Посещений:
ФОРМИРОВАНИЕ ПАТТЕРНА



Интегумент

Deciphering principles of morphogenesis from temporal and spatial patterns on the integument
Ang Li, Yung-Chih Lai, Seth Figueroa, Tian Yang, Randall B. Widelitz, Krzysztof Kobielak,Qing Nie and Cheng Ming Chuong
Developmental Dynamics Volume 244, Issue 8, pages 905–920, August 2015

How tissue patterns form in development and regeneration is a fundamental issue remaining to be fully understood. The integument often forms repetitive units in space (periodic patterning) and time (cyclic renewal), such as feathers and hairs. Integument patterns are visible and experimentally manipulatable, helping us reveal pattern formative processes. Variability is seen in regional phenotypic specificities and temporal cycling at different physiological stages. Results: Here we show some cellular/molecular bases revealed by analyzing integument patterns. (1) Localized cellular activity (proliferation, rearrangement, apoptosis, differentiation) transforms prototypic organ primordia into specific shapes. Combinatorial positioning of different localized activity zones generates diverse and complex organ forms. (2) Competitive equilibrium between activators and inhibitors regulates stem cells through cyclic quiescence and activation. Conclusions: Dynamic interactions between stem cells and their adjacent niche regulate regenerative behavior, modulated by multi-layers of macro-environmental factors (dermis, body hormone status, and external environment). Genomics studies may reveal how positional information of localized cellular activity is stored. In vivo skin imaging and lineage tracing unveils new insights into stem cell plasticity. Principles of self-assembly obtained from the integumentary organ model can be applied to help restore damaged patterns during regenerative wound healing and for tissue engineering to rebuild tissues. Developmental Dynamics 244:905-920, 2015.


Рисунки к статье



Biological Pattern Formation


Формирование паттерна - это процесс, с помощью которого возникает упорядоченность из хаотичности. Оно присутствует в разнообразных неравновесных системах как физического мира (такие как волны на воде, слои гор и дюны из песка) так и биологического мира (таких как периодические разветвления перьев, пигментные пятна и полоске на коже животных, зигзаги на поверхности просвета кишечника лягушек и змей) (Ball et al., 2009; Inaba et al., 2012; Shyer et al., 2013; Lin et al., 2013a; Mahalwar et al., 2014). Формирование паттерна может возникнуть в двух измерениях пространства и времени, а повторяющиеся элементы могут появиться идентичными или приспособленными к определенной степени изменчивости (Chuong and Richardson, 2009).
Биологические паттерны выполняют критические функции в тканях/органах и организмах в разеное время онтогенеза. Напр., паттерны пигмента тела могут быть использованы для камуфляжа или для предостережения или привлечения др. Паттерны в просвете кишечника увеличивают область абсорбции. Густые волосы и пуховые перья могут задерживать воздух и сохранять тепло. Временные паттерны, такие как циклическая регенерация перьев и волос может замещать изношенные наружные покровы, а также делает возможными изменения в морфологии и паттерне пигмента интегумента в зависимости от сезона или стадий физиологического развития. Отмечается очевидная связь между формированием паттерна, регенерацией и за счет вытягивания инженеринга ткани. Механизмы формирования паттерна могут предоставить информацию о корректном развитии размера, формы и полярности популяции стволовых клеток и их производных в органах, демонстрируя, как стволовые клетки поддерживают свою популяцию и мультипотентность во время тканевого гомеостаза.
Различающиеся паттерны, подобные пятнам, полоскам, сегментам, могут быть сгенерированы с помощью разных механизмов. При неавтономном формировании паттерна расположенные в пространстве морфогенетические сигналы (морфогены) д. быть предетерминированы в специфических местах эмбриона. Диффузные морфогены перемещаются через морфогенетическое поле, чтобы в свою очередь сформировать паттерн нижестоящих генов (Wolpert, 1969; Lander et al., 2002; Lander, 2013). Напр., паттерн сегментации эмбрионов Drosophila, устанавливаемый с помощью градиента Bicoid (Driever and Nusslein-Volhard, 1988; Houchmandzadeh et al., 2002), формирование жилок в имагинальных дисках мух (Lander et al., 2002) и спецификация доменов нейрональных предшественников, детерминируемая с помощью градиента Shh (Dessaud et al., 2008).
Автономное формирование паттерна было описано с помощью двух базовых структур моделирования. Одна модель базируется на формировании спонтанного паттерна, возникающего в результате реакций и диффузии, по крайней мере, двух биохимических субстанций (Turing, 1952; Gierer and Meinhardt, 1972). В таких моделях один центральный механизм управляет формированием паттерна, базируясь на коротко-действующей активации и дально-действующем ингибировании. Вторая модель имеет в основе механику, такую как внезапное возникновение нестабильности эластомеров (Moulton and Goriely, 2011), при этом конкуренция между геометрическими эффектами (напр., изменение измерений в трубке) и механическими эффектами (напр., остаточными стрессами из-за дифференциального роста) создает паттерны.
Вероятно, что разного типа молекулярные петли обратной связи (circuits) участвуют конвергентным образом, чтобы продуцировать сходные биологические паттерны. Некоторые молекулярные серкуиты могут базироваться на транскрипционной активности генома, некоторые могут базироваться на пороговой реакции на градиент морфогена, др. могут базироваться на клеточных взаимодействиях в комбинации с физико-химическими силами.
Чтобы в совершенстве понять исходы тканевого инженеринга, необходимо больше знать о принципах морфогенеза, чтобы понять, как зарождаются, развиваются и стабилизируются паттерны на клеточном и молекулярном уровнях серкуитов в присутствии огромных средовых или генетических флюктуаций. Тот факт, что разрушение молекулы X мешает формированию определенного паттерна указывает лишь на то, что молекула X участвует в этом процессе. Чтобы понять специфическую роль X, необходимо выяснить её пространственное распределение, определить с какими молекулами она взаимодействует и как эти молекулы затрагиваются в количественном отношении. Такая информация д. выявить роль X в контексте специфического механизма. Напр., необходимо знать, является ли X активатором, ингибитором, модулятором устойчивости паттерна или просто регулятором активатора и/или ингибитора. Кроме того, знание детальной временной динамики клеточных процессов оказывается очень важным для выяснения детальных механизмов формирования паттерна. Поскольку наружные покровы развиваются на поверхности тела и обнаруживают разнообразные четкие рисунки (паттерны), которые удобны для наблюдения и экспериментальных манипуляций, в противовес висцеральным органам, поэтому интегумент становится ведущей модельной системой для выяснения механизмов формирования паттерна.

Periodic Pattern Formation in Integumentary Organs: Multiplicity Allows Variability


Покровные органы такие как волосы, перья, чешуйки, когти, клюв, зубы, эпидермальные железы и т.д., не только создают границу между организмом и внешней средой, но и также облегчают адаптацию организма к разнообразным внешнесредовым условиям, делая возможными коммуникации между индивидами одного и того же и др. видов (Fig. 1). Многие покровные органы состоят из нескольких зачатков органов, которые действуют совместно как популяция органов. Напр., имеются множественные количества у млекопитающих зубов, множественные железки и тысячи волос и перьев (Fig. 2B). Эта множественность позволяет животным иметь отличия в разных регионах тела и делает тем самым покровные органы разных регионов, обладающими региональными и возраст-специфическими фенотипами, так что они надежно приспосабливаются к среде (Chuong et al., 2013).

Figure 1. Sphinx of integumentary organs. A Greek version of a Sphinx is used to symbolize the riddle on how different integument organs (hair, feather, scale, claw, sweat gland, mammary gland, and salivary gland) are expressed in different body surface regions. Conversion from the scale to feather is also depicted.

Figure 2. Diagram depicting variations in spatial and temporal patterns of integument organs. A: Schematic drawing showing the growth phase of the feather follicle (Lucas and Stettenheim, 1972) and hair follicle (Chen and Chuong, 2012). Note in both follicles, they undergo regenerative cycling through growing, resting, and molting phases, thus giving the follicle an opportunity for phenotype renewal. B: For integument patterning, first the integument primordia form regularly spaced arrays over the morphogenetic field. Different phenotypes are generated through a process akin to metamorphosis that occurs at the organ level. Individually they undergo temporal cycling and as a population they can form a regenerative wave. Newly hatched chicks have most parts of the body covered by feathers of similar morphology, whereas adult chickens show regional specificity of feather morphology. The figure is modified from Wu et al. (2004a), Chuong et al. (2013). Photo credit: female Silver Laced Wyandotte by Doug and Pete Akers; male Silver Spangled Hamburg by Jim Legendre.

Reaction-Diffusion Model and Beyond


Поскольку паттерны интегумента часто поразительные и очевидные, то интегумент становится эффективной системой наблюдения и анализа формирования паттерна во время его первоначального образования, а также во время физиологических циклов и повреждений, вызванных регенерацией. Важно, что многие паттерны интегумента (такие как периодическое образование волосяных фолликулов ил мозаичных цветных пятен меха леопарда) чётко формируются автономным способом, поскольку паттерн не коррелирует с какими-либо специфическими характерными особенностями (landmarks) тела (такими как ось тела, границы) (Lander, 2011). Как упоминалось ранее, модель типа Тьюринга представляет теорию, объясняющую автономные биологические паттерны. Исходная теория управления диффузией описывала, как гомогенная система из двух реакционных и диффузионных химических веществ (морфогенов) может становиться нестабильной, так, что незначительные пертурбации могут приводить к формированию периодического химического паттерна со временем (Turing, 1952). Turing предложил reaction-diffusion (RD) систему из двух морфогенов вдоль изолированного кольца и установил, что паттерны принимают форму волн. Он обсудил 6 возможных состояний, при которых паттерны будут конвергировать в направлении: (1) стационарное состояние с чрезвычайно длинной длиной волны; (2) колебательное состояние с чрезвычайно длинной длиной волны; (3) стационарное состояние с чрезвычайно короткой длиной волны; (4) колебательное состояние с чрезвычайно короткой длиной волны; (5) стационарное состояние с имеющей предел длиной волны (этот случай широко принят как паттерн Тьринга); (6) колебательное состояние с имеющей предел (finite) длиной волны (существует подлинное перемещение волн через морфогенетическое поле) (Turing, 1952; Kondo and Miura, 2010). Чтобы конвергировать к стационарному паттерну, при котором создаваемые волны остаются на месте, доминантное характеризующее (корневое) число системы из дифференциальных уравнений д. быть реальным числом. Напротив, при колеблющемся паттерне, который создает перемещающиеся волны, доминантное характеризующее число является сложным числом, чей комплексный член (complex term) детерминирует частоту перемещения волн. Некоторые биологические примеры, согласующиеся с этими случаями, описаны в обзоре Kondo and Miura (2010). Модель Тьюринга позднее была переработана Gierer and Meinhardt (Gierer and Meinhardt, 1972). Они показали, что стабильные периодические паттерны достижимы с помощью системы из двух морфогенов, при этом один из морфогенов является активатором, это означает, что он сам себя усиливает и тем самым умножает свои собственные малые пертурбации и создает локальные пики. Второй морфоген д. быстро диффундировать и противодействовать продукции активатора, чтобы ограничить распространение пика, образуемого активатором. Одно из следствий модели активатор-ингибитор предполагает, что активатор также способствует продукции своего собственного ингибитора. Второй антагонистический механизм, известный как субстрат-зависимая модель, вносит необходимость субстрата для и его истощение во время само-усиления активатора (Gierer and Meinhardt, 1972; Headon and Painter, 2009). Лежащим в основе механизмом для обеих моделей является коротко-действующая активация и дально-действующее ингибирование. Далее мы покажем, что диффузия морфогене может быть заменена межклеточными контактами на разных расстояниях во время формирования автономного паттерна (Inaba et al., 2012; Hamada et al.,2014a).

Autonomous Patterning in Feather Morphogenesis


Биологические доказательства, подтверждающие модель активатора/ингибитора, обнаружены в 1998 (Jung et al., 1998). В этом исследовании было показано, что FGFs работают как активаторы, тогда как BMPs функционируют как ингибиторы при периодическом формировании зачатков перьев. Зачатки представлены утолщениями эпителия (плакодами), лежащими поверх с высокой плотностью клеток мезенхимной ткани (дермальные уплотнения). Интересно, что в отличие от неавтономной модели, при которой ингибиторы д. обнаруживаться в пространствах между зачатками, здесь и активаторы (FGFs) и ингибиторы (BMPs) присутствуют в мезенхимном примордии пера, свойство, согласующееся с механизмом Тьюринга формирования автономного паттерна (Gierer and Meinhardt, 1972). В этой и последующих работах (Lin et al., 2006), мы выяснили, что компетентная популяция клеток отвечает на сумму активаторов и ингибиторов, которые усиливают или подавляют образование зачатка, не ограниченных FGF и BMP. Мы также установили, что эти молекулы могут быть секретированы или эпителием или мезенхимой. Более того, последующие исследования по реконструкции перьев показали, что когда мезенхимные клетки увеличиваются в количестве, то количество, а не размер зачатка пера увеличивается соотв. образом. Только изменения в соотношении активатора/ингибитора за счет эктопической экспрессии noggin или BMP может сделать зачатки крупнее или меньше (Jiang et al., 1999). Увеличение FGF локально и глобально увеличивает зачатки перьев за счет участков между зачатками вдоль срединной линии и увеличивает количества зачатков перьев на более молодом, латеральном крае кожи (Widelitz et al., 1996).
Паттерн ветвления перьев также является биологическим феноменом, который может быть объяснен механизмами диффузией управляемой нестабильности Тьюринга (Harris et al., 2005). Harris et al. (2005) описали двухкомпонентную активатор/ингибитор модель, которая может воспроизводить паттерн периодического ветвления перьев пуха. С добавлением третьего морфогена, дально-действующего, локального ингибитора, Harris et al. (2005) модулировали спиральное образование зубчиков (barbs), которые, как полагают, создаются перемещающимися волнами. Они предположили, что специфически расположенное увеличение или уменьшение продукции фонового активатора д. стимулировать билатерально симметричные pennaceous перьев (перо содержит центральный стержень, который подразделяет оперение на две половинки) При этом дорсально располагается стержень (центральная ость) а вентрально располагается генеративная зона зубчиков (где инициируется образование зубчиков или веточек). Некоторые доказательства подтверждают, что Shh и BMP2 являются диффундирующими активатором и ингибитором, соотв. (Yu et al., 2002). PATCHED (связанный с мембраной рецептор для Shh) , как полагают, является локальным ингибитором, который может связывать молекулы Shh, диффундирующие сквозь и делающий их неспособными отвечать на активирующие удаленные клетки.
Формирование паттерна пигментации перьев - сложный процесс, который может использовать как автономное, так и не автономное формирование паттерна. Предшественники меланоцитов располагаются в проксимальной части фолликула пера и их активность регулируется окружающей нишей. В белых регионах рисунка меланоциты могут отсутствовать или присутствовать, но не способны к дифференцировке (Lin et al., 2013a). Активация стволовых клеток автономно детерминируется вблизи дна фолликула. Та же самая популяция стволовых клеток меланоцитов в одном фолликуле может формировать разные пигментные паттерны на разных возрастах или при разных физиологических условиях. Более дистальная зубчики формирующая ramogenic зона, периферическая пульпа обнаруживает паттерн экспрессии agouti, который комплементарен пигментному паттерну. Поскольку мезенхимный паттерн agouti диктует паттерн меланоцитов, то эта часть характеризуется процессом неавтономного формирования паттерна. Однако, формирование паттерна agouti в pulp является автономных процессом формирования паттерна.

Autonomous Patterning in Hair Morphogenesis


Формирование паттерна волосяных фолликулов является др. неотразимым биологическим примером диффузией управляемой нестабильности Тьюринга (Sick et al. 2006). Было установлено, что Wnt является важным и достаточным для индукции волосяных фолликулов (Gat et al., 1998; Andl et al., 2002). Передача сигналов Wnt индуцирует также экспрессию ингибитора DKK (Sick et al., 2006). Трансгенные мыши с избыточной экспрессией DKK2 обнаруживают снижение плотности волос (Sick et al., 2006). Между тем белки Wnt, как известно, значительно крупнее, чем DKKs (Maini et al., 2006). Следовательно, ожидаются различия в динамике их диффузии. Доказательства делают Wnt и DKK прекрасными кандидатами на роль пары активатора/ингибитора, подходящих к механизму формирования паттерна Тьюринга. Эта находка подтверждает, что клетки предшественники кожи обладают равным потенциалом формировать волосяные фолликулы или межфолликулярные участки кожи и что результат может быть предопределен тонкой настройкой относительных активностей активаторов или ингибиторов модели Тьюринга в окружении во время спецификации (Maini et al., 2006).
Др. интересным случаем формирования автономного паттерна волос является перемещение волн образования волос (цвета) (Suzuki et al., 2003; Plikus et al., 2009). Волосы взрослых мышей циклически регенерируют. Регенерация несинхронная, но происходит в виде перемещения волн по телу. Это можно легко наблюдать у Foxn1 мутантных мышей, чьи волосяные фолликулы быстро устраняются после стимуляции отложения пигмента и подвергаются новому раунду регенерации (Suzuki et al., 2003). Такие волны можно также наблюдать у нормальных мышей после сбривания волос (Plikus et al., 2009). У Foxn1 мутантных мышей волны имеют регулярное расположение в пространстве, обнаруживая характеристики паттерна реакции и диффузии химических веществ Belousov-Zhabotinskii (Zaikin and Zhabotinsky, 1970). Возможно, что подобного типа волны регенерации управляются механизмами, сходными с найденными колебательными случаями с finite длинами волн, описанными в модели Тьюринга RD. Для волн регенерации у нормальных мышей, паттерн более сложный и для объяснения было предложена модель Cellular Automaton.

Autonomous Patterning in Fish Pigment Stripe Formation


Исследования группы Dr. Kondo's паттернов пигментации у рыб данио выявили, что паттерны пигмента у рыб данио зависят от двух типов пигментных клеток (melanophores и xanthophores), формируемых в специальных взаимоотношениях: Xanthophores способствуют жизнеспособности melanophores в длинном диапазоне, в то же время они взаимно ингибируют рост др. др. на коротких расстояниях (Nakamasu et al., 2009). Короткого ранга репульсивное взаимодействие, осуществляемое xanthophores заставляет дендриты непосредственно контактировать с меланофорами (Inaba et al., 2012), тогда как дально-действующи сигналы, способствующие выживанию, предоставляемые xanthophores для melanophores, как полагают, осуществляются посредством Delta/Notch взаимодействий на длинных проекциях, посылаемых от menanophores к xanthophores (Hamada et al., 2014b). Подобное взаимоотношение не соответствует модели активатор/ингибитор, но всё ещё подтверждает механизм локальной само-активации, сопровождаемой дально-действующим латеральным ингибированием (Meinhardt and Gierer, 2000). В такой системе диффузия морфогенов замещается разными типами межклеточных взаимодействий на различные расстояния.

Mechanical Force as a Patterning Player


Помимо модели Тьюринга и её производных, была предположена возможность механических стрессов для индукции выпячиваний ткани, чтобы объяснить периодические биологические паттерны, такие как отпечатки пальцев кожи (K?cken and Newell, 2005), конволюция коры головного мозга (Caviness, 1975), образование складок слизистой воздушных путей, кровеносных сосудов и ЖКТ (Moulton and Goriely, 2011), а также Muri-ori складок на листьях граба (Mahadevan and Rica, 2005). Эта теория предполагает периодические выпячивание или складки ткани, возникающие в результате стремления минимизировать внутренние стрессы, генерируемые физически ограниченным ростом ткани. Напр., рисунок отпечатков пальцев может управляться с помощью внутри-эпителиальных стрессов, индуцируемых с помощью противодействия образованию борозд и морщин в результате дифференциального роста эпителиального базального слоя (K?cken and Newell,2005). Идея подтверждается компьютерным моделированием. Экспериментальные доказательства вклада механических сил в формирование автономных биологических паттернов также начинают обнаруживаться. Напр., недавнее исследование компрессионных стрессов, генерируемых с помощью анизотропных мышечных сокращений на комбинированный рост энтодермы-мезенхимы (путем ингибирования мышечной дифференцировки) может вызывать рисунок в просвете кишечника, который устраняется в результате повторного появления стресса (путем толчков шелковой нити вне кишечника без мышечного слоя) это может приводить к повторному появлению паттерна (Shyer et al., 2013).

Multiplicity Allows Variability


Формирование периодического паттерна делает возможным множественные реплики, чтобы сформировать орган (т.e., перья, волосы; Chuong et al., 2013).Пространственная и временная изменчивость делает возможной появление структурной и функциональной изменчивости. Мириады комбинаций упомянутых выше процессов делают возможными генерацию разнообразных фенотипов. Это наиболее очевидно на перьях. По времени молодые птицы покрыты радиально симметричными пушистыми перьями, которые обеспечивают тепло. При дальнейшем развитии перья внутри того же самого участка пространства обладают общими характеристиками, но эти признаки могут отличаться между разными участками тела. Напр., пушистые перья вдоль дорсального тракта замещаются на билатерально симметричные перья. Напротив, пушистые перья на крыльях замещаются на билатерально асимметричные перья, обнаруживающие аэродинамические преимущества. Дистальные бородки (barbs) билатерально симметричных и билатерально асимметричных перьев сцеплены со своими соседними бородками (barbs) с помощью barbules, которые делают способными контурные (pennaceous) перья крыла эффективно удерживать воздух; однако, проксимальные регионы является пуховыми и плюмажными (plumulaceous). Даже внутри трека наблюдаются постепенные фенотипические изменения в размере или окраске, это предоставляет больше возможностей взаимодействовать с их окружением. Это может возникнуть как градиент увеличения количества plumulacous barbs на перо, при движении от кончика крыла в направлении тела, это служит сохранению температуры тела.

Spatial Variations: Localized Cellular Activity in Organ Primordia and Regional Specificity on the Whole Body Integument


Ранее нами было предположена общая схема, согласно которой множественные модули локальной клеточной активности в зачатке органа могут служить основанием для генерации сложной формы органа. Разные модули клеточной активности могут базироваться на высоко локальных физических процессах, таких как клеточная полярность, перестройка, пролиферация, апоптоз и дифференцировка (Fig. 3). Количество, размер, позиция, продолжительность и пространственное распределение таких модулей активности могут конвергировать, чтобы сформировать спектр проектов органа (Chuong et al., 2006), подходящих для разных физиологических состояний или для адаптации к эволюционным нуждам (Chuong et al., 2006).

Figure 3. Combination of localized cell activity zones can lead to organ shaping. A: Position and number of localized cell proliferation zones modulate the shape of avian beaks. B: Cell apoptosis zones induced by Shh signaling give rise to periodically branched barbs. C: Posteriorly localized cell rearrangement zones inaugurate the directional elongation of feather buds. The three panels are modified from Chang et al. (2004a), Wu et al. (2004b), Li et al. (2013a), respectively.

Localized Proliferative Zone and Beak Shapes


Клювы птиц это хорошо известный пример эволюционного разнообразия. Дарвин наблюдал, что клювы, происходящие от одного и того же типа зяблика, варьируют в форме от острова к острову на Галапагоссах. Утиные клювы с широкими кончиками, тогда как у утят они очень узкие. С помощью кратковременного мечения BrdU мы установили зоны локальной клеточной пролиферации на латеральных краях фронто-назальных масс (единственное лицевое возвышение, участвующее в развитии клюва) на ст Hamburger and Hamilton 26 у эмбрионов кур (Hamburger and Hamilton, 1951). Эти две зоны превращаются в то, что позднее становится расположенным центрально. Однако, у уток две зоны персистируют на латеральных краях и это вызывает расширение фронто-назальных масс. Следовательно, количество и топология локальных зон клеточной пролиферации являются главными детерминантами формы клюва. Мы также установили, что клеточная пролиферация управляется с помощью BMP4 (Fig. 3A) (Wu et al., 2004b).
Др. пример зоны локальной клеточной пролиферации, контролируемой с помощью передачи сигналов BMP наблюдается в развивающихся когтях мышей. Обычно имеется зона локализованной клеточной пролиферации вблизи надногтевой пластинки (eponychium). У K14-Noggin мышей эта зона расщепляется на множество маленьких ростовых зон, которые позднее дифференцируются во множественные ногтевые пластинки (Plikus et al., 2004).

Localized Apoptotic Zone and Branching Morphogenesis


Во время ветвления эпителиального цилиндра пера, мы отметили апоптические клетки, расположенные в маргинальной пластинке barb жилок (ridges) способом, сходным с разделением пальцев во время развития конечностей (Zuzarte-Luis and Hurle, 2005). В перьях локальные зоны апоптоза, как полагают, в основном предопределяются передачей сигналов Shh (Fig. 3B) (Chang et al., 2004b; Chuong et al., 2014).

Localized Cell Rearrangement Zone and Feather Bud Orientation


Сравнительно недавнее исследование процесса элонгации зачатков перьев показало присутствие локализованных модулей клеточной перестройки во время удлинения пера. Элонгация зачатка пера точно и униформно ориентирована (Li et al., 2013a). С помощью серии трансплантационных экспериментов мы установили, что задняя часть дермиса пера достаточна и необходима для ориентации элонгации. Внутри задней части дермиса имеется серпообразная, пространственно хорошо определяемая зона, состоящая из ядерных β-catenin-позитивных клеток. Мы продемонстрировали, что β-catenin активирует экспрессию не мышечного миозина IIB (NM IIB) в этой зоне. Как главный клеточный двигательный белок, NM IIB (RoLo et al., 2009) управляет направленным клеточным перемещением, что приводит к поляризованной элонгации зачатка пера (Li et al., 2013a). В этом случае, локальный модуль базируется на способе клеточной перестройки.
Обнаружение локальных модулей, базирующихся на разных клеточных активностях подтверждает, что это может быть широко используемой стратегией в морфогенезе. Как же молекулярные сигналы регулируют активности, расположение, границы и продолжительность действия этих модулей? При удлинении зачатка пера зона ядерного β-catenin инициируется с помощью Wnt7a, испускаемого задней частью эпидермиса зачатка. Wnt7a образует градиент "шумов" в дермисе ("Шумы" означают флюктуации или изменчивость концентрации белка на уровне микро-шкалы), тогда как зона ядерного β-catenin довольно гомогенна по своей интенсивности и имеет чёткую границу. Путем комбинирования молекулярной биологии и математического моделирования мы продемонстрировали, что Notch лиганд-Notch рецептор латеральное ингибирование, которое действует ниже пути Wnt, является критическим для удаления шумов и установления четкой границы зоны ядерного β-catenin , это гарантирует точность ориентации удлинения зачатка пера (Fig. 3C). Др. механизмы обеспечения четкости границ описаны при изучении спецификации нейронов спинного мозга (Briscoe et al., 2000; Todd et al.,2012).

Regional Specificity: Different Integument Organ Phenotypes Are Shaped by Topological Combinations of Different Localized Cellular Activity Modules


Специфические формы органных зачатков могут быть получены за счет комбинации модулей клеточной активности разными способами. Приведенные выше примеры показали некоторые центральные пути передачи сигналов (такие как BMP, Shh, Wnt) повторно используемые в закладке зон локальной клеточной активности во время формообразования органов. Недавно мы также сообщили, как передача сигналов FGF и Sprouty устанавливает зоны предшественников в противовес зонам дифференцировки вдоль проксимо-дистальной оси пера (Yue et al., 2012). Однако, детали структуры регуляторной сети генов (Davidson and Erwin, 2006) и физико-химические правила, модулирующие пространственное и временное распределение зон, активности могут варьировать зависимым от контекста образом (Chuong et al., 2014). Способность регулировать эти активности позволяет нам искусственно менять форму, симметрию и размер кожных придатков (Lin et al., 2013b).
Наивысший уровень топологических различий может быть оценен при региональной специфичности, наблюдаемой в интегументе всего тела индивидуальных животных. Это наиболее очевидно у цыплят: напр., перья в противовес чешуйкам, ригидными и длинными перьями для полёта в противовес пушистым перьям области груди. Эти региональные различия также очевидны у человека, хотя не столь явны у мыши. Эти разные регионы происходят из одного и того же генома и всё же они способны продуцировать разные фенотипы интегумента, по-видимому, благодаря эпигенетическим механизмам, которые ещё предстоит исследовать.

Temporal Cycling: Stem Cells are Regulated by Immediate Niche and Multi-Layers of Macro-Environments


Эпидермис мышей и человека подвергается постоянному обновлению. Чешуйки на конечностях цыплят или покров тела рептилий обновляются постоянно, подобно их эпидермису (Wu et al., 2014). Эпидермис змей подвергается синхронному циклическому обновлению (Chang et al., 2009). Органы интегумента с их собственными стволовыми клетками, такие как перья, волосы и оленьи рога, могут иметь свой собственный регенеративный цикл (Chuong et al., 2012). Для перьев регенерационный цикл может быть подразделен на две основные фазы: фазу роста (когда стволовые клетки активируются, чтобы сформировать перо) и фазу покоя (когда стволовые клетки молчат) (Lucas and Stettenheim, 1972). В фазе роста стволовые клетки эпителия пера составляют кольце-образное выпячивание в воротниковой (collar) области проксимальной части фолликула пера (Fig. 2A). В фазе покоя кольцо стволовых клеток сдвигается проксимально и оказывается в непосредственном контакте с dermal papilla (DP; Yue et al., 2005). Считается, что DP и системные гормоны управляют поведением стволовых клеток во время регенерации пера (Lin et al., 2013b). Рога благородного оленя на ст. роста растут и сбрасываются ежегодно в ответ на уровни тестостерона приблизительно в сезонные изменения (Chuong et al., 2012). В фазе роста оленьи рога являются костной структурой, покрытой сильно васкуляризованной кожей. Нишей стволовых клеток для костной части рогов, как полагают, является камбиальный слой надкостницы (Rolf et al.,2008).
Для волос регенеративный цикл состоит из фазы роста (anagen), дегенерации (catagen), и фазы покоя (telogen) при физиологических условиях. Циклическое поведение управляется с помощью молекулярных взаимодействий с микро- и макроокружением (Muller-Rover et al., 2001; Millar, 2002; Schmidt-Ullrich and Paus, 2005; Alonso and Fuchs, 2006; Rendl et al., 2008). Индивидуальный волосяной фолликул содержит резервуар стволовых клеток, расположенных с специализированном регионе, известном как выпячивание (bulge) (Fig. 2A, red), расположенном непосредственно ниже сальной железы (Cotsarelis et al., 1990). Эти hair follicle stem cells (hfSCs) находятся в покойном состоянии во время фаз покоя и telogen волосяного цикла, но периодически оказываются активированными, чтобы стать зачатком волоса и запустить регенерацию фолликула (Greco et al., 2009). Регуляция этих состояний покоя и активации является центром цикла регенерации. Этот процесс регулируется с помощью многих слоёв модуляторов (Fig. 4) (Chen and Chuong, 2012). Многие новые компоненты идентифицированы, которые добавили несколько дополнительных слоёв регуляции hfSC.

Figure 4. Hierarchical regulation of stem cell activation and quiescence. Hair follicle bulge stem cells are in a quiescent (green) or active (red) state via balanced molecular signaling (mainly Wnt and BMP) influenced by the external environment, extrafollicular and intrafollicular factors.

В начале каждой фазы anagen используется двухступенчатая последовательность активации. На первой ступени клетки предшественники зародыша волоса (HG), расположенные непосредственно выше DP, начинают пролиферировать, а на второй ступени запускается активация hfSC в регионе выпячивания (Greco et al., 2009). HG является временным регионом HF, возникающим периодически из популяции hfSC во время волосяного цикла и расположенным между DP и выпячиванием hfSCs в телогенных фолликулах (Ito et al., 2004; Zhang et al., 2009; Greco et al., 2009). Интересно, что HG биохимически отличен от выпячивания и не экспрессирует hfSC маркеров, таких как NFATC1 и CD34, но вместо этого богат P-cadherin (Greco et al., 2009). Однако, на транскрипционном уровне клетки HG наиболее близко представляют активированные выпячивания hfSCs и функционируют как родственное расширение популяции выпячивания hfSC (Ito et al., 2004; Greco et al., 2009). Обе популяции hfSC и HG экспрессируют кожный SC маркер, keratin 15 (K15) (Liu et al., 2003; Greco et al., 2009). Несмотря на неспособность HG клеток поддерживать SC-подобные характеристики in vitro, недавно было продемонстрировано, что HG клетки способны функционально пополнять популяцию выпячивания hfSC после повреждения (выщипывания волос) in vivo (Rompolas et al., 2012, 2013).

Dynamic Functional States of Intra-Bulge Hair Follicle Stem Cells


Хотя hfSCs остаются в относительно покое во время большей части постнатального цикла волос, в начале anagen сложный сигнальный каскад достигает кульминации в активации hfSC. Активация hfSC происходит посредством активации передачи сигналов Wnt и ингибирования пути передачи сигналов BMP, это в конечном итоге стабилизирует ядерный β-catenin в HG, чтобы способствовать быстрому возобновлению роста HF (Gat et al., 1998; Botchkarev et al., 1999; Kobielak et al., 2003, 2007; Van Mater et al., 2003; Lo Celso et al., 2004; Andl et al., 2004; Zhang et al., 2006; Ito et al., 2007; Plikus et al.,2008, 2011; Greco et al., 2009). Во время перехода от поздней telogen к ранней anagen фазе, HG клетки продуцируют повышенные уровни Wnt белков, в то время как DP секретирует ингибирующие BMP факторы, такие как Noggin (Botchkarev et al., 1999, 2001; Greco et al., 2009) и transforming growth factor-β2 (TGFβ2). Эти факторы роста приводят к повышению экспрессии TMEFF1 (transmembrane protein with EGF-like and two follistatin-like domains 1) в HG, это в свою очередь ещё сильнее ингибирует путь BMP и способствует активации hfSC (Oshimori and Fuchs, 2012).
Поведение медленно делящихся hfSCs тонко регулируется с помощью сложного баланса сигнальных клеточных путей, которые сходятся, чтобы индуцировать одним махом hfSC покой и активацию, приводя к формированию нового волоска (Blanpain and Fuchs, 2009). Один важный путь, необходимый для собственно HF cycling, это передача сигналов BMP (Botchkarev et al., 2001; Kobielak et al., 2003, 2007; Andl et al., 2004; Plikus et al., 2004; Zhang et al., 2006). BMP лиганды соединяются с трансмембранным BMP рецептором 1A (BMPR1A) в выпячивании hfSCs (Botchkarev et al., 2001) во время фазы покоя волосяного цикла. Это индуцирует передачу сигналов канонического BMP, чтобы фосфорилировать цитоплазматические Smad1, Smad5 и Smad8 (Andl et al., 2004; Kobielak et al., 2007). Эти Smads гетеродимеризуются с Smad4 и транслоцируются в ядро, чтобы непосредственно трансактивировать свои гены мишени (Massague et al., 2005). Т.о., устранение гена BMPR1A в коже приводит к преждевременной активации покоящихся hfSCs (Kobielak et al., 2007). Подавление транскриптов BMP4 вместе с усилением активности ингибиторов BMP, таких как Noggin, приводит к переходу от telogen к anagen фазе.
Каноническая передача сигналов Wnt является др. критическим путем, идентифицированным, как участвующим в гомеостазе hfSC. Стабилизация β-catenin важна для стимуляции роста волоса (Gat et al., 1998; Van Mater et al., 2003; Lo Celso et al., 2004) и способствует переходу от покоящихся hfSCs к пролиферирующему transit amplifying (TA) потомству (Lowry et al., 2005). Напротив, делеция β-catenin специфически в hfSCs приводит к неспособности собственно активации hfSC в начале anagen; вместо этого они адаптируют эпидермальную судьбу с возможной потерей HFs со временем (Huelsken et al., 2001; Lowry et al., 2005). Однако, как передача сигналов BMP в точности интегрируется, чтобы регулировать путь Wnt, как часть молекулярной сети, способной контролировать активацию hfSC, только в начале понимания. Хотя путь канонических Wnt, действующих посредством стабилизации β-catenin, хорошо известен, как играющий важную роль в регуляции hfSC, но вплоть до недавнего времени не было установлено специфических лигандов и рецепторов Wnt кандидатов на роль ключевых игроков в этом процессе (Gat et al., 1998; Chan et al., 1999; Reddy et al., 2001; Lo Celso et al., 2004; Morris et al.,2004; Tumbar et al., 2004; Lowry et al., 2005). Ингибитор передачи сигналов BMP, особенно в популяции hfSC, делает возможным обнаружение нового прирожденного внутреннего механизма использования BMP/Wnt пути интеграции, направляющего hfSCs к восприятию ранней HG-подобной судьбы в ответ на зависимую от лиганда активацию канонического Wnt. Эти события приводят увеличению экспрессии Wnt7a, Wnt7b и Wnt16 и стабилизации β-catenin в hfSCs, которые способствуют само-автономной регуляции, тогда как Wnt антагонист Dkk3 супрессируется (Kandyba et al., 2013). В то же самое время, экспрессия Wnt рецептора Fzd10 увеличивается. Функционально, эктопические инъекции белка Wnt7a достаточны, чтобы способствовать активации hfSC и началу фазы anagen в покоящихся телогенных HFs (Kandyba et al., 2013). Напротив, целенаправленное устранение Wnt7b в выпячивании hfSCs приводит к нарушению цикла HF с задержкой активации hfSC и более короткой фазой роста (Kandyba and Kobielak, 2014).

Intra-Follicle Interactions


Epidermis-dermal papilla


Основным источником этих, происходящих из волосяного фолликула, стимулирующих является DP (Fig. 2A). ранние исследования по трансплантациям продемонстрировали, что DP регулирует активность hfSC во время постнатальных циклов HF и координирует с эпидермисом, чтобы генерировать "de novo" волосяные фолликулы in vivo (Jahoda, et al., 1984, 2001). Во время telogen-anagen активации DP высвобождает разные стимулирующие факторы, такие как BMP ингибитор, Noggin, и белки пути FGF, такие как FGF7 и FGF10. Они действуют согласованно, чтобы стимулировать hfSCs к регенерации волоса (Fig.2) (Botchkarev et al., 1999; Kishimoto et al., 2000; Rendl et al., 2005, 2008; Driskell et al., 2009; Greco et al., 2009). Кроме того, подкожные адипоциты также генерируют волны перемежающихся ингибирующих и активирующих сигналов, которые облегчают синхронизацию ниш hfSC в коже, преимущественно под влиянием DP и активности дермального слоя (Plikus et al., 2008) (Fig. 2A). Клетки дермальных покровов, располагающиеся по соседству с кератиноцитами наружного эпителиального влагалища корня волоса, как полагают, способны заново заселить DP (Rahmani et al., 2014). BMP передача сигналов такж является критической для DP, чтобы генерировать HFs (Rendl et al., 2008). Модуляция передачи сигналов BMP в DP ответственна за формирование разного типа волос (Driskell et al.,2009). Т.о., существует интенсивное общением между многими клетками ниши HF (Plikus et al., 2008, 2011; Festa et al., 2011).

Interactions among different epidermal components


Недавно сопровождающий слой, расположенный между внутренним и наружным эпителиальным влагалищем корня волоса (Fig. 2A), как было установлено, действует как важный компонент ниши волосяного фолликула за счет продукции высоких уровней fibroblast growth factor 18 (FGF18) и bone morphogenetic protein 6 (BMP6), что способствует покою hfSC (Fig. 2) (Hsu et al., 2011). Подкожные инъекции или BMP6 или FGF18 достаточны, чтобы блокировать переход от telogen к anagen, демонстрируя, что сопровождающий (companion) слой функционирует, чтобы ограничивать активность hfSC и способствует поддержанию гомеостаза hfSC in vivo (Blanpain et al., 2004; Greco et al., 2009). Напротив, сопутствующий слой клеток, экспрессирующий keratin 6 (K6+), механически удаляется выщипыванием волоса, то выпячивание hfSCs оказывается преждевременно активированным и преждевременно активируется волосяной цикл, преждевременно инициирующий цикл нового волоса.


Extra-Follicle Interactions


Interactions between hair follicles and intra-dermal adipose tissue


С помощью бритья кожи спины мышей и кроликов мы наблюдали волны регенерации, перемещающиеся по коже живых мышей (Plikus and Chuong, 2008). В фазе telogen, кожа розовая, но становится тёмной по мере пигментации, откладываемой в растущих волосяных фолликулах вовремя anagen. Пигмент продолжает оставаться в течение всей фазы catagen и опять теряется в фазе anagen. Наблюдаемые регионы кожи изменяют окраску, позволяя нам анализировать поведение популяций волосковых стволовых клеток скорее, чем активацию только одиночных фолликулов. Активация hfSCs индуцирует новые волосковые циклы, начиная с anagen (Plikus and Chuong, 2008). Волосковые волны также наблюдали на спинах Cg-Msx2tm1Rilm/Mmcd мышей, которые обнаруживали циклические раунды роста и алопеции (Plikus and Chuong, 2004).
Чтобы понять механизм, регулирующий волосковые волны, мы исследовали флюктуации в молекулярной экспрессии в течение всего волоскового цикла. Передача канонических сигналов Wnt, как известно, регулирует активацию hfSC (Millar et al., 1999). Хотя и, существенный для волоскового цикла, BMP также ингибирует образование фолликулов волос. Как было продемонстрировано волна экспрессии BMP в дермисе происходит не фазе с циклом Wnt/β-catenin? подтверждая тем самым подразделение anagen на фазы распространения (низкий BMP, высокий Wnt/β-catenin) и автономного anagen (высокий BMP, высокий Wnt/β-catenin) . Telogen также подразделен на refractory фазу (высокий BMP, низкий Wnt/β-catenin) и компетентную фазу (низкий BMP, низкий Wnt/β-catenin) при регенерации волос (Plikus et al., 2008). Продолжительность этих фаз может быть экспериментально изменена за счёт избыточной экспрессии Wnts или супрессии активности Wnt с помощью Dkk1 (Plikus et al., 2011). Более того, роли передачи сигналов Wnt и BMP , регулирующие цикл волос законсервированы у кроликов (Plikus et al., 2011). hfSCs могут оставаться в покое после вступления волоскового цикла в покоящуюся фазу telogen, благодаря секреции BMP2 и BMP4 из DP и дермальных фибробластов непосредственно рядом с выпячиванием (bulge). В поздней фазе telogen уровни ингибирующей передачи сигналов дермального BMP снижаются и в свою очередь уровни экспрессии белка Wnt повышаются (Plikus et al., 2008, 2011). Следовательно, локальное молекулярное общение между hfSCs и окружающей нишей направляет BMP-high/Wnt-low ингибирующее состояние в направлении BMP-low/Wnt-high набора, способствующего переходу telogen-anagen и регенерации волос (Fig. 4).
Чтобы лучше понять, как динамика Wnt/BMP активатор/ингибитор пары связана с паттернами регенерации волос, была предложена модель cellular automaton (CA) (Plikus et al., 2011). Модель коррелирует со способностью к фазовому переходу (напр., от компетентной фазы telogen к фазе распространения anagen) волосяного фолликула (one automaton) к разным уровням WNT и BMP, продуцируемым внутри фолликулов (the same automaton) и вне фолликулов (adjacent automata). Моделирование результатов может воспроизводить регенеративные паттерны, наблюдаемые у нормальных мышей, у мышей с нарушениями пути WNT и у кроликов. Модель выявляет флюктуации уровней активатора и ингибитора, изменяющие эффективность образования hfSCs в соседних волосяных фолликулах и приводят к изменениям паттерна регенерации волос (Plikus et al., 2011). Модели клеточных клонов, которые недвусмысленно включают каждый тип клеток и регуляцию с помощью обратной связи, могут быть использованы для таких систем, чтобы выяснить лежащие в основе механизмы на клеточном и молекулярном уровнях (Lander et al., 2009; Lo et al., 2009; Chou et al., 2010; Ovadia and Nie, 2013; Gord et al., 2014).
Недавно внутрикожные предшественники адипоцитов, как было установлено, активно секретируют platelet-derived growth factor-α (PDGFα), который может стимулировать стволовые клетки фолликула волоса к вступлению в anagen (Festa et al., 2011). Следовательно, передача этих накапливающихся сигналов в hfSCs преодолевает высокий ингибирующий порог, продуцируемый клетками окружающей ниши, и инициирует новую регенерацию HF (Fig. 4) (Oshimori and Fuchs, 2012).
Итак, эти интегрированные модели демонстрируют как hfSCs, их непосредственные потомки, их ниши, а также компоненты микро- и макроокружения могут уравновешивать один др. или, альтернативно, кооперировать, чтобы поддерживать стволовые клетки во время гомеостаза покоя и активации. Способность hfSCs секретировать ауторегуляторные сигналы, и всё ещё ощущать средовые сигналы от окружающей ниши стохастическим способом, чтобы контролировать потребности в регенерации органа, может представить общий пример для регуляции стволовых клеток. Т.о., выяснение реципрокных молекулярных circuits между hfSCs и разными компонентами ниш может пролить свет на мишени для использования трансляции в будущей регенеративной медицине.

Interactions between hair follicles and body status such as pregnancy and aging


Интересное наблюдение, что волны регенерации волос первоначально пересекают всю кожу спины, как одиночная волна, но впоследствии циклы волос фрагментируются по небольшим доменам, которые оказываются не синхронизированными один с др. Более того, при беременности и лактации при травмах кожи могут фрагментированные домены цикла волос на коже спины превратиться в один домен (Johnson, 1958). Это может быть обусловлено ассоциированными с беременностью изменениями уровней гормонов (эстрогена, пролактина) (Oh and Smart, 1996; Pearson et al., 1999; Craven et al., 2001, 2006; Foitzik et al., 2003).
Др. интересной находкой стало то, что цикл волос замедляется у старых мышей (старше 18 мес.). Домены волосяных волн фрагментируются на более мелкие регионы и распространение волны снижается с расстоянием. Чтобы протестировать, может ли старая кожа отвечать на сигналы от более молодой кожи у мышей, кусочек кожи от старых мышей трансплантировали молодым. Более старая кожа отвечала на сигналы от кожи молодых мышей и восстанавливала волосяной цикл на территории в 3 мм от границы кожи хозяина. Follistatin, ещё один ингибитор BMP, был экспрессирован на высоких уровнях в поздней фазе telogen и ранней anagen. Follistatin может индуцировать активацию hfSC и распространение волосяной волны; , однако, уровни follistatin существенно снижены в коже старых мышей (Chen et al.,2014). Эти данные подтверждают, что follistatin от молодых мышей может индуцировать распространение волны восстановления волос в коже старых мышей. Каждый из этих примеров демонстрирует, что внешнее окружение по отношению к фолликулу может драматически влиять на активацию hfSC (Chen et al., 2014).

Multi-Scale Antagonistic Competition Between BMP and Wnt Signaling


Многие слои регуляции, контролирующие активность hfSC, в основном базируются на передаче канонических сигналов BMP/Wnt (Fig. 4). Такой многоярусный контроль помогает гарантировать, что учитывается вся регуляторная информация, что позволяет популяции hfSC проводить анализ всей активатор/ингибитор активности, чтобы выбрать решение, активироваться или оставаться в покое (Kandyba and Kobielak, 2014; Kandyba et al., 2014). Более того, задержка ассоциированной с клеточным циклом канонической Wnt-зависимой активации генов мишеней вследствие hfSCs ингибирования BMP демонстрирует, что ингибирование BMP предшествует лиганд-рецептор зависимой активации канонического Wnt и активации hfSCs (Kobielak et al., 2007; Kandyba et al., 2013, 2014; Kandyba and Kobielak, 2014).
Интеграция регуляции внешних и внутренних регуляторов может действовать совместно, чтобы синхронизировать или де-синхронизировать как сети, ведущие к ускорению или задержке реактивности hfSCs путем изменения длины refractory и компетентной фаз telogen (Kandyba et al., 2013, 2014; Kandyba and Kobielak, 2014). Т.о., hfSCs могут ощущать супрессивные уровни BMP от внутренних и внешних источников. Разработана модель на базе осцилляций состояний выпячиваний hfSCs у взрослых (Maini et al., 2006) в ответ на устойчивое равновесие в условиях конкуренции между активаторами и ингибиторами, которое является фундаментальным для поддержания покоя или активности hfSC. Следовательно, высвобождение сигналов активации hfSC может восстановить баланс обратно в направлении покоя в выпячивании, тем самым будет восстановлена циклическая молекулярная сеть (Kandyba, et al., 2013).

"Organ Metamorphosis" in Feathers Is Made Possible by Physiological Regenerative Cycling


По крайней мере 4 разных оперенья присутствует у видов птиц от вылупления до конца первого ежегодного цикла линьки, включая прирожденное (natal down), ювенильное (juvenal), перемежающееся (alternate) и базовое оперение (Lucas and Stettenheim, 1972). Оперение, присутствующее на разных физиологических стадиях развития, может драматически отличаться по форме и цвету. У взрослых птиц характер оперения может также существенно варьировать в основном в ответ на сезонные изменения и половые различия (половой диморфизм). Метаморфоз характера оперения оказывается возможным благодаря мощным и циклическим регенеративным активностям стволовых клеток перьев (Chuong et al., 2012). DP и ассоциированная с ним пульпа могут служить в качестве трансляционного центра, чтобы передавать системную информацию о дифференциальном ветвлении перьев и характере окраски. Напр., в присутствии дополнительной тироидной субстанции, также как и прогестерона, DP увеличивается в размере (Shaffner, 1954 1955; Juhn and Harris, 1955). Сезонные изменения характера оперения, по-видимому, являются результатом изменений во времени фото-стимуляции, скорости метаболизма и нейроэндокринной регуляции (Dawson and Goldsmith, 1983; Nolan Jr and Ketterson, 1990; Kuenzel, 2003; V?zina et al., 2009). Половой диморфизм - это системное отличие фенотипа у разных полов одного и того же вида, управляемое половыми гормонами (Mayer et al., 2004). Напр., уровни тестостерона связаны с размером орнамента оперенья ("tail white") у тёмноглазых junco (McGlothlin et al., 2008). Помимо тестостерона в предыдущих исследованиях было установлено, что гонадные стероидные гормоны (эстроген, гипофизарный пептидный гормон и лютеинизирующий гормон) также участвуют в регуляции различий в цветовой раскраске оперенья у самцов и самок птиц одного вида (Kimball and Ligon, 1999). Следовательно, средовые сигналы изнутри и извне тела могут модулировать стволовые клетки перьев, а значит форму и окраску перьев.

Pursuing Understanding at the Genomic Level: Systems Biology Approaches


Имеются интересные и важные вариации органов интегумента в разных регионах тела на разных ст. развития, но как достигается подобная пространственно-временная регуляция от каждого индивидуального генома? Появление next generation sequencing (NGS) технологии предоставило крупно-масштабный, беспристрастный подход к получению профилей генетических и эпигенетических сетей в разных биологических процессах. Кожные придатки предоставляют крупномасштабную, мощную платформу для функционального скрининга молекул кандидатов, открываемых с помощью NGS-derived технологий. Интеграция разных NGS подходов, напр., whole genome sequencing (WGS), RNA sequencing (RNA-seq), иммунопреципитации хроматина, сопровождаемой секвенированием (ChIP-seq), chromosome conformation capture, сопровожаемого секвенированием (3C-seq), bisulfite-seq (BS-seq) и т.д., открывают многообещающее направление в области морфогенеза и регенерации (van Dijk et al., 2014). Перья и волосы являются основными моделями для понимания генетических и эпигенетических основ фенотипа интегумента (Hillier et al., 2004).

Genetic Approach


Frizzle chicken


Перья у Frizzle мутантных домашних цыплят (Somes Jr, 1990) заворачиваются наружу и вверх из-за нарушений структуры главного черешка пера. Была выяснена генетическая основа признака frizzle (Ng et al., 2012). Причинная область была ограничена регионом, богатым геном кератина. Дальнейший анализ последовательностей идентифицировал делецию 69 bp in frame в гене KRT75 кур Frizzle . Кроме того, эктопическая экспрессия мутантного KRT75 могла изменять искривление черешка пера дикого типа, демонстрируя, что эта мутация достаточна, чтобы индуцировать признак frizzle.

Naked neck chicken


Naked neck цыплята лишены перьев на шее и имеют узкие треки перьев на теле. Работа группы Dr. Headon's продемонстрировала, как геномный анализ может помочь установить молекулярный механизм регуляции паттерна перьев (Mou et al., 2011). Тонкое генетическое картирование идентифицировало крупную геномную инсерцию из хромосомы 1 на хромосому 3, которая отвечала признак Naked neck. Соседняя 770-kb область содержала 5 генов кандидатов, которые могут быть затронуты этой инсерцией. Из них, BMP12 был единственным, который экспрессировался нормально в развивающихся зачатках перьев. Было подтверждено, что усиление передачи сигналов BMP и явилось причиной признака Naked neck, а региональная несоразмерность фенотипа обусловлена негомогенной чувствительностью к передаче сигналов BMP по всему телу. Анализ с помощью микрочипов регионов шеи и туловища выявил различающиеся уровни ретиноевой кислоты (RA), контролируемые с помощью RALDH (RA синтетазы), модулирующие чувствительность формирующей перья кожи к передаче сигналов BMP.

Rock pigeons


Использование NGS технологии снижает цену полного геномного секвенирования вида. Даже легче провести секвенирование всего генома множественных линий и подвидов, чтобы идентифицировать генетическую основу специфического фенотипа (Ellegren, 2014). Прекрасным примером является исследование генетического признака, контролирующего фенотипы головного гребня голубей (Shapiro et al., 2013). Было ре-секвенировано 40 пород сизых голубей и получен SNP в гене EphB2, который оказался четко ассоциирован с фенотипом головного гребня. Кроме того, они предприняли попытку выяснить молекулярные эпистатические взаимоотношения, лежащие в основе изменчивости цвета у домашних голубей (Domyan et al., 2014).

Importance of the Epigenetic Process in Integument Development and Regeneration


Эпигенетические механизмы позволяют клеткам с идентичными геномами достигать разных фенотипов за счет регуляции профилей экспрессии генов за счет различных модификаций гистонов. Два функционально перекрывающихся эпигенетических writers, Ezh1 и Ezh2, как было установлено, участвуют в регуляции H3K27me3, чтобы регулировать гомеостаз волосяного фолликула. Ezh1/2-нулевая кожа теряет способность регенерировать волосяные фолликулы из-за снижения пролиферации и усиления апоптоза (Ezhkova et al., 2011). Др. эпигенетический writer, DNMT1, важен для поддержания в недифференцированном состоянии клеток эпидермальных предшественников человека (Sen et al., 2010). Кондиционный нокаут DNMT1 также влияет на регенерацию волосяных фолликулов и приводит к прогрессивной потере волос у мышей (Li et al., 2012). Сходным образом, эпигенетический стиратель (erasers), напр., HDAC1, также играет важную роль в развитии волосяного фолликула. Кондиционный нокаут HDAC1 у мышей приводит к алопеции и дистрофии волосяных фолликулов (Hughes et al., 2014).

Epigenetic States of Hair Follicle Stem Cells


ChIP-seq анализ был использован для изучения hfSCs взрослых во время активации и дифференцировки (Lien et al., 2011). Сравнивали профили мРНК H3K4me3 (маркер инициированных генов) и H3K27me3 (маркер репрессированных генов) покоящихся hfSCs, активных hfSCs и в переходных умножающихся клетках. Было сделано несколько новых находок: (1) значительно меньше бивалентных H3K27me3+H3K4me3 генов было найдено в hfSCs, чем в эмбриональных стволовых клетках (ESCs), указывая, что бивалентное или "poised" состояние может быть уникально предназначено для поддержания мультипотентности ESC. (2) polycomb group (PcG) комплекс, опосредуемый H3K27me3 не столь интенсивно участвует во время активации hFSCs, но он функционирует, чтобы замалчивать ключевые регуляторы стволовых клеток и высвобождает регуляторы детерминированных матричных клеток вовремя дифференцировки.

High order chromatin organization


Экспрессия генов может управляться с помощью ремоделирования высокого порядка хроматина, которое может успешно сводить вместе удаленные гены, расположенные вдоль последовательности ДНК (Botchkarev et al., 2012; Gdula et al., 2013). Один из примеров - это косвенная регуляция модификаций хроматина с помощью p63 во время развития эпидермиса (Fessing et al., 2011). P63 и Brg1, как известно, действуют в комплексе эпидермальной дифференцировки (Mardaryev et al., 2014).

New Insights in Cellular Plasticity Revealed by Real Time Imaging and Cell Tracking Cellular Plasticity and Phenotypic Stability


Клетки из разных регионов интегумента наделены разными характеристиками (профили генной экспрессии, клеточной морфологией). Являются ли эти характеристики постоянными или обратимыми? Появление эктопического роста волос на деснах человека, собак и грызунов (Baranov et al., 2010) может указывать на потенциал эктодермальных предшественников выбирать разные судьбы. Экспериментальные доказательства, подтверждающие идею, что эктодермальные предшественники могут продуцировать разные фенотипы после стимуляции с помощью внешнесредовых сигналов, начали появляться, с тех пор, когда Jahoda et al. имплантировали клетки дермальных сосочков вибрисс крыс в ушную раковину и индуцировали в ней образование волос, похожих на вибриссы (Jahoda et al.,1993). Сообщалось также, что эктодермальные предшественники, формирующие разные органы интегумента, когда нарушены некоторые молекулярные пути. Напр., разобщенные клетки потовых желез могут регенерировать потовые железы, также как и волосяные фолликулы и эпидермис, если смешиваются с дермальными фибробластами кожи спины новорожденных (Leung et al., 2013). Также у K14-Noggin трансгенных мышей потовые железы наблюдались, трансдифференцирующимися в волосы (Plikus et al., 2004). Кроме того, K14-Noggin мышиный эпителий грудных сосков превращался эпителий, формирующий волосы, возможно из-за уменьшения уровней с паратироидным гормоном родственного белка, когда передача сигналов BMP снижалась (Mayer et al., 2008). У эмбрионов кур воздействие ретиноевой кислоты может индуцировать рост перьев в тарзо-метатарзальном регионе, формирующем чешуйки (Dhouailly et al., 1980). Сходные фенотипы были также описаны после эктопической экспрессии β-catenin, BMP7, доминантного негативного BMP рецептора, Dll1, среди прочих (Zou and Niswander, 1996; Crowe et al., 1998; Noramly et al., 1999; Widelitz et al., 2000; Prin and Dhouailly, 2004; Lin et al., 2006). Во всех приведенных выше наблюдениях указывается, что эктодермальные предшественники пластичны (по крайней мере, внутри определенного временного промежутка) , чтобы продуцировать разные фенотипы интегумента.

Intravital Imaging of Hair Follicles Reveals Plasticity to "Regenerate" Stem Cells


Наблюдение вживую важно для анализа молекулярной и клеточной динамики во время биологических процессов, таких как морфогенез и регенерация. Его использование затруднено для кожных придатков из-за двух факторов: (1) они являются трехмерными структурами, которые могут расти по крупной шкале; (2) проксимальная часть фолликулов волос и перьев проникает глубоко в кожу. Для осуществления наблюдения вживую придатков кожи необходимо выполнение двух обязательных условий: (1) микроскомп д. быть способен видеть на глубину ткани с высоким разрешением; (2) клетки или молекулы мишени д. быть мечены. Недавно группа, Dr. Greco's успешно отследила поведение hfSCs и их потомков во время физиологической регенерации волос и исследовала роль эпителиально-мезенхимного взаимодействия в этом процессе (Rompolas et al., 2012). Они отследили клоны hfSCs из разных позиций выпячивания и установили, что их положение д. предопределять будущую судьбу стволовых клеток выпячивания. Используя удаление с помощью лазера, они установили, что стволовые клетки выпячивания необязательны для регенерации и могут быть замещены соседними эпителиальными клетками из эпидермиса между фолликулами, infundibulum и сальных желез (Fig. 5A) (Rompolas et al., 2013). Эти динамические свойства согласуются с концепцией, что пластичность соседних эпителиальных предшественников скорее, чем стволовые клетки, могут переключать свои судьбы, как это необходимо в случае повреждения, подобно реке, течение которой может менять свое направление в зависимости от изменений ландшафта (Chuong and Widelitz, 2009).

Figure 5. Flow of stem cells can change in physiological growth and after injury, implying the concept of "River of Stem Cells" (Chuong and Widelitz,2009). Hair and nail are used as examples. A: Schematic drawing of hair follicles showing cellular flow under physiological conditions (anagen and telogen), after plucking, after the formation of a large wound and laser ablation. B: Schematic drawing of cell flow in the nail during growth and regeneration. Blue arrows: cell flow during growth; red arrows: cell flow during regeneration. Flow ? is to peri-nail epidermis. Flow ? is for self-renewal of nail LRCs. Flow ? is to the nail matrix. B is modified from Leung et al. (2014).

Genetic Lineage Reveals Dual Fate Homeostasis of Integument Progenitors In Vivo


Недавнее исследование открыло, что потенциал стволовых клеток ногтей (K15 позитивные, сохраняющие метку клетки) распределяются в кольцевой конфигурации в проксимальном складчатом регионе ногтя. Интересно, что эксперименты по отслеживанию клонов показывают, что эти клетки не только вносят вклад в рост и регенерацию самой структуры ногтя, но и также в околоногтевой эпителий. Т.о., эти стволовые клетки бифункциональны (Leung et al., 2014). После повреждения ногтя предшественники ногтя вносят большой вклад в формирование ногтевой структуры, чем околоногтевого эпителия (Fig. 5B) (Leung et al., 2014). Сходным образом, в более ранней работе Ito et al. (2005), стволовые клетки волосяного выпячивания не только вносили вклад в циклическую регенерацию волоса, но и также в регенерацию межфолликулярного эпидермиса после ранения. Этот феномен наблюдался также в потовых железах, где медленно делящиеся клетки label-retaining cells (LRCs) были способны к трансдифференцировке в эпидермис при длительном заживлении ран (Leung et al., 2013). Эти открытия показывают, что предшественники интегумента могут принимать на себя разные пути дифференцировки в физиологических и патологических условиях.

Perspectives


Autonomous Patterning Can Be Generated by Robotic Stem Cells


Self-organized biological patterns not only fascinate biologists but also engineers in the field of robotics, as there are a number of applications for building multi-robot systems that are capable of self-assembly and self-healing (without human intervention) so as to detect and recover from unforeseen errors and attacks. The robots in these artificial systems are termed robotic stem cells as they have stem cell-like properties that can self-reorganize to repair damage to their swarming organization (Rubenstein et al., 2009). This type of cross-field research would be mutually beneficial in that the discovered principles of biological pattern formation can inspire novel design of the interaction algorithms of robotic stem cells. One the other hand, the effort to alter the algorithms to create different shapes of the robotic swarm may add to biologists' understanding of how biological patterns evolve over time. For example, Turing type activator-inhibitor interactions have been shown to mediate the periodic formation of hairs and feathers (Maini et al., 2006). Based on this, a "digital hormone model" was developed for a team of robots in a field to form spot or stripe configurations (Jiang et al., 2004) and demonstrated the novel utility of this mechanism in controlling self-reconfigurable robotic systems (Shen et al., 2002). Recently, a multi-robot system was developed that can self-assemble into complex two-dimensional shapes based on algorithms controlling three primitive collective behaviors: edge-following, gradient formation, and localization (Rubenstein et al., 2014). However for this robotic system to form a specific shape, a blueprint is still required.

Self-Organization of Progenitor Cells in Tissue Engineering


One major goal of tissue engineering is to let cells self-organize into complex organs in vitro with structures comparable to those developed in vivo. Pioneering work of self-organizing tissue pattern formation was achieved by Eiraku et al. (2011, 2012). They developed a 3-D culture system in which mouse embryonic stem cell aggregates could be induced to differentiate into retinal and non-retinal neuroectodermal epithelium. More intriguingly, the retina epithelium could autonomously fold inward to form a shape reminiscent of the embryonic optic cup. Two-photon live imaging was employed to observe and analyze cell shape and dynamics during optic cup morphogenesis. It helped reveal differential cell morphologies at different phases of this morphogenetic process as well as upon inhibition of ROCK kinase activity. Furthermore, they developed a relaxation-expansion model to explain how the tissue internal forces and cell shape changes result in the spontaneous invagination of the neural retina (Eiraku et al., 2011, 2012). This work demonstrates the great potential of in vitro self-organized pattern formation systems, in combination with the advancing imaging techniques and mathematical modeling that can deepen our understanding of how the patterning process really works from initiation to the steady state.

Evo-Devo of Integument Organs Driven by Novel Molecular Modules That Enable New Patterning Processes


The morphological diversification of the Metazoa (multicellular animals) is attributable to two major mechanisms. One is the emergence of new paths of cell differentiation (e.g., the cells produce new protein products, or alter their shapes); the other is the adjustment or novel use of molecular modules for pattern formation. It is believed that the genes and gene regulatory networks involved in cell differentiation keep on expanding during evolution while those molecular modules setting up basic biological patterns have minimal changes (Newman et al.,2009). One example of the first type of mechanism would be the expansion of keratin multigene families and the diversification of integument organs. The expansion of α-keratin genes may have contributed to the independent origin of hair and nails in mammals and baleen in whales (Vandebergh and Bossuyt, 2012). Large-scale expansions of β-keratin genes in birds and turtles may be involved in the innovation of the feathers and turtle shells (Greenwold and Sawyer, 2010; Li et al., 2013b). In a recent study, we carried out an exhaustive search of α- and β-keratin genes in the Galgal4 genome assembly and characterized the expression pattern of some keratin genes. β-keratin genes have diverse expression patterns in the five types of feathers we examined, and within the same individual feather α- and β-keratins are expressed in different regions (Ng et al., 2014). For the second type of mechanism, components of Wnt, BMP, and Hedgehog pathways have been discovered to interact in a specific manner to generate the periodic patterns in the integument (Maini et al., 2006). Many of these components constantly work together as a molecular module. For example the Wnt/Notch module is known to define different morphogenetic fields in different biological processes (Newman et al., 2009; Mu?oz Descalzo and Martinez Arias, 2012; Li et al.,2013a). Although these genes have relatively conserved coding sequences, their regulatory regions may still accumulate changes through evolution as these modules are recruited to a new biological process.