Morphogen rules: design principles of gradient-mediated embryo patterning
James Briscoe, Stephen Small Development 2015 142: 3996-4009; doi: 10.1242/dev.129452
The Drosophila blastoderm and the vertebrate neural tube are archetypal examples of morphogen-patterned tissues that create precise spatial patterns of different cell types. In both tissues, pattern formation is dependent on molecular gradients that emanate from opposite poles. Despite distinct evolutionary origins and differences in time scales, cell biology and molecular players, both tissues exhibit striking similarities in the regulatory systems that establish gene expression patterns that foreshadow the arrangement of cell types. First, signaling gradients establish initial conditions that polarize the tissue, but there is no strict correspondence between specific morphogen thresholds and boundary positions. Second, gradients initiate transcriptional networks that integrate broadly distributed activators and localized repressors to generate patterns of gene expression. Third, the correct positioning of boundaries depends on the temporal and spatial dynamics of the transcriptional networks. These similarities reveal design principles that are likely to be broadly applicable to morphogen-patterned tissues.
Важность градиентов в развитии эмбрионов и регенерирующей ткани известна давно. Начали складываться детальные представления о функции и природе градиентов (rev. Rogers and Schier, 2011). Крупный теоретический вклад внесли среди прочих, Alan Turing, Lewis Wolpert и Francis Crick. Turing придумал термин 'морфоген' для обозначения биохимической субстанции, которая диффундирует между клетками и генерирует специфические реакции на определенные концентрации (Turing, 1952). Wolpert внес концептуальное понятие 'позиционная информация' , согласно которому формирование онтогенетического паттерна зависит от интерпретации клетками позиционных значений, которые они приобретают от внешних сигналов (Wolpert, 1969). Crick, отметил, что спецификация паттерна в целом осуществляется в течение нескольких часов и что большинство развивающихся тканей возникают из участков не более, чем ~100 клеточных диаметров, аргументируя теоретически, что диффузия достаточна для становления молекулярных градиентов в тканях (Crick, 1970). Объединение этих идей привело к теории морфогена, согласно которой формирование паттерна ткани контролируется с помощью концентрационного градиента морфогена и что клетки приобретают позиционную информацию путем непосредственного измерения концентрации морфогена, воздействию которой они подвергаются.
Революция в молекулярной генетике 1980s и 1990s привела к идентификации некоторых молекул. которые ведут себя, как градиент формирующие сигналы (Driever and N?sslein-Volhard, 1988a; Ferguson and Anderson, 1992; Green and Smith, 1990; Katz et al., 1995; Riddle et al., 1993; Tickle et al., 1985). Последующие исследования выявили, что в большинстве случаев градиенты этих молекул устанавливаются за счет дисперсии от локального источника и необходимы для экспрессии генов-мишеней, которые экспрессируются на разных расстояниях от источника (rev. Rogers and Schier, 2011; Iba?es and Izpis?a Belmonte, 2008; Jeong and McMahon, 2005;Kicheva et al., 2013; Lander, 2013; Lawrence and Struhl, 1996). Недавно внимание было сфокусировано на выявлении клеточных и молекулярных механизмов образования градиентов (Chamberlain et al., 2008; Gregor et al., 2007b; Grimm et al., 2010; He et al., 2008; Kicheva et al., 2007; Little et al., 2011; Zhou et al., 2012). В то же самое время дополнительные исследования имели целью понять, как клетки отвечают на градированные сигналы, чтобы контролировать дифференциальную экспрессию гена (Crauk and Dostatni, 2005; Gregor et al., 2007a; Jiang and Levine, 1993;Robertson, 2014). Наконец комбинация исследований генетики, геномики, эктопической экспрессии, сетевой анализ и математическое моделирование привели к новой точке зрения на интерпретацию морфогена (Davidson, 2010; Jaeger et al., 2008; Shilo et al., 2013).
Хотя образование градиента было изучено в разных онтогенетических контекстах, исследования были сфокусированы на двух примерах в частности: Bicoid (Bcd)-обеспечиваемое формирование паттерна бластодермы Drosophila и Sonic hedgehog (Shh)-обеспечиваемое формирование паттерна нервной трубки позвоночных (Boxes 1 and 2) (rev. Alaynick et al., 2011; Dessaud et al., 2008; Jaeger, 2011; Jessell, 2000; Nasiadka et al., 2002; Struhl, 1989). Здесь мы сравним эти системы в контексте идеи о сетях генов регуляторов и теории динамических систем. Это сравнение выявило несколько общих свойств и подтвердило, что общий организующий принцип лежит в основе формирования паттерна в обеих тканях. Эти принципы составляют основу пересмотренной теории морфогеном-обусловленного формирования паттерна. Мы полагаем, что этиа теория, скорее всего, приложима ко многим тканям и может объяснить стратегию формирования паттерна ткани.
Box 1. Anterior-posterior (AP) patterning of the Drosophila blastoderm
AP patterning of the early Drosophila embryo involves maternal gradients of two homeodomain proteins: Bicoid (Bcd) and Caudal (Cad). Bcd protein is translated from a source of mRNA at the anterior pole and diffuses posteriorly through the syncytial blastoderm, forming a long-range AP gradient, with highest levels at the anterior end (Driever and Nusslein-Volhard, 1988a; Little et al., 2011). Complementing the Bcd gradient is an anti-parallel gradient of Cad, which is shaped by Bcd-mediated translational repression (Chan and Struhl, 1997; Niessing et al., 2002). These gradients are initially formed near the cortex of the oocyte, while nuclei divide rapidly in the central region. After ten nuclear division cycles, nuclei migrate to the periphery and import different amounts of Bcd and Cad, depending on their position along the AP axis.
Bcd activates target genes that create boundaries at defined positions along the AP axis, dividing the body plan into regions that will become cephalic (C), thoracic (T1-T3) and abdominal (A1-A8) segments. Bcd target genes include sloppy-paired 1 (slp1), giant (gt) and hunchback (hb), which are activated in overlapping domains in anterior regions. slp1, gt and hb encode repressors, which prevent expression of run, Kr and kni, respectively. Mutual repression between these pairs of repressors refines their patterns, creating sharp gene expression boundaries that foreshadow the organization of the body plan (Clyde et al., 2003; Jaeger et al., 2004a; Kraut and Levine, 1991).
Box 2. Dorsal-ventral (DV) patterning of the vertebrate neural tube
Cell fate specification in the vertebrate neural tube follows a template similar to that in the Drosophila blastoderm. Discrete domains of progenitors (p0-p3, pMN, pd1-pd6) are arrayed along the DV axis (Alaynick et al., 2011; Dessaud et al., 2008; Jessell, 2000). Progenitor domain identity is based on the combinatorial expression of a set of TFs and this combinatorial code is necessary and sufficient to specify the neuronal subtypes (V0-V3, MN, dI1-dI6) that each domain generates. The pattern of gene expression is established in a progressive manner in response to opposing gradients of secreted factors: Shh emanating from the ventral pole (NC, notochord); Wnt and BMP signaling dorsally.
Shh binds to the transmembrane receptor Ptch, and this relieves repression on a second transmembrane protein, Smo. Smo activation initiates intracellular signal transduction, culminating in the regulation of Gli family TFs (Briscoe and Th?rond, 2013), which are bifunctional transcriptional repressors and activators. In the absence of signal, Gli proteins are either completely degraded or processed to form transcriptional repressors (GliR), whereas Shh signaling inhibits GliR formation and instead activating forms of Gli proteins (GliA) are generated.
In response to the dynamic gradient of Gli activity produced by Shh signaling, the expression of ventral TFs (e.g. Nkx6.1, Olig2, Nkx2.2) are activated, and dorsally expressed TFs (e.g. Pax3, Pax7, Pax6, Msx1, Irx3) are repressed. Binding sites for Gli proteins are associated with genes expressed in the ventral half of the neural tube (Oosterveen et al., 2012; Peterson et al., 2012; Vokes et al., 2007). Many Shh/Gli-regulated genes encode TFs that act as Groucho/TLE-dependent repressors (Muhr et al., 2001). Analogous to the gap proteins, pairs of TFs expressed in adjacent domains cross-repress each other's expression (Briscoe et al., 2000; Vallstedt et al., 2001).
The Drosophila blastoderm and the vertebrate neural tube: distinct but alike
Бластодерма Drosophila и нервная трубка позвоночных имеют разное эволюционное происхождение еще до появления билатеральной симметрии. Сигналы, которые действуют как позиционные сигналы в двух тканях не связаны, участвующие транскрипционные факторы (TFs) не являются ортологами, и временная шкала формирования паттерна разная. Становление градиента Bcd и возникновение паттерна gap генов происходит в течение первых ~2 ч развития Drosophila (Driever and Nusslein-Volhard, 1988a;Fowlkes et al., 2008; Surkova et al., 2008). В самом деле, экспрессия gap генов впервые выявляется в ядерном цикле 10 , а паттерн в целом считается полностью проявившимся во время ядерного цикла 14, период ~60 min после того как эти гены впервые экспрессируются. В нервной трубке, напротив, период формирования паттерна варьирует между видами, но протекает в течение нескольких часов. Напр., у эмбрионов кур и мышей становление и тщательная разработка паттерна происходит в течение периода более 18 ч (Dessaud et al., 2007; Jeong and McMahon, 2005). Эти различия во времени могут быть непосредственно связаны с существенными различиями в клеточной биологии двух тканей. Бластодерма Drosophila является синцитием с ядрами, располагающимися в общей цитоплазме и подвергающимся синхронным делениям. Отсутствие деления цитоплазмы в бластодерме делает возможным относительно нестесненное перемещение TFs между соседними ядрами, особенно во время митозов, когда ядерные мембраны разрываются. Напротив, нервная трубка состоит из псевдостратифицированных слоёв эпителия, состоящих из множественных индивидуальных клеток, пролиферирующих асинхронно. Дальнодействующие передачи сигналов в нервной трубке базируются на секретируемых белках, которые воспринимаются с помощью трансмембранных рецепторов и передаются с помощью внутриклеточных сигнальных путей.
Несмотря на эти различия имеются очевидные параллели между механизмами формирования паттерна в этих двух тканях. Обе являются quasi одномерными системами с антипараллельными градиентами передачи сигналов, исходящими из двух полюсов вдоль оси формирования паттерна. Эти сигналы устанавливают дискретные домены, экспрессии наборов TFs, которые подразделяют ткань на молекулярно отличающиеся блоки клеток, расположенных вдоль оси формирования паттерна. В обоих случаях комбинация TFs, экспрессируется в каждой клетке, представляет собой молекулярную корреляцию её позиции и контролирует её последующее развитие (Boxes 1 and 2). Т.о., формирование паттерна становится вопросом понимания того, как различающиеся домены экспрессии TF генерируются организованным и воспроизводимым способом.
Сравнение лежащих в основе механизмов, оперирующих в двух тканях, подкрепляет идею, что имеются фундаментальные сходства в их стратегиях формирования паттерна. Здесь мы предлагаем общую логику дизайна механизмов формирования паттерна, сопоставимую с тремя принципами, которые являются общими для эмбрионов Drosophila и системы формирования паттерна нервной трубки позвоночных (Fig. 1). Во-первых, мы предполагаем, что градиенты морфогенов устанавливают первоначальные условия формирования паттерна (Fig. 1A). Даннные, выводимые из пространственных и временных градиентов и временные сигналы от градиентов детерминируют состояние транскрипционной сети с помощью регуляции экспрессии активирующих и репрессирующих TFs. Во-вторых, гены мишени контролируются с помощью составных и модулярных регуляторных элементов, содержащих сайты связывания для многих отличающихся TFs (Fig. 1B). Эти элементы интегрируют транскрипционные сигналы, чтобы создавать точные паттерны экспрессии генов. Наконец, динамика транскрипционной сети трансформирует градированные сигналы в точный паттерн генной экспрессии (Fig. 1C), непосредственно увязывая пространственные и временные механизмы формирования паттерна. Принимая во внимание отдельные источники и молекулярные и клеточные различия между двумя системами, эти сходства, скорее всего, говорят в пользу важности свойств формирования клеточного паттерна во всех сложных тканях.
Fig. 1.
Design principles of patterning in the Drosophila blastoderm and vertebrate neural tube. (A) Signaling gradients polarize tissues by initiating and orienting gene expression patterns. A morphogen (M, left), Bcd in the case of the blastoderm (center) and Shh for the neural tube (right), forms a gradient. This asymmetry initiates the division of the tissue into domains of gene expression (colored blocks) arrayed along the patterning axis (anterior-posterior in the blastoderm and ventral-dorsal in the neural tube). (B) Patterns of target gene expression are controlled by modular regulatory elements containing binding sites for multiple distinct TFs. These elements integrate transcription inputs from morphogen effectors, uniformly expressed factors, and the transcriptional repressors that comprise the morphogen-regulated transcriptional network. (C) The dynamics of the transcriptional network transform broadly distributed activation and localized repression mechanisms into precisely positioned boundaries of gene expression. This directly links spatial and temporal mechanisms of pattern formation.
Морфогены provide asymmetry but not precise positional information
Генетические и молекулярные исследования показывают, что Bcd и Shh действуют как дальнодействующие морфогены внутри своих тканей. В обеих системах отсутствие морфогена предупреждает образование некоторых типов клеток и приводит к драматическим сдвигам и экспансии оставшихся детерминированных клеток в регионы, обычно занимаемые типами клеток, которые оказались неспособными к образованию. Напр., у эмбрионов от матерей с отсутствием Bcd, головной и торакальный сегменты полностью отсутствуют и обнаруживается удвоение задних структур на переднем конце эмбриона (Frohnh?fer et al., 1986). Сходным образом, у мутантных эмбрионов мышей с отсутствием передачи сигналов Shh, типы клеток, обычно обнаруживаемые в дорсальной части нервной трубки, замещаются клетками, обычно оккупирующими вентральную часть нервной трубки (Chiang et al., 1996; Litingtung and Chiang, 2000; Wijgerde et al., 2002). Т.о., на функциональном уровне Bcd и Shh участвуют в двух типах активности: репрессии клеточных судеб, обычно продуцируемых на противоположном полюсе, и в инструктивной активации генов, необходимых для формирования структур, где имеются высокие уровни морфогена.
Несколько линий доказательств указывают на то, что Bcd и Shh могут действовать зависимым от концентрации способом. В бластодерме Drosophila увеличение количества копий гена bcd сдвигает задние границы активности зависимых от Bcd генов мишеней в направлении заднего конца эмбриона (Driever and N?sslein-Volhard, 1988b; Struhl et al., 1989). Напротив, изменения в количестве или сродстве сайтов связывания Bcd изменяют передне-задний (AP) диапазон bcd репортерных трансгенов: увеличивая связывание в результате задней экспансии и наоборот (Driever et al., 1989; Simpson-Brose et al., 1994; Struhl et al., 1989). Для нервной трубки эксперименты ex vivo с использованием рекомбинантного Shh белка показали, что 2- 3-кратные изменения в концентрации Shh вызывают переключения качественных характеристик нейральных предшественников (Ericson et al., 1997b;Mart? et al., 1995; Roelink et al., 1995). Следовательно, существует корреляция между концентрацией лиганда и дифференциальной экспрессией генов. Сравнимые изменения в качественных характеристиках нейральных предшественников выявляются также при манипуляциях с уровнями активности внутриклеточного Gli - транскрипционного фактора передачи сигналов Shh (Stamataki et al., 2005). Итак, эти данные, по-видимому, подтверждают традиционный взгляд на морфоген, согласно которому границы генной экспрессии соответствуют специфическому порогу активности морфогена, подразумевая, что концентрация формирующего паттерн сигнала является прямым отражением позиционной информации.
Однако, находки на бластодерме и нервной трубке затрудняют строгие взаимоотношения между концентрацией сигнала и позиционными качественными особенностями. У эмбрионов, у которых градиент Bcd сглажен за счет генетических манипуляций, некоторые гены мишени продолжают формировать хорошо различимые границы, позиция которых сдвинута, но тем не менее правильно упорядочена вдоль оси формирования паттерна (Fig. 2A,B) (Chen et al., 2012; L?hr et al., 2009; Ochoa-Espinosa et al., 2009). Более того, у таких эмбрионов границы генов мишеней ассоциированных с более низкими уровнями концентрации Bcd, чем у эмбрионов дикого типа, подтверждая, что Bcd присутствует в избытке в каждой позиции внутри градиента дикого типа (Ochoa-Espinosa et al., 2009). Наконец, во время процесса формирования паттерна позиция границ экспрессии gap генов изменяется относительно уровней Bcd, демонстрируя непосредственно отсутствие простых взаимоотношений между концентрацией морфогена и пороговыми реакциями (Jaeger et al., 2004b).
Fig. 2.
Target gene expression boundaries do not correlate with simple concentration thresholds. (A) Boundaries of the Bcd target genes otd and hb are set at specific positions in wild-type (wt; 2? Bcd) embryos. Neither gene is expressed in embryos laid by bcd mutant (bcd?/?) females. When the Bcd gradient is flattened by genetic manipulation, the expression of otd and hb is restored but otd expression shows a sharp boundary that shifts posteriorly when bcd copy number is increased from two to six. By contrast, hb is expressed throughout the embryo in response to the flattened Bcd gradient. In embryos with flattened gradients, both otd and hb can be activated by lower concentrations of Bcd than those associated with their boundary positions in wild-type embryos. (B) Drosophila embryos with altered Bcd dosage (x-axis) show shifts in target gene boundary positions (y-axis), but these (red line) are smaller than predicted by a linear relationship between Bcd dose and boundary position (dashed line). (C) In the neural tube, progenitor identities (upper images) are established sequentially, with identities corresponding to higher morphogen concentrations appearing after longer periods of signaling. As a consequence, ventral progenitors exposed to high concentrations of Shh transiently adopt a gene expression profile associated with fates induced by lower concentrations. Measurements of Gli activity (bottom images, purple gradient) indicate that the amplitude and range of the gradient change over time. The level of Gli activity initially increases before decreasing, creating an adapting response. Correlating Gli activity levels with individual expression boundaries indicates that a boundary of gene expression is associated with different levels of Gli activity at different developmental times.
Абсолютные уровни морфогена также, по-видимому, не управляют экспрессией генов в нервной трубке. Измерения активности Gli in vivo выявляют изменения во времени в уровнях передачи сигналов на индивидуальных границах экспрессии (Fig. 2C) (Balaskas et al., 2012; Junker et al., 2014). Качественные особенности доменов нейральных предшественников устанавливаются последовательно, при этом качественные особенности, соответствующие более высоким концентрациям морфогенов нуждаются в более продолжительной передаче сигналов (Dessaud et al., 2007, 2010; Jeong and McMahon, 2005). Как следствие вентральные предшественники подвергаются воздействию более высоких концентраций Shh , они временно адаптируют профиль генной экспрессии, ассоциированный с судьбами, вызываемыми более низкими концентрациями. В результате границы генной экспрессии ассоциируют с разными уровнями передачи сигналов с течением времени (Balaskas et al., 2012; Junker et al., 2014). Это указывает на динамичность системы, в которой продолжительность, также как и уровень передачи сигналов морфогена, является критическим для формирования паттерна нейральных предшественников. Более того, нарушения формирования паттерна и потеря вентральных типов клеток, наблюдаемая у мутантных Shh эмбрионов, может быть восстановлена в значительной степени, у двойных мутантных эмбрионов, лишенных Shh и Gli3, члены семейства Gli, которые функционируют преимущественно как репрессоры транскрипции (Litingtung and Chiang, 2000; Persson et al., 2002). Т.о., подобно Bcd, абсолютные уровни активности Shh/Gli, по-видимому, недостаточны для детерминации паттерной экспрессии генов.
Несмотря на это, градиенты Bcd и Shh существенны для формирования паттерна (Briscoe et al., 2001;Driever et al., 1990; Frohnh?fer et al., 1986; Staller et al., 2015a; Wijgerde et al., 2002). перепроверка этих, кажущихся противоречивыми, заключений привела к мнению, что градиенты обеспечивают первоначальную поляризацию, которая влияет на позиционные качественные особенности, но абсолютные уровни сигнала не сказываются непосредственно на пространственные характеристики (metric) развивающихся клеток. Согласно этому мнению, градиенты с совершенно разными амплитудами всё ещё способны функционировать, формируя паттерн генов мишеней. Напр., жизнеспособность эмбрионов, гетерозиготных по bcd, обладающих только половиной от максимального количества Bcd, присутствующих у эмбрионов дикого типа, подтверждают, что критические пороги градиентов (если такие существуют) ограничиваются низкой половиной концентрационного диапазона. Кроме того, генетические и трансгенные техники были использованы для получения эмбрионов с градиентами Bcd, отличающимися в 5 раз от их максимальных концентраций (Fig. 2B) (Driever and N?sslein-Volhard, 1988a; Liu et al., 2013; Struhl et al., 1989), и все эти эмбрионы выживают и плодовиты в лабораторных условиях.
Способность к генетическому изменению амплитуды градиента Bcd привела к критической проверке гипотезы, что границы генов мишеней позиционируются зависимыми от порогов механизмами. Если границы предопределяются специфическими порогами, то д. быть возможным предсказать, насколько далеко сдвигается каждая граница, когда изменяется профиль Bcd. Предыдущие исследования показали, что сдвиги границ в таких эксперимента менее драматичны, чем предсказывалось на основании простой модели морфогена (Gao and Finkelstein, 1998; Gao et al., 1996; Houchmandzadeh et al., 2002). Сравнительно недавно количественный анализ показал, что позиционирование границ является процессом, зависящим от времени (Liu et al., 2013). Когда гены мишени впервые экспрессируются, то границы сдвигаются в позицию, очень близкую к той, что предсказывается моделью морфогена. Однако, в течение минут, эти инициальные сдвиги уменьшаются до степени, соответствующей их позиции у эмбрионов дикого типа, это согласуется с предыдущим исследованием. Эти результаты подтверждают существование механизмов, которые умеряют (buffer) флюктуации в амплитуде и форме градиента (see below).
Morphogens function with transcriptional networks to refine gene expression boundaries
Если специфические пороги концентраций морфогена не являются критическими для формирования паттерна, то как объяснить паттерны генной экспрессии? Информация получена благодаря биоинформационному и геномному анализу cis-regulatory elements (CREs), ассоциированных с дифференциально экспрессирующимися генами. Анализ связывания ДНК и иммунопреципитации хроматина предоставили доказательства, что Bcd и Gli белки непосредственно активируют экспрессию многих генов мишеней в регионах, совпадающих с пространственной протяженностью морфогенетического градиента. Напр., сайты связывания Bcd обнаруживаются в регуляторных элементах более чем 50 разных генов мишеней, большинство из которых экспрессируются в переднем и центральном регионах эмбриона (Chen et al., 2012; Ochoa-Espinosa et al., 2005; Segal et al., 2008). Сходным образом, гены, индуцируемые в вентральной половине нервной трубки, ассоциированы с сайтами связывания Gli (Oosterveen et al., 2012, 2013;Peterson et al., 2012; Vokes et al., 2007).
Первоначально предположенный механизм для объяснения активности морфогена (Driever et al., 1989), заключался в том, что позиция границы генов мишеней детерминируется непосредственным способом с помощью чувствительности к связыванию CREs эффектора морфогена (Fig. 3A) (Driever et al., 1989; Struhl et al., 1989). В этой модели 'сродства к связыванию' , CREs, содержащие сайты связывания с низким сродством к эффектору морфогена будут связаны (и активированы) только в регионах, содержащих высокие уровни морфогена, тогда как CREs с высоким сродством сайтов связывания также будут связываться в регионах, содержащих низкие уровни морфогена. Однако, анализ CRE, ассоциированных с наборами генов мишеней для Bcd и Shh не подтвердил этого. Например, позиции границ для набора генов мишеней для Bcd не коррелируют со сродством и количеством сайтов связывания Bcd в ассоциированных с ними (Fig. 3B) (Ochoa-Espinosa et al., 2005). Сходным образом, гены мишени для Shh в нервной трубке не обнаруживают ожидаемой корреляции между сродством сайтов связывания Gli и диапазоном генной индукции (Oosterveen et al., 2012; Peterson et al., 2012). В самом деле, единственным достойным внимания трендом в этих базах данных стало то, что более вентральными частями ограниченные гены, по-видимому, содержат сайты связывания высокого сродства. необходимо отметить, однако, что эта модель базируется на предположении, что морфоген эффектор является латентным в отсутствие сигнала и превращается в транс-активатор с помощью морфогена. В случае передачи сигналов Shh члены семейства Gli соединяются с теми же самыми регуляторными элементами, что и их Shh-активированные аналоги, но действуют как репрессоры транскрипции (see Box 2). Тем не менее, эти данные говорят против идеи, что простая иерархия дифференциальной связывающей чувствительности предопределяет границы экспрессии генов мишеней.
Fig. 3.
The cis-regulatory mechanisms controlling gene expression. (A) A simple mechanism of morphogen gene regulation is that target gene boundary position is determined directly by the binding affinity of CREs for the morphogen effector. The affinity of the CRE thus determines the amount of activated morphogen effector (purple) bound and is predicted to correlate with the extent of gene expression. High-affinity sites (red) produce long-range induction, whereas low-affinity binding sites (green) result in more restricted gene induction. Increasing the affinity of these binding sites (dotted green) would expand the range of gene induction. (B) There is a lack of correlation between boundary positions (x-axis) of a set of Bcd target genes (blue points) and the affinity of Bcd binding sites (y-axis) in the CREs associated with the target genes. (C) The CREs of target genes within the patterning network combine three classes of transcriptional inputs. The morphogen effectors (M, purple) act broadly to regulate many target genes along their patterning axis. Input from uniformly expressed factors (U, yellow) change the sensitivity of individual target genes to morphogen input. Repressive input from pd-TFs (TF1 and TF2) regulated by the network inhibit the positive activity of the morphogen and uniform factors. The integration of these inputs produces the regulatory logic of the transcriptional network. (D) Patterning by combinatorial binding in the blastoderm. The expression patterns of two activators (Bcd and Zld) and two repressors (Slp1 and Run) are shown (left). Hypothetical CREs are also shown (center) with their predicted expression patterns (right). The top construct contains only activation inputs and is expressed throughout the anterior embryo. The addition of repressor sites restricts activation to specific regions and positions the boundaries of gene expression. (E) Nkx6.1 is expressed in the ventral third of the neural tube. An Nkx6.1 CRE recapitulates this expression and contains a combination of binding sites for Gli, Sox2 and the pd-TFs Dbx and Msx. In the ventral neural tube, the absence of repressor forms of Gli and the lack of Dbx and Msx expression allows Sox2 proteins to activate the CRE. Dorsal to this, the presence of Gli repressors and Dbx or Msx blocks the activity of the CRE. GliA and GliR, activator and repressor forms of Gli.
Помимо эффекторов, связывающих морфоген, CREs, контролирующие формирование пространственного и временного паттерна, связывают многие TFs (Fig. 3C). Некоторые из них экспрессируются повсеместно как активаторы транскрипции, которые играют важные роли в активации экспрессии генов. Напр., в бластодерме униформно экспрессируемый TF Zelda (Zld; Vielfaltig - FlyBase) необходим для корректного паттерна gap генов (Liang et al., 2008; Xu et al., 2014). Zld соединяется с регуляторными элементами многих gap генов и, изменяя эти взаимодействия, влияет на связывание Bcd с ДНК и на паттерны Bcd-зависимой экспрессии. Дифференциальное связывание Zld с субнабором генов мишеней создает механизм, с помощью которого чувствительность генов мишеней к эффектору морфогена может быть модифицирована независимо от самого эффектора (Kanodia et al., 2012). В нервной трубке SoxB1 семейства TFs (Sox1-3), экспрессирующиеся во всех нейральных предшественниках, по-видимому, играют Zld-подобную роль в модулировании передачи сигналов Shh (Bergsland et al., 2011; Oosterveen et al., 2012; Peterson et al., 2012). Сайты связывания для SoxB1 белков были идентифицированы и функционально участвуют в регуляторных элементах, ассоциированных с TFs нейральных предшественников. Т.о., количество, сродство или расположение сайтов связывания SoxB1 внутри данного элемента может влиять на их реакцию на передачу сигналов Shh-Gli.
Также обнаруживаемые в генах мишенях, CREs являются сайтами связывания для TFs, которые находятся под транскрипционным контролем активности Bcd и Gli (Fig. 3C). Мы обозначили эти TFs как детерминирующие паттерн TFs (pd-TFs). Комбинация генетики развития и количественных подходов показывает, что pd-TFs формируют транскрипционные сети, которые играют центральную роль в интерпретации морфогена. Функционируют pd-TFs преимущественно как репрессоры и у эмбрионов Drosophila и в нервной трубке позвоночных пары pd-TFs экспрессируются в соседних доменах, перекрестно репрессируя др. др. (see Boxes 1and 2 for details) (Briscoe et al., 2000; Clyde et al., 2003; Ericson et al., 1997b; Kraut and Levine, 1991;Vallstedt et al., 2001). Подобная перекрестная регуляция создает бистабильные переключения, которые стабилизируют и обостряют домены генной экспрессии, кульминация достигается в виде всё-или-ничего экспрессии генов на границе между клетками, содержащими разные репрессоры. Перекрестные репрессивные взаимодействия также вносят вклад в позиционирование границ генной экспрессии вдоль формирующей паттерн оси. Мутации в одном или более pd-TF(s) вызывают предсказуемые сдвиги в паттерне экспрессии оставшихся pd-TFs, не влияя на сами градиенты морфогенов (Fig. 3D). Это еще более отдаляет позиционные качественные характеристики от абсолютного уровня сигнала морфогена. Напр., gap ген hunchback (hb)экспрессируется в передней половине эмбрионов мух и отвечает за ограничение абдоминального gap гена knirps (kni) задними регионами (Clyde et al., 2003; Pankratz et al., 1992; Yu and Small, 2008). У мутантов, лишенных hb, домен экспрессии kni расширяется кпереди в регионы, обычно занимаемые hb. Две др. взаимно репрессирующие др. др. пары, Gt и Kruppel (Kr), и Slp1 и Run, также образуют бистабильные переключения, которые создают дополнительные границы в более передних регионах (Box 1) (Andrioli et al., 2004; Wu et al., 1998). В нервной трубке TF Nkx2.2 экспрессируется в домене, который вентрально примыкает к предшественникам, экспрессирующими Pax6; у эмбрионов, лишенных Pax6, экспрессия Nkx2.2 расширяется дорсально и впоследствии увеличивается образование подтипы нейронов, образующихся из этих предшественников (Ericson et al., 1997a). Факторы pd-TFs Olig2 и Irx3, также, как и Nkx6.1 и Dbx2, тоже формируют бистабильные переключения, которые демаркируют дополнительные границы ы вентральной части нервной трубки (Box 2) (Novitch et al., 2001; Sander et al., 2000; Vallstedt et al., 2001). Итак, эти находки подтверждают, что транскрипционные репрессоры, стоящие ниже морфогена, создают транскрипционную сеть, которая гарантирует клеткам выбор одной дискретной качественной особенности и положение границы между отличающимися регионами вдоль формирующей паттерн оси.
Итак, анализ CREs подтвердил стратегию считывания градиента морфогена, которая использует комбинированную активность трех классов транскрипционных сигналов (Chen et al., 2012; Oosterveen et al., 2012;Xu et al., 2014). Во-первых, эффекторы морфогена действуют широко, чтобы регулировать многие гены мишени вдоль их формирующей паттерн оси. Во-вторых, сигналы от униформно экспрессирующихся факторов изменяют чувствительность индивидуальных генов мишеней к сигналам морфогена. Наконец, сигналы от перекрестной репрессии pd-TFs, которые сами по себе дифференциально регулируются с помощью сети, генерируя переключение экспрессии генов, которые создают дискретные границы и детерминируют позицию границы этой экспрессии (Fig. 3D). Напр., регуляторные последовательности, ассоциированные с генами мишенями для Bcd orthodentical (otd; ocelliless - FlyBase) содержат кластеры сайтов связывания для Bcd, Zld и для Hb, которые действуют как активирующий ко-фактор в отношении Bcd посредством упреждающей петли (Gao and Finkelstein, 1998; Ochoa-Espinosa et al., 2005; Simpson-Brose et al., 1994; Xu et al., 2014). Сайты связывания для всех трех белков могут вносить вклад в активацию экспрессии otd. Регуляторные последовательности otd также содержат сайты связывания для репрессора Run и матерински экспрессируемого репрессора Capicua, которые также являются критическими для ограничения экспрессии Otd в презумптивных регионах головы эмбрионов (Chen et al., 2012; L?hr et al., 2009). Сходным образом, в нервной трубке детальный анализ регуляторного элемента, ассоциированного с Nkx6.1 идентифицировал комбинацию сайтов связывания для SoxB, Gli и гомеодоменовых TFs (Fig. 3E) (Oosterveen et al., 2012). Каждый из них, по-видимому, вносит вклад в регуляцию Nkx6.1, при этом разные гомеодоменовые белки репрессируют Nkx6.1 на разных территориях вдоль формирующей паттерн оси нервной трубки. Т.о., паттерн генной экспрессии не управляется лишь исключительно с помощью концентрации эффектора морфогена, а вместо этого контролируется с помощью комбинации уровней эффекторов морфогена, униформно экспрессирующихся факторов и TFs, регулируемых с помощью морфогена. Эта комбинация сигналов и не абсолютный уровень эффектора морфогена, предоставляют скоррелированную позиционную информацию в ткани.
Хотя детальные молекулярные механизмы того, как индивидуальные CREs контролируют транскрипцию остаются только очерченными, анализ некоторых CREs, ассоциированных с генами, экспрессирующимися в бластодерме, предоставляет некоторую информацию. Активация, по-видимому, является комбинаторной с использованием более, чем одного активаторного белка во всех исследованных случаях. Это может быть результатом межбелковых взаимодействий: напр., униформно экспрессируемый фактор Zld способствует связыванию Bcd, подтверждая кооперативный механизм (Xu et al., 2014). Альтернативно или в дополнение, Zld и Bcd могут действовать независимо, добавочным способом. SoxB TFs также, по-видимому, функционируют сходным образом с белками Gli, чтобы вносить вклад в регуляцию нейральных генов (Bergsland et al., 2011; Oosterveen et al., 2012, 2013; Peterson et al., 2012).
В целом транскрипционные активаторы, по-видимому, функционируют на значительных расстояниях, при этом CREs часто располагаются на расстоянии многих kilobases от точки старта транскрипции генов, которые они регулируют (Davidson, 2010; Kvon et al., 2014). Напротив, репрессоры, по-видимому, действуют локально, на регуляторных элементах, с которыми они связаны, чтобы супрессировать активаторы, связанные с тем же самыми CRE (Gray et al., 1994; Small et al., 1993). В некоторых случаях сайты связывания для активаторов и репрессоров или перекрываются, или тесно связаны и поэтому конкуренция за связывание является важным механизмом (Small et al., 1992). Альтернативно репрессоры могут действовать на более коротких расстояниях внутри регуляторного элемента, чтобы ингибировать активаторы, связанные внутри ~200 пн (Gray and Levine, 1996). Т.о., соединение репрессора с регуляторным элементом д. супрессировать позитивную транскрипционную активность или путем вытеснения активаторов или замалчиванием активности связанных активаторов.
Имеющиеся данные подтверждают, что CREs, ассоциированные с генами мишенями, интегрируют многие сигналы, чтобы 'вычислить' , как каждый ассоциированный ген мишень регулируется (Fig. 3C-E) (Segal et al., 2008; Wilczynski et al., 2012). Следствием этого механизма является то, что ни один из индивидуальных TFs не функционирует как главный регулятор, это согласуется с отсутствием строгой корреляции между сродством связывания эффекторов морфогена и реагирующими индивидуальными генами. Для каждого CRE, имеется комбинация позитивных и негативных импульсов, которые и определяют, как ассоциированный ген будет отвечать. Т.о., CREs связывают комбинаторную регуляторную логику сети с её молекулярной реализацией в геноме. Это указывает на гибкий, но сильный способ становления и эволюции паттернов генной экспрессии. Напр., перемещение сайтов связывания репрессора на разыне расстояния от сайтов активаторов может привести к альтерациям в силе репрессии, к тонкой настройке позиции границ, хотя всё ещё необходима генерация бистабильности для формирования границы (Gray et al., 1994; Hewitt et al., 1999).
В бластодерме Drosophila и в нервной трубке позвоночных многие регуляторные элементы ассоциированы со многими формирующими паттерн генами. Напр., ген мишень для Bcd hb содержит два разных CREs, обладающих кластерами сайтов Bcd. Это непосредственные, очень сходные паттерны экспрессии в передней половине эмбриона (Perry et al., 2011). Это подтверждает идею 'теневых энхансеров', в которых принципиальные CRE (или первый идентифицированный регуляторный элемент) 'затенен' с помощью дополнительных CREs со сходной активностью (Barolo, 2012; Hong et al., 2008a; Perry et al., 2010). Аналогичный феномен также, по-видимому, действует в нервной трубке. Анализ связывания хроматина идентифицирует два или более дискретных регионов совместно связываемых с помощью Gli1/Sox2, это совпадает с блоками законсервированных последовательностей среди многих генов, кодирующих pd-TFs, активируемых с помощью передачи сигналов Shh в вентральной части нервной трубки (Oosterveen et al., 2012,2013; Peterson et al., 2012). Функциональные исследования подтвердили специфичную для нервной ткани активность CRE для многих из этих регионов. В большинстве случаев, разные CREs из одного и того же гена обладают сходным, но не идентичным характером активности (Perry et al., 2011). Сходство в активности, несмотря на различия в композиции элементов указывает на то, что существуют многие способы, с помощью которых может быть достигнут один и тот же паттерн экспрессии гена .
Допускается несколько возможностей объяснения, почему гены содержат множественные CREs с кажущимися сходными активностями (Barolo, 2012; Hong et al., 2008a; Perry et al., 2010). Одна возможность заключается в том, что разные CREs выполняют разные функции по интерпретации градированного сигнала. Хотя коллективный анализ регуляторных элементов оказался неспособным обнаружить корреляцию между силой связывания морфогена эффектора и паттерном активности элемента (Ochoa-Espinosa et al., 2005), возможно, что корреляция существует для субнаборов элементов. Активность этих CREs д. быть инструктирована непосредственно с помощью градиента морфогена. Онид. играть управляющие роли по установлению соотв. паттернов ключевых pd-TFs в сети, которая затем управляет формированием паттерна. Согласно этому мнению, все др. CREs в системе д. нуждаться в сигналах от морфогена для активации, но это может быть разрешающим и сигнал от репрессоров уже в виде сформированного паттерна д. вносить вклад в позиционирование границы для генов мишеней. Тем не менее скоординированные сдвиги в экспрессии генов, возникающие в результате делеции индивидуальных репрессоров в транскрипционной сети, подтверждают, что сеть доминирует над градированными сигналами и является главным двигателем формирования паттерна.
Очевидно, избыточные регуляторные элементы д. также вносить вклад в устойчивость формирования паттерна (Perry et al., 2010). Успехи техники по получению изображений и повышение разрешения данных, генерируемых с помощью этих подходов, начинают выявлять, что транскрипция является процессом с шумами и взрывами (Darzacq et al., 2007; Elowitz et al., 2002; Garcia et al., 2013). Т.о., скорее всего, трудно контролировать одиночный элемент точным способом. Комбинирование множественных независимых CREs может усреднять флюктуации экспрессии гена, это возникает в результате регуляции с помощью единственного энхансера и увеличения частоты экспрессирующих ядер (Perry et al., 2012). Это д. повышать устойчивость и надежность формирования паттерна перед лицом внешнесредовых стрессов, таких как изменчивость температуры, в которой развиваются эмбрионы в природе. Альтернативно или дополнительно множественные CREs д. действовать, чтобы тонко настраивать пространственный и временной паттерны генной экспрессии (Perry et al., 2011; Staller et al., 2015b). Возможно также, что множественные CREs комбинируются, чтобы продуцировать дополнительные или взаимно усиливающие взаимодействия, гарантирующие быстрые изменения в генной индукции или повышении уровней экспрессии. Наконец, присутствие множественных полу-перекрывающихся элементов может обеспечить способность к развитию за счет ослабления селективных ограничений для индивидуальных элементов и сделать возможным некоторый эволюционный дрейф (Hong et al., 2008a). Всё-таки идею, что множественные CREs повышают устойчивость и способность к развитию, следует принимать во внимание для кажущихся различными механизмов дальнодействующего функционирования активаторов и локального действия репрессорных TFs. В этом случае отсутствие связывания репрессора с одним CRE д. приводить к неправильной экспрессии генов, даже если остальные CREs, ассоциированные с геном, остаются подавленными.
Integrating graded positional information with patterning networks: insights from mathematical modeling
Экспериментальные подходы, представленные выше, идентифицировали множество молекулярных компонентов сети формирования паттерна и предоставили информацию о регуляторной архитектуре, которая их связывает, но они не дают детального объяснения, как формируется пространственный паттерн в каждой из тканей. Математические модели, базирующиеся на экспериментальных данных, описывающие динамику транскрипционных сетей, проливают свет на этот вопрос.
Динамичная модель сети gap генов базируется на количественных данных от эмбрионов, достаточна для моделирования становления AP паттерна и показывает, что прекресно регуляторные взаимодействия между парами gap генов ответственны за наблюдаемые независимые от Bcd сдвиги в экспрессии этих генов (Fig. 4A) (Jaeger et al., 2004b; Manu et al., 2009a,b). Ключом к такому поведению является то, что сила перекрестной репрессии между gap генами является асимметричной, при этом задние gap гены доминируют на своими более передними партнерами. Это приводит к каскаду асимметричных обратных связей, которые обостряют и сдвигают весь паттерн экспрессии gap генов кпереди по мере развития.
Fig. 4.
The dynamics of the transcriptional network generate pattern. (A) A mathematical model of the gap gene network recapitulates the temporal-spatial pattern along the AP axis of the blastoderm. Cross-regulatory interactions between gap gene pairs establish the initial patterns of pd-TF expression in middle regions of the embryo (65% to 29% embryo length) (time 1). Asymmetries in the strength of cross-repression between gap genes means that posterior gap genes dominate over their more anterior partners. As development proceeds (time 2), this leads to the gradual sharpening and an anterior shift of the entire gap gene expression pattern. (B) A transcriptional circuit comprising four pd-TFs (Nkx2.2, Olig2, Irx3 and Pax6) linked by a series of cross-repressions determines the response of these genes to Shh-Gli signaling and positions the two progenitor domain boundaries that they define. A mathematical model of the circuit recapitulates the pattern and temporal sequence of gene expression observed in neural progenitors: Olig2 expression is induced in ventral neural progenitors before Nkx2.2; Nkx2.2 induction represses Olig2, resulting in an overall dorsal shift in pattern in vivo. A phase portrait based on the mathematical model illustrates the connections between the levels or durations of signal. Compared with Olig2, the induction of Nkx2.2 requires higher levels and longer durations of Shh-Gli activity. The dynamics of Shh signaling at three different positions in the neural tube are indicated with dotted purple lines. The portrait also illustrates that transient high levels of signaling at early times (purple dashed line) are not sufficient to switch from Olig2 to Nkx2.2, provided that this level of signaling is not sustained. (C) The transcriptional circuit produces hysteresis. Nkx2.2 induction by Shh-Gli signaling requires the repression of Pax6 and Olig2; this necessitates high levels of Gli activity (bottom green line). Once induced, Nkx2.2 inhibits Pax6 and Olig2 expression, thereby allowing Nkx2.2 expression to be sustained at lower levels of Shh-Gli signaling (top green line). This might explain how gene expression is maintained as Shh-Gli activity decreases below inducing levels.
Сходный динамический механизм, по-видимому, оперирует в сети нервной трубки (Fig. 4B). Транскрипционные circuit, представленные 4 Shh-регулируемыми pd-TFs (Nkx2.2, Olig2, Irx3 и Pax6), связаны с сериями перекрестных репрессий, изученных в деталях (Balaskas et al., 2012; Cohen et al., 2014;Panovska-Griffiths et al., 2013). Силы перекрестных репрессивных взаимодействий между pd-TFs, по-видимому, детерминируют реакцию этих генов на передачу сигналов Shh-Gli и , тем самым определяют позиционирование границ двух доменов предшественников. Напр., in vivo и ex vivo, первичные нервные клетки, подвергнутые действию фиксированной концентрации рекомбинантного Shh, индуцируют экспрессию Olig2 в вентральных нервных предшественниках перед индукцией Nkx2.2 (Dessaud et al., 2007; Jeong and McMahon, 2005). Далее Olig2 репрессируется, как только индуцируется Nkx2.2, приводя к общему сдвигу в дорсальную сторону паттерна in vivo. Это поведение воспроизводится в математических моделях. Неожиданно, модели предсказывают, что транскрипционная сеть может генерировать разное временное и пространственное поведение Nkx2.2 и Olig2, даже если оба гена получают идентичные импульсы от морфогена. Это приводит к заключению, что дифференциальные реакции формирующих паттерн генов на разные уровни и периоды передачи сигналов морфогена являются следствием регуляторной логики транскрипционной сети. Т.о., динамика транскрипционной сети ответственна за пространственный и временной паттерн экспрессии генов.
Те же самые модели помогают также объяснять и др. обнаруживаемое экспериментально поведение. Как упоминалось выше, сдвиги в экспрессии генов, вызываемые измененными уровнями Bcd оказались менее серьезными, чем предполагалось. Детальное математическое моделирование системы gap генов показало, что регуляторные взаимодействия между gap генами подразумевают, что профили генной экспрессии, воспринимаемые каждым ядром, стабильны против пертурбаций в определенных пределах (Manu et al., 2009a,b). Это указывает на то, что перекрестная регуляция между gap генами вызывает некую ошибочную коррекцию нижестоящего Bcd градиента, это улучшает точность и надежность границ экспрессии gap генов. В соответствии с этим эмбрионы, мутантные по любому из двух gap генов, Kr и kni, обнаруживают более высокую изменчивость позиции границ оставшихся доменов, чем у эмбрионов дикого типа (Surkova et al., 2013). В нервной трубке эмбрионов, лишенных репрессора Gli3, обнаруживаются временно увеличивающиеся уровни активности Gli (Balaskas et al., 2012). Несмотря на это усиление передачи сигналов, позиция границ экспрессии Nkx2.2 и др. генов в вентральной части нервной трубки, по-видимому, остаются неизменными (Persson et al., 2002). Проверка математической модели транскрипционной сети подтвердила, что перекрестные репрессивные взаимодействия между Pax6 и Nkx2.2 д. объяснить эту нечувствительность ко временному повышению активности Gli. В соответствии с этим двойные мутанты, лишенные Gli3 и Pax6 обнаруживают заметно повышенный сдвиг границы экспрессии Nkx2.2 (Balaskas et al., 2012). Это подтверждает, что сеть делает клетки нечувствительными к временным флюктуациям в уровнях передачи сигналов и предоставляет средство для клеток для эффективной средней передачи сигналов морфогена со временем.
Инструменты и концепции теории динамических систем предоставляют подходящий способ оценки и визуализации этих идей (Jaeger and Monk, 2014; Jaeger et al., 2008; Strogatz, 2014). Напр., 'phase portraits' (Fig. 4B), базирующиеся на математических моделях сетей, могут быть использованы для иллюстрации связей, между тем как система реагирует на разные уровни или продолжительность сигнала. В случае транскрипционной сети в вентральной части нервной трубки, такой анализ показывает, что по сравнению с Olig2, индукция Nkx2.2 нуждается в более высоких уровнях и в большей продолжительности активности Shh-Gli (Fig. 4B). Кроме того, показано, что временное повышение передачи сигналов в ранние периоды времени, даже если оно выше порога, необходимого для индукции Nkx2.2, является недостаточным для переключения индукции с Olig2 на Nkx2.2. Это подчеркивает, что не существует отдельных механизмов для пространственного и временного паттернов: оба являются продуктом транскрипционной сети.
Дополнительный уровень сложности формирования паттерна выявлен в нервной трубке, где уровни активности передачи сигналов морфогена со временем изменяются (Fig. 2C) (Balaskas et al., 2012; Chamberlain et al., 2008; Junker et al., 2014). Как следствие отсутствуют постоянные взаимоотношения между позицией и уровнем передачи сигналов. В вентральной части нервной трубки продукция белка Shh увеличивается во время развития, приводя к увеличению максимальной концентрации Shh на вентральном полюсе нервной трубки (Chamberlain et al., 2008; Cohen et al., 2015). Транскрипционная активность нижестоящего Gli также первоначально увеличивается, но затем снижается, несмотря на увеличение концентрации Shh. Такая адаптивная динамика, как полагают, возникает в результате комбинации трех механизмов: негативная обратная связь, вызываемая передачей сигналов Shh, транскрипционное подавление экспрессии гена Gli и дифференциальная стабильность активной и неактивной изоформ Gli (Cohen et al., 2015; Junker et al., 2014). Независимо от относительных вкладов каждого из этих механизмов, результатом является то, что уровень активности Gli, ассоциированный с определенными качественными особенностями предшественников, выше, чем уровень активности Gli в этих клетках в более позднее время. Модели транскрипционной сети нервной трубки подтверждают, что взаимная репрессия между парами TFs д. объяснить, как поддерживается экспрессия генов, когда передача сигналов Shh снижается ниже индуктивных уровней. По терминологии динамических систем сеть продуцирует феномен, известный как 'hysteresis' (Strogatz, 2014). Это является собственно мультистабильной системой, в которой состояние системы зависит от истории получаемых сигналов, а также от текущего импульса. В случае нервной трубки индукция Nkx2.2 с помощью передачи сигналов Shh нуждается в репрессии Pax6 и Olig2, но будучи однажды индуцированным Nkx2.2 ингибирует экспрессию этих генов, делая тем самым возможной экспрессию Nkx2.2 устойчивой при более низких уровнях передачи сигналов Shh-Gli (Fig. 4C) (Balaskas et al., 2012). Итак, Nkx2.2 при репрессии Pax6 и Olig2 действует по памяти о прошлых воздействиях передачи сигналов Shh. Следовательно, поскольку временная последовательность генной экспрессии может быть объяснена динамикой транскрипционной сети, то также может быть объяснено поддержание экспрессии генов по мере развития ткани (Dessaud et al., 2010; Su et al., 2012). Это не исключает возможности, что альтернативные молекулярные механизмы, такие как модификации хроматина, также играют роль в стабилизации паттерна; однако, структура и динамика транскрипционной сети предоставляет способ совершат это без необходимости в дополнительном уровне регуляции.
Сосредоточение на динамике передачи сигналов открывает возможность, что градиенты интерпретируются прежде достижения устойчивого состояния. Теоретические исследования подтвердили, что это может снижать эффекты флюктуаций и тем самым повышать точность пространственных границ (Bergmann et al., 2007; Saunders and Howard, 2009;Tamari and Barkai, 2012). Кроме того, кинетика реакций генов мишеней может быть использована для контроля дифференциальных реакций генов: гены мишени с высокой скоростью транскрипции быстро экспрессируются, чтобы продуцировать раннее начало и дальнодействие паттерна, тогда как гены, с низкой скоростью транскрипции продуцируют коротко действующие реакции. Такой механизм был предположен для передачи сигналов Nodal во время индукции мезэнтодермы у рыбок данио (Dubrulle et al., 2015). Учёт динамики передачи сигналов также привело к идее, что клетки используют временные производные или интеграл паттерна передачи сигналов в ткани. Поведение, согласующееся с этим было подтверждено для TGFβ (Sorre et al., 2014) и Dpp (Wartlick et al., 2011). Это может приводить к более аккуратному формированию паттерна, чем тот, что достигается с помощью механизмов, базирующихся на простой интерпретации абсолютных концентраций морфогена (Richards and Saunders, 2015). Механистически, способ клеток 'подсчитывать' производные или интеграл д., скорее всего, базироваться на нижестоящей транскрипционной сети. В случае нервной трубки транскрипционная сеть может быть описана как система, которая использует интеграл передачи сигналов Shh, чтобы определить паттерны генной экспрессии.
Как упоминалось выше существуют заметные различия во временной шкале, на которой базируется формирование паттерна в бластодерме и нервной трубке. Что вызывает подобные различия во временной шкале, неизвестно. Некоторые признаки двух тканей могут вносить вклад. В бластодерме синцитиальная структура позволяет градиентам TFs формироваться быстро и непосредственно в общей цитоплазме. В клетках нервной трубки, однако, передача сигналов морфогена базируется на внеклеточных градиентах, передаваемых с помощью внутриклеточных каскадов. Отметим. что в случае передачи сигналов Shh, трансдукция уникально быстрая, поскольку базируется на деградации репрессорных изоформ белков Gli и градированном накоплении вновь синтезируемых белков Gli, которые могут превращаться в активированные изоформы (Briscoe and Th?rond, 2013). Однако, помимо этих различий в кинетике формирующих паттерна сигналов, свойства репрессорных белков также могут вносить вклад в различия временных шкал (Cohen et al., 2015; Humke et al., 2010). Напр., gap белки имеют относительно короткий период полу-жизни и в основном деградируют в начале гаструляции (Kraut and Levine, 1991; Pisarev et al., 2009), это позволяет транскрипционно сети приближаться к устойчивому состоянию более быстро, чем это могло бы быть достигнуто, если бы gap гены жили дольше. Период полу-жизни TFs нервной трубки не был измерен, но их стабильность может вносить вклад в скорость формирования паттерна и возможно, что модулирование этого периода полу-жизни предоставляет механизм изменения скорости формирования паттерна у отличающихся видов.
Anti-parallel gradients and pattern scaling
Др. общим свойством двух систем развития является то, что обе используют антипараллельные формирующие паттерн сигналы, исходящие от противоположных полюсов оси формирования паттерна. Передний градиент Bcd в бластодерме дополняется градиентом TF Caudal (Cad), исходящим от заднего полюса (Mlodzik and Gehring, 1987). В нервной трубке градиенты BMP и Wnt от дорсального полюса дополняются вентральным градиентом Shh (Barth et al., 1999; Jessell, 2000; Muroyama et al., 2002; Nguyen et al., 2000). В обеих тканях антипараллельные градиенты имеют противоположные активности. Bcd активирует экспрессию переднего gap гена, тогда как Cad способствует экспрессии более задних gap генов (Rivera-Pomar et al., 1995). Кроме того, Bcd репрессирует трансляцию Cad в передних регионах эмбриона посредством прямого соединения с cad РНК (Chan and Struhl, 1997; Niessing et al., 2002). Это создает градиент Cad белка, который формируется непосредственно с помощью градиента белка Bcd. Удаление Bcd расширяет домен экспрессии Cad в передние регионы, которые, по-видимому, вносят вклад, (но он недостаточен для) постериоризации этого региона у bcd мутантов. В нервной трубке активация экспрессии вентральных генов с помощью передачи сигналов Shh противостоит передаче сигналов BMP и Wnt (Alvarez-Medina et al., 2008; Kicheva et al., 2014; Liem et al., 2000; McMahon et al., 1998; Mizutani et al., 2006). Ex vivo исследования нейральных предшественников показали, что модулирование передачи сигналов BMP изменяет реакцию на фиксированные дозы Shh (Liem et al., 2000; Mizutani et al., 2006), а у эмбрионов мышей, лишенных BMP ингибитора noggin, обнаруживается потеря судеб вентральных клеток, несмотря на нормальную продукцию белка Shh (McMahon et al., 1998). Сходным образом, передача сигналов Wnt также ингибирует вентральные гены мишени, чтобы способствовать приобретению дорсальных качественных особенностей (Alvarez-Medina et al., 2008). Т.о., в обеих тканях формирование паттерна, по-видимому, зависит от интеграции сигнальных активностией, исходящих от противоположных полюсов.
Следствием взаимного общения между антипараллельными градиентами является то, что в результате возникает частичное перекрывание между формирующими паттерн сигналами. Это может вносить вклад в отсутствие четкой корреляции между уровнями морфогенов и границами экспрессии генов мишеней и становлением паттерна у эмбрионов, у которых градиент уплощен или устранен. Напр., хотя положение некоторых gap генов сдвигается у эмбрионов, у которых градиент Bcd уплощен, хорошо определяемые границы генной экспрессии продолжают формироваться в правильном пространственном порядке (Chen et al., 2012; Ochoa-Espinosa et al., 2009). Вообще-то у этих эмбрионов выявлены др. асимметричные активности, которые обеспечивают поляризованными сигналами сеть gap генов (Liu et al., 2013; L?hr et al., 2009). Альтернативно, остаточный, хотя и пологий градиент, наблюдаемый у эмбрионов с 'flattened Bcd', может вносить вклад в поддержание паттерна. Сходным образом, в нервной трубке эмбрионов мыши, лишенных Shh и Gli3 (Litingtung and Chiang, 2000; Persson et al., 2002), сигналы, исходящие из дорсального полюса нервной трубки, могут объяснить сохранение пространственного паттерна вентральных pd-TFs (Liem et al., 2000; Mizutani et al., 2006). Следовательно, дорсальные сигналы осуществляют дифференциальное воздействие на pd-TFs , экспрессируемые дорсально и путем репрессии вентральных pd-TFs, закладывают паттерны генной экспрессии.
Примечательно, у эмбрионов, лишенных Shh и Gli3, вентральный паттерн кажется менее точным, чем в норме (Litingtung and Chiang, 2000; Persson et al., 2002). В самом деле, теоретический анализ показал, что одни из преимуществ интеграции антипараллельных градиентов морфогенов является то, что предоставляется более аккуратный способ получения позиционной информации (Howard and ten Wolde, 2005; McHale et al., 2006; Morishita and Iwasa, 2009; Srinivasan et al., 2014). Используя противоположные градиенты для измерения позиции относительно двух полюсов ткани делает возможной количественную поправку в формировании паттерна, позволяя его приспособить к шкале размеров ткани (Howard and ten Wolde, 2005; McHale et al., 2006). Т.о., паттерн у более крупных индивидов будет организован в соответствии с тканью и vice versa. Альтернативно, исследования линий Drosophila, отличающихся по размерам, показало, что более крупные эмбрионы содержат соотв. более высокие уровни bcd мРНК, чем более мелкие эмбрионы (Cheung et al., 2011, 2014). Однако, взаимоотношение прична-эффект между количествами bcd РНК и размером эмбриона пока не установлены .
Наличие анти-параллельных градиентов может также улучшать аккуратность формирования паттерна путем усреднения флюктуаций в уровнях каждого из морфогенов, ассоциированных с прирожденными процессами шумов, в формировании градиента. Молекулярность этих механизмов может быть исполнена несколькими способами. Напр., один сигнал может контролировать экспрессию компонентов пути трансдукции противоположного сигнала. Это может касаться нервной трубки, где эффектор передачи сигналов Shh, Gli3, по-видимому, регулируются с помощью активности Wnt (Alvarez-Medina et al., 2008). Следовательно, благодаря действию в качестве транскрипционного репрессора генов мишеней для Shh, Gli3 может ограничивать спецификацию вентральных предшественников. Альтернативно, взаимная репрессия между pd-TFs, которые индуцируются с помощью противоположных градиентов, представляет собой механизм для повышения точности границ и шкалы размера паттерна эмбриона (Manu et al., 2009a,b; Sokolowski et al., 2012; Surkova et al., 2013). В этом отношении компьютерное моделирование показывает, что в бластодерме Drosophila диффузия gap белков между ядрами возможна из-за отсутствия цитоплазматических мембран, это помогает репарации любых ошибок в формировании паттерна, т.к. всё ещё возможна быстрая генерация чётких границ (Tka?ik et al., 2015). Более сложные механизмы, которые используют обратные связи и 'shuttling' морфогенов лигандов с помощью секретируемых ингибиторов, также были идентифицированы в некоторых тканях с формированием паттерна на базе морфогенов (rev. Shilo et al., 2013). Дальнейшие исследования необходимы для лучшего молекулярного понимания различных механизмов и вкладов, вносимых ими в каждой ткани.
Conclusions and perspectives
The combined experimental and computational modeling approaches described here build upon the morphogen and positional information concepts developed over the last half century, but support revisions to the theory. Central to this are three ideas. First, gradients establish tissue polarity, but do not pattern tissues via strict concentration thresholds. Thus, there is no strict correspondence between specific threshold concentrations of a morphogen and the position of a gene expression boundary. Second, pattern formation is achieved through transcriptional networks comprising gradient effectors, uniformly expressed factors and pd-TFs that respond to and refine the graded inputs. These transcriptional activities are interpreted by modular regulatory elements containing clusters of binding sites for the network of factors. Third, the integration of gradient-induced polarity with the transcription network produces a dynamical system that refines and positions gene expression boundaries along the patterning axis. Together, this means that positional information is not a static measure but a process that arises from the dynamics of interactions within the network.
These principles might apply to other morphogen-patterned systems. An example in the Drosophila embryo is the Dorsal (Dl) morphogen, which is crucial for establishing target gene expression patterns at specific positions along the dorsal-ventral (DV) axis (Roth et al., 1989). There is good evidence that Dl target genes are differentially sensitive to Dl concentrations, but, at the level of the CREs associated with Dl target genes, activation mechanisms are combinatorial, with multiple proteins (Twist and Zld) involved in refining the apparent sensitivities of individual target genes (Foo et al., 2014; Hong et al., 2008b; Jiang and Levine, 1993). There is also support for the idea that the binding of repressors to target gene CREs is important for boundary positioning (Crocker and Erives, 2013; Ozdemir et al., 2014), which echoes the interplay between activators and repressors along the Drosophila AP axis and in the vertebrate neural tube.
A major consequence of this view of morphogen patterning is that there is no mechanistic difference between spatial and temporal patterning: both spatial gradients and temporal changes in morphogen input can produce similar gene expression patterns. This might explain apparently conflicting observations that have argued against the importance of the long-range spread of a morphogen ligand in some tissues (see Box 3). Moreover, boundary precision and size scaling are built into the system. The system is robust to fluctuations in the morphogen signal and provides an effective memory when morphogen signal declines, which offers an explanation for the striking 'canalization' of pattern formation in many developing tissues.
Box 3. Other morphogen-based patterning systems: the case of Wingless (Wg)
The Wnt family member Wg has been implicated in patterning the DV axis of the Drosophila wing disc (Campbell and Tomlinson, 1999; Ja?wi?ska et al., 1999; Minami et al., 1999; Neumann and Cohen, 1997; Zecca et al., 1996). Wg is secreted from the DV boundary at the center of the wing disc, forming a long-range gradient, and experimental evidence suggests that cells distant from the boundary respond directly to Wg. Nevertheless, recent studies revealed that a membrane-tethered version of Wg, which is not released from cells, is able to pattern the DV axis almost as well as secreted Wg (Alexandre et al., 2014). This challenges the requirement for a spatial gradient of Wg. One possible explanation is that Wg expression in the wing disc is dynamic. At early developmental stages, Wg is expressed throughout the disc but, over time, the expression of Wg becomes restricted to the DV boundary (Alexandre et al., 2014). Thus, cells furthest from the DV boundary at the lateral margins of the wing are exposed to Wg for only a brief time at early developmental stages, whereas those closer to the DV boundary receive Wg for longer periods of time. If Wg is interpreted by a transcriptional network that operates with similar principles to the blastoderm and neural tube networks, then different durations of Wg signaling will have the same effect as a spatial gradient of Wg. In this view, either a spatial or temporal gradient of Wg (or a combination of both) could direct pattern formation, and assaying the dynamics or outcome of patterning would not distinguish between static gradient and temporal patterning mechanisms.
Consistent with this, unbiased computational analyses and screens for artificial transcriptional circuits capable of producing stripes of gene expression have also identified mechanisms that rely on the dynamics of the network (Cotterell and Sharpe, 2010; Fran?ois and Siggia, 2010). A systematic survey of morphogen-regulated networks comprising three TFs identified six distinct classes of network design that generated striped gene expression (Cotterell and Sharpe, 2010). Each of these used a different dynamical mechanism to interpret the morphogen but all relied on cross-regulatory interactions between the TFs. Similarly, an in silico evolutionary approach to identify transcriptional networks that interpret either static or dynamic morphogen gradients also resulted in cross-regulatory networks, the structures of which were reminiscent of known morphogen interpreting networks (Fran?ois and Siggia, 2010). Notably, in this study, networks that had evolved to interpret temporal changes in morphogen signaling were also capable of pattern formation when challenged with a static spatial gradient. This emphasizes the importance of network dynamics for understanding pattern formation and supports the idea that the mechanisms identified in the gap gene and neural tube networks represent general principles for morphogen interpretation.
Despite much progress, many questions remain. Elucidating the components and operation of the transcriptional networks continues and, for many tissues, the relative importance of the spatial or temporal component of gradients needs to be determined. How opposing gradients cross-talk and are integrated into networks is poorly understood. New technologies (e.g. CRISPR/Cas9) will permit the manipulation of regulatory sequences in the native locus, which should allow rapid progress in understanding how patterning information is integrated. Alongside these experimental objectives, improved models and simulations will undoubtedly be important and necessitate improved quantification of the components of the systems. This includes not only measuring the number of molecules of key TFs but also measurements of protein-DNA interactions and rates of transcription and translation of target genes. Models that simplify and abstract aspects of a system will help provide an intuitive understanding of its operation, whereas increasingly complex simulations will result in more realistic models and a means to interpret more and diverse forms of data. Together, therefore, our comparison of patterning in the Drosophila blastoderm and the vertebrate neural tube suggests a unified framework for morphogen-mediated pattern formation and establishes a research agenda that will likely take us through further revisions of this fascinating problem.
