверждают, что отолитическая мембрана (или критический компонент) секретируется волосковыми клетками и является первичным посредником прикрепления отолитов, сродни с ролью отолитических мембран в отокониях млекопитающих. Тем не менее реснички являются критическими для нормального формирования отолитов у рыбок данио: дефектные отолиты наблюдаются у эмбрионов, которые дефицитны по любому из, по крайней мере, 16 связанных с ресничками генов, включая dyneins, центросомные белки и тубулин-модифицирующие энзимы (Colantonio et al., 2009; Lee et al., 2012) (Fig. 1). Т.к. многие из этих генов выполняют перекрывающиеся функции при биогенезе ресничек, то и везикулярный транспорт и передача межклеточных сигналов, возможно и др. клеточные функции также затрагиваются.
Critical Molecular Processes
Недавний протеомный анализ сравнил вестибулярные волосковые клетки с не сенсорными клетками и обнаружил, что приблизительно 50% волосковых клеток обогащены белками, участвующими в доставке белков, тогда как только 4% не сенсорных клеток были обогащены белками, ассоциированными с внутриклеточным транспортом (Herget et al., 2013). Наиболее многочисленным белком, обнаруженным Herget et al.в их фракции волосковых клеток был Otoferlin, важный регулятор экзоцитоза синаптических пузырьков и высвобождения нейротрансмиттера в волосковых клетках (Dulon et al., 2009). Поскольку трафик к базолатеральным синапсам является важным для сенсорной передачи, постольку внутриклеточный транспорт к апикальной части мембраны является критическим для сборки отолитов и ресничек. Белки, которые обеспечивают доставку из аппарата Гольджи в апикальную плазматическую мембрану, включают Otop1 и некоторые адапторные белки из транспорта покрытых пузырьков, (rev. Hughes et al., 2006). Отоконии отсутствуют или уменьшены у мышей с мутациями в адапторных белках Mocha, Muted и Pallid (Falcon-Perez et al., 2002; Rolfsen and Erway, 1984; Trune and Lim, 1983b), а отолиты неспособны формироваться у рыбок данио с мутациями в гомологе Pallid (Amsterdam et al., 2004). Удивительно, экспрессия одних и тех же адапторных белков и секреция отоконинов совместно снижены в двух линиях мышей с мутациями в аутофагических протеиназах Atg4b и Atg5 (Marino et al.,2010). Поскольку рыбки данио с мутациями в atg5 также имели дефектные отолиты (Hu et al., 2011), связь между аутофагией и секрецией, скорее всего, законсервирована во внутреннем ухе. Более того, экспрессия некоторых белков специфически на кончиках стереоцилий законсервирована в кохлеарных и вестибулярных волосковых клетках (Grati and Kachar, 2011), подтверждая, что механизмы корректного транспорта белков в слуховых и вестибулярных волосковых клетках могут быть законсервированы.
Некоторые межклеточные сигнальные молекулы, их рецепторы и нижестоящие транскрипционные факторы затрагивают формирование отокониев и отолитов (Fig. 1 and Table 1). Поскольку эти молекулы, как известно, регулируют дифференцировку как нейрональных, так и не нейрональных клеток во внутреннем ухе, то наблюдаемые эффекты на отоконии и отолиты могут быть косвенными или вторичными. Интересующихся, как эти молекулы регулируют образование необходимых типов клеток или формирование биокристаллов мы отправляем к недавним обзорам (Groves et al., 2013; Maier et al., 2014). Коротко, FGF, TGFβ , Hedgehog, BMP4, Wnt5b, ретиноевая кислота и передача сигналов Notch вместе служат в качестве внешних факторов, которые индуцируют и формируют паттерн предшественников внутреннего уха на разных ст. развития (Esterberg and Fritz, 2009; Hammond et al., 2003; Leger and Brand, 2002; Louwette et al., 2012; Pujades et al., 2006; Radosevic et al., 2011; Sap?de and Pujades, 2010). Эти молекулы, которые в свою очередь воздействуют на внутренне присущие транскрипционные факторы, включают Sox2, Neurog1 и Atoh1 (Bermingham et al.,1999; Zheng and Gao, 2000; Millimaki et al., 2007; Radosevic et al., 2011; Raft et al., 2007; Sap?de et al., 2012). На более поздних стадиях развития Atoh1 является важным для формирования стереоцилий и жизнеспособности волосковых клеток (Cai et al., 2013; Chonko et al., 2013). Кроме того, микроРНК, по-видимому, модулируют образование, созревание и поддержание волосковых клеток и их жизнеспособность (Friedman et al., 2009; Weston et al., 2011). Все эти функции д. в конечном итоге влиять на формирование и поддержание биокристаллов.
Table 1. References for Zebrafish Proteins Listed in Figure 1 That Are Not Discussed in the Main Texta
Degeneration and Regeneration of Otoconia
Мало известно относительно вопроса дегенерации и регенерации отокониев. Как упоминалось выше, дегенерация отоконий превалирует у старых людей (Anniko et al., 1984; Igarashi et al., 1993; Ross et al., 1976) и грызунов (Jang et al., 2006; Lim, 1984). Старение вызывает разнообразные побочные изменения во внутреннем ухе, такие как нарушение гомеостаза ионов эндолимфы (Gratton et al., 1997), это д. затрагивать отоконии. Недостаточная экспрессия отокониальных белков (Xu and Lundberg,2012 2012) и ломкость закрепляющих филамент, приводит к дегенерации и смещению. Возобновление экспрессии отокониальных белков, с помощью доставки с аденовирусами соотв. генов или с помощью некой химической индукции, может оказаться способной регенерировать отоконии или замедлить их дегенерацию.
Поскольку волосковые клетки экспрессируют критические отокониальные белки и каналы и насосы и являются важными для секреции компонентов прикрепления мембраны, то дегенерация отокониев может сопровождаться потерей волосковых клеток, обычно наблюдаемой у пожилых (Merchant et al., 2000). В дополнение к старению волосковые клетки становятся чувствительными к повреждениям из-за травмы и к aminoglycoside ото-токсичности, тогда как поддерживающие клетки менее уязвимы (Lee et al., 2013). Поскольку эти факторы также вносят вклад в BPPV, защищая или регенерируя сенсорные волосковые клетки, то возможны стратегии лечения вестибулярной дисфункции (Cabrera Kang and Tusa, 2013). В самом деле, аденовирусная доставка Atoh1 в поддерживающие клетки внутреннего уха недавно была одобрена для клинических испытаний на человеке для лечения нарушений слуха и равновесия (G?l?oc and Holt, 2014). Вестибулярные волосковые клетки млекопитающих также недавно были сгенерированы из плюрипотентных стволовых клеток путем воспроизведения времени отногенетического действия передачи сигналов BMP, TGFβ, и FGF (Koehler et al., 2013). Вотличие от таковых в ухе млекопитающих, рыбки данио регенерируют свои волосковые клетки, а лежащие в основе механизмы стали фокусом многих исследований (Steiner et al., 2014). Однако, было также продемонстрировано, что aminoglycosides могут непосредственно вызывать деградацию отокониев in vitro (Walther et al., 2014). Возникают ли вызываемые aminoglycoside вестибулярные нарушения в результате потери волосковых клеток или непосредственно из-за деградации отокониев, представляет особый интерес в свете эффектов регенерации волосковых клеток на структуру отокониев и отолитов.
Summary and Future Directions Great progress has been made in the research in otoconia and otolith development in recent years. It is now clear that, despite their apparently simple structures, the processes governing the development of these crystals are complex and involve a series of temporally and spatially well-coordinated cellular and extracellular events. As summarized in Figure 2G, several molecules from different pathways (channel/pump, enzymatic and trafficking processes) work in concert to increase the local concentrations of Ca2+ and HCO3- to form CaCO3crystallites. At the same time or beforehand, Oc90 selectively recruits other otoconins to form an initial matrix to facilitate the seeding process. Continuous addition of organic and inorganic components and fusion of several minute crystallites ensure proper growth. The otoconial membrane is critical to the correct anchoring of the growing crystals. Thus, multiple mechanisms drive each of the three steps in bio-crystal formation illustrated in Figure 2.
Much more work is needed to define the roles of many newly discovered proteins. Murine models with targeted disruption of many genes are not yet available, and double mutants could yield important details on the shared pathways of otoconial proteins. At least 70 additional mutant zebrafish have been identified with defective otoliths, but the responsible genes are yet unclear. Additional studies are needed to uncover what drives otoconia formation in specific locations, and how to prevent and treat degeneration. These types of studies are the foundation required to design future therapies to treat otoconia-related vertigo and balance disorders.
|