Семейство Ste20 serine/threonine протеин киназ представляет важное семейство киназ, участвующих в пролиферации, миграции и окончательной дифференцировке клеток (Davis, 1993; Fanger et al., 1997). Семейство Ste20 киназ было хорошо изучено в качестве регуляторов передачи MAPK-зависимых сигналов в контроле реакции спаривания у дрожжей (Zhao et al., 1995). Как результат, идентифицированы многочисленные Ste20-подобные киназы млекопитающих (SLKs). SLKs могут быть сгруппированы в три больших семейства: p21-activated kinases (PAKs), pleckstrin-homology domain-containing PAKs (PH-PAKs) germinal center kinases (GCKs) (Sells and Chernoff, 1997).

Ранее была идентифицирована новая киназа Ste20-related kinase (rev. Al-Zahrani et al., 2013), названная SLK (Itoh et al., 1997; Pytowski et al., 1998; Sabourin and Rudnicki, 1999; Sabourin et al., 2000; Yamada et al., 2000). SLK была классифицирована как родственная GCK киназа (Kuramochi et al., 1997) и, как было установлено, повсеместно экспрессируется во взрослых тканях, клеточных линиях и в развивающихся эмбрионах мышей (Sabourin and Rudnicki, 1999; Zhang et al., 2002). SLK представлена N-терминальным Ste20 каталитическим киназным доменом, центральным биспиральным (coiled-coil) доменом и C-терминальным собранным в виток (coil) мотивом, наз. ATH регионом (AT1-46 homology; (Schaar et al., 1996; Sabourin and Rudnicki,1999).

SLK участвует во многих важных клеточных процессах, включая контроль клеточного цикла, адгезию, реорганизацию цитоскелета, апоптоз и миграцию in vitro. SLK, как было установлено, фосфорилирует Plk1 во время прохождения переходной стадии G2/M, когда киназная активность SLK наивысшая (Ellinger-Ziegelbauer et al., 2000). Подтверждает это то, что, истощение SLK приводит к неспособности подавления активности cyclin A и аресту ранней G2 фазы (O'Reilly et al., 2005). Избыточная экспрессия SLK также вызывает распад волокон актина, релокализацию актина на периферию клетки и ретракцию клетки (Sabourin and Rudnicki, 1999; Sabourin et al., 2000; Wagner et al., 2002). SLK может также фосфорилировать RhoA по S188 стоящего ниже angiotensin II type 2 receptor (AT2R), активация которого предупреждает сокращения сосудистых гладких мышц (Guilluy et al., 2008). Кроме того, SLK, как было установлено, регулирует набор радиальных микротрубочек (Burakov et al., 2008), подтверждая роль SLK в реорганизации цитоскелета.

Многие факторы необходимы для успешного эмбрионального развития. Одним из критически важных органов является плацента, которая действует как интерфейс между средой плода и матери, обеспечивая обмен газами, питательными веществами и отходами (Rossant and Cross, 2001). Плацента мышей подразделяется на три основных функциональных слоя: лабиринт, соединительная зона и материнская ткань. Лабиринт облегчает обмен материалами между матерью и эмбрионом (Rossant and Cross, 2001). Соединительная зона обеспечивает структуру и ригидность и состоит из слоя гигантских клеток, который разделяет плодные и материнские ткани (Rossant and Cross, 2001; Tycko and Efstratiadis, 2002). Наконец, линия материнской ткани матки и окружение эмбриона во время развития (Rossant and Cross, 2001). Собственно, образование плаценты у мышей проходит 4 ключевые стадии: пост-имплантации (день эмбриогенеза [E] 4.5-E8), хорион-алантоисного прикрепления (E8.5), дифференцировки лабиринта (E9-E17) и трофической инвазии (Natale et al., 2006). Собственно, кровоснабжение плаценты является важным для роста и развития здорового эмбриона (Adamson et al., 2002). Следовательно, инвазия трофобласта, ремоделирование маточных спиральных артерий и передача функциональных, ангиогенных сигналов существенно для материнского кровоснабжения, т.к. эти процессы увеличивают кровоток и гарантируют развитие здоровых плаценты и плода (Cui et al., 2012).

Кстати, роль SLK in vivo была исследована с использованием трансгенных подходов и специфической для ткани избыточной экспрессии дикого типа или kinase dead SLK (Cybulsky et al., 2010; Storbeck et al., 2013). Функциональная роль SLK связана с мышце-специфческой дифференцировкой и слиянием, также, как и поврежденными подоцитами (Zhang et al., 2002; Storbeck et al., 2004, 2013; Cybulsky et al., 2010). Здесь мы описываем создание и характеризацию SLK gene-trapped аллеля. Гомозиготная экспрессия gene-trapped SLK-LacZ слитого белка приводит к эмбриональной гибели на E14.5. Мы показали, что этот SLK-LacZ слитый белок обладает пониженной способностью фосфорилирования экзогенных субстратов и что гомозиготные эмбрионы обнаруживают нарушения развития нейронов и скелетных мышц. Эти дефекты сопровождаются нарушением ангиогенеза в плаценте, усилением апоптоза и аномальным развитием.

Discussion

Собственно эмбриональное развитие регулируется с помощью большого количества разных сигнальных сетей. Изменения таких сигнальных путей может приводить к дефектам, которые в свою очередь приводят к тяжелым эмбриональным дефектам и гибели. Ранее было показано, что SLK экспрессируется на высоком уровне в клонах нейронов и скелетных мышц (Zhang et al., 2002; Storbeck et al., 2004, 2013). Однако мало известно о специфической функции SLK по контролю развития этих структур in vivo. Мы использовали подход генных ловушек (gene-trap), чтобы нарушить аллель SLK. Пойманный в ловушку аллель приводит к экспрессии SLK-LacZ слитого белка, лишенного аминокислот 795-1202. Неожиданно слитый белок обнаружил существенное снижение свой способности фосфорилирования экзогенных субстратов, скорее всего, из-за стерических препятствий за счет LacZ домена. Используя β -galactosidase в качестве репортера мы показали. что SLK-LacZ слитый белок экспрессируется во всех взрослых тканях и на высоком уровне в нейронах, миогенных клетках, хрящах и печени развивающегося эмбриона, что подтвердило результаты предыдущих исследований (Zhang et al., 2002; Storbeck et al., 2004, 2013; Cybulsky et al., 2010).

Чтобы исследовать роль SLK в развитии, от животных с отловленным геном получали гомозигот, которые имели тяжелые дефекты развития и погибали на стадии эмбриогенеза. Дальнейший анализ показал уменьшение клеток за счет усиления апоптоза, что сопровождалось заметной дезорганизацией миогенного и нейронального компартментов эмбрионов на ст. E12.5 и E14.5. Подтверждением наблюдаемого снижения количества клеток стал анализ in vitro первичных MEFs, выделенных от gene trapped гомозигот, показавший снижение скорости пролиферации. Интересно, что не обнаружено различий в апоптозе в культивируемых MEFs. Анализ тканей плаценты также выявил аберрантное образование кровеносных сосудов, что приводило к кровотечениям плаценты у гомозиготных животных. Подтверждением роли SLK в ангиогенезе стал нокдаун SLK в MDME клетках, приведший к существенному снижению образования капилляров in vitro.

Развитие плаценты является критическим для эмбриогенеза и клеточной жизнеспособности. Одним из очевидных объяснений уменьшения количества клеток и увеличения клеточной гибели у гомозиготных эмбрионов является отказ плаценты. Отсутствие обмена соотв. питательных веществ и газов, скорее всего, вызывает апоптоз во всем эмбрионе, приводя к наблюдаемой деградации белков. Однако анализ SLK^fs/fs E12.5 эмбрионов, которые обнаруживают от слабых до промежуточных фенотипические отклонения, выявил выглядящей нормальной сосудистую сеть, но дезорганизованные миогенные и нейрональные компартменты, также, как и недоразвитые висцеральные органы. Кроме того, анализ более ранних временных точек выявил более мелкие Tuj.1 компартмены на ст. E10.5 у SLK^fs/fs эмбрионов, указывая на отсутствие усиления апоптоза. Это указывает на то, что помимо развития плаценты, SLK необходима для собственно эмбриогенеза клеточно автономным способом.

Сомиты дают демамиотом, склеротом и эндотелиальные клетки, а также управляют миграцией клеток нервного гребня и аксонов спинальных нервов. Сомитогенез зависит от нескольких сигнальных градиентов (Baker et al., 2006; Goldbeter and Pourquie, 2008) при этом сомиты закладываются по длине эмбриона, для этого необходима собственно координация клеточной миграции и динамики фокальных адгезий. Мы недавно показали, что SLK регулирует динамику фокальных адгезий и клеточную миграцию путем фосфорилирования paxillin (Wagner et al., 2002, 2008; Quizi et al., 2013). Поскольку SLK экспрессируется в миогенных предшественниках (Storbeck et al., 2004), единственной возможностью является то, что она необходима для миграции клеток предшественников и организации ткани. Сходным образом, она экспрессируется нейрональных стволовых клетках (Zhang et al., 2002), а её подавление, скорее всего, приводит к нарушению организации нейрональных компартментов. Ранее мы показали, что SLK также необходима для пролиферации клеток (O'Reilly et al., 2005). Помимо дефектов миграции очевидно, что дефицит SLK вносит вклад в наблюдаемое уменьшение размера миогенного и нейронального компартментов.

Подобно нашей SLK gene-trap модели, нокауты p38, Mek1, B-Raf, ERK2 и Pak4 приводят к эмбриональной гибели на ст. E12.5 и также обнаруживают дефекты во внеэмбриональных тканях. Нокаут Pak4, напр., вызывает гибель на ст. E11.5 (Qu et al., 2003). Как мы показали здесь, снижение клеточной пролиферации и усиление апоптоза наблюдаются и у Pak4 нокаутных эмбрионов, в особенности в нервной системе (Tian et al., 2009). Снижение клеточной пролиферации у эмбрионов вряд ли является главной причиной гибели эмбрионов у наших моделей и у описанных другими. Однако нокаутные мышиные модели, поводящие к эмбриональной гибели на ст. между E10.5 и E12.5 часто соседствуют с аномалиями плаценты и/или дефектами эмбриональной сосудистой сети (Cobb and Goldsmith, 2000; Rossant and Cross, 2001). Подобно SLK-LacZ fusion плаценте, Pak4 нокаутная плацента, как известно, обнаруживает пониженные количества кровеносных сосудов, а также уменьшение количества клеток во всей ткани лабиринта (Tian et al., 2009). Дефекты внутри ЦНС наблюдались и в нашей модели, сходные с таковыми при нокауте Pak4. Однако мы также описали дефекты экспансии мышечного компартмента, что ещё больше подчеркивает центральную роль SLK в развитии мышц и возможно в миграции клеток предшественников. Хотя дезорганизация сосудистой сети наблюдалась у нокаутной Pak4 модели, эмбрион всё ещё обладали соотв. образом сформированным сосудистым сплетением, но с аномальным ветвлением сосудов, указывающим на роль Pak4 в ветвлении скорее, чем в образовании сосудов (Tian et al., 2009). Сходным образом, дезорганизованные сосуды обнаруживались в SLK^fs/fs плаценте на ст. E12.5, а полный коллапс этих сосудов наблюдался на ст. E14.5. Кроме того, MDMECs, обработанные с помощью siSLK, были неспособны формировать капилляры и были более дезорганизованы, чем контрольные клетки. Эти данные подтверждают роль SLK в поддержании сосудов и ангиогенезе, что согласуется с предыдущими сообщениями (Guilluy et al., 2008). Повышенные уровни расщепленной caspase 3 наблюдаются на ст. E12.5 у SLK^fs/fs эмбрионов, возможно внося вклад в увеличение апоптоза в ответ на выключение плаценты. Caspase 3 расщепляет SLK, как было установлено, активирует пути SAPK и p38 MAPK и индуцирует апоптоз (Sabourin et al., 2000). Интересно, что мы не обнаружили продуктов расщепления SLK-LacZ слитого белка у эмбрионов на ст. E12.5 или E14.5. Единственная возможность, что тетрамерная структура SLK-LacZ слитого белка недоступна для расщепления каспазой 3 и что этот механизм не участвует в эмбриональной гибели.

Др. возможным объяснением наблюдаемого фенотипа является то, что SLK-LacZ слитый тетрамер не является мишенью для активности неизвестных субстратов. Это маловероятно, учитывая, что слитый белок неспособен аутофосфорилироваться или фосфорилировать экзогенный гистон H1, подтверждая, что нарушен доступ к субстрату. Поэтому мы считаем, что, скорее всего, этот слитый белок неспособен фосфорилировать свои нормальные субстраты, внося тем самым вклад в наблюдаемую гибель.

SLK, как было установлено, фосфорилирует и инактивирует стоящий ниже, чем RhoA, AT2R SHP-1/CK2-зависимым способом. Такая инактивация RhoA приводит к реляксации сосудов и в конечном итоге к расширению сосудов из эндотелиальных клеток (Guilluy et al., 2008). В нашей дефицитной по киназе модели фосфорилирование и инактивация RhoA д. быть репрессированы и приводить к увеличению активного RhoA и сужениям сосудов. Такое усиление сокращения сосудов могло бы объяснить, почему сосуды, позитивные по гладкомышечному актину (SMA), спадаются в SLK^fs/fs плацента на ст. E14.5, приводя в конечном итоге к сужению кровеносных сосудов и уменьшению кровотока и доставки питательных веществ эмбриону.

В целом наши данные показали, что активность SLK-LacZ слитого белка, вызываемая с помощью SLK gene trap, заметно снижена. Это приводит к дефектам пролиферации и ангиогенеза в плодной плаценте, приводя к эмбриональной гибели. Однако заметные дефекты развития наблюдались также в миогенном и нейрональном компартментах, подтверждая важную роль SLK в развитии этих структур.