Посещений:
РАЗВИТИЕ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ



человек

Human pancreas development
Rachel E. Jennings, Andrew A. Berry, James P. Strutt, David T. Gerrard, Neil A. Hanley
Development 2015 142: 3126-3137; doi: 10.1242/dev.120063

A wealth of data and comprehensive reviews exist on pancreas development in mammals, primarily mice, and other vertebrates. By contrast, human pancreatic development has been less comprehensively reviewed. Here, we draw together those studies conducted directly in human embryonic and fetal tissue to provide an overview of what is known about human pancreatic development. We discuss the relevance of this work to manufacturing insulin-secreting ?-cells from pluripotent stem cells and to different aspects of diabetes, especially permanent neonatal diabetes, and its underlying causes.


Рисунки к статье

Поджелудочная железа сложный орган, происходящий из двух зачатков, дорсального и вентрального, которые возникают с каждой из сторон энтодермы дистальной части передней кишки. Она содержит разные комбинации клеточных клонов. Экзокринная часть представлена ацинарными клетками, которые секретируют переваривающую жидкость и систему протоков, с помощью которых жидкость дренируется в кишечник. Эндокринная порция представлена в виде дискретных островков Лангерганса, которые представлены многими отличающимися типами клеток, секретирующими (по крайней мере) пять разных гормонов в кровообращение (α-клетки, глюкагон; β-клетки, инсулин; δ-клетки, соматостатин; ε-клетки, ghrelin; и γ [или PP]-клетки, панкреатические полипептиды). Клетки с такими радикально различающимися функциями у взрослых развиваются из одних и тех же предшественников. Наше понимание того, как формируется орган у людей, базируется на экстраполяциях данных, полученных у др. видов, особенно мышей (J?rgensen et al., 2007; Murtaugh, 2007; Pan and Wright, 2011; McCracken and Wells, 2012).
Существует особенно настоятельный интерес к пониманию развития поджелудочной железы у людей, из-за довольно-таки разных форм терапии диабета, растущих проблем со здоровьем в мире. Открытие pluripotent stem cell (PSC) предоставило довольно доступную человеческую модель для изучения ранних онтогенетических событий и представление, как генерируются инсулин-секретирующие β-клетки человека in vitro (rev. Pagliuca and Melton, 2013). β-клетки теряются в результате аутоиммунной деструкции при type 1 diabetes mellitus (T1D) с последующей неспособностью восстанавливать уровни глюкозы в крови. PSCs дифференцируются в β-клетки вселяют огромную надежду на трансплантации при T1D или открытие лекарств, связанных с диабетом (Hanley, 2014). Генерация дифференцирующихся PSCs, базирующихся на понимании онтогенетических процессов и оценке их пригодности в качестве терапевтического подхода, требует детальных знаний об эквивалентных клетках in vivo. В противоположность T1D, type 2 diabetes (T2D), является наиболее преобладающей формой нарушения, он обычно характеризуется прогрессирующей неспособностью β-клеток удовлетворять потребности тела в инсулине. Genome-wide association (GWA) исследования идентифицировали большие количества вариантов последовательностей в геноме человека, ассоциированных с T2D (Mahajan et al., 2014). Важные функциональные признаки были описаны для некоторых из этих вариантов вл взрослых β-cells (Pasquali et al., 2014). Однако, по крайней мере, некоторые локусы, GWA сигналы могут увязать с онтогенетическими событиями, если достаточное количество функциональных β-клеток будет сгенерировано для постнатального метаболического контроля (Travers et al., 2013).В самом деле, некоторые варианты располагаются в тесной близи к генам, известными в качестве моногенной причины диабета в случае мутации. Эти гены обнаруживают тенденцию кодировать транскрипционные факторы, регулирующие развитие поджелудочной железы у др. видов (Vaxillaire et al., 2012; Rubio-Cabezas and Ellard, 2013; Flanagan et al., 2014; Rubio-Cabezas et al., 2014; Schwitzgebel, 2014). Более того, сегодня очевидно, что онтогенетическая патология может быть ассоциирована с альтерациями регуляторных элементов вне последовательностей кодирующих генов (Weedon et al., 2014). Такие элементы в меньшей степени законсервированы, чем кодирующие последовательности генов, которые они регулируют; т.о, выводя сделанные на др. видах не являются прямолинейными, частично наше знание достигается посредством моделирования развития поджелудочной железы из дифференцирующихся PSCs человека (Weedon et al., 2014).

Timeline and regulators of human pancreas development


Pancreas specification and morphogenesis


Эмбриогенез человека от оплодотворения для приблизительно 8 weeks post-conception (wpc), после чего эмбрион обозначается как плод. Эмбриональное развитие подразделено на 23 разные Carnegie Stages (CS) (O'Rahilly and M?ller, 2010) (Table 1). Продолжительность развития (иногда искусственно) подразделяют на индивидуальные стадии по морфологии. После имплантации сюда входят ранние внутренние дискриминаторы, видимые под световым микроскопом, такие как количество пар сомитов. После этого большое значение уделяется внешним признакам, таким как детали развития конечностей или появление пигментации сетчатки. Т.о., эмбриогенез человека разделен на стадии по зрелости и по продолжительности во времени [напр. 'days post-conception' (dpc)]; это слегка отличается от модельных видов, таких как мыши, для которых классификация на стадии наиболее впечатляющая, но эмбриогенез обычно описывается как время, прошедшее 'после спаривания' или 'после оплодотворения'.

Table 1. Stages of human embryonic development, key features and estimation of equivalent timeline of mouse development

У мышей плоский лист энтодермы сворачивается, чтобы сформировать первичную кишечную трубку, которая подразделяется на переднюю, среднюю и заднюю кишку (J?rgensen et al., 2007; Pan and Wright, 2011). Передняя энтодерма инвагинирует, чтобы сформировать anterior intestinal portal (AIP), который маркирует границу между передней и средней кишкой и это является местом спецификации поджелудочной железы [которая возникает на день эмбриогенеза (E) 7.5 у мышей]. Индукция поджелудочной железы происходит на эквивалентном месте и очень сходно или с незначительной задержкой у эмбрионов человека (Fig. 1; Table 1). На соотв. ст., CS9 у людей дефинитивная энтодерма всё ещё сообщается с висцеральной энтодермой желточного мешка (Jennings et al., 2013). Образование энтодермальных складок (и тем самым образование AIP) является лишь видимой стадией позднее, на CS10 (соответствующей приблизительно E8-E8.5 у мышей). Тем не менее, как и у др. видов, возникающая в результате энтодерма передней кишки человека располагается по соседству с хордой (Sadler, 2000) (Fig. 1). Из исследований на др. видах, мы знаем, что хорда заставляет формировать паттерн соседней передней кишки в дорсальный панкреатический зачаток в результате исключения sonic hedgehog (SHH), это делает возможной экспрессию ключевого транскрипционного фактора pancreatic and duodenal homeobox factor 1 (PDX1) (J?rgensen et al., 2007; Pan and Wright, 2011). В эмбрионах человека SHH может быть обнаружен на ст. CS10, а PDX1 на ст. CS12. Т.о., хотя время может быть слегка позднее, эти данные подтверждают, что этот аспект формирования паттерна поджелудочной железы у человека очень сходен с таковым у др. млекопитающих видов (Fig. 2). Напротив, не выявляется ранняя панкреатическая эндокринная дифференцировка (т. наз. ст. 'первичного перехода' развития поджелудочной железы мышей (Villasenor et al., 2008;Jennings et al., 2013), вообще-то из-за относительного отсутствия близости парной дорсальной аорты к ранней панкреатической энтодерме, ограничивая вероятность формирования раннего про-эндокринного паттерна, который обнаруживается у мышей и кур (Lammert et al., 2001; Bonal and Herrera, 2008).

Fig. 1. Human embryonic pancreas specification. (A) Carnegie stage 10. The schematic (sagittal) shows the proximity between the dorsal wall of the foregut endoderm (fe; blue) and the notochord (noto; red) at the level of the anterior intestinal portal (AIP; dashed line), which allows patterning of that region of dorsal foregut endoderm to a future pancreatic fate. The bright-field immunohistochemistry images show transverse sections at this level of the AIP for PDX1, SHH and FOXA2. FOXA2 marks the foregut endoderm and anterior neural tube (nt). PDX1, the key pancreatic transcription factor, is not yet expressed; however, the asterisked area in the PDX1 panel shows the region of presumptive pancreatic endoderm where SHH is already excluded. (B) Early Carnegie stage 13. The schematic (sagittal) shows the first signs of budding of the dorsal pancreas (dp; yellow) from the foregut endoderm (fe)/early embryonic duodenum (duo). By this stage, the liver bud has already extended ventrally as hepatic cords (hc; pink), the extrahepatic biliary duct (ehb; green) and gall bladder (gb; green). The immunohistochemistry sections (sagittal) show staining for FOXA2 (marks all of the structures), SOX9 (most clearly marks the foregut/duodenum, gallbladder and part of the extrahepatic biliary duct) and NKX6.1 (marks endocrine competent endoderm of the dorsal pancreatic bud). The lack of clearly visualized ventral pancreatic bud (vp; yellow) in the immunohistochemistry sections is due to the plane of tissue sectioning. Counterstaining is with Toluidine Blue. Scale bars: 50 ?m (A); 100 ?m (B).

Fig. 2. Transcription factor network of human pancreas development. Transcription factors and other key markers that identify different cell types and stages during early pancreas specification and subsequent lineage commitment. Only dorsal pancreas specification is shown for simplicity (markers for the extrahepatic biliary duct are in gray). Factors highlighted are based on data from immunohistochemical studies of human pancreas development (see main text for details).

Вентральный и дорсальный панкреатические зачатки на ст. CS13 маркированы с помощью транскрипционных факторов SRY (sex-determining region Y)-box 9 (SOX9), PDX1 и GATA binding protein 4 (GATA4) (Piper et al., 2004;Jennings et al., 2013), все они необходимы для роста поджелудочной железы человека (Stoffers et al., 1997; Piper et al., 2002; Shaw-Smith et al., 2014). Дорсальный зачаток на ст. CS13 характеризуется также появлением микропросветов (Jennings et al., 2013): первый признак развивающейся просветной сети, с помощью которой секреты ацинарных клеток будут отводиться впоследствии в кишечник (Kesavan et al., 2009; Villasenor et al., 2010). Хотя процесс эпителиального ветвления и поляризации не был выяснен до конца во время развития у человека, данные подтверждают, что взаимодействие между регуляторами нейральной миграции (такими как netrins) и компонентами ВКМ (такими как integrins) играют важную роль в клеточной адгезии и миграции панкреатической энтодермы (Yebra et al., 2003, 2011). В течение остальной части эмбрионального периода поджелудочная железа человека подвергается значительной экспансии за счет пролиферирующих клеток предшественников. У человека, в отличие от мыши, Nirenberg and Kim homeobox factor (NKX) 2.2 (NKX2-2 - Human Gene Nomenclature Database) белок не выявляется в этих клетках (Jennings et al., 2013). Различия в панкреатических клетках предшественниках становятся заметными на ст. CS19, когда SOX9+/NKX6.1+ (NKX6-1 - Human Gene Nomenclature Database) центральные похожие на протоки структуры ('trunks') обнаруживают меньше GATA4, тогда как более периферические собранные в кластеры клетки, наз. ('tips') являются SOX9+/GATA4+/NKX6.1+ (Fig. 2). На ст. 10 wpc, эти будущие ацинарные 'кончиковые' клетки более не содержат NKX6.1 (Jennings et al., 2013). Это подразделение напоминает сегрегацию компартмента ацинарных клеток у мышей (Esni et al., 2004; Solar et al., 2009; Schaffer et al., 2010) и это также схоже с тем, что инициируется перед основной волной эндокринной дифференцировки. Однако, у человека полное разрешение профилей транскрипционных факторов, напр., потери SOX9 из ацинарных клеток, задерживается (между 10 и 14 wpc) (Jennings et al., 2013) по сравнению с мышами, к которых SOX9 теряется быстро из из периферических кончиковых клеток (Schaffer et al., 2010).
Некоторые группы, как было установлено, со временем развития поджелудочной железы человека становятся всё менее пролиферативными, и при этом сохраняющаяся пролиферация располагается более периферически относительно центральных регионов туловища, как и у др. видов (Polak et al., 2000; Piper et al., 2004; Sarkar et al., 2008). Потенциал развития предшественников в конце эмбриогенеза и начале плодного периода выяснялся Scharfmann с колл., которые трансплантировали целый орган перед существенной эндокринной дифференцировкой (на ст. ~8 wpc) под капсулу почки взрослым мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID). Они наблюдали значительный рост поджелудочной железы, содержащей все клоны клеток, включая островки, которые оказались способны устранять гипергликемию у мышей (Castaing et al., 2001,2005). Интересно, что благодаря использованию мечения bromodeoxyuridine (BrdU) и инкубации in vivo у мышей, они показали. что ацинусы, по-видимому, развиваются клонально из ацинарных предшественников (т.e. клеток, которые уже содержат carboxypeptidase A, оставаясь пролиферативными). Напротив, хотя ранние PDX1+ панкреатические предшественники были пролиферативными, как только клетки подвергались дифференцировке в β-клетки, скорость репликации существенно снижалась (Castaing et al., 2005). Недавно, Scharfmann с колл., используя ту же самую технику инкубации in vivo у мышей клеток предшественников плодов человека как части протокола для достижения захватывающего развития чувствительной к глюкозе линии β-клеток человека (Ravassard et al., 2011; Scharfmann et al., 2014).
По сравнению с исследованиями на др. видах, затруднительно получение информации о сигнальных путях, регулирующих развитие поджелудочной железы человека. В значительной степени это обусловлено существенными затруднениями по получению первичных моделей человеческих панкреатических предшественников, пригодных для долговременного культивирования и адаптации. В попытке выяснить точные сигнальные пути, которые регулируют, по крайней мере, частично, эффекты около-панкреатической мезенхимы на рост поджелудочной железы, Scharfmann с колл. использовали комбинацию экспериментов с человеком и мышами для установления роли передачи сигналов fibroblast growth factor (FGF) , скорее всего, FGF1, FGF7 и FGF10, действующих посредством FGF рецептора подтипа 2B (который связывает все три эти изоформы FGF) (Elghazi et al., 2002; Ye et al., 2005). Эти данные согласуются с концепцией, согласно которой, у мышей, Fgf10 не нужен для инициального образования зачатка, но важен для пролиферации последующих клеток предшественников (Bhushan et al., 2001). С помощью сравнительной транскриптомики, анализ онтологии генов подчеркивает обогащенность компонентами передачи сигналов WNT в панкреатических предшественниках человека на ст. CS16-CS18, перед существенной дифференцировкой ацинарных клеток и перед примечательной эндокринной дифференцировкой (Cebola et al., 2015). Эти данные созвучны с полученными на мышах (Rodr?guez-Seguel et al., 2013) а, совсем недавно, с результатами использования новой методологии по долговременному культивированию человеческих панкреатических предшественников, показавших позитивные эффекты передачи сигналов WNT, FGF10 и epidermal growth factor (EGF) на пролиферацию клеток (Bonfanti et al., 2015). Рядом с этой способствующей пролиферации поддержкой статуса предшественников, EGF также ингибирует эндокринную дифференцировку (Bonfanti et al., 2015). Кстати, роль передачи сигналов Notch и ретиноевой кислоты в обеспечении пролиферации клеток предшественников или передачи сигналов bone morphogenetic protein (BMP) в её ингибировании, не были непосредственно проанализированы во время эмбриогенеза человека, хотя эти факторы, как известно, важны у мышей (J?rgensen et al., 2007; Pan and Wright, 2011).

Endocrine differentiation


Транскрипционный фактор neurogenin 3 (Neurog3) временно необходим для детерминации мышиных клеток предшественников в центральных похожих на протоки структурах, чтобы они приобрели судьбу эндокринных клеток (Gradwohl et al., 2000; Schwitzgebel et al., 2000; Gu et al., 2002) (Fig. 2). Во время развития человека экспрессия NEUROG3 быстро увеличивается непосредственно после эмбрионального периода, очерчиваемого появлением плодных β-леток, которые являются первыми и наиболее многочисленными островковыми типом клеток в развитии человека (Piper et al., 2004; Lyttle et al., 2008; Piper Hanley et al., 2010; Jennings et al., 2013). SOX9 отсутствует в клетках с высокими уровнями NEUROG3 и не обнаруживается в эндокринных клетках после этого, хотя он сохраняется в клетках панкреатических протоков (Jennings et al., 2013). Имеет место дополнительное обнаружение как SOX9+/NEUROG3+(weak) клеток, так и hormone+/NEUROG3+(weak) клеток, это согласуется с той же самой преходящей ролью NEUROG3 в поджелудочной железе человека и мыши (Lyttle et al., 2008; Jeon et al., 2009; Piper Hanley et al., 2010; Jennings et al., 2013). Кластеры β-клеток имеют хорошее кровоснабжение с 10 wpc, а на ст. 12-13 wpc островки уже без сомнения содержат α-клетки, β-клетки, δ-клетки и γ-клетки (Piper et al., 2004; Jennings et al., 2013). Пик обнаружения NEUROG3 приходится приблизительно на конец первого триместра и не обнаруживается в плодах человека после 35 wpc (Salisbury et al., 2014). С помощью дополнительных логических выводов из экспериментов с плодной поджелудочной железой человека у мышей, NEUROG3, по-видимому, выключается в некоторых точках после 26-28 wpc (Capito et al., 2013). Вместе с данными, демонстрирующими минимальное умножение экспрессии в пуле нативных предшественников β-клеток человека post-NEUROG3 (Castaing et al., 2005), объединенные данные по PSCs человека подразумевают, что эндокринная дифференцировка у человека базируется целиком на NEUROG3 (McGrath et al., 2015), это подразумевает, что распределение человеческих β-клеток in utero завершается, по крайней мере, на 5 неделе, а, скорее всего, в 3 мес., до рождения. Это важно, поскольку это подразумевает, что плодная масса β-клеток после этого является отражением пролиферации β-клеток в сравнении с апоптозом скорее, чем дальнейшей спецификации новых β-cells.
Гипотеза, связывающая субоптимальное развитие массы β-клеток у плодов и будущий риск возникновения T2D, привлекла много внимания (Hales and Barker, 1992; Hattersley and Tooke, 1999). Исследование потомства после зимнего голода в Нидерландах 1944-1945 показали, что у последнего присутствуют нарушения секреции инсулина и непереносимость глюкозы, но нет резистентности к действию инсулина, у индивидов без диабета это коррелировало с недоеданием вплоть до 32 недель беременности (de Rooij et al., 2006), очень сходно с периодом времени экспрессии NEUROG3 (Salisbury et al., 2014). Следовательно, возможно предсказать, что, по крайней мере, некоторые GWA сигналы для T2D могут быть связаны с событиями во время развития поджелудочной железы, такими как пролиферация клеток предшественников или дифференцировка β-клеток скорее, чем с функциональными атрибутами взрослых β-клеток . Одним из примечательных примеров является локус KCNQ1. Два независимых региона ассоциации в этом локусе являются необычными тем, что расположены в импринтируемом регионе на 11p15.5, для которого риск существует только в случае материнского наследования (Kong et al., 2009). Gloyn, Travers с колл. изучали паттерны метилирования в плодной поджелудочной железе человека во время периода эндокринной дифференцировки и в островках взрослых людей (Travers et al., 2013). Хотя количество плодных выборок было довольно ограниченным, они продемонстрировали, что KCNQ1 и его частично дублирующий транскрипт моноаллельно экспрессировались только в выборках плодов. Фактически, риск может быть связан с функцией соседнего гена CDKN1C, который был моноаллельным в выборках плодов и взрослых, но это исследование открывает возможность, что, по крайней мере, риск T2D вариантов связан специфически с событиями во время развития поджелудочной железы человека. Эта возможность позволяет дальнейшие исследования, особенно если локусы риска могут быть идентифицированы там, где экспрессируются ассоциированные гены в поджелудочной железе плодов, но не во взрослых β-клетках. В данное время пример single nucleotide polymorphisms (SNPs) из исчерпывающего мета-анализа T2D в точности совпадает с количеством генов, выполняющих ключевую роль в развитии поджелудочной железы, таких как PDX1, HNF1B, HNF4A, GLIS3, HHEX, NOTCH2 и PROX1 (Mahajan et al., 2014) (Table 2), или которые обладают широкой регуляторной ролью в развитии органа, такие как HMGA2 (Ashar et al., 2010).

Table 2. Factors affecting human pancreas development

Mapping human PSC differentiation onto human pancreas development


C момента первых экспериментов по панкреатической дифференцировке человеческих PSCs прошло 15 лет (Assady et al., 2001), имеет место сближение протоколов дифференцировки во время последней декады в пионерских публикациях Baetge с колл. (D'Amour et al., 2005, 2006; Kroon et al., 2008; reviewed by Docherty et al., 2007; Pagliuca and Melton, 2013). Хотя эти протоколы по генерации панкреатических предшественников, дифференцированные эндокринные клетки обнаруживают тенденцию продуцировать глюкагон и инсулин. Это было воспринято, как указание на незрелость, так как это было также отмечено для др. энтодермальных производных переденей кишки (Baxter et al., 2015). В самом деле, Melton с колл. идентифицировали сходства в транскрипции между происходящими из PSC β-клетками и плодными β-клетками человека, это может объяснить относительное отсутствие чувствительности к глюкозе (Hrvatin et al., 2014). Хотя плодные β-клетки человека секретируют инсулин и была показана некоторая чувствительность к глюкозе во время первого триместра (Otonkoski, 1988; Otonkoski et al., 1988), уровни глюкозы у плодов, как полагают, регулируются обычно с помощью переноса материнской глюкозы. Относительная незрелость происходящих из PSC β-клеток также может отражать отсутствие соотв. онтогенетической ниши, содержащей необходимые сигнальные факторы для дифференцировки панкреатических клеток (Pagliuca and Melton, 2013), это согласуется с более значительной зрелостью, достигаемой после инкубации in vivo у мышей, по сравнению с терминальной дифференцировкой в чашке (Kroon et al., 2008). Этот вопрос незрелости дифференцировки β-клеток, по крайней мере, частично может быть переадресован к двум группам, сообщившими об улучшенных протоколах (Pagliuca et al., 2014; Rezania et al., 2014). Улучшенные протоколы удивительно сходны с особенно обширным анализом, проведенным Kieffer с колл. (Rezania et al., 2014). Эти успехи связаны с исчерпывающими работами др., что делает их дельными в попытке скоррелировать их последний из 7 стадий протокол (Fig. 3) согласующийся с развитием поджелудочной железы человека.

Fig. 3. In vitro differentiation of human PSCs (hPSCs) towards pancreatic ?-cells. Schematic overview of the stages of in vitropancreatic differentiation using recently published, improved protocols (Pagliuca et al., 2014; Rezania et al., 2014). Key molecular markers of each stage are highlighted, as are the factors used at each stage to direct differentiation along the appropriate route. SANT, Hedgehog signaling antagonist; LDN, BMP type 1 receptor inhibitor; T3, triiodothyronine; ALK5i, ALK5 inhibitor; Vit C, vitamin C.
Перед спецификацией панкреатической энтодермы (ст. 4 протокола), мало что можно установить непосредственно из изучения эмбриогенеза человека. После этого профили экспрессии из человеческих выборок подтверждают использование SHH ингибиторов, таких как SANT, чтобы поощрить формирование панкреатической энтодермы из предшественников в передней кишке (D'Amour et al., 2005, 2006; Jennings et al., 2013; Pagliuca et al., 2014; Rezania et al., 2014). Используя FGFs, BMP ингибиторы, такие как Noggin или LDN, и ретиноевую кислоту (RA), чтобы управлять дифференцировкой передней кишки и панкреатической спецификацией (ст. 3 и 4), не тестируется на эмбрионах человека, но согласуется с исследованиями на др. видах (Bhushan et al., 2001; Elghazi et al., 2002; Stafford and Prince, 2002; Ye et al., 2005; Wandzioch and Zaret, 2009; Guo et al., 2013; Pagliuca et al., 2014; Rezania et al., 2014). Панкреатические энтодермальные клетки, генерируемые Rezania et al. (2014), и те, что из совсем недавнего сообщения (Russ et al., 2015), оказались выдающимися в отношении профилей транскрипционных факторов PDX1, NKX6.1 и SOX9, и в отношении отсутствия NKX2.2, воспроизводили развитие поджелудочной железы человека (Jennings et al., 2013) (Fig. 3). Протокол от Rezania, Kieffer с колл. также использовал трехмерную культуру, что позволяло очень близко воспроизводить развитие in vivo (Rezania et al., 2014). Однако, хотя это потенциально ускоряет появление NEUROG3 (ст. 5), он в целом не вызывает отличий в эффективности и возможной зрелости дифференцировки β-клеток из PSCs человека (McGrath et al., 2015). Интересным дополнением к превращению зрелых эндокринных предшественников в более функциональные β-клетки (sст. 6 и 7) стал супрафизиологический тироидный гормон, tri-iodothyronine (T3). Хотя T3, как известно, способствует созреванию печени, отсутствуют доказательства, что он затрагивает развитие поджелудочной железы у эмбрионов человека; врожденный гипотериоз, относительно распространенное детское заболевание, которое может вызывать весьма вредные эффекты на нейральное развитие, откровенно не влияет на гомеостаз глюкозы.
Значение эндокринных клеток, содержащих инсулин и глюкагон, по PSC протоколам остается неясным. Самые последние методы были улучшены существенно, чтобы генерировать значительно большую пропорцию моногормональных клеток - это ключевой успех (Pagliuca et al., 2014; Rezania et al., 2014). Весьма вероятно, что достигнутая с помощью стимуляции продукция MAFA, критического β-клеточного транскрипционного фактора, в ядрах созревающих β-клеток (Rezania et al., 2014), который появляется вследствие добавления ингибитора к AXL рецепторной тирозин киназе, в комбинации с T3 и ингибированием TGFβ type 1 receptor kinase (ALK5; TGFBR1 - Human Gene Nomenclature Database). Кроме того, антиоксидант N-acetyl cysteine, в высоких дозах способствует локализации в ядре MAFA (Fig. 3, stage 7) (Rezania et al., 2014). Недавно, генерация клеток, продуцирующих два гормона, in vitro была увязана с использованием BMP ингибиторов во время панкреатической спецификации (Russ et al., 2015). Однако, вообще-то это чрезмерное упрощение, относительно этих insulin+/glucagon+ клеток с двойным окрашиванием как артефакта in vitro; они являются нормальным аспектом развития плода человека (Polak et al., 2000; Piper et al., 2004; Sarkar et al., 2008; Jeon et al., 2009; Riedel et al., 2012; Riopel et al., 2014). Частота их обнаружения сильно варьирует от ~5% до 92% эндокринных клеток, вообще-то благодаря различной чувствительности протоколов иммуногистохимии в разных группах или вариациям в возрасте изучаемого материала. Интересно, что Kieffer с колл. охарактеризовали эти нативные плодные клетки детально (Riedel et al., 2012). Их количество, по-видимому, прогрессивно уменьшается с начала эндокринной дифференцировки на ст. 8 wpc и затем они были едва обнаружимы во взрослой поджелудочной железе. Хотя клетки с двойным окрашиванием экспрессируют α-клеточный транскрипционный фактор ARX, они лишены β-клеточных факторов, PDX1, NKX6.1 и MAFA, это согласуется с in vitro происходящими из PSC би-гормональными клетками, которые, по-видимому, способны формировать моно-гормальнальные glucagon-позитивные клетки после трансплантации (Kelly et al., 2011; Rezania et al., 2013). Однако, в сочетании с данными по мышам нет доказательств, что нативные би-гормональные клетки являются естественными предшественниками любого из зрелых типов эндокринных клеток, в самом деле, данные противоречивы (Herrera, 2000). Их возможная судьба неясна. Вообще-то имеется некоторое перекрывание в развитии плода человека, природная толерантность к немногим бессмысленным клеткам, предназначенным погибнуть; или вообще-то такие клетки обладают пока ещё не установленной функцией, потенциально секретируя др. факторы или гормоны. Что ясно так это то, что сегодня наилучшими PSC-производными моно-гормональными β-клетками являются PDX1+, NKX6.1+ и MAFA+. Однако, они не являются совершенными инсулин-продуцирующими клетками: пока неясно, почему секреция инсулина прекращается в ответ на низкий уровень в крови глюкозы при том же самом пороге, что и в нормальных β-клетках, что жизненно необходимо для клинических трансплантаций (Hanley, 2014), и только незначительное количество клеток демонстрирует соотв. реакции на кальций и incretin (Rezania et al., 2014). Т.о., хотя достигнут существенный прогресс в отношении генерации in vitro полностью функциональных β-клеток, но эта задача еще не была поставлена.

Developmental disorders of the human pancreas


Мутации, в основном гомозиготные, в диапазоне транскрипционных факторов, как известно, нарушают развитие поджелудочной железы человека и могут вызывать permanent neonatal diabetes mellitus (PNDM) способом широко согласующимся с находками по целенаправленным нарушениям у мышей. PNDM обнаруживает тенденцию к ассоциации с низким весом при рождении, по-видимому, отражающим неадекватную секрецию инсулина, основного ростового фактора, из плодных β-клеток. Известные причины PNDM рассматриваются здесь, что каждая из них почти обязательно воздействует на развитие из клеток предшественников, и не является функцией окончательно дифференцированных β-клеток, согласно, по крайней мере, некоторым доступным данным из непосредственных исследований развития поджелудочной железы человека (Table 2). Ряд др. условий также подчеркивает где происходит нарушение развития поджелудочной железы. Др. причины моногенных диабетов, включая преходящий диабет новорожденных, описаны др. (Flechtner et al., 2008; Vaxillaire et al., 2012; Rubio-Cabezas and Ellard, 2013; Flanagan et al., 2014;Rubio-Cabezas et al., 2014; Schwitzgebel, 2014).

Pancreas agenesis or hypoplasia


Первым идентифицированным геном, инактивиация которого мутацией вызывает агенез поджелудочной железы, стал PDX1(Stoffers et al., 1997). Затронутые новорожденные с гомозиготными точковыми мутациями, вызывающими сдвиг рамки считывания, обнаруживают признаки экзокринной недостаточности поджелудочной железы, а также гипергликемию, требующую инсулин. Фенотип полностью согласуется с регрессией поджелудочной железы, происходящей после образования инициального зачатка у Pdx1-нулевых мышей и согласно данным на эмбрионах человека, показавшими, что экспрессия PDX1 предопределяет самое раннее образование панкреатической энтодермы и что PDX1 экспрессируется последовательно в возникающих зачатках и позднее в мультипотентных предшественниках (Piper et al., 2004; Lyttle et al., 2008; Pan and Wright, 2011; Jennings et al., 2013). Впоследствии были идентифицированы др. альтерации PDX1 (Schwitzgebel et al., 2003; Thomas et al., 2009), включая один случай лишь легкого дефицита экзокринной функции поджелудочной железы при PNDM, обусловленный, по-видимому, гипоморфной мутацией (Nicolino et al., 2010).
Второй ген, являющийся причиной клинического агенеза поджелудочной железы - это специфический транскрипционный фактор поджелудочной железы 1a (PTF1A). PTF1A является basic helix-loop-helix (bHLH) транскрипционным фактором, который формирует часть PTF комплекса. Первоначально был описан благодаря своей роли в экзокринной дифференцировке у мышей (Krapp et al., 1996), Wright с колл. продемонстрировали более фундаментальную роль Ptf1a в ранней спецификации поджелудочной железы из энтодермы передней кишки (Kawaguchi et al., 2002). У человека мутация в PTF1A приводит к укорочению C-терминального региона, как было установлено в случае агенеза поджелудочной железы и мозжечка (Sellick et al., 2004). Интересно, что агенез поджелудочной железы без аномалий мозжечка был недавно приписан альтерациям в регионе на 25 kb ниже PTF1A (Weedon et al., 2014). Этот элемент оказывается связанным с фактором, ограниченным энтодермой, с PDX1 in vitro в клетках предшественниках, происходящих из PSC, предположительно это поможет объяснить специфичный для поджелудочной железы фенотип и отсутствие дефектов мозжечка. Было бы интересно изучить этот элемент подробнее в нативной поджелудочной железе человека. В самом деле, хотя транскрипты выявлены, профиль белка PTF1A трудно определить в точности в развивающейся поджелудочной железе человека из-за отсутствия пригодных антител.
GATA4 и GATA6 являются важными членами GATA семейства транскрипционных факторов цинковые пальчики, которые регулируют клеточную дифференцировку и пролиферацию в ряде энтодермальных органов у мышей, включая и поджелудочную железу (Ketola et al., 2004; Decker et al., 2006; Carrasco et al., 2012; Xuan et al., 2012). Исследования GATA6 в развитии человека ограничены из-за того, что его экспрессия в популяции клеток панкреатических предшественников описана для единственного временного периода, CS16-CS18 (Cebola et al., 2015). GATA4 впервые обнаруживается в энтодерме передней кишки на ст. CS12 (Jennings et al., 2013). Он экспрессируется в ранних панкреатических предшественниках, но во время, и после ст. CS19, его присутствие оказывается ограниченным периферическими 'кончиковыми' клетками (Jennings et al., 2013). Позднее он обнаруживается в CPA1+ ацинарных клетках, как и у мышей (Decker et al., 2006). В 2011, описана гаплонедостаточность по GATA6 у человека как распространенная причина агенеза и гипоплазии поджелудочной железы (Lango Allen et al., 2011). Большинство случаев обнаруживало и кардиальные нарушения и менее часто аномалии ЖКТ. Интересно, что недавние ChIP-seq данные показали, что PDX1 и GATA6 обычно обнаруживаются в тесной близости к активным энхансерам, обеспечивая скоординированную регуляцию развития поджелудочной железы человека (Cebola et al., 2015). Однако, не все пациенты с GATA6-инактивирующими мутациями вызывают врожденные болезни сердца, обнаруживая агенез поджелудочной железы и диабет, и не все мутации возникают de novo у затронутых индивидов, подразумевая определенную вариабельность клинического проявления (Bonnefond et al., 2012). В развивающихся легких экспрессия GATA6 находится непосредственно ниже HMGA2, гена кандидата, приводящего к SNP при T2D GWA исследовании (Singh et al., 2014). В двух работах сообщалось, что кондиционная инактивация Gata6 и Gata4 у мышей влияет на степень перекрывания между двумя факторами (Carrasco et al., 2012; Xuan et al., 2012). Перекрывание менее очевидно у людей, хотя оно и может объяснить те случаи инактивации GATA6 без сахарного диабета (diabetes mellitus (DM)). В самом деле, кажется довольно удивительным, что GATA4 не идентифицируется в ассоциации с агенезом или гипоплазией поджелудочной железы у людей. Однако, описаны некоторые случаи мутаций GATA4, приводящие к PNDM и, по крайней мере, к некоторой степени экзокринной недостаточности (Shaw-Smith et al., 2014).
Гетерозиготные мутации в hepatocyte nuclear factor 1B (HNF1B) вызывают диабет с ранним началом, поликистоз почек и ряд др. желудочно-кишечных аномалий. Поджелудочная железа обычно гипопластична (Haumaitre et al., 2006), это согласуется с находками у мышей (Haumaitre et al., 2005). Однако, недавно наблюдался полный агенез поджелудочной железы в некоторых случаях посмертных исследований (Body-Bechou et al., 2014), выявляя спектр от гипоплазии до полного отсутствия, как в случае мутаций GATA6 (Bonnefond et al., 2012). Синдром Ivemark характеризуется кистозной дисплазией поджелудочной железы, почек и печени помимо прочих аномалий. Нарушение распознается как цилиопатия с гомозиготными мутациями, идентифицированными в NEK8 и nephrocystin-3 (NPHP3; известен также как nephronophthisis 3) (Bergmann et al., 2008; Frank et al., 2013). Показательна вариабельность у некоторых пациентов с мутациями NPHP3, у них поджелудочная железа была нормальной при посмертном исследовании и обнаруживала нормальную эндокринную и экзокринную функцию (Bergmann et al., 2008). Напротив, затронутые плоды из единокровных родословных с мутациями NEK8 обнаруживали более серьезную дезорганизацию поджелудочной железы при посмертном исследовании во втором триместре беременности (Frank et al., 2013). Ацинусы поджелудочной железы были недоразвиты м потерей обычного разветвленного вида и не обнаружимыми островками (Frank et al., 2013). В одном случае протоки были с кистами. Предполагается, что молекулярно NPHP контролирует переключение канонической и не канонической передачи сигналов WNT (Bergmann et al., 2008). Известно также, что он взаимодействует с NEK8, который связан с передачей сигналов WNT, а также регуляцией активности TAZ, ко-активатора вместе с YAP транскрипционных факторов с TEA доменом (TEAD), ядерных эффекторов пути передачи сигналов Hippo (Frank et al., 2013). Как было установлено, TEAD является стержневым регулятором развития поджелудочной железы, это указывает на существование предполагаемой связи с патологией человека (Cebola et al., 2015).
Синдром Alagille вызывается дефектами пути передачи сигналов Notch. Среди производных энтодермы передней кишки преобладают аномалии желчных протоков, но в редких случаях описывается также экзокринная недостаточность поджелудочной железы (Krantz et al., 1997). Недавно установлено, что вообще-то 40% случаев связано с DM (Turnpenny and Ellard, 2012). Один из эффекторов передачи сигналов Notch - SOX9 (Pritchett et al., 2011). Первым указание, что SOX9 необходим для развития и роста поджелудочной железы получено в исследованиях материала эмбрионов и плодов человека и в посмертном материале при campomelic dysplasia (скелетном нарушении), вызываемой гаплонедостаточностью SOX9 (Piper et al., 2002). Это приводит к гибели вскоре после рождения, а также к смене пола (46,XY нарушение половой дифференцировки). Ранняя гибель затрудняет получение информации о том действительно ли может наступить permanent neonatal diabetes. В соответствии с профилем экспрессии SOX9 в панкреатических предшественниках человека, в случае campomelic dysplasia вся поджелудочная железа гипопластична с дезорганизованными маленькими островками (Piper et al., 2002), очень похоже на последствия гомозиготной инактивации у мышей (Seymour et al., 2007).
Гипоплазия экзокринной поджелудочной железы также наблюдается при синдроме Johanson-Blizzard, результата инактивирующих мутаций в UBR1 (Zenker et al., 2005, 2006). Однако, эта патология, скорее всего, связана с тяжелым панкреатитом, имеющим удивительно раннее начало во время внутриматочного периода.

Other causes of permanent neonatal diabetes reflecting abnormal differentiation of β-cells and other islet cell types


Связь с болезни кистозных почек и диабетом новорожденных базируется на GLIS3, нижестоящей мишени HNF1B, который кодирует Kruppel-like транскрипционный фактор с цинковыми пальчиками. Инактивирующие мутации в GLIS3 вызывают диабет новорожденных, кистозную болезнь почек, фиброз печени, врожденный гипотироидизм и д. аномалии (Senee et al., 2006). У мышей GLIS3 необходим для морфогенеза панкреатических протоков и генерации NEUROG3+ клеток, и также действует в дифференцированных β-клетках, чтобы регулировать транскрипцию инсулина (De Vas et al., 2015). Выявляется более ограниченный фенотип по сравнению с мутациями в HNF1B, развитие экзокринной части поджелудочной железы кажется нормальным у человека и мыши при инактивации GLIS3 (Senee et al., 2006; De Vas et al., 2015).
Гомозиготные инактивирующие мутации в NEUROG3 могут вызывать диабет новорожденных, который связывается с отсутствием дифференцировки β-клеток (Wang et al., 2006; Pinney et al., 2011; Rubio-Cabezas et al., 2011). Этот фенотип сопровождается также поразительным отсутствием эндокринной дифференцировки кишечника, приводящей к врожденной диарее. Хотя клиническая эндоскопическая биопсия сделала возможным иммуногистохимический анализ кишечного фенотипа, фенотип поджелудочной железы остается спорным. Первые идентифицированные пациенты обнаруживали полное отсутствие энтероэндокринных клеток, но диабет не развивался вплоть до 8 лет, указывая на дифференцировку и функцию, по крайней мере, некоторых β-клеток (Wang et al., 2006). Функциональное моделирование R93L и R107S мутаций NEUROG3 в энтодерме кур предоставило доказательства, что затрагиваемый аллель скорее гипоморфен, чем полностью инактивирован (Jensen et al., 2007). Интересно, что это указывает на то, что эндокринная дифференцировка кишечника более чувствительна к потере функции NEUROG3, чем соотв. панкреатический процесс. NEUROG3-независимые пути эндокринной дифференцировки поджелудочной железы, по-видимому, вряд ли базируются на PSCs человека (McGrath et al., 2015). Более того, инактивирующие мутации NEUROG3 приводят к постоянному диабету в 5 мес. возрасте у затронутых детей рожденных с малым весом (указывает на дефицит инсулина in utero) (Pinney et al., 2011), а инактивация обоих аллелей NEUROG3 приводит к постоянному диабету новорожденных (Rubio-Cabezas et al., 2011). Удивительным для эндокринного детерминирующего фактора являются некоторые признаки экзокринной неполноценности в одном случае (low serum amylase and low fecal elastase levels) (Pinney et al., 2011).
Инактивирующие мутации в RFX6лежат в основе синдрома PNDM, атрезии тонкого кишечника и гипоплазии желчного пузыря (Smith et al., 2010). Несмотря на широкую распространенность нарушений дифференцировки энтодермы передней кишки, экзокринная панкреатическая функция нормальна, хотя с легким уменьшением размера поджелудочной железы. Помимо неспособности к дифференцировке β-клеток , α-клетки и &adelta;-клетки также отсутствовали. RFX6 транскрипты выявляются поступательно в нормальной плодной поджелудочной железе человека с конца эмбриогенеза, одинаково с началом транскрипции NEUROG3 и инсулина (Lyttle et al., 2008; Smith et al., 2010; Jennings et al., 2013). Недавно было установлено, RFX6 регулирует компоненты пути, секретирующего инсулин в дифференцированных β-клетках (Chandra et al., 2014; Piccand et al., 2014).
Стоящие ниже NEUROG3, 4 др. транскрипционных фактора были идентифицированы в качестве причины PNDM , асли мутантны: NEUROD1 (Rubio-Cabezas et al., 2010), NKX2.2 (Flanagan et al., 2014), PAX6 (Solomon et al., 2009) и MNX1 (Bonnefond et al., 2013; Flanagan et al., 2014). Первые три фактора экспрессируются в β-клетках человека с раннего плодного периода (Lyttle et al., 2008; Jennings et al., 2013), при этом NEUROD1 и NKX2.2 считаются непосредственными мишенями для действия NEUROG3 (Sussel et al., 1998; Gradwohl et al., 2000). Интересно, что инактивация Mnx1 у мышей вызывает агенез дорсальной поджелудочной железы из-за дефицита мезенхимы вокруг поджелудочной железы (Harrison et al., 1999; Li et al., 1999). Однако, у человека инактивирующие мутации в MNX1 вызывают постоянный диабет новорожденных, кстати без признаков экзокринной недостаточности поджелудочной железы, подразумевая, что первичное место дисфункции в основном ограничено β-клетками (Bonnefond et al., 2013; Flanagan et al., 2014).

Conclusion: towards comprehensive, dynamic maps of how human pancreas development is regulated


Until now, studies of human development have tended to be small scale and user defined; attempts at higher throughput analysis have been most likely confounded by cell heterogeneity. With new technologies based on large-scale parallel sequencing, this is changing rapidly. Not only have studies on PSC-derived pancreatic progenitors emerged, but the first transcriptome of native human embryonic pancreatic progenitors is now available (Cebola et al., 2015). Coupled with computational analysis, this has already given strong clues that at least one signaling pathway, WNT signaling, important for pancreas development in other species, is similarly active in human pancreatic progenitors, and has directly demonstrated a new pathway regulating pancreatic growth centered on the function of TEAD and YAP. We can anticipate more comprehensive 'regulome' data defining active and repressed enhancers (based on histone marks) and DNA methylation status, both compared with other human embryonic organs and also over time to produce a truly comprehensive, dynamic genomic atlas of human pancreas development to complement what is already known in adult islet cells (Mor?n et al., 2012; Bramswig et al., 2013; Pasquali et al., 2014). Such data should set the scene for determining the relevance of human pancreas development and ?-cell differentiation to the wider array of GWA sequence variants associated with T2D, complementing the functional annotation available for adult ?-cells (Pasquali et al., 2014). It is possible that research over the next few years will prove that several aspects of T2D risk relate firmly to molecular events during in utero development. With the increasing ability to perform analyses at the level of single cells, we can also expect to gain insight into the degree of heterogeneity among progenitors and, for instance, whether this influences their subsequent differentiation. All of this will highlight far more accurately where we are at with the latest human PSC differentiation protocols (Pagliuca et al., 2014; Rezania et al., 2014) . In turn, the protocols can then be used for the validated interrogation of precise aspects of human pancreas development and, using new genome-editing technologies, the roles of particular factors (McGrath et al., 2015).